No description available.

Orientador: Pedro de Oliva Neto / Banca: Michel Brienzo / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Eleni Gomes / Banca: João Claudio Thomeo / Resumo: Atualmente os resíduos lignocelulósicos, principalmente os agroindustriais estão sendo visados para a utilização em processos biotecnológicos. Os resíduos, se convenientemente hidrolisados, transformam-se em carboidratos que podem ser usados para diversos fins, tais como: produção de biomassa microbiana, açúcares fermentescíveis, bioenergia e compostos de alto valor agregado tais como enzimas. As enzimas do complexo fibrolítico estão entre as enzimas mais promissoras para a bioconversão e aproveitamento destes resíduos. O objetivo do presente trabalho foi utilizar um bioprocesso integrado utilizando-se diferentes resíduos, bioprocessos e micro-organismos, que combinados pudessem viabilizar a produção dos compostos mencionados. Dentre os resíduos foram estudados o bagaço de cana-de-açúcar, bagaço de laranja (polpa cítrica), torta de algodão, farelo de soja e outros com e sem pré-tratamento. Dentre os pré-tratamentos utilizados estão pré-tratamentos térmicos com ácido ou base. Também foram avaliados pré-tratamentos biológicos dos resíduos pelo cultivo de fungos filamentosos e unicelulares para produção enzimática. Tais substratos foram cultivados por fungos filamentosos com destaque para o Trichoderma reesei para a produção de enzimas fibrolíticas. Desta forma procurou-se integrar estes processos visando à produção de açúcares fermentescíveis. Como produtos secundários foram obtidos biomassa proteica (cogumelos comestíveis) e resíduo proteico que podem ser estudados para ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Currently the lignocellulosic residues, particularly the agroindustrial wastes are being targeted for use in biotechnological processes. If the waste is conveniently hydrolysed their carbohidrates can be used for various purposes such as production of microbial biomass, fermentable sugars, bioenergy and high-value compounds such as enzymes. The enzymes of fibrolytic complex are among the most promising enzymes for bioconversion of these wastes. The aim of this study was to use an integrated bioprocess using different waste, bioprocesses and micro-organisms that they combined could be enable the production of these compounds. Among the wastes were studied the sugarcane bagasse, orange peel (citrus pulp), cottonseed meal, soybean meal and others with and without pre-treatment. Among the used pre-treatments are thermal pretreatments with acid or base. Biological pre-treatments of these wastes also were evaluated by the cultivation of unicellular and filamentous fungi for obtaining pretreated residues. Such substrates were cultured by other fungy such as Trichoderma reesei for fibrolytic enzyme production. In this way the integration of these processes was performed for the production of fermentable sugars. As by-products were obtained protein biomass (edible mushrooms) and protein residue that can be studied for animal feed. Therefore, the work was divided into three chapters, which were done simultaneously / Doutor

A β-1,4-glucan 4-glucanohydrolase or 3.2.1.4. from Trichoderma viride was purified 39-fold over the crude enzyme and completely freed of hydrocellulase, β-1,4-exoglucanase, and aryl-β-D-glucosidase activities by the application of Avicel column adsorption chromatography, alkali swollen cellulose column adsorption chromatography, precipitation with ammonium sulfate, rechromatography on alkali swollen cellulose column, and glass paper electrophoresis at pH 4 in that order. The optimum temperature was 60°C. for the action of this purified enzyme on both amorphous cellulose and CMC for a period of 1 hour incubation. An activation energy of 5.1 Kcal per mole for amorphous cellulose and 6.4 Kcal per mole for CMC between 40° to 60°C. was observed. The optima pH appeared to be 4.2 for amorphous cellulose and 5.0 for CMC. The purified enzyme involved neither activator nor cofactor nor inhibitor in its action, and it was found to be stable at pH 6 to 7 at room temperature for a period of two hours. The sedimentation coefficient of this purified enzyme was 3.5S. It contained no cysteine and only a trace of methionine. From K_m determinations, cellulodextrins with DP above 6 and amorphous cellulose appeared to be the optimum substrates for this purified enzyme, but it did not attack hydrocellulose. A more or less random attack was indicated from the study of mode of action on reduced cellopentaose. Evidence that medium-size chain oligosaccharides might be intermediates in the decomposition of amorphous cellulose by the purified enzyme was obtained. Cellotriose in addition to cellobiose and glucose was found among the principal products from the hydrolysis of both G₅H and amorphous cellulose. The difference in the role of three main cellulase components obtained from T. viride was discussed in connection with the concept of the complete decomposition of cellulose by a multiple enzyme system, and a scheme of the possible mechanism of decomposition of cellulose by the cellulase system of T. viride was proposed. / Ph. D.

O fungo filamentoso Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) é o principal produtor de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas utilizadas para a produção de biocombustíveis a partir de biomassa lignocelulósica. Para que o custo de produção de etanol de segunda geração (2G), em escala industrial, seja competitivo, uma mistura eficiente de enzimas hidrolíticas é necessária para degradar a biomassa vegetal em açúcares fermentescíveis. Dada a crescente demanda pelo desenvolvimento de processos que reduzam os custos de enzimas de interesse biotecnológico, o presente trabalho se propôs a analisar o perfil global do transcriptoma de T. reesei em presença de celulose, soforose e glicose como fontes de carbono, a fim de prover um melhor entendimento de como essas enzimas são produzidas por esse microrganismo. Para isso, foi utilizada a abordagem RNA-seq e duas linhagens de T. reesei: QM9414 (parental) e xyr1 (mutante). No Capítulo I, foram anlisados 22 genes que codificam celulases e xilanases, com o intuito de verificar a regulação da expressão gênica pelo fator de transcrição XYR1 em diferentes fontes de carbono. Foi observada uma dependência da fonte de carbono e redução da expressão destes genes que codificam celulases e xilanases quando se comparou a linhagem mutante com a parental, cultivados na presença de celulose e soforose. Na presença de glicose, a maior parte dos genes analisados apresentou aumento de expressão no mutante xyr1. Por meio de análises in silico foi identificado o elemento regulatório cis para o fator de transcrição XYR1 usando quatro conjuntos de dados de genes dependente-condição envolvendo os experimentos RNA-seq e qPCR-TR. Foram identificados dois motivos com o consenso de ligação proposto para o regulador XYR1 (nomeado PWMXYR1). Ao usar esses motivos identificados, foi analisada a presença e disposição dos putativos elementos regulatórios cis nesses conjuntos de dados, sendo que sítios com intervalos curtos foram mais associados a promotores dependentes de XYR1 do que sítios simples. Além disso, a abordagem utilizada permitiu a identificação de sítios de ligação XYR1, na região promotora dos genes cel7a e xyn1 e mapear a potencial sequência alvo do regulador na região promotora do gene cel6a. Adicionalmente, sete outros promotores (genes cel7b, cel61a, cel61b, cel3c, cel3d, xyn3 e swo) apresentaram sítios de ligação putativos de XYR1. Usando a arquitetura do regulador PWMXYR1, foram identificados potenciais genes alvos de regulação direta por XYR1 no genoma de T. reesei. O mapeamento do referido sítio foi realizado, também, nos genes diferencialmente expressos na linhagem mutante xyr1, destacando que a regulação indireta desempenha um papel fundamental nas vias de sinalização. Estes resultados fornecem novas informações sobre os mecanismos de sinalização mediados por XYR1 na regulação de promotores de celulases. No Capítulo II, foi analisado o transcriptoma global da linhagem parental (QM9414) em diferentes fontes de carbono: celulose; soforose e glicose. Aplicando limites rigorosos de corte, 2060 genes foram identificados como diferencialmente expressos em pelo menos uma das fontes de carbono analisadas. Clusterização hierárquica desses genes diferencialmente expressos identificaram-se três possíveis regulons, representando 123 genes controlados por celulose, 154 genes controlados por soforose e 402 genes controlados por glicose. A análise da rede regulatória demonstrou a inter-relação existente entre as condições, permitindo a identicação de 75 genes específicos do crescimento em soforose e 107 de celulose. Esses resultados revelaram novos genes envolvidos na degradação da celulose, tais como: proteínas acessórias, transportadores, fatores de transcrição e CAZymes que respondem especificamente a presença de celulose ou soforose. No Capítulo III, analisou-se o perfil transcricional da linhagem mutante xyr1 comparando com a linhagem parental (QM9414), na presença das três fontes de carbono. As análises de expressão gênica revelaram que 2185 genes foram diferencialmente expressos na condição celulose, 2124 genes na condição soforose e 46 genes em glicose. Esses genes foram utilizados para analisar a inter-relação existente entre as condições, com destaque para grande número de genes exclusivos nas condições de indução (celulose e soforose). Por meio da clusterização hierárquica foram identificados 6 possíveis regulons, sendo 3 deles compostos por genes up-regulados e 3 regulons por genes down-regulados. Na ausência do regulador XYR1, a expressão de genes CAZys, fatores de transcrição, transportadores, entre outros, foram afetadas de modo dependente da fonte de carbono. Essas análises permitiram verificar que o fator de transcrição XYR1 é fundamental no processo de indução de enzimas de interesse biotecnológico, além de participar de outros processos bioquímicos/moleculares. Desse modo, todos os resultados obtidos fornecem informações sobre os eventos moleculares envolvidos na regulação da expressão gênica durante a adaptação de T. reesei frente a diferentes condições ambientais como: diferentes fontes de carbono e necessidades nutricionais. Contribuindo, assim, para uma melhor caracterização desse fungo filamentoso em relação à produção de enzimas e o desenvolvimento de mutantes metabólicos para utilização industrial. / The filamentous fungus Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) is a major producer of cellulolytic enzymes used for biofuels production from lignocellulosic biomass. In order to achieve a low cost second generation ethanol production in industrial scale, an efficient mix of hydrolytic enzymes are required for the degradation of plant biomass into fermentable sugars. Given the growing demand for development of processes in order to reduce the cost of enzymes production, the present work proposes a large-scale transcriptomic analysis of T. reesei in presence of cellulose, sophorose, and glucose as carbon sources, in order to provide insights about the mechanisms of enzymes production by this microorganism. For this purpose, RNA-seq approach was employed, as well, as two T. reesei strains: QM9414 (parental) and xyr1 (mutant). In Chapter I, 22 genes encoding cellulases and xylanases were analyzed regarding the regulation through the transcription factor XYR1. This regulation seems to occur in a carbon source dependence manner, and the expression of cellulases and xylanases was diminished in the mutant strain compared to the parental strain in the presence of cellulose and sophorose. In glucose, most of the analyzed genes showed higher expression in the mutant compared to the parental strain. In silico analysis identified a cis regulatory element for XYR1 using four datasets of condition-dependent genes based on RNA-seq and qPCR experiments. Two binding motifs have been identified with the proposed consensus for the XYR1 (named PWMXYR1). Using these motifs, the presence and arrangement of putative cis regulatory elements was analyzed, and the results indicate that the sites with short intervals were stronger associated with XYR1 dependent promoters than single sites, even with high scores. Moreover, this approach allowed the identification of XYR1 binding sites in the promoter region of cel7a and xyn1, as well as, map the potential target sequence in the promoter of cel6a gene. In addition, seven other promoters from genes cel7b, cel61a, cel61b, cel3c, cel3d, xyn3 and swo presented XYR1 putative binding sites. Using the cis-regulatory architecture of PWMXYR1, potential targets for direct regulation by XYR1were identified in a genome wide manner. The putative binding sites were also mapped in the differentially expressed genes identified in the mutant strain xyr1, suggesting that indirect regulation plays a key role in signaling pathways. Taken together, the data provided here provides important information regarding signaling mechanisms mediated by XYR1 in the regulation of cellulases promoters. In Chapter II, the transcriptome of the parental strain (QM9414) was analyzed in three carbon sources, cellulose, sophorose and glucose. By applying a stringent cut-off threshold, 2,060 genes were identified as differentially expressed in at least one of the carbon sources analyzed. Hierarchical clustering of differentially expressed genes identified three possible regulons, representing 123 genes controlled by cellulose, 154 genes controlled by sophorose and 402 genes controlled by glucose. The analysis of the regulatory network demonstrated the interrelation between the conditions, allowing the identification of 75 genes specifically expressed in soforose and 107 in cellulose. These results revealed new players involved in cellulose degradation, such as accessory proteins, transporters, transcription factors and CAZymes, that specifically respond to the presence of either cellulose or sophorose. In Chapter III, a genome wide comparative transcriptional analysis were performed between the mutant xyr1 strain and the parental strain (QM9414) using the three carbon sources. Gene expression analysis revealed 2,185 genes differentially expressed in cellulose, 2124 genes in sophorose and 46 genes in glucose. These differentially expressed genes were used to analyze the relationship between the conditions, revealing a greater number of exclusive genes in theinducing conditions (cellulose and sophorose). The hierarchical clustering analysis revealed 6 possible regulons, being three composed by up-regulated genes and 3 regulons composed by down-regulated genes. In the absence of the regulator XYR1, the expression of CAZy genes, transcription factors among other genes were affected in a carbon-dependent manner. These analyses showed that the transcription factor XYR1 has an essential role in induction of enzymes of biotechnological interest and participates in other biochemical/molecular processes. Taken together these results provide important information about the molecular events, involved in gene expression regulation during T. reesei adaptation to different environments such as: carbon sources and/or nutritional needs, thus contributing to a better understanding of this filamentous fungus regarding the the production of enzymes and the development of mutants for industrial applications.

O presente trabalho teve por objetivo avaliar a atividade celulolítica de fungos isolados de bagaço de cana-de-açúcar e serapilheira, atuantes sobre bagaço de cana-de-açúcar e farelo de arroz como substratos. Dez isolados fúngicos de amostras de bagaço de cana-de-açúcar e material vegetal em decomposição foram avaliados quanto à atividade celulolítica, tendo como referências os fungos Trichoderma reesei QM9414 e T. reesei RUTC30. A atividade celulolítica foi estimada pela capacidade hidrolítica do extrato enzimático dos fungos crescidos em bagaço de cana-deaçúcar, com e sem pré-tratamento térmico e com diferentes proporções de farelo de arroz. A atividade celulolítica foi estimada tanto em papel de filtro, para celulase total, como a carboximetilcelulose sódica, para endoglucanase. Os isolados identificados por análise molecular através da região 26S rDNA foram: Aspergillus giganteus (S1), Aspergillus fumigatus (S2 e F4), Trichoderma viride/Trichoderma hamatum (S3 e S6), Trichoderma koningiopsis (TPB), Paecilomyces variotti (F1), Moniliophthora perniciosa (F2), Acremonium cellulyticus/Penicillium verruculosum (G3) e Trichoderma sp RA305 (MAD). O Trichoderma reesei QM9414 apresentou a maior atividade tanto para celulase total como para endoglucanase. O isolado F1 não diferiu estatisticamente para atividade de endoglucanase em relação à cepa QM9414 em substrato contento somente bagaço. O isolado MAD não diferiu estatisticamente para atividade de celulase total e endoglucanse em relação à cepa QM9414 em substrato contendo 10% de farelo de arroz. Os isolados TPB e S2 apresentaram as maiores atividades para endoglucanase em bagaço de cana-de-açúcar tratado. Tais resultados mostram que a biodiversidade em nichos, como o bagaço de cana-de-açúcar e materiais vegetais em decomposição, podem fornecer linhagens de fungos celulolíticos com grande potencial biotecnológico. / The objective of this work was to evaluate the cellulolytic activity of fungi isolated from sugarcane bagasse and decaying plant material, growing on sugarcane bagasse and rice bran as substrate. Ten isolates from sugarcane bagasse and decayed plant material were evaluated for their cellulolytic activity as compared to the fungi Trichoderma reesei QM9414 and T. reesei RUTC30. The cellulolytic activity was estimated by the hydrolytic capacity of the enzymatic extract of fungi grown on sugarcane bagasse, with and without pre-heat treatment and with different proportions of rice bran. It was used as substrates both filter paper, for total cellulolytic activity, and sodium carboxymethyl cellulose, for endoglucanase activity. The isolates identified by molecular analysis using 26S rDNA region were: Aspergillus giganteus (S1), Aspergillus fumigatus (S2 and F4), Trichoderma viride/Trichoderma hamatum (S3 and S6), Trichoderma koningiopsis (TPB), Paecilomyces variotti (F1), Moniliophthora perniciosa (F2), Acremonium cellulyticus/Penicillium verruculosum (G3) and Trichoderma sp RA305 (MAD). Trichoderma reesei QM9414 showed the highest total cellulolytic activity and endoglucanase activity among all isolates. Isolate F1 was not statistically different for endoglucanase activity in relation to strain QM9414 using bagasse as substrate. Isolate MAD was not statistically different for total cellulose activity and endoglucanase activity in relation to strain QM9414 using substrate containing 10% of rice bran. Isolates TPB and S2 had the highest endoglucanase activities using sugarcane bagasse treated as substrate. These results show that biodiversity in niches, such as bagasse and decayed plant material, can provide strains of cellulolytic fungi with great biotechnological potential.

Devido as suas características funcionais, as proteínas vêm sendo cada vez mais utilizadas em diferentes áreas e atividades da sociedade humana como: alimentícia, indústria, têxtil, papel e celulose, química e médica. A produção industrial de proteínas de valor comercial para diversas aplicações, vem sendo cada vez mais conduzida através do desenvolvimento de sistemas de expressão em diferentes hospedeiros, como Saccharomyces cerevisiae. O presente trabalho teve por objetivo desenhar um sistema de expressão metabolicamente independente induzido pelo hormônio estradiol que, em S. cerevisiae, seja capaz de produzir e secretar com eficiência proteínas homólogas e/ou heterólogas de interesse industrial. Para tanto, foi desenhado e construído um plasmídeo regulador (que expressa o fator de transcrição quimérico c-mycGal4(DBD)hERα(LBD)VP16(AD) e um plasmídeo de expressão (que contém o promotor quimérico p5xUASGAL-UARcb1, o qual será induzido pelo fator de transcrição quimérico, regulando a expressão da proteína repórter celobiohidrolase I - cbh1 de Trichoderma reesei). Ambos plasmídeos foram utilizados para transformar a cepa ScW303-1A/pdr5Δ(construída neste trabalho) e induzido com diferentes concentrações de estradiol. Para analisar a habilidade do promotor em dirigir a expressão da proteína repórter cbh1, foi feito o teste de DNS, com os transformantes selecionados, utilizando carboximetilcelulose 1% como substrato. A maior atividade enzimática ocorre na indução do sistema com 5 μM de 17-β-estradiol e DES (dietilestilbestrol). Os resultados mostram que o sistema de expressão induzido por 17-β-estradiol e DES, funciona de forma eficiente em S. cerevisiae e que o mesmo pode ser utilizado na produção biotecnológica de outras proteínas de interesse. / Due to its functional characteristics, the proteins are being increasingly used in different areas and activities of human society: food, industry, textile, pulp and paper, chemical and medical. The industrial production of commercially valuable proteins for various applications is increasingly being conducted through the development of systems of expression in different hosts such as Saccharomyces cerevisiae. This study aimed to design a metabolically independent expression system induced by estradiol hormone in S. cerevisiae is able to produce and secrete effectively homologous proteins and / or heterologous of industrial interest. Thus, it was designed and built a regulatory plasmid (expressing the chimeric transcription factor c-myc-Gal4 (DBD) -hERα (LBD) - VP16 (AD) and an expression plasmid (which contains the chimeric promoter 5xUASGAL- UARcb1, which is induced by the chimeric transcription factor, regulating the expression of the reporter protein cellobiohydrolase I - cbh1 of Trichoderma reesei). Both plasmids were used to transform ScW303-1A / pdr5Δ strain (constructed in this work) and induced with different concentrations of estradiol. To analyze the ability of the promoter to direct the expression of the reporter protein cbh1, the DNS testing, with the selected transformants was done using 1% carboxymethylcellulose as a substrate. The highest enzymatic activity occurs in the induction system with 5 μM of 17-β-estradiol and DES (diethylstilbestrol). The results show that the expression system induced by 17-β-estradiol and DES operates efficiently in S. cerevisiae and that it can be used for the biotechnological production of other proteins of interest.

A transcrição pela RNA polimerase II (RNA polimerase B) e a sínteses de proteínas são os mais importantes processos metabólicos em células eucarióticas, e estão envolvidas no controle da expressão gênica. Trichoderma reesei foi utilizado como modelo de estudo para o desenvolvimento deste estudo. Este fungo filamentoso é um microrganismo que vem sendo utilizado por vários laboratórios no mundo para o estudo dos diversos processos biológicos básicos devido à sua grande importância biotecnológica. Foi estabelecido por nosso grupo de pesquisa um banco de dados ESTs (\"Expressed Sequence Tags\") para este microrganismo e, por meio da técnica de \"microarrays\" de cDNAs, determinou-se a reposta transcricional de T. reesei em função da disponibilidade de oxigênio e glicose, assim como a alguns estresses ambientais. Com base nesses resultados foram escolhidos alguns transcritos afetados pela limitação de oxigênio, tais como o gene btf3. Este gene codifica para a proteína reguladora BTF3 (Fator Transcricional 3 da RNA polimerase B), muito conservada em eucariotos, envolvida na transcrição de vários promotores da classe II e que faz parte do complexo que se liga aos polipeptídios nascentes (NAC). Com o intuito de estudar a funcionalidade do gene btf3 em condições normais e em choque térmico foi realizada uma análise transcricional comparativa em larga escala da cepa selvagem de T. reesei QM9414 e do mutante nocaute do gene btf3. A expressão de aproximadamente 2.000 genes foi analisada, por meio de \"microarrays\", em células submetidas ao estresse por choque térmico produzido pelo incremento da temperatura de cultura a 40°C. O nocaute do gene btf3 produziu o incremento da expressão dos genes das vias metabólicas primárias (ND4 e FBA), da defesa celular (DnaJ, HSP70 e RCI) e da síntese de proteínas (eIF2); enquanto que reprimiu genes da estrutura celular (HFBII) e da síntese de RNA (ATF21). No choque térmico, genes que codificam para proteínas associadas com a defesa celular, como as chaperonas Hsp70 e DnaJ, tiveram sua expressão induzida enquanto que proteínas associadas à divisão celular, como histonas e septina B, e à síntese de proteínas, como as proteínas ribossomais, foram reprimidas em ambas as cepas como resultado do estresse. Os resultados obtidos na análise por \"microarray\" foram validados através de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Estes resultados sugerem que BTF3 possa atuar como repressor de alguns genes transcritos pela RNA polimerase II. / Transcription by RNA polymerase II (RNA polymerase B) and protein synthesis are the most important metabolic processes in eukaryotic cells, and they are involved in the control of gene expression. Trichoderma reesei was used as model of study for the development of this study. This filamentous fungus is a microorganism that has been used by some laboratories around the world for the study of diverse basic biological questions due to its great biotechnological importance. We had established a data base of ESTs (Expressed Sequence Tags) for this microorganism and, through the technique of cDNA microarray, we had determined the transcriptional response of T. reesei to oxygen and glucose availability, as well as some environmental stresses. Based on such studies we chose some transcripts affected by oxygen limitation such as the btf3 gene, for more detailed investigations. This gene codes for the BTF3 regulatory protein (RNA Polymerase B Transcription Factor 3), a conserved transcriptional factor among eukaryotes that is involved in the transcription of several class II promoters and is part of the nascent polypeptide-associated complex (NAC). In order to study the functionality of the btf3 gene in normal and heat shock conditions, a large-scale transcriptional comparative analysis between T. reesei wildtype strain QM9414 and the btf3 knockout mutant was executed. The expression of approximately 2,000 genes was analyzed using microarrays in cells submitted to heat stress produced by culture temperature increment to 40°C. The knockout of btf3 produces the increment of the expression of genes involved with the primary metabolism pathways (ND4 and FBA), cellular defense (DnaJ, HSP70 and RCI) and protein synthesis (eIF2); whereas it repressed genes related to the structure cell (HFBII) and RNA synthesis (ATF21). In heat shock, genes that encode Hsp70 and DnaJ proteins, associated to cellular defense, as chaperones, had their expression induced. On the other hand, genes for proteins associated to cellular division, such as histones and septin B, and those related to protein synthesis, such as ribossomal proteins were transcriptionally repressed in both strains as a result of the stress. The results obtained in the microarray analysis were validated through quantitative real-time PCR (qPCR). These results suggest that BTF3 can act as a repressor for some genes transcribed by RNA polymerase B.

Fungos associados às plantas desempenham diversas funções biológicas importantes e constituem imensos reservatórios de novos compostos químicos, atividades biológicas e processos biotecnológicos ainda subexplorados. A diversidade estimada para esses microrganismos é enorme, porém menos de 7 % das espécies é conhecida. Em cana-de-açúcar, uma das principais culturas agrícolas do Brasil, estudos de interação e diversidade são recentes e ainda incipientes, principalmente com relação à comunidade fúngica e sua interação com plantas transgênicas. Uma das espécies presentes na comunidade fúngica associada à cana-de-açúcar é o fungo Trichoderma virens, o qual apresenta grande potencial de exploração como agente de controle biológico, promotor de crescimento vegetal e produtor de enzimas e metabólitos secundários. Nesse sentido, o presente trabalho buscou primeiramente determinar a estrutura e diversidade da comunidade de fungos (endófitos de raiz e rizosfera) associados a duas variedades de cana-de-açúcar, uma convencional (SP80-1842) e outra transgênica (IMI-1, expressando resistência ao herbicida imazapir), e avaliar possíveis efeitos da transgênese, do estágio de crescimento e do manejo agrícola. Além disso, uma linhagem de T. virens, isolada como endófito de raiz dessa planta, foi selecionada para estudos de interação fungo-planta e determinação dos mecanismos envolvidos na sua atividade de controle biológico. Na primeira etapa do trabalho, que compreendeu isolamento, caracterização e avaliação de alterações na comunidade fúngica, os resultados obtidos mostraram que a comunidade fúngica associada à cana-de-açúcar é formada por pelo menos 35 gêneros diferentes, a maioria do filo Ascomicota, sendo que a sua estrutura incluiu um grande número de gêneros pouco frequentes e um pequeno número de gêneros altamente frequentes (Penicillium, Fusarium, Aspergillus, Trichoderma e Epicoccum), dos quais alguns apresentam especificidade ao local de isolamento (raiz ou rizosfera). A avaliação de possíveis efeitos sobre a comunidade fúngica mostrou que a idade da planta foi o único fator que influenciou de forma significativa as características dessa comunidade, sendo que os efeitos da transgênese, se existentes, devem ser secundários quando comparados às fontes naturais de variação. Na segunda etapa, a linhagem de T. virens T.v.223 foi transformada pelo sistema Agrobacterium tumefaciens e o transformante gerado (expressando resistência à higromicina B e a proteína GFP) foi utilizado em ensaios de interação via reisolamento e microscopia. Os resultados revelaram que esse fungo não promoveu alterações fenotípicas visíveis na planta hospedeira, colonizou predominantemente as raízes, onde formou camadas densas de micélio ao seu redor, antes de penetrar o espaço intercelular das primeiras camadas de célula da epiderme do tecido radicular. Por último, mutantes de T. virens deficientes para produção de quitinases foram gerados por deleção gênica e silenciamento gênico via RNAi e avaliados quanto à capacidade de controle biológico de diferentes fitopatógenos em ensaios em casa de vegetação. Curiosamente, os resultados mostraram que as enzimas quitinolíticas podem ser essenciais à atividade de controle biológico efetuada por T. virens, mas que a importância e a participação dessas enzimas no processo dependem do tipo de planta e de patógeno envolvidos na interação, já que mais de um mecanismo deve contribuir para o controle biológico por T. virens, como por exemplo, a indução de resistência da planta. / Plant-associated fungi perform several important biological functions and are considered a vast source of novel chemical compounds, biological activities and biotechnological processes, whose potential is underexplored. The estimated diversity for these microorganisms is massive, but less than 7% of the species are already known. Sugarcane, one of the most important crops in Brazil, has only recently been studied regarding interactions and diversity, but these studies are still incipient, mainly concerning fungal community and its interaction with transgenic plants. One of the species found on sugarcane fungal community is the fungus Trichoderma virens, whose potential on biological control, growth promotion, and enzymes and secondary metabolites production is huge. Taking this into consideration, the current work aimed to determine the structure and diversity of the fungal community (root endophytes and rhizosphere) associated to two varieties of sugarcane, the conventional (SP80-1842) and the transgenic counterpart (IMI-1, expressing imazapyr herbicide resistance), and assess possible effects from transgenese, growth stage and management. In addition, a strain of T. virens, isolated as a sugarcane endophyte, was selected to perform the fungal-plant interaction assays and to determine its biological control mechanisms. The results of the first part of this work, including the isolation, characterization and evaluation of fungal community changes, showed that the sugarcane fungal community is made up by at least 35 different genera, most of them belonging to Ascomycota phylum, and its structure included many genera observed in very low frequencies, and a few genera highly frequent (Penicillium, Fusarium, Aspergillus, Trichoderma and Epicoccum), from which some have specificity to the place of isolation (root or rhizosphere). Assessing possible effects upon the fungal community showed that the growth stage was the only factor significantly influencing the communitys features, besides, if transgenese effects are present, they may be minor compared to other natural sources of variation. The second part of this work included the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of T. virens strain T.v.223 and utilization of the generated transformant (hygromycin B resistant and GFPexpressing) to perform interaction studies by re-isolation and microscopy. The results revealed that this fungus did not promote any phenotypic change in the host plant, it was found mostly in roots, formed a dense mycelia cover over the roots and was able to penetrate intercellular spaces of root epidermis first layers. Finally, T. virens chitinase-deficient mutants were generated by gene deletion and RNAi gene silencing, and tested for biological control activity against different phytopathogens in greenhouse assays. Curiously, the results showed that chitinolytic activity may be essential to the biocontrol activity of T. virens, but its significance and the input of each chitinase depends on the plant and pathogen playing the interaction, since more than one mechanism may account for T. virens biological control, for instance, the induction of plant resistance.

Devido à sua importante atividade celulolítica, o fungo Trichoderma harzianum possui um grande potencial de aplicação na hidrólise da biomassa. No entanto, as celulases deste fungo filamentoso ainda não foram caracterizadas em profundidade. A celobiohidrolase I (CBHI) é a principal enzima celulolítica produzida por Trichoderma sp. e atualmente é uma das celulases mais investigadas para aplicações de biocombustíveis. A CBHI hidrolisa celulose cristalina à unidades solúveis de celobiose, o que a torna uma enzima chave para a produção de açúcares fermentáveis a partir da biomassa. O objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar a CBHI de Trichoderma harzianum (ThCBHI) bioquímica, biofísica e estruturalmente. Primeiramente foi estabelecido um protocolo de purificação eficiente da proteína a partir da expressão homóloga no fungo. A caracterização bioquímica ThCBHI mostrou que a proteína possui uma massa molecular de 66 kDa, pI de 5,23 e o pH e a temperatura de atividade ótima foram 5,0 e 50 ºC, respectivamente. A influência do pH e temperatura sobre as estruturas secundárias e terciárias e atividade enzimática da ThCBHI foram analisados por espectroscopia de CD, fluorescência e SAXS, e os resultados mostraram que as perturbações de pH e de temperatura afetam a estabilidade por dois mecanismos diferentes. As variações de pH podem modificar a protonação dos resíduos, afetando diretamente sua atividade, levando a desestabilização estrutural apenas em limites extremos de pH, como pH 9,0. A temperatura, por outro lado, tem uma influência direta sobre enovelamento e compactação da enzima, fazendo com que na temperatura em torno de 60 ºC ocorra perda da estrutura secundária, e terciária. Quando as análises foram realizadas na presença do produto de reação e também inibidor competitivo, celobiose, a estabilidade térmica da ThCBHI aumentou significativamente de 61,5 para 65,9 ºC. Os estudos estruturais e simulações de dinâmica molecular mostraram que a flexibilidade do resíduo Tyr260, em comparação com a Tyr247 do homólogo de T. reesei CBHI (TrCBHI), é aumentada devido às cadeias laterais curtas adjacentes de Val216 e Ala384 criando uma abertura adicional na face lateral do túnel catalítico. A ThCBHI também apresenta um loop encurtado na entrada do túnel de interação com a celulose, o que tem sido descrito como o responsável por interagir com o substrato de TrCBHI. Estas características estruturais podem explicar por que a ThCBHI apresenta maior valor de kcat e menor inibição pelo produto em comparação com TrCBHI. / Trichoderma harzianum is a fungus that has a considerable potential in biomass hydrolysis application due to its elevated cellulolytic activity. Cellulases from Trichoderma reesei have been widely used as model in studies of cellulose breakdown. However, cellulases from Trichoderma harzianum are less-studied enzymes which have not been characterized biophysically and biochemically as yet. CBHI, a cellobiohydrolase I, is the major cellulolytic enzyme produced by Trichoderma sp. and is currently one of the most investigated cellulases for biofuel applications. CBHI hydrolyzes crystalline cellulose to soluble cellobiose units, which turns it into a key enzyme for producing fermentable sugars from biomass. The aim of this work was to purify and characterize the CBHI of Trichoderma harzianum (ThCBHI). We established an efficient purification protocol of ThCBHI, from the homologous expression. The biochemical characterization of ThCBHI showed that the protein has a molecular mass of 66 kDa, a pI of 5,23, and the optimum pH and temperature for its activity are 5,0 and 50 ºC, respectively. The effect of pH and temperature on secondary and tertiary structure and enzymatic activity of ThCBHI were analyzed by CD and Fluorescence spectroscopy and showed that they affect protein stability by two distinct mechanisms. Variations of pH modify protonation of the residues, affecting directly its activity, leading to structural destabilization only at extreme pH values, such as pH 9, 0. On the other hand, temperature has direct influence on mobility, fold and compactness of the folding enzyme, at temperatures above 60 ºC, there is loss of secondary and tertiary structure. When the assays were conducted in the presence of the cellobiose, a competitive inhibitor, thermal stability of ThCBHI was significantly increased to 61,5 to 65,9 ºC. Structural studies and molecular dynamics simulations showed that the flexibility of Tyr260, in comparison to the Tyr247 from the homologous T. reesei CBHI, is enhanced due to the short side chains of adjacent Val216 and Ala384 residues and creates an additional gap at the side face of the catalytic tunnel. In addition, CBHI of T. harzianum has a shortened loop at the entrance of the cellulose-binding tunnel, which has been described to interact with the substrate in T. reesei CBHI. These structural features might explain why T. harzianum enzyme displays higher kcat value and lower product inhibition on both glucosides and lactosides substrates in comparison to T. reesei CBHI.

A transcrição pela RNA polimerase II (RNA polimerase B) e a sínteses de proteínas são os mais importantes processos metabólicos em células eucarióticas, e estão envolvidas no controle da expressão gênica. Trichoderma reesei foi utilizado como modelo de estudo para o desenvolvimento deste estudo. Este fungo filamentoso é um microrganismo que vem sendo utilizado por vários laboratórios no mundo para o estudo dos diversos processos biológicos básicos devido à sua grande importância biotecnológica. Foi estabelecido por nosso grupo de pesquisa um banco de dados ESTs (\"Expressed Sequence Tags\") para este microrganismo e, por meio da técnica de \"microarrays\" de cDNAs, determinou-se a reposta transcricional de T. reesei em função da disponibilidade de oxigênio e glicose, assim como a alguns estresses ambientais. Com base nesses resultados foram escolhidos alguns transcritos afetados pela limitação de oxigênio, tais como o gene btf3. Este gene codifica para a proteína reguladora BTF3 (Fator Transcricional 3 da RNA polimerase B), muito conservada em eucariotos, envolvida na transcrição de vários promotores da classe II e que faz parte do complexo que se liga aos polipeptídios nascentes (NAC). Com o intuito de estudar a funcionalidade do gene btf3 em condições normais e em choque térmico foi realizada uma análise transcricional comparativa em larga escala da cepa selvagem de T. reesei QM9414 e do mutante nocaute do gene btf3. A expressão de aproximadamente 2.000 genes foi analisada, por meio de \"microarrays\", em células submetidas ao estresse por choque térmico produzido pelo incremento da temperatura de cultura a 40°C. O nocaute do gene btf3 produziu o incremento da expressão dos genes das vias metabólicas primárias (ND4 e FBA), da defesa celular (DnaJ, HSP70 e RCI) e da síntese de proteínas (eIF2); enquanto que reprimiu genes da estrutura celular (HFBII) e da síntese de RNA (ATF21). No choque térmico, genes que codificam para proteínas associadas com a defesa celular, como as chaperonas Hsp70 e DnaJ, tiveram sua expressão induzida enquanto que proteínas associadas à divisão celular, como histonas e septina B, e à síntese de proteínas, como as proteínas ribossomais, foram reprimidas em ambas as cepas como resultado do estresse. Os resultados obtidos na análise por \"microarray\" foram validados através de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Estes resultados sugerem que BTF3 possa atuar como repressor de alguns genes transcritos pela RNA polimerase II. / Transcription by RNA polymerase II (RNA polymerase B) and protein synthesis are the most important metabolic processes in eukaryotic cells, and they are involved in the control of gene expression. Trichoderma reesei was used as model of study for the development of this study. This filamentous fungus is a microorganism that has been used by some laboratories around the world for the study of diverse basic biological questions due to its great biotechnological importance. We had established a data base of ESTs (Expressed Sequence Tags) for this microorganism and, through the technique of cDNA microarray, we had determined the transcriptional response of T. reesei to oxygen and glucose availability, as well as some environmental stresses. Based on such studies we chose some transcripts affected by oxygen limitation such as the btf3 gene, for more detailed investigations. This gene codes for the BTF3 regulatory protein (RNA Polymerase B Transcription Factor 3), a conserved transcriptional factor among eukaryotes that is involved in the transcription of several class II promoters and is part of the nascent polypeptide-associated complex (NAC). In order to study the functionality of the btf3 gene in normal and heat shock conditions, a large-scale transcriptional comparative analysis between T. reesei wildtype strain QM9414 and the btf3 knockout mutant was executed. The expression of approximately 2,000 genes was analyzed using microarrays in cells submitted to heat stress produced by culture temperature increment to 40°C. The knockout of btf3 produces the increment of the expression of genes involved with the primary metabolism pathways (ND4 and FBA), cellular defense (DnaJ, HSP70 and RCI) and protein synthesis (eIF2); whereas it repressed genes related to the structure cell (HFBII) and RNA synthesis (ATF21). In heat shock, genes that encode Hsp70 and DnaJ proteins, associated to cellular defense, as chaperones, had their expression induced. On the other hand, genes for proteins associated to cellular division, such as histones and septin B, and those related to protein synthesis, such as ribossomal proteins were transcriptionally repressed in both strains as a result of the stress. The results obtained in the microarray analysis were validated through quantitative real-time PCR (qPCR). These results suggest that BTF3 can act as a repressor for some genes transcribed by RNA polymerase B.