Bacterioferritin, an iron storage protein having a 24-subunit quaternary structure, was used as a model for the study of host-guest interactions and guest encapsulation, making use of its spherical cage-like structure. A hexahistidine-affinity tag fused to the C-terminus of each bacterioferritin subunit was constructed. The C-terminus of each subunit points toward the inside of the cavity, while the N-terminus is exposed on the surface of the protein. The hexaHistag was able to form strong interactions with a nickel-nitrilotriacetic acid linked dye molecule (guest) and this interaction was used in attempts to develop a principle to control guest molecule encapsulation within the spherical cavity of the 24-mer bacterioferritin protein molecule. The procedure involved (1) subunit dissociation under acidic pH, (2) affinity controlled dye-Histag binding with exposed C-terminal hexahistidine residues and (3) reassociation of the subunits at neutral pH. The encapsulation conditions involving step 1 and 3 were studied preliminarily using laser light scattering to measure size (hydrodynamic radius) of the protein particle with apoferritin as a model system as it resembles the size and structure of bacterioferritin. In order to encapsulate guest molecules, the emptied shell of bacterioferritin was generated by site-directed mutagenesis resulting in ferroxidase- as well as heme-free bacterioferritin mutants (E18A/M52L/E94A), and these mutants were used to examine protein stability before conducting encapsulation experiments. However, wild-type bacterioferritin possessed highest stability in maintaining its multisubunit structure; hence, it was used for the encapsulation studies. It was found that 100% bacterioferritin with hexahistidine tag at the C-terminus, and a combination of 60% bacterioferritin with hexahistidine tag at the C-terminus and 40% bacterioferritin without hexahistidine tag at the C-terminus yielded similar amounts of encapsulated guest molecules. This suggested that all hexahistidine at the C-terminus were not equally available for dye molecule binding.

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Photoaffinity labeling is a quintessential technique in studying and analyzing the interaction between a ligand and receptor. Diazirines are one of the important photo-labile moieties used in photoaffinity labeling due to their superior photo labeling characteristics. Herein, we report the investigations we conducted with diazirine photolabels on (a) photochemical aspects leading to enhancement of their ambient light stability and (b) equipping them with fluorous tags to enable fluorous enrichment of labeled proteins. Furthermore, we report a pilot study to develop BACE-1 inhibitors, which have potential to be developed into photoaffinity probes. 3-Trifluoromethyl-3-phenyldiazirine offers good selectivity and protection against pseudolabeling but due to its photo lability, it undergoes decomposition even under ambient light. Thus the laboratory handling, including synthesis, of 3-trifluoromethyl-3-phenyldiazirine is cumbersome and restricted under constant darkness. Herein, we have designed, synthesized and evaluated two photolabels with enhanced stability to ambient light conditions in addition to the good selectivity and protection against pseudolabeling as offered by 3-trifluoromethyl-3-phenyldiazirine. It was also found that the aqueous solubility, a vital physical property for a photolabel, was also improved in the modified ambient light stable photolabels. Fluorous tags have found wide use in synthetic applications; herein we explore the possibility of its application in photoaffinity studies. We designed, synthesized and conducted photoactivation studies on two fluorous diazirine photolabels. The photoactivation studies unraveled an unanticipated photoreaction when the fluorous tag was directly connected to the diazirine ring, yielding a fluorous alkene. The more practical photolabel of the two was chosen as the target specific photoaffinity labeling moiety for fluorous proteomics. Upon conducting photolabeling experiments under various conditions, we found that the strong hydrophobic character of the fluorous tag renders the photoaffinity label insoluble in aqueous solutions and significantly alters the binding mode and affinity of the photoaffinity label to its target receptor. A library of 1,3-disubstituted 2-propanols was combinatorially prepared and tested as small molecule inhibitors of β-secretase (BACE-1). The initial screening of the 1,3-disubstituted 2-propanol library revealed a few low micromolar inhibitors for BACE-1. The compound that showed the best activity was chosen for further SAR studies, which resulted in a potent BACE-1 inhibitor with nanomolar inhibition. Investigation on the selectivity of these compounds for BACE-1 inhibition over cathepsin D revealed that these compound series possess very high selectivity. Furthermore, the physicochemical properties study showed that these compounds possessed the calculated parameters advantageous to cross the blood-brain barrier (BBB).

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L’étude de l’assemblage et de l’acheminement à la membrane plasmique des complexes de signalisation des RCPGs va jouer un rôle crucial dans le développement de nouveaux médicaments ayant moins d’effets secondaires. Des outils permettant l’étude de ces phénomènes existent déjà, mais un outil polyvalent qui permettrait d’étudier plusieurs aspects pourrait grandement faciliter et accélérer ces études. L’étiquette SNAP est un candidat intéressant puisqu’avec cette étiquette il est possible de marquer une seule construction avec une variété de différents substrats. Une construction encodant pour le récepteur β2AR avec une étiquette SNAP à son extrémité C-terminale a été ingénérée. Cette construction est apte à lier son ligand, à être acheminée à la membrane plasmique et à homodimériser. La protéine exprimée a été marquée avec le fluorophore BG-430. De la fluorescence non spécifique a été détectée dans la cellule (même en absence de l’étiquette SNAP sur le récepteur). Un essai BRET a été développé, utilisant la construction HA-β2AR-SNAP en tant qu’accepteur et est fonctionnel. L’étiquette SNAP, comme utilisée ici, ne présente pas un aussi bon candidat qu’attendu, puisque le substrat n’ayant pas réagi demeure coincé dans la cellule. Le facteur activateur de plaquette (PAF) et son récepteur (PAFR) jouent un rôle critique dans plusieurs réponses inflammatoires et le récepteur FP est impliqué dans l’accouchement prématuré. Une meilleure compréhension des complexes de signalisation associés à ces récepteurs pourrait être la première étape dans la compréhension de leur signalisation dans des situations normales ou de maladies. Des expériences de BRET étudiant des interactions de bases entre les récepteurs et leurs partenaires d’interactions connus ont été réalisées. Elles ont permis de déterminer que : les récepteurs PAF et FP homodimérisent, que les récepteurs PAF et FP hétérodimérisent, que les protéines Gβγ interagissent de manière constitutive avec ces récepteurs et qu’aucun signal de BRET n’a été détecté avec la protéine Gα et ce, en présence ou en absence de stimulation par un agoniste (suggérant qu’il est nécessaire d’optimiser le système présentement utilisé). / Studies of the assembly and plasma membrane trafficking of G protein-coupled receptor (GPCR) signalling complexes will play an important role in the development of new drugs with fewer side effects. Tools for this purpose have already been developed, but a more versatile tool which would allow assessment of multiple aspects of GPCR trafficking and protein/protein interaction could greatly facilitate and expedite these studies. The SNAP tag is without doubt an interesting candidate for this task. Using this tag, it is possible to label one receptor construct, with a variety of different substrates. A construct encoding the β2AR receptor was engineered with a C-terminal SNAP tag. This construct, when expressed in HEK 293 cells, was able to bind ligand, to traffic to the plasma membrane and to form homodimers. The expressed protein was then labelled with the BG-430 fluorophore. Non-specific fluorescence was detected in the cell, even in the absence of the SNAP tag. A BRET assay was developed using the HA-β2AR-SNAP as a BRET acceptor. The SNAP tag as used in this initial study was not as good as thought previously because uneacted substrate remains trapped in cells (i.e. the background was too high). Platelet-activating factor (PAF) and its receptor (PAF-R) play a critical role in many inflammatory responses and the receptor for prostaglandin F (FP) plays a role in pre-term labour. A better understanding of signalling complexes associated with these receptors might be the first step in a better understanding of their signalling in health and disease. As an initial step in this direction, we used BRET to study basic interactions between these receptors and known signalling partners. PAF-R and FP receptors homodimerize. A heterodimer between the FP and PAF receptors was also detected. Gβγ subunits interact with these receptors in a constitutive way. In the case of the Gα, no BRET signal was detected with or without agonist stimulation suggesting more work is required to optimize the system.

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La presente investigación tiene como objetivo principal, establecer la capacidad de adaptación de una resina compuesta en cavidades clase I in vitro preparadas con instrumental de alta rotación y con láser de Er: YAG en los primeros molares y premolares. Específicamente se propone, a) evaluar la desadaptación de la interfaz entre el material restaurador y diente receptor, en cavidades elaboradas con láser de Er:YAG y con instrumental rotatorio de alta rotación al Microscopio Olympus LEXT OLS4000 3D Confocal Laser y Microscopio Olympus IX-81 Inverted Confocal Fluorescence; b) analizar la extensión de la interfaz en cortes longitudinales de la corona dentaria con el software Image Pro Plus y Software Olympus LEXT OLS4100 Versión 3.1.1.1 sin tener en cuenta raza y sexo de las piezas provistas para realizar las cavidades elaboradas con el LASER Er:YAG y Turbina KaVo 650B; c) realizar un análisis estadístico de las interfases; d) comparar la longitud de los tags de los complejos de unión cuando la dentina ha sido preparada con láser de Er:YAG y cuando la dentina ha sido preparada con instrumental rotatorio convencional más ácido ortofosfórico antes del sistema adhesivo en ambos grupos y; e) determinar el patrón de fractura de los especímenes, por observación a microscopía Confocal. Se partió de la hipótesis de que con la utilización del Láser Er:YAG sobre dentina - con baja densidad de potencia y acondicionándola con ácido ortofosfórico - conseguiremos una adaptación similar a las obtenidas con instrumental rotatorio de superalta velocidad utilizando refrigeración y el mismo adhesivo en ambos casos. Además, la dentina sufrirá desecación cuando sea irradiada con el láser de Er:YAG, debido a la absorción de energía por parte del contenido acuoso presente en el interior de los túbulos dentinarios y ello podría evidenciarse por la presencia de resina del sistema adhesivo en el interior de los mismos por la deshidratación. Pudiendo ser superior la longitud cuando sea utilizado el láser de Er:YAG en la preparación, siempre con el mismo sistema adhesivo. Observándose mayor presencia de fallas cohesiva de la superficie dentinaria irradiada con láser frente a las superficies no irradiadas debido al debilitamiento de la superficie por las microexplosiones de la ablación. Se realizó un estudio experimental y descriptivo in vitro donde se comparó la adaptación de material de restauración fotopolimerizable sobre cavidades clase 1 de Black realizadas con instrumental de alta rotación y otras realizadas con Laser Er:YAG en molares y premolares. Se procedió inicialmente a realizar una lectura crítica del material bibliográfico y se evaluó la calidad metodológica de los artículos seleccionados en base a los criterios CASPe para pruebas diagnósticas (Critical Appraisal Skills Programme Español) y se diseñó un protocolo de trabajo para nuestro estudio. Se utilizaron 50 dientes humanos, seleccionados según los siguientes criterios de inclusión: pacientes de ambos sexos, primeros molares y premolares superiores e inferiores permanentes con la corona íntegra y sin presencia de caries dental o problemas de desarrollo, que se obtuvieron en la Asignatura de Cirugía A y Hospital Odontológico Universitario de la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional de La Plata, extraídos con diagnóstico de enfermedad periodontal grave. A los pacientes se les realizó un consentimiento informado que consta de dos documentos, que procedieron a firmar, en donde se dejó constancia en el primero de ellos toda la información sobre la extracción quirúrgica de la o las piezas dentarias y en el segundo se informa al paciente sobre la donación de sus piezas dentarias con problemas periodontales para ser utilizadas en investigación por propia voluntad y autorizando su uso, respetando las normas de Helsinki sobre principios éticos para la investigación médica sobre sujetos humanos y las buenas prácticas médicas. Se le explican las condiciones del experimento que se realizará con el material extraído (dientes) y se le ofrecen garantías al respecto sobre la no utilización del material para fines genéticos. En caso de que el paciente no acepte las condiciones, se rechaza la muestra y se garantiza al paciente que su tratamiento se realizará en idénticas condiciones y no supondrá ningún trato desigual a efectos médicos ni administrativos. En el mencionado estudio comparativo “in vitro” se realizó la descripción de las diferencias existentes en la zona de interfase a través del análisis estadístico, por medio de aquellos parámetros que fueron cuantificables, de las desadaptaciones presentes o GAPS entre un Grupo de piezas dentarias tratadas con láser Er: YAG para realizar cavidades clase I y otro Grupo tratadas con instrumental rotatorio de superalta velocidad. Las comparaciones entre dos grupos de datos se realizaron mediante la prueba T-Student agrupada (estadístico T) cuando se cumplieron los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza. Cuando alguno de estos supuestos no se cumplió, se realizó la prueba de Wilcoxon para muestras independientes (Mann-Whitney) (estadístico W). Los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza se analizaron mediante las pruebas de Shapiro-Wilk (modificada) y F para igualdad de varianza, respectivamente. El modelo experimental desarrollado y utilizado ha funcionado correctamente y no ha presentado mayores inconvenientes en su ejecución. Todas las muestras utilizadas y las distintas tecnologías empleadas no generaron dificultades en su manipulación. La mayoría de las microfotografías muestran semejanzas con respecto a la zona de la pared de las cavidades realizadas en ambos grupos con las dos técnicas propuestas, mientras que en la zona de la base de las cavidades realizadas se observaron diferencias en el grado de adaptación de la resina al tejido dentario observándose un leve aumento de la desadaptación en las cavidades tratadas con láser de Er:YAG. Basándonos en el análisis estadístico de nuestros resultados y con las limitaciones propias de un estudio in vitro (ex vivo), concluimos que: 1. Al utilizar densidad de energía baja por pulso se obtuvieron valores similares de desadaptación (GAP) entre el Grupo de piezas dentarias tratadas con láser de Er:YAG y el Grupo de piezas dentarias tratadas con instrumental rotatorio ambos habiendo utilizado spray, grabado total con ácido orto fosfórico y el mismo sistema adhesivo. 2. Los “tags” resultaron ser hasta 10 veces más largos cuando la dentina se irradió con láser de Er:YAG y se utilizó grabado ácido, que cuando se utilizó instrumental rotatorio y ácido orto fosfórico. 3. El patrón de fractura mostró un mayor porcentaje de fallo cohesivo de dentina en la parte de las muestras que fueron irradiadas con láser, respecto del grupo en que se utilizó instrumental rotatorio. 4. Los resultados obtenidos confirman todas las hipótesis de trabajo, aunque sugiere que no habría marcadas diferencias de adaptación entre ambas técnicas, la técnica con instrumental rotatorio podría producir una adaptación levemente mayor. En la mayoría de las comparaciones realizadas no se llegaron a encontrar diferencias significativas entre ambas técnicas con respecto al espesor y la superficie. En dos comparaciones se encontraron diferencias significativas de espesor: el láser produjo mayores valores a nivel de base y pared. Por otro lado, en otra comparación también se observó una tendencia a la generación de mayor superficie con láser, aunque no fue estadísticamente significativa. De esta manera, los resultados obtenidos sugieren que no habría marcadas diferencias de adaptación entre ambas técnicas, aunque la técnica con turbina podría producir una adaptación levemente mayor. El desarrollo de nuevas investigaciones derivadas del presente trabajo, podrían aportar un mayor número de observaciones, lo cual sería importante para la confirmación de estas conclusiones.

隨著人們習慣的改變，從網路上獲取新知漸漸取代傳統媒體，這也延伸產生許多新的行為。社群標籤是近幾年流行的一種透過使用者標記來分類與詮釋資訊的方式，相較於傳統分類學要求物件被分類到預先定義好的類別，社群標籤則沒有這樣的要求，因此容易因應內容的變動做出調整。 問答型網站是近年來興起的一種個開放性的知識分享平台，例如quora、Stack Overflow、yahoo 奇摩知識+，使用者可以在平台上與網友做問答的互動，在問與答的討論中，結合大眾的經驗與專長，幫助使用者找到滿意的答案，使用單純的問答系統的好處是可以不必在不同且以分類為主的論壇花費時間尋找答案，和在關鍵字搜索中的結果花費時間尋找答案。 本研究希望能針對問答型網站的文件做自動標籤分類，運用標籤推薦技術來幫助使用者能夠更有效率的找到需要的問題，也讓問答平台可以把這些由使用者所產生的大量問題分群歸類。 在研究過程蒐集Stack Exchange問答網站共20638個問題，使用naïve Bayes演算法與文件相似度計算的方式，進行標籤推薦，推薦適合的標籤給新進文件。在研究結果中，推薦標籤的準確率有64.2% 本研究希望透過自動分類標籤，有效地分類問題。幫助使用者有效率的找到需要的問題，也能把這些由使用者所產生的大量問題分群歸類。 / With User's behavior change. User access to new knowledge from the internet instead of from the traditional media. This Change leads to a lot new behavior. Social tagging is popular in recent years through a user tag to classify and annotate information. Unlike traditional taxonomy requiring items are classified into predefined categories, Social tagging is more elastic to adjust through the content change. Q & A Website is the rise in recent years. Like Quora , Stack Overflow , yahoo Knowledge plus. User can interact with other people form this platform , in Q & A discussion, with People's experience and expertise to help the user find a satisfactory answer. This study hopes to build a tag recommendation system for Q & A Website. The recommendation system can help people find the right problem efficiently , and let Q & A platform can put these numerous problems into the right place. We collect 20,638 questions from Stack Exchange. Use naïve Bayes algorithm and document similarity calculation to recommend tag for the new document. The result of the evaluation show we can effectively recommend relevant tags for the new question.