En 2003, l'Organisation Mondiale de la Santé a déclaré la non-observance au traitement médical un problème de santé public majeur. Les impacts de la non-observance sont multiples touchant à la fois des facteurs économiques, humains et sociaux. La compréhension de la dynamique entourant la non-observance est un enjeu de taille, et ce, d'autant plus pour les patients qui ont subi une transplantation cardiaque. En effet, pour ces individus, la non-observance au traitement post-greffe menace directement leur survie et leur qualité de vie. Le concept de représentation de la maladie est l'un des facteurs s'étant montré en mesure de prédire de façon plus significative et constante l'observance au traitement. Malgré l'importance de l'observance au traitement pour les greffés cardiaques, et bien que les liens entre cette variable et la représentation de la maladie soient confirmés par la littérature, on ne retrouve aucune étude explorant en détails les représentations de la maladie des greffés cardiaques et ses liens possibles avec l'observance. De surcroît, cette relation n'a pas été explorée dans un contexte longitudinal où il serait pertinent d'évaluer si les fluctuations de la représentation de la maladie peuvent entraîner des impacts sur l'observance au traitement. Par ailleurs, le concept de représentation de la maladie est traditionnellement étudié par l'entremise d'outils quantitatifs. Pourtant, ce dernier fait référence à des croyances d'ordre idiosyncrasique, dynamique, qui peuvent être cohérentes, rationnelles ou non. L'ajout d'une évaluation qualitative pourrait permettre une meilleure compréhension de la représentation de la maladie et de ses liens avec l'observance au traitement. L'étude actuelle vise à explorer en détails les représentations de la maladie des greffés cardiaques à l'aide de deux méthodologies soit qualitative et quantitative. Les fluctuations de la représentation de la maladie à travers le temps, en plus d'être mesurées seront mises en relation avec l'observance au traitement dans un objectif de mieux cerner les liens entre ces deux variables. Une meilleure connaissance de ces deux concepts et de leur relation pourrait permettre le développement d'outils ou d'interventions visant à optimiser l'observance au traitement chez les greffés cardiaques. Le présent document présente un compte-rendu des travaux à ces effets. Le premier chapitre abordera la problématique, décrira les variables sous étude, et fera état de la littérature dans ce domaine. Le second chapitre présentera les résultats du premier volet de cette étude visant à explorer la représentation de la maladie des greffés cardiaques par des mesures quantitatives et qualitatives. Il sera démontré comment les mesures qualitatives permettent d'expliquer, de nuancer et d'approfondir les résultats quantitatifs. Des suggestions concrètes pour améliorer l'évaluation quantitative de la représentation de la maladie seront par le fait même proposées. Le troisième chapitre présentera les résultats du second volet de cette étude visant à analyser les fluctuations de la représentation de la maladie et ses liens potentiels avec l'observance au traitement. Il sera démontré que les représentations de la maladie des greffés cardiaques pourraient être stables et adéquates entre le 4e et le 10e mois suivant la transplantation cardiaque. De plus, la possibilité d'une relation entre les fluctuations de la représentation de la maladie et l'observance au traitement sera mise en lumière. Finalement, des profils d'observance seront présentés toujours dans une optique de mieux cerner les liens entre la représentation de la maladie et l'observance au traitement. Finalement, le quatrième chapitre fera une synthèse de l'ensemble de ces travaux en faisant un retour sur les objectifs de cette étude et les résultats encourus. De plus, les implications méthodologiques et cliniques seront survolées et des applications concrètes suggérées. Les limites et forces de l'étude seront aussi abordées pour ensuite terminer en extrapolant sur les recherches futures. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : représentation de la maladie, observance au traitement, greffés cardiaques, méthodologies qualitative et quantitative.

Cette étude à cas unique de type A-B-A vise à vérifier, à l'aide quels sont les effets d'un programme d'équitation thérapeutique de dix (10) séances sur les humeurs dépressives et le contrôle de soi chez des adolescentes en troubles de comportement et si ces effets se maintiennent après la fin du programme. Les sujets sélectionnés sont trois (3) adolescentes de 16 et 17 ans, hébergées en Centre de réadaptation Estrie du Centre jeunesse de l'Estrie pour troubles de comportement. L'évaluation, d'une durée de quinze (15) semaine [i.e. semaines], se fit à l'aide de la version française du Beck Depression Inventory-II (BDI-II) pour mesurer les humeurs dépressives, les échelles de comportements extériorisés et de problèmes d'attention de la version autorapportée pour adolescent du Achenbach (version YSR) pour le contrôle de soi et un questionnaire maison pour calculer les variations de l'humeur avant et après les séances d'équitation thérapeutique.

L'adénocarcinome pancréatique est un des cancers les plus létaux, avec une survie à 5 ans après diagnostic de seulement 5%. L'absence de traitement curatif et les nombreux échecs des thérapies ciblées mettent en avant l'urgence d'identifier une stratégie thérapeutique efficace. L'atteinte de cet objectif doit passer par l'identification de biomarqueurs diagnostic et pronostic, l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et la connaissance des mécanismes de résistance induits par les thérapies ciblées. La voie PI3K/Akt/mTOR, une des voies les plus altérées dans les cancers, est suractivée dans les cancers du pancréas et corrélée à un mauvais pronostic. Chez les Vertébrés, la famille des phosphoinositide-3-kinases (PI3K) de classe I est constituée des isoformes p110a, p110ß, p110d et p110?. Bien qu'elles réalisent toutes la même réaction biochimique (phosphorylation du PIP2 en PIP3, second messager lipidique), chaque isoforme de PI3K possède des rôles physiologiques spécifiques. Les inhibiteurs globaux de PI3Ks actuellement testés en phase I/II dans les cancers solides avancés présentent un bénéfice thérapeutique limité à des doses maximales tolérées. Les inhibiteurs des isoformes de PI3K sont actuellement les agents les plus prometteurs car ils offrent les avantages d'être, à de faibles doses, plus efficaces, plus puissants dans l'inhibition d'une PI3K et donc moins toxiques que les inhibiteurs pan-PI3K. Les objectifs de cette thèse sont de déterminer les rôles isoforme-spécifiques des PI3K et l'intérêt thérapeutique de cibler une ou plusieurs isoformes dans la pancréatite et l'adénocarcinome pancréatique, par l'identification de voies isoforme-spécifiques et l'étude des réponses adaptatives induites par le ciblage d'une ou de toutes les isoformes de PI3K. Dans un premier temps, mon travail a permis de mettre en évidence, valider et compléter des résultats obtenus dans l'équipe, visant à démontrer l'importance de la signalisation PI3K/Akt dans ces deux processus physiopathologiques : la pancréatite chronique et l'initiation de la carcinogenèse pancréatique. Plus précisément, l'hyperactivation de la voie PI3K/Akt observée dans des échantillons humains et murins atteints de pancréatique chronique est corrélée avec l'enrichissement d'une signature transcriptomique d'activation de l'isoforme p110a. Par ailleurs, l'inactivation génétique et pharmacologique de p110a lors d'une inflammation chronique pancréatique ou en présence de Kras oncogénique empêche l'apparition de métaplasies acino-canalaires, structures associées à l'initiation de la carcinogenèse pancréatique. L'élaboration d'un protocole de transdifférenciation acino-canalaire in vitro m'a permis de valider que seule l'isoforme p110a est nécessaire à cette étape d'initiation de la carcinogenèse pancréatique en régulant les petites GTPases Rho, essentielles au remodelage du cytosquelette d'actine. Dans un deuxième temps, grâce à une analyse quantitative du phosphoprotéome d'une lignée cancéreuse pancréatique traitée ou non à différents temps par un inhibiteur pan- ou isoforme-sélectif, j'ai démontré pour la première fois l'existence de cibles, de réseaux de signalisation et de réponses adaptatives régulés par chaque isoforme de PI3K. Pour conclure, l'ensemble des résultats démontrent le rationnel de l'utilisation combinatoire d'inhibiteurs isoforme-spécifiques de PI3K chez les patients atteints de cancer du pancréas pour une meilleure réponse clinique. / Pancreatic ductal adenocarcinoma is one of the most lethal cancers, with a 5 year-survival rate below 5%. Lack of curative treatment and failure of targeted therapies urge the need to identify novel efficient therapeutic strategy. Achievement of this goal will be obtained through the identification of diagnosis and prognosis biomarkers, identification of novel therapeutic targets and the knowledge of resistance mechanisms induced by these targeted therapies. PI3K/Akt/mTOR signalling, one of the most altered in cancers, is overactivated in pancreatic cancer and correlated with poor prognosis. In the Vertebrates, the family of class I phosphoinoitide-3-kinase (PI3K) includes four isoforms: p110a, p110ß, p110d and p110?. Although they all perform the same biochemical reaction (phosphorylation of PIP2 in PIP3, a membrane lipid messenger), each isoform were demonstrated to have specific physiological roles. Global PI3K inhibitors are currently being tested in phase I/II clinical trials in advanced solid cancers, but show at maximal doses tolerated a limited therapeutic benefit. Isoform-selective PI3K inhibitors are currently the most promising agents because, at low doses, they are more efficient to inhibit one PI3K isoform, and thus, less toxic than pan-PI3K inhibitors. The objectives of this thesis are to determine isoform-specific PI3K roles and the therapeutic interest to target one or more isoforms in pancreatitis and PDAC, by the identification of isoform-specific pathways and the study of adaptive responses induced by targeting of one or all isoforms of PI3K. In a first part, my work has highlighted, validated and completed results obtained in the team, to demonstrate the significance of PI3K/Akt signalling in two physiological processes: chronic pancreatitis and initiation of pancreatic carcinogenesis. Precisely, the overactivation of PI3K/Akt pathway measured on human and murine chronic pancreatitis samples is correlated with a specific p110a activation gene expression signature. Moreover, genetic and pharmacologic inactivation of p110a during pancreatic chronic inflammation or cancerogenesis (by oncogenic Kras) prevents the formation of acino-ductal metaplasia, structures at the origin of pancreatic carcinogenesis initiation. Development of in vitro acino-ductal transdifferentiation protocol allowed me to demonstrate that only p110a is necessary at this initial step of pancreatic carcinogenesis by the regulation of Rho small GTPases, further regulating actin remodelling. In the second part, by a phosphoproteomic-based approach, I quantified PI3K downstream phosphorylation-regulated targets in a pancreatic cancer cell line treated or not by a pan- or selective PI3K inhibitor at different times. I demonstrated for the first time existence of targets, signalling pathways and adaptive responses regulated by each PI3K isoform. To conclude, all these results demonstrate the rational of combinatorial use of isoform-specific PI3K inhibitors in patients with pancreatic cancer for better clinical response.

La mitochondrie occupe un rôle essentiel au sein des cellules cancéreuses. Etant la source principale de synthèse d’ATP mais est également le lieu de réactions anaboliques et cataboliques, la mitochondrie supporte le développement tumoral. De plus, la mitochondrie est également impliquée dans la réponse aux stress cellulaire en régulant notamment l’autophagie ou la mort des cellules cancéreuses.Dans ce contexte, nous avons démontré que la fonction mitochondriale peut altérer la réponse au stress réticulaire permettant la survie des cellules tumorales. En effet, la surexpression de la protéine GILZ (Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper) atténue la mort cellulaire induite par le stress réticulaire. Ceci est permis grâce au maintien du réseau mitochondrial et à l’augmentation de la fonction mitochondriale. Dans cette étude, nous avons démontré que le maintien de la fonction mitochondriale est important pour l’effet protecteur de GILZ puisque l’utilisation de lignées cellulaires de mélanome dépourvues d’activité mitochondriale (lignées ρ0) et surexprimant GILZ sont sensibles à la mort induite par les inducteurs de stress réticulaire. Nos études ont également démontré que l’augmentation de la fonction mitochondriale induite par GILZ peut être utilisée pour resensibiliser les cellules cancéreuses à la mort notamment en utilisant des molécules prooxydantes comme l’elesclomol.Dans un autre contexte tumoral, nous avons également démontré qu’une sous population de cellules de mélanome BRAFV600E peuvent augmenter leur métabolisme mitochondrial dans le but de survivre à la mort cellulaire induite par les inhibiteurs de MAPK. La résistance aux MAPKi implique une augmentation significative de l’OxPHOS mitochondriale associée un remodelage du réseau mitochondrial autour du réticulum endoplasmique facilitant la recapture du calcium mitochondrial. Nos résultats ont permis de démontrer que la fonction mitochondriale est cruciale pour la survie des cellules cancéreuses. De part son rôle cellulaire multiple, il apparaît clairement que la mitochondrie constitue une cible thérapeutique de choix dans le traitement des cancers. / Mitochondria occupies a key role in cancer cells. As the main source of ATP synthesis and the site of anabolic and catabolic reactions, mitochondria support tumor development. Besides, mitochondria are also involved in the response to cellular stress regulating autophagy or cancer cell death.In this context, we have demonstrated that mitochondrial function may alter the ER stress response thus promoting tumor cell survival. Indeed, overexpression of the Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper protein (GILZ) protein attenuates endoplasmic reticulum stress mediated cell death. This is achieved by maintaining the mitochondrial network and the increase of mitochondrial function. In this study, we demonstrated that maintaining mitochondrial function is important for the protective effect of GILZ since using melanoma cell lines lacking mitochondrial activity (ρ0 cell lines) and overexpressing GILZ are susceptible to death induced by reticular stress inducers. Our studies have also shown that the increase of mitochondrial function induced by GILZ can be used to re-sensitize the cancer cells to death induced by prooxidant molecules as elesclomol.In another tumoral context, we have also demonstrated that a sub-population of BRAF mutated melanoma cells can increase mitochondrial metabolism to survive to ER stress-mediated cell death induced by several MAPK inhibitors. Resistance to MPAki involves a significant increase in mitochondrial OXPHOS associated with mitochondrial network remodeling around the ER, which facilitates mitochondrial calcium uptake. Our results have shown that mitochondrial function is crucial for the survival of cancer cells. Altogether our data indicate that given their multiple cellular roles, cancer cell mitochondria constitute attractive therapeutic targets.

De récents essais cliniques ont montré les bénéfices thérapeutiques des nouvelles immunothérapies (Sipoleucel T pour le cancer de la prostate…). Mais jusqu’ici la majorité des essais cliniques de vaccins contre le cancer n’ont montré que de faibles effets sur les patients, ce qui contraste avec les résultats obtenus dans les modèles pré cliniques. Ceux-ci, comprennent la greffe sous cutanée de cellules tumorales ce qui ne mime pas la vrai localisation anatomique de la lésion tumorale. De plus, dans la plupart des cas les vaccins anti-cancéreux sont administrés par voie systémique et induisent une réponse antitumorale avec un effet thérapeutique au niveau du compartiment systémique. La réponse antitumorale induite par ces vaccins au niveau du microenvironnement tumoral et ses effets antitumoraux sur des modèles orthotopiques n’ont jamais été décrits sur des modèles pré cliniques. Comme la majorité des tumeurs humaines se développe dans des localisations muqueuses, nous avons étudié l’effet de la voie d’immunisation dans l’induction des réponses antitumorales au niveau du site anatomique de la tumeur en comparant l’induction de LT CD8+ spécifiques de l’antigène tumoral après une vaccination par voie systémique (intramusculaire) ou muqueuse (intranasale). Cette stratégie de vaccination repose sur l’utilisation d’un vecteur non réplicatif qui cible les antigènes in vivo aux cellules dendritiques et qui a été développé au sein de notre unité. Il s’agit de la sous unité B de la toxine de Shiga (STxB) associée à un antigène tumoral (protéine E7 de l’HPV16) nous avons également analysé l’effet antitumoral de cette vaccination sur deux modèles de tumeurs orthotopiques à localisations ORL et pulmonaires exprimant l’antigène E7. Nous avons montré que la vaccination i.n. induisait une plus forte réponse LT-CD8+ spécifique et des effets antitumoraux au niveau des localisations muqueuses que la vaccination par voie systémique, et que cette immunisation par voie i.n. induisait un phénotype particulier sur ces LT-CD8+ spécifiques et en particulier une augmentation de l’expression des intégrines CD103 et CD49a en opposition à la voie systémique. L’inhibition de CD49a réduit l’effet thérapeutique de la vaccination par voie i.n. et le nombre de LT-CD8+ infiltrant les tumeurs orthotopiques. Nos résultats montrent que la réponse LT-CD8+ systémique ne sert pas comme marqueur prédictif de la qualité de la réponse immunitaire antitumorale au niveau local. Nos observations mettent en évidence l’existence d’une compartimentalisation de la réponse muqueuse antitumorale, une découverte capitale pour le développement rationnel des vaccins anti cancer / Recent clinical trials have shown the therapeutic benefits of new promising immunotherapies (Sipoleucel T for prostate cancer, Ipilimumab in melanoma…). But by far, the majority of cancer vaccine clinical trials have shown modest clinical effects on cancer patients, contrasting with results found in preclinical models. Those preclinical models of cancer rely on subcutaneous grafts of tumor cells which do not mimic the true anatomic location of tumor lesions. In addition, in most cases cancer vaccines are administrated by systemic route, eliciting systemic antitumor responses and therapeutic effects. The antitumor response elicited by those vaccine strategies at the local environment of tumor location and their antitumor effect on orthotopic tumor models has not yet been addressed in preclinical cancer models. Since the majority of human tumors develop at mucosal surfaces, we addressed the question of the effect of the immunization route in the induction of local mucosal antitumor CD8+T cell responses by comparing a systemic intramuscular (i.m.) and intranasal (i.n.) route of administration of cancer vaccine. This vaccine consists of a non-replicative vaccine strategy that targets tumor antigen in vivo to dendritic cells developed at our laboratory and composed of the B subunit of the Shiga toxin (STxB) associated to a tumor antigen (E7 protein of HPV16). We also analyzed the antitumor effect of these vaccinations on two mucosal orthotopic tumor models of head and neck and lung cancer expressing the E7 antigen. We found that intranasal vaccination induced stronger specific CD8+T cell responses and antitumor effects at mucosal sites than systemic immunization, and, that mucosal vaccination induced a mucosal imprinting phenotype on mucosal derived antigen specific T cells as they expressed the mucosal integrins CD103 and CD49a, as opposed to systemic specific CD8+T cells or tumor infiltrating T cells in subcutaneous tumors. Inhibition of CD49a reduced the antitumor efficacy of the nasal vaccine and the number of tumor infiltrating CD8+T cells on orthotopic mucosal tumors. Our results showed that systemic antigen-specific T cell responses as typically assessed did not predict the quality of local mucosal immune response. Our observations provide direct evidence for the compartmentalization of mucosal tumor immunity, a critical finding for the rational design of better cancer vaccines

Le mélanome, la tumeur cutanée la plus agressive, est devenu un problème majeur de santé publique dans de nombreux pays. Diagnostiqué précocement, il peut être traité par excision chirurgicale, mais le pronostic pour les mélanomes plus avancés est très mauvais car cette tumeur est résistante à toutes les thérapies utilisées à ce jour. Dans le but de développer de nouvelles thérapies pour traiter cette tumeur, nous étudions les voies de signalisation qui jouent un rôle prépondérant dans la prolifération, la survie et la différenciation des mélanocytes et des mélanomes. Il s’agit de la voie des MAPK, la voie PI3K et la voie de l’AMP cyclique (AMPc). Nous avons tout d’abord démontré que certaines phosphodiestérases (PDE ; les inhibiteurs physiologiques de la voie de l’AMPc) sont surexprimées dans les lignées de mélanomes et inhibent ainsi la différenciation de ces cellules. La surexpression des PDEs est nécessaire à la transformation des mélanocytes par l’oncogène Ras alors que la réactivation de la voie de l’AMPc dans les lignées de mélanome inhibe leur prolifération. Ces données suggèrent qu’une stratégie thérapeutique qui aurait pour objectif de stimuler la différenciation des mélanomes en réactivant la voie de l’AMPc pourrait permettre d’inhiber leur prolifération. Nous avons par ailleurs montré que la protéine kinase B-Raf, qui est fréquemment mutée dans les mélanomes, était cependant inactivée dans les mélanomes contenant une mutation de Ras. Nous avons démontré que cette inhibition était due à une régulation négative de B-Raf par son substrat Erk. En effet, Erk phosphoryle B-Raf sur sa partie amino-terminale pour empêcher son interaction avec Ras. Ce mécanisme de régulation négative de B-Raf force ces lignées de mélanomes à utiliser l’isoforme C-Raf. Ce travail a des conséquences sur le traitement du mélanome. En effet, si B-Raf n’est pas utilisé pour l’activation de la voie des MAPK dans les mélanomes mutés N-Ras, les inhibiteurs de B-Raf en développement clinique seront inefficaces dans ces cancers. Nous avons par ailleurs démontré qu‘un inhibiteur des kinases B-Raf et C-Raf, en développement clinique (Sorafenib), induisait l’activation de ces kinases par hétérodimérisation en régulant leur phosphorylation. Ces résultats mettent en évidence de nouveaux mécanismes de régulation des proto-oncogènes B-Raf et C-Raf qui pourraient jouer un rôle important dans la résistance des mélanomes aux inhibiteurs de Raf qui sont actuellement en développement clinique. / Melanoma, the most aggressive skin tumor, has become a major public health problem in many countries. Diagnosed early, it can be treated by surgical excision, but the prognosis for advanced melanoma is very poor because the tumor is resistant to all therapies used today. In order to develop new therapies to treat this tumor, we study the signaling pathways that play a major role in the proliferation, survival and differentiation of melanocytes and melanoma. These are the MAPK, PI3K pathway and the cyclic AMP (cAMP). We first demonstrated that some phosphodiesterases (PDEs; physiological inhibitors of cAMP pathway) are overexpressed in melanoma lines and thus inhibit the differentiation of these cells. Overexpression of PDEs is necessary for melanocyte transformation by oncogenic Ras when the reactivation of the cAMP pathway in melanoma lines inhibits their proliferation. These data suggest a therapeutic strategy that would aim to stimulate the differentiation of melanoma by reactivating the cAMP pathway could help to inhibit their proliferation. We have also shown that the protein kinase B-Raf, which is frequently mutated in melanoma, however, was inactivated in melanomas containing a mutation of Ras. We demonstrated that this inhibition was due to a downregulation of B-Raf by Erk substrate. Indeed, Erk phosphorylates B-Raf on its amino-terminal to prevent its interaction with Ras. This negative regulatory mechanism of B-Raf melanoma is forcing these lines to use isoform C-Raf. This work has implications for the treatment of melanoma. Indeed, if B-Raf is not used for the activation of MAPK in N-Ras mutated melanoma, the B-Raf inhibitors in clinical development will be ineffective in these cancers. We also demonstrated that a kinase inhibitor of B-Raf and C-Raf, which is in clinical development (Sorafenib), induces the activation of these kinases by heterodimerization in regulating their phosphorylation. These results reveal new mechanisms of regulation of proto-oncogene B-Raf and C-Raf, which could play an important role in the resistance of melanoma to Raf inhibitors, which are currently in clinical development.

Le développement du parasite Plasmodium falciparum, responsable du paludisme, nécessite la synthèse de phospholipides et plus particulièrement de phosphatidylcholine (PC) et phosphaditylethanolamine (PE) qui représentent environ 85% de la totalité des phospholidipes du parasite. Leur synthèse s'effectue principalement par les voies métaboliques de novo, voies de Kennedy, en trois étapes enzymatiques. Les enzymes CTP: phosphoethanolamine cytidylyltransferase (ECT) et CTP: phosphocholine cytidylyltransferase (CCT) catalysent les étapes limitantes des deux voies de biosynthèse de la PE et de la PC, respectivement. Ces deux enzymes sont essentielles à la survie du parasite murin, P. berghei et représentent ainsi des cibles thérapeutiques potentielles. La PfCCT est constituée de deux domaines cytidylyltranférases (CT) répétés alors que l'enzyme homologue chez l'homme est composée d'un seul domaine. En revanche, pour la ECT, la présence de deux domaines CT est retrouvée chez toutes les espèces mais les analyses de séquences et de structures ont montré que des résidus importants du site catalytique liant le substrat n'étaient pas conservés dans le domaine CT C-terminal de la PfECT. Ce travail a eu pour but de déterminer les propriétés enzymatiques et les caractéristiques cellulaires de la PfECT et de la PfCCT. Les paramètres cinétiques de ces enzymes ont été quantifiés in vitro à l'aide protéines recombinantes ainsi que sur les enzymes endogènes à l'aide d'extraits parasitaires. Grâce à l'utilisation de protéines recombinantes ponctuellement mutées, nous avons montré que seul le domaine CT N-terminal de la PfECT est catalytiquement actif. Chez P. falciparum, la PfECT et la PfCCT sont exprimées tout au long du cycle intra-érythrocytaire du parasite. La PfECT est présente dans la fraction soluble du parasite alors que la PfCCT apparait aussi bien dans la fraction soluble qu'insoluble. Des expériences d'immunofluorescence ont montré que la PfECT est cytosolique. L'ensemble des résultats présentés apportent un éclairage important sur les fonctions et les propriétés de ces deux cibles potentielles et constituent les premières étapes indispensables à l'élaboration d'une approche thérapeutique. / Phospholipids are essential for the growth and development of Plasmodium falciparum malaria parasite. Phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE) are its major structural phospholipids. This study focused on CTP: phosphoethanolamine cytidylyltransferase (ECT) and CTP: phosphocholine cytidylyltransferase (CCT) that catalyzes the rate-limiting steps of the de novo Kennedy pathways for PE and PC biosynthesis respectively. Both ECT and CCT are essential in the rodent malaria parasite P. berghei and constitute potential chemotherapeutic targets to fight against malaria. PfCCT consists of two very similar cytidylyltransferase (CT) domains whereas the human enzyme consists of only one CT domain. The presence of two CT domains in ECT seems to be widespread in all the organisms. Sequence and structural analysis showed that the C-terminal CT domain of ECT lacks key residues in the substrate binding motif. This study aimed at unravelling the enzymatic properties and cellular characteristics of PfECT and PfCCT enzymes. In addition, these studies addressed the key question if C-terminal CT domain of PfECT is catalytically active. Kinetic parameters of the enzymes were evaluated in vitro on native proteins as well as on recombinant proteins, the latter being produced in bacterial system. Cellular characterisation studies using polyclonal antisera showed that PfECT and PfCCT are expressed throughout the intra-erythrocytic life cycle of the parasite. PfECT is found mainly in soluble form in the parasite while PfCCT is present in soluble as well as insoluble forms in the parasite. Furthermore, immunofluorescence studies for PfECT revealed that it is mainly cytosolic. To assess the contribution of each CT domain to overall PfECT enzyme activity, recombinant PfECT mutants were generated by site-directed mutagenesis. Kinetic studies on these mutants indicated that the N-terminal CT domain was the only active domain of PfECT. Collectively, these results bring new insights into the kinetic and cellular properties of the enzymes and will pave the way in developing a future pharmacological approach.

Les leishmanioses sont des maladies tropicales négligées provoquées par un protozoaire parasite du genre Leishmania, et transmises par un insecte vecteur, le phlébotome. Les leishmanioses menacent 310 millions de personnes dans 98 pays à travers le monde. Les traitements antileishmaniens actuels sont limités et présentent des problèmes majeurs de toxicité et d'émergence de chimiorésistance. Dans ce contexte, il est nécessaire de développer de nouveaux agents antileishmaniens spécifiquement dirigés contre une cible thérapeutique chez le parasite. La GDP-Mannose Pyrophosphorylase (GDP-MP) est une cible thérapeutique essentielle à la survie du parasite à la fois in vitro et in vivo. Plusieurs différences ont été identifiées dans le site actif de GDP-MPs leishmaniennes par rapport à l'enzyme humaine, montrant ainsi l'intérêt de cette cible thérapeutique dans le développement de nouveaux traitements contre la leishmaniose. La GDP-MP catalyse la synthèse du GDP-mannose, la forme activée du mannose, brique moléculaire importante dans les processus de glycosylation et la synthèse de glycoconjugués essentiels à la reconnaissance hôte-parasite. Ce travail de thèse a consisté à produire et purifier les GDP-MPs de 3 espèces de parasites (Leishmania infantum, Leishmania donovani et Leishmania mexicana) ainsi que l'homologue humaine dans le but de comparer leurs propriétés enzymatiques. A partir d'inhibiteurs potentiels conçus et synthétisés sur la base de modèles moléculaires de GDP-MPs leishmaniennes et humaine, 100 composés ont été évalués sur les enzymes purifiées et sur les parasites in vitro. Cette analyse nous a permis de sélectionner des composés spécifiquement dirigés contre la cible du parasite et présentant une activité antileishmanienne. Nous avons également initié une étude de l'expression et de la localisation de la GDP-MP après traitement par les composés les plus intéressants. Ces composés pourront par la suite être utilisés comme outils pharmacologiques pour le développement de nouveaux agents antileishmaniens spécifiques. / Leishmaniases are Neglected Tropical Disease (NTD)caused by a protozoan parasite of the genus Leishmania and transmitted by an insect vector, the phlebotomine sandfly. Leishmaniases threaten 310 millions people in 98 countries around the world. Current antileishmanial treatments are limited and present major issues of toxicity and drug resistance emergence. In this context, it is necessary to develop new specific antileishmanial drugs specifically directed against a therapeutic target in the parasite.The GDP-Mannose Pyrophosphorylase (GDP-MP) is a therapeutic target which has been described to be essential for parasite survival both in vitro and in vivo. Several differences have been identified in the active site of leishmanial GDP-MPs compared to the human counterpart, showing the prominence of this therapeutic target in the development of new treatments against leishmaniasis. The GDP-MP catalyzes the synthesis of GDP-Mannose,the activated form of mannose, an important molecular constituent of the glycosylation processes involved in the biosynthesis of glycoconjugates which are essential for host-parasite recognition. My thesis work consisted in the production and purification of GDP-MPs from 3 Leishmania species (Leishmania donovani,Leishmania infantum and Leishmania mexicana)and from humanin order to compare their enzymatic properties. From potential inhibitors designed and synthesized on the basis of leishmanial and human GDP-MP molecular models, 100 compounds were evaluated on purified enzymes and on parasites in vitro. These analyses allowed us to select some compounds which are specifically directed against the parasite target and presenting antileishmanial activities. We have also initiated a study of expression and localization of GDP-MP after treatment with the most potent compounds. These compounds will be used as pharmacological tools for the development of new specific antileishmanial drugs.

Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie dégénérative liée à une résistance des tissus à l’insuline et à la mort des cellules β-pancréatiques. Il touche près de 400 millions de personnes dans le monde. Les traitements actuels sont symptomatiques et présentent soit des effets secondaires importants soit peu d’effet sur la réduction de la mortalité ou des complications cardiovasculaires. L’agrégation du peptide amyloïde hIAPP (human Islet Amyloid PolyPeptide) est impliquée dans la destruction des cellules β-pancréatiques. A l’état pathologique, hIAPP adopte une conformation en feuillets β, conduisant à son agrégation en formant des oligomères toxiques responsables de la mort des cellules β-pancréatiques. Bloquer cette agrégation est une voie à explorer pour un traitement étiologique du DT2. Des peptides et des peptidomimétiques de type azapeptide, basés sur les séquences peptidiques clés impliquées dans la structuration de hIAPP agrégé, ont été conçus rationnellement dans le but d’interagir avec le peptide de manière sélective et d’inhiber son agrégation. Le développement de différentes voies de synthèse des azapeptides contenant 2 acides aza-aminés consécutifs a été réalisé. L’activité anti-fibrillation des composés a été évaluée par fluorescence à la Thioflavine-T et par microscopie électronique en transmission. Pour les composés les plus prometteurs, l’activité anti-oligomérisation a été évaluée par électrophorèse capillaire et par spectrométrie de masse à mobilité ionique. Ce travail a ainsi permis de développer des composés peptidomimétiques originaux, présentant une activité inhibitrice prometteuse de l’agrégation du peptide amyloïdogénique hIAPP, impliqué dans le diabète de type 2. / Type II diabetes (T2D) is a degenerative disease linked to insulin resistance and pancreatic β-cells death. Worldwide, approximately 400 million people currently have T2D. Actual treatments are symptomatic and have either significant side effects or little effect on reducing mortality or cardiovascular complications. The aggregation of hIAPP peptide (human Islet Amyloid PolyPeptide) is involved in pancreatic β-cells destruction. At the pathologic state, hIAPP adopt a β-sheet rich conformation, leading to its aggregation forming toxic oligomers responsible of pancreatic β-cells death. Blocking this aggregation is a way to explore for etiological treatment of T2D. Peptides and peptidomimetics of azapeptide type, based on key sequences linked to the structuration of aggregated hIAPP, have been rationally designed, to interact with the peptide in a selective manner, and to inhibit its aggregation. The development of different synthetic routes to prepare azapeptides containing 2 consecutive aza-amino acids, have been performed. The anti-fibrillization activity of the compounds have been evaluated by Thioflavin-T fluorescence and by transmission electronic microscopy. For the most promising compounds, the anti-oligomerization activity has been evaluated by capillary electrophoresis and by Ion mobility spectrometry-mass spectrometry. Thus, this work allowed to develop original peptidomimetic compounds displaying a promising inhibitory activity of hIAPP peptide aggregation, involved in type II diabetes.

Les cancers de l’ovaire présentent un taux de survie à 5 ans inférieur à 40% et constituent la principale cause de décès par cancer gynécologique dans le monde. Ce sombre pronostic s’explique par un diagnostique tardif (du à un développement asymptomatique dans les premiers stades) et une résistance aux traitements existants et souligne la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques. La découverte ces dernières années, d’un nombre important de lncRNAs a permis d’ouvrir de nouvelles perspectives pour la recherche en oncologie. Peu d’études ont à ce jour exploré leur implication dans la chimiorésistance, a fortiori dans les cancers de l’ovaire. Parmi ces lncRNAs, ‘UCA1’ exerce de multiples fonctions oncogéniques par des mécanismes encore peu décrits. Son expression constitue un facteur de mauvais pronostique dans diverses tumeurs malignes dont les cancers de l’ovaire. Nous avons pu démontrer un rôle de ceRNA pour le miR-27a-5p, qui une fois libéré suite à l’inhibition d’UCA1, régule négativement UBE2N, une cible directe. UBE2N est un acteur connu des voies de réparation de l’ADN et de la régulation de la voie NF-kB, et son inhibition dans nos modèles entraîne une augmentation de l’expression de BIM et perturbe les mécanismes de réparation de l’ADN, sensibilisant des cellules cancéreuses ovariennes à l’action des sels de platine et des PARPi. L’inhibition d’UBE2N sensibilise également aux sels de platine plusieurs cultures organoïdes tridimensionnelles dérivées de patientes, et pourrait ainsi constituer une stratégie thérapeutique innovante pour lutter contre la chimiorésistance dans le cancer de l'ovaire. / Ovarian cancers present a 5-year survival rate of under 40% and are the leading cause of death from gynecological cancer worldwide. This poor prognosis is explained by a late diagnosis (due to asymptomatic development in the early stages) and resistance to existing treatments and highlights the need to develop new therapeutic approaches. The discovery in recent years of a significant number of lncRNAs has opened up new opportunities for oncology research. Few studies have so far explored their involvement in chemoresistance, let alone ovarian cancer. Among these lncRNAs, 'UCA1' performs multiple oncogenic functions through mechanisms not yet well described. Its expression is a factor of poor prognosis in various malignant tumours including ovarian cancers. We were able to demonstrate a role of ceRNA for miR-27a-5p, which when released following the inhibition of UCA1, negatively regulates UBE2N, a direct target. UBE2N is a known actor in DNA repair pathways and NF-kB pathway regulation, and its inhibition in our models leads to an increase in BIM expression and disrupts DNA repair mechanisms, sensitizing ovarian cancer cells to the action of platinum salts and PARPi. The inhibition of UBE2N also sensitizes to platinum salts, several three-dimensional organoid cultures derived from patients, thus may provide an innovative therapeutic strategy to combat chemoresistance in ovarian cancer.