Introduction : L’hémophilie B (HB) est une maladie hémorragique héréditaire caractérisée par un déficit en facteur IX (FIX) de la coagulation. La thérapie génique de l’HB par injection de virus adéno-associés (AAV) montre des résultats prometteurs, mais entraine une toxicité hépatique à forte dose. La création de nouveau transgène de FIX permettant d’injecter de moindres doses d’AAV est un réel enjeu. Matériel et Méthodes : Des transgènes thérapeutiques exprimant une protéine humaine de FIX à demi-vie prolongée par fusion à l’albumine (hFIX-Alb) ou exprimant un FIX une activité spécifique augmentée, le hFIX-E410H, ont été créés et injectés à des modèles murins. Une nouvelle molécule recombinante de hFIX à demi-vie prolongée par fusion à la sous-unité B du FXIII via un linker clivable par le facteur X activé (hFIX-LXa-FXIIIB) a été crée, produite et caractérisée. Résultats : Le transgène hFIX-Alb n’accumulait pas le niveau plasmatique du FIX par rapport au FIX sauvage. Des expériences ont été entreprises pour comprendre les mécanismes responsables du défaut d’expression. Le transgène hFIX-E410H, montrant une activité spécifique augmentée in vitro et in vivo chez les souris HB, permettait de diminuer les doses d’AAV d’environ 2,5 fois. La molécule hFIX-LXa-FXIIIB était fonctionnelle, corrigeait la génération de thrombine chez les souris HB, et présentait une demi-vie augmentée 3,9 fois chez la souris et 2,3 fois chez le rat. Conclusion : Nous avons développé et caractérisé de nouveaux transgènes de FIX modifiés et une nouvelle molécule de FIX à demi-vie prolongée, qui pourraient constituer de nouvelles perspectives thérapeutiques de l’HB / Introduction: Haemophilia B (HB) is an inherited bleeding disorder due to coagulation factor IX (FIX) deficiency. Adeno-associated virus (AAV)-based gene therapy for HB has shown promising results but can cause liver toxicity after administration of high dose of AAV vectors.The design of new transgene expressing modified FIX that would allow injecting fewer doses of AAV is a real challenge. Materials & Methods: Therapeutic transgene expressing human FIX with prolonged half-life due to fusion to mature albumin (hFIX-Alb) or expressing FIX with improved specific activity, hFIX-E410H, were designed and injected to murine animal model. A novel recombinant FIX molecule exhibiting enhanced half-life through fusion to the FXIIIB subunit via activated factor X-cleavable linker was design, produced and characterised. Results: The hFIX-Alb transgene did not increase the plasma FIX clotting activity compared to the transgene expressing wild-type hFIX. Experiments were undertaken to understand the mecanisms responsible for lower expression. The hFIX-E410H transgene, which showed improved specific activity in vitro and in vivo in HB mice, allowed injecting a 2.5-fold lower dose of AAV. The hFIX-LXa-FXIIIB molecule was functional, corrected the generation capacity in HB mice, and exhibited a 3.9-fold and 2.2-fold enhanced half-life in mice and in rats, respectively, compared to wild-type FIX. Conclusion: We have developed and characterised new transgenes expressing modified FIX, and a novel FIX molecule with prolonged half-life, which could become interesting perspectives for the treatment of HB

Les dystrophies rétiniennes héréditaires (DRH) sont un ensemble de pathologies rétiniennes incurable provoquant la cécité. Les DRH sont caractérisées par le dysfonctionnement/dégénérescence des photorécepteurs et le remodelage de la structure de la rétine. Une des approches thérapeutiques envisagées pour traiter les DRH est la thérapie génique spécifique, c’est à dire le remplacement du gène défectueux par un gène sain. Cependant, bien qu’efficace, la thérapie génique spécifique n’est pas toujours applicable, en particulier quand la dégénérescence est trop avancée ou quand le gène muté n’est pas connu. Afin de traiter tous les cas de DRH quelle que soit leur origine génétique et leur stade de progression, une approche de thérapie génique d’addition est envisagée : Le transfert d’optogène. Cela consiste à convertir les cellules encore présentes dans la rétine malgré la dégénérescence, en cellule photosensible suite à l’expression d’un optogène (protéine photosensible). Mon projet de thèse a consisté dans un premier temps à évaluer le transfert de gène avec un vecteur AAV2/2 dans les cellules ganglionnaires rétiniennes de chien et de primate non-humain. Cette première partie a permis d’initier un second projet qui a eu pour objectif d’évaluer l’efficacité du transfert d’optogène (Channelrhodopsin-2) pour la restauration de la fonction visuelle dans un modèle canin de dystrophie rétinienne (le chien Rpe65- /-). / Inherited retinal dystrophies (IRD), a group of incurable retinal pathologies, are associated with visual impairments due to a malfunction and/or degeneration of photoreceptors and/or retinal pigment epithelium (RPE). Significant progress in the field of gene therapy has allowed the development and the characterization of an innovative tool to treat IRD patients: recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) that carry and deliver therapeutic nucleic acids. However, due to the heterogenic nature of IRD, gene supplementation will not allow to treat all forms of IRD because: (i) the numbers of mutated genes are unknown according to the state of art; (ii) the dominant forms of IRD in which mutations lead to negative effects are not eligible; (iii) the limit of AAV packaging excludes large-sized mutated genes and (iv) this approach is only applicable when photoreceptors are still alive. To treat all IRD patients, a novel therapeutic approach, independently of the mutated gene and the disease kinetic is suitable: the optogene transfer (light-sensitive protein) to restore photosensitivity in neurodegenerative retina by converting surviving retinal cells into photosensors. The primary goal of my research was to promote and characterize adeno-associated virus type 2-(AAV2) transduction in retinal ganglion cells of dog and non-human primate. A second aim was to investigate the feasibility of AAV2-mediated optogenes transfer in retinal ganglion cells as a therapeutic approach to restore visual function in RPE65 deficient dog, a canine model of IRDs.

Le Syndrome de Wolfram (SW; OMIM #222300, prévalence 1-9 / 1000 000) est une maladie neurodégénérative, qui se présente avec un début juvénile, intégrant le diabète insipide, diabète sucré, l’atrophie optique (AO), et la surdité. AO est généralement son premier symptôme neurologique, commençant à l’âge de 11 ans et se terminant par la cécité 8 ans plus tard. Malheureusement, un modèle murin du SW approprié aux symptômes ophtalmologiques n'a pas encore été trouvé, donc la recherche de la thérapie pour sauver la vision en est à ces débuts. Dans cette thèse j’ai étudié l’atteinte visuelle de deux modèles de souris mutantes pour le SW et succès d’une approche de thérapie génique (TG) avec le gène humain WFS1.Premièrement, les souris Wfs1exon8del sont été examinées à 3 et 6 mois pour l’acuité visuelle (AV) et la sensibilité aux contrastes (SC) via changements dans le reflexe optomoteur (ROM), la fonction rétinienne neurale par électrorétinogramme (ERG), ainsi que la physiologie de l’œil par la fondoscopie et tomographie par cohérence optique (TCO). De plus, la proportion des cellules ganglionnaire de la rétine (CGRs) et la perte axonale dans le nerf optique (NO) à 7 mois ont été examinés avec marquage anti-Brn3a et microscopie électronique, respectivement. Il y avait une perte progressive de l’AV et la SC chez les souris KO à partir du 1 mois. Elle était accompagnée d'une pâleur du disque optique (DO), d'amincissement de la rétine ainsi que des lésions axonales. Par contre, il n’avait pas de perte des CGRs ni stress du réticulum endoplasmique dans la rétine. Brièvement, les souris KO présentent un phénotype ophtalmique du SW significatif et peuvent servir comme modèle.Deuxièmement, à la recherche d'un autre modèle du SW, les fonctions visuelles de la lignée Wfs1E864K de la souris ont été étudiées. Déjà à 1 mois, les souris Wfs1E864K/E864K avait une perte drastique de la fonction des CGRs, mais en gardant le nombre de cellules à un niveau normal. Ceci a été accompagné par un amincissement de la rétine et d’un sévère dommage du NO, comme montré par le TCO et la fondoscopie, respectivement. En conséquence, les souris Wfs1E864K/E864K, avec leur fort phénotype ophtalmique, pourraient servir comme modèle du SW classique.Enfin, pour enquêter sur les futures options de traitement contre le SW, les souris de la lignée Wfs1exon8del à 1 mois ont subi une TG intravitréenne avec AAV-2/2-CMV-WFS1. Les examens à 3 et 6 mois ont montré une amélioration de l’AV, ainsi que le sauvetage de la pâleur du DO et réduction des lésions axonales chez les souris KO. En outre, aucun effet indésirable lié à des injections TG n’ont été noté. Suivant cette idée, les souris Wfs1E864K/E864K ont également été soumis à la TG intravitréenne, délivrée à P14, mais sans succès.En conclusion, la lignée Wfs1exon8del de la souris est un modèle fiable du SW, y compris les aspects visuels. Je propose le modèle Wfs1E864K/E864K comme une alternative, en particulier pour enquêter sur la fonction de Wfs1 dans l'œil. Enfin, la GT intravitréenne avec WFS1 a un potentiel pour sauver partiellement le phénotype ophtalmique, ouvrant la voie vers le traitement pour les patients du SW / Wolfram Syndrome (WS; OMIM #222300, prevalence 1-9 / 1 000 000) has a juvenile onset and incorporates diabetes insipidus, diabetes mellitus, optic atrophy (OA), and deafness; leading to death in middle age. OA is its first neurological symptom, starting in adolescence and ending with blindness within 8 years. Unfortunately, a suitable WS mouse model comprising ophthalmologic symptoms has not yet been found, therefore the search for its treatment is delayed. In this thesis, I studied visual impairment in two WS mouse models along with a success of a gene therapy (GT) approach with the human WFS1 gene.Firstly, 3 and 6 months old Wfs1exon8del mice were examined for the visual acuity (VA) and contrast sensitivity via changes in the opto-motor reflex (OMR), the neural retinal function via electroretinogram (ERG), as well as the eye physiology via fundoscopy and optic coher-ence tomography (OCT). Also, the proportion of retinal ganglion cells (RGC) and the axonal loss at the age of 7 months were determined with anti-Brn3a immuno-labeling of retinal sections and electron microscopy of optic nerve (ON) sections, respectively. There was a progressive loss of VA and contrast sensitivity in Wfs1exon8del-/- mice, starting already at 1 month of age. It was accompanied by optic disc pallor, retinal thinning as well as axonal damage. However, there was no RGC loss and the endoplasmic reticulum (ER) stress in the retina was at a normal level. It suggested a presence of another cause for the reported degeneration in KO mice; in opposition to what was proposed in the literature. I brief, KO mice exhibit significant WS ophthalmic phenotype.Secondly, in search for another model, visual functions of Wfs1E864K mouse line were investigated. This line was originally a model of Wolfram-like Syndrome, characterized by dominant mutations in WFS1 leading to congenital progressive hearing impairment, diabetes mellitus and OA. Only homozygous mutants, however, showed expected visual impairment. Already at 1 month of age, Wfs1E864K/E864K mice had drastic loss of RGC function, albeit keeping the cell number at a normal level. This was accompanied by retinal thinning and a severe ON damage, as shown with OCT and fundoscopy, respectively. In contrast, the RGC function in Wfs1E864K/+ mice dropped slightly only at the age of 7 and 12 months, showing that the pathology of the E864K mutation-driven disease in mice is different than in humans. Therefore, Wfs1E864K/E864K mice, with their strong ophthalmic phenotype, could potentially serve as a model of the classical WS.Finally, to investigate future treatment options, 1 month old Wfs1exon8del+/+ (WT) and Wfs1exon8del-/- (KO) mice underwent a uni- and bi-lateral intravitreal gene therapy (GT) with AAV-2/2-CMV-WFS1. Exams at 3 and 6 months of age showed improved VA, as well as optic pallor and axonal damage rescue in KO mice. Also, no adverse effects related to either GT or sham injections were noted. Following this idea, the Wfs1E864K/E864K mice were also subjected to intravitreal GT, delivered at P14, but without success.In conclusion, Wfs1exon8del mouse line is a reliable model of WS, including the visual aspects. I propose the Wfs1E864K/E864K model as an alternative, especially to investigate Wfs1 function in the eye. Finally, the intravitreal AAV-driven GT with WFS1 has a potential to partially rescue the ophthalmic phenotype, paving the wave towards the treatment for WS patients.

L'électrotransfert est une technique de transfert de gène in vivo, permettant une expression<br />élevée du transgène dans un grand nombre de tissus. Dans ce contexte, nous avons utilisé l'imagerie<br />optique pour optimiser différents protocoles d'électrotransfert dans le muscle et la peau.<br />Nous avons développé un système de régulation de l'expression des gènes combinant le système<br />de régulation répressible à la tétracycline Tet-Off et une stratégie antisens. Nous avons examiné<br />le potentiel de l'électrotransfert d'ADN plasmidique pour l'obtention d'anticorps neutralisants à<br />haut titre contre les toxines botuliques A, B et E. Les animaux immunisés avec des plasmides<br />codant les fragments immunogènes des toxines expriment de façon endogène ces fragments de<br />toxines, qui servent d'antigènes et déclenchent une réponse immune. Nous avons finalement étudié<br />l'état de méthylation de l'ADN plasmidique après injection et électrotransfert dans le muscle<br />squelettique et sa possible intégration dans le génome.

Cette thèse montre les enjeux et les controverses liés au développement de la thérapie génique au Royaume-Uni. Adoptant une approche d'analyse des politiques publiques, elle décrit la mise sur agenda de la technique, pour des raisons thérapeutiques et économiques et en réponse à des questions éthiques et à un risque sanitaire. Le processus de réglementation adopté, sous la forme d'un réseau d'organismes de contrôle est décrit, avec les normes qu'il impose. Les éléments ayant favorisé sa mise en Œuvre et son développement sont présentés, ainsi que le rôle d'un ensemble d'acteurs publics et privés : initiatives gouvernementales, administrations décentralisées, agences de développement régional, entreprises pharmaceutiques et de biotechnologie, associations caritatives, académies scientifiques et médicales, hommes politiques et personnalités influentes. Les relations entre les différents acteurs sont mises en évidence ainsi que leur influence sur les décisions politiques. Une évaluation des effets des mesures gouvernementales et un bilan du développement de la thérapie génique dresse un état quantitatif et qualitatif des essais réalisés et analyse leurs répercussions sur l'opinion publique, à travers l'étude des médias et des sondages d'opinion. L'analyse, en 1990 et en 1995, des points de vue des acteurs concernés, qu'ils soient scientifiques, religieux ou membres de groupes d'intérêt, montre une évolution des mentalités. Mais si la thérapie génique somatique à des fins thérapeutiques est maintenant bien acceptée, son utilisation pour améliorer les caractéristiques de l'être humain, ainsi que la thérapie génique germinale et l'eugénisme restent des sujets controversés.

Cette thèse s'inscrit dans le cadre de la modélisation des interactions entre hôtes et auxiliaires de lutte biologique. L'objectif principal est de faire l'analyse mathématique et la simulation numérique des modèles spatiotemporels construits. Il s'agit de déterminer la typologie et la catégorisation des structures spatiales émergentes en fonction des paramètres de contrôle. Nous considérons dans la première partie de la thèse, une chaîne alimentaire de deux espèces, c'est à dire une population de proies et une population de prédateurs modélisées par un système de réaction-diffusion. Nous étudions l'analyse qualitatives des solutions, les bifurcations globales et locales, et déterminons les conditions de variation spatiales et temporales des motifs. Nous démontrons l'existence de "Travelling waves" par les outils d'analyse fonctionnelle en généralisant la méthode développée par S. Ahmad. Une étude mathématique similaire est menée dans le cadre d'une chaîne alimentaire de trois espèces constituée d'une proie, d'un prédateur et d'un super-prédateur. Le dernier chapitre de cette thèse est consacré à la construction et l'étude d'un modèle mathématique de type réaction-diffusion de la thérapie génétique du cancer. Le modèle prend en considération à la fois la dynamique de la population des cellules cancéreuses, des virus réplicatifs et de la réponse immunitaire qui reconnait les antigènes viraux dans les cellules cancéreuses. Nous établissons les conditions de stabilité de l'état d'équilibre endémique et celui correspondant à l'élimination de la tumeur. Si la tumeur ne peut pas être complétement guérie, nous déterminons les conditions d'une thérapie optimale et estimons par simulation le temps de survie du patient.

Deux différents types de vecteurs, les nanocapsules lipidiques (LNC) et les systèmes multimodulaires (MMS) ont été développés pour l'administration par voie systémique de deux types d'acides nucléiques, l'ADN et les petits ARN à interférence (siRNA). Ces vecteurs sont formulés à base de complexes d'acides nucléiques et de lipides cationiques (lipoplexes) qui ont été soit encapsulés au coeur des LNC, soit recouverts de stabilisateurs stériques afin de former des MMS. Une partie du travail a consisté à développer des vecteurs de siRNA et à les caractériser par des méthodes physico-chimiques. En fonction du lipide cationique utilisé, jusqu'à 65% de siRNA ont pu être encapsulés dans les LNC, en présentant des caractéristiques appropriées pour une administration par voie systémique. La seconde partie a consisté à approfondir la caractérisation des vecteurs d'ADN et à analyser leur profil de distribution en utilisant de l'imagerie par fluorescence in vivo. Chez la souris saine, les vecteurs d'ADN ont présenté des profils de biodistribution spécifiques à leur composition. Sur deux modèles tumoraux (gliome sous-cutané et mélanome), les vecteurs ayant un temps de circulation prolongé ont également montré une co-localisation intéressante avec les cellules tumorales. Afin de mettre en évidence l'efficacité de ces vecteurs, un plasmide codant pour la tymidine kinase du virus herpes simplex (HSV-tk) a été encapsulé et administré. Puis un traitement par le ganciclovir (GCV) basé sur l'approche par gène suicide a été effectué. Les premiers résultats sont concluants, montrant une baisse de croissance tumorale après quelques jours de traitement aussi bien dans le modèle de gliome que dans celui du mélanome. Ces résultats indiquent que ces outils sont prometteurs pour une variété d'applications en thérapie génique.

La chirurgie informatisée est une science nouvelle dont le but est de croiser la chirurgie avec les sciences de l’informatique afin d’aboutir à des améliorations significatives dans les deux domaines. Avec l’évolution des nouvelles techniques chirurgicales, une collaboration étroite entre chirurgiens et chercheurs est devenue à la fois inévitable et essentielle à l’optimisation des soins chirurgicaux. L’utilisation de modèles mathématiques est la pierre angulaire de ce nouveau domaine. Cette thèse démontre comment une approche systématique d’un problème clinique nous a amenés à répondre à des questions ouvertes dans le domaine chirurgical en utilisant des modèles mathématiques à grande échelle. De manière générale, notre approche inclut (i) une vision générale du problème, (ii) le ciblage du/des système(s) physiologique(s) à étudier pour y répondre, et (iii) un effort de modélisation mathématique, qui a toujours été poussé par la recherche d’un compromis entre complexité du système étudié et réalité physiologique. Nous avons consacré la première partie de cette thèse à l’optimisation des conditions limites à appliquer à un bio-réacteur utilisé pour démultiplier le tissu pulmonaire provenant d’un donneur. Un modèle géométrique de l’arbre trachéo-bronchique couplé à un modèle de dépôt de soluté nous a permis de déterminer l’ensemble des pressions à appliquer aux pompes servant le bio-réacteur afin d’obtenir une distribution optimale des nutriments à travers les cultures de tissus. Nous avons consacré la seconde partie de cette thèse au problème de resténose des greffes de veines utilisées pour contourner une occlusion artérielle. Nous avons reproduit l’apparition de resténose grâce à plusieurs modèles mathématiques qui permettent d’étudier les preuves cliniques et de tester des hypothèses cliniques avec un niveau croissant de complexité et de précision. Pour finir, nous avons développé un cadre de travail robuste pour tester les effets des thérapies géniques afin de limiter la resténose. Une découverte intéressante a été de constater qu’en contrôlant un groupe de gènes spécifique, la perméabilité à la lumière double après un mois de suivi. Grace aux résultats obtenus, nous avons démontré que la modélisation mathématique peut servir de puissant outil pour l’innovation chirurgicale. / Computational surgery is a new science that aims to intersect surgery and computational sciences in order to bring significant improvements in both fields. With the evolution of new surgical techniques, a close collaboration between surgeons and computational scientists became unavoidable and also essential to optimize surgical care. A large usage of mathematical models is the cornerstone in this new field. The present thesis shows how a systematic approach to a clinical problem brought us to answer open questions in the field of surgery by using mathematical models on a large scale. In general, our approach includes (i) an overview of the problem, (ii) the individuation of which physiological system/s is/are to be studied to address the question, and (iii) a mathematical modeling effort, which has been always driven by the pursue of a compromise between system complexity and closeness to the physiological reality. In the first part, we focused on the optimization of the boundary conditions to be applied to a bioreactor used to re-populate lung tissue from donor. A geometrical model of tracheobronchial tree combined with a solute deposition model allowed us to retrieve the set of pressures to be applied to the pumps serving the bioreactor in order to reach an optimal distribution of nourishment across the lung scaffold. In the second part, we focused on the issue of post-surgical restenosis of vein grafts used to bypass arterial occlusions. We replicated the event of restenosis with several mathematical models that allow us to study the clinical evidences and to test hypothesis with an escalating level of complexity and accuracy. Finally, we developed a solid framework to test the effect of gene therapies aimed to limit the restenosis. Interestingly, we found that by controlling a specific group of genes, the lumen patency is double after a month of follow-up. With the results achieved, we proved how mathematical modeling can be used as a powerful tool for surgical innovation.

Le cancer du col de l’utérus est le troisième cancer le plus fréquent chez la femme, dont l’agent étiologique majeur est l’infection par les papillomavirus humain (notamment HPV-16 et 18), qui sont de petits virus infectant les épithéliums muqueux et cutanés, et pouvant induire la formation de tumeurs. L’inducteur majeur du processus oncogène est le processus d’intégration des régions codantes pour les oncoprotéines E6 et E7, au sein de la cellule hôte suite à l’infection. Elles interférent avec le cycle cellulaire et induisent notamment l’immortalisation, voire la transformation des cellules. Les fonctions les plus connue de ces deux oncoprotéines sont la dégradation des suppresseurs de tumeur p53 et pRb, respectivement. Mon travail de thèse à consisté en la mise au point des vecteurs adénoviraux exprimant des miARN dirigés contre l’oncoprotéine E6. Exprimés in vitro ils induisent l’induction de la mort cellulaire par apoptose des cellules tumorales traitées, via l’activation de la voie de caspases, et in vivo permettent le ralentissement de la croissance de tumeurs xénogreffées à des souris Nude. De plus, la stratégie thérapeutique adénovirale a montré ses extensions possibles sur d’autres types de cancers HPV-positifs, mais également via l’expression de différentes moléculaires thérapeutiques, visant à empêcher l’interaction des oncoprotéines telles qu’E6 avec leurs partenaires cellulaires et ainsi les empêcher d’exercer les activités biologiques impliquées dans le développement de cancers. Pour finir, les adénovirus peuvent également être vu comme des outils d’extinction fonctionnels d’E6 et permettant d’étudier les répercutions sur d’autres processus cellulaires. / Cervical cancer is the third most common female cancer. Infection by human papillomavirus (mainly HPV-16 and 18), with tropisms for mucosal or cutaneous squamous surfaces, is the major etiological agent implicated in cancer and tumor development. After infection, the oncogenic process is triggered by integration of oncoproteins E6 and E7 coding regions into the host cell genome. After integration, these oncoproteins interfere with the cell cycle and induce immortalization and cellular transformation of normal cells. The best known function of these two oncoproteins is the degradation of tumors suppressors p53 and pRb respectively. My thesis project consisted in the development of adenoviral vectors expressing miRNA directed against E6 oncoprotein. Their in vitro expression resulted in cellular death by apoptosis of the treated tumor cells, and allowed reduction of tumor growth in vivo in nude mice xenografts. In addition, the adenoviral therapeutical strategy showed its possible extensions on other types of HPV-positive cancers, but also through the possible expression of different therapeutic molecules aimed at preventing the interaction of viral oncoproteins, such as E6, with their cellular partners. These abolished interactions prevent oncoproteins from exercising their biological activities implicated in the development of cancers. In conclusion, we can say that adenoviruses can also be seen as functional tools suppressing E6 and enabling to highlight the repercussions of its suppression on other cellular processes.

L’infarctus du myocarde est une cause majeure de morbidité et mortalité adulte dans les pays développés. Le manque de perfusion myocardique induit la mort des cardiomyocytes notamment par apoptose. Un remodelage moléculaire et cellulaire s’ensuit et comprend une hypertrophie des cardiomyocytes dans la zone péri-infarcie, de la fibrose, une réactivation des gènes fœtaux et des changements métaboliques. Ce remodelage entraîne à terme une diminution de fonction menant à la défaillance cardiaque. Les traitement médicamenteux améliorent la qualité de vie et la survie mais ne peuvent guérir. La thérapie hybride (cellulaire et génique) est une approche thérapeutique nouvelle et prometteuse pour l’infarctus du myocarde. C’est dans ce contexte que s’inscrivent les travaux de ma thèse. <p>Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont des cellules souches adultes de choix pour la thérapie cellulaire. Plusieurs études ont montré qu’elles participent à la cardioprotection et à la régénération du myocarde en sécrétant une myriade de facteurs de croissance et de cytokines aux effets pro-angiogéniques et anti-apoptotiques.<p>Le « stromal-derived factor-1 » (SDF-1) ou CXCL12 est une chimiokine produite par un grand nombre de cellules dont les CSM et les cardiomyocytes. Il est un ligand pour CXCR4 et CXCR7, 2 récepteurs de la famille des récepteurs liés aux protéines G. CXCL12a est un facteur critique pour la migration, la domiciliation et la survie des cellules souches de la moelle osseuse dans le myocarde infarci et pour la survie des cardiomyocytes. Dans l’infarctus aigu du myocarde, un délai entre la fenêtre temporelle d’activation du ligand et de son récepteur rend cet axe peu efficace. Dans les pathologies ischémiques chroniques, une altération de la signalisation CXCL12a/CXCR4 réduit ses effets bénéfiques.<p>Ces observations ont conduit au développement d’approches thérapeutiques ciblant l'axe CXCL12a/CXCR4. CXCL12a peut être administré seul, sa production peut être stimulée par la transplantation de cellules souches, enfin sa synthèse peut être augmentée dans le myocarde par thérapie génique ou par l’association d’une thérapie cellulaire et génique. La majorité des études montrent une amélioration du remodelage et de la fonction cardiaque associée essentiellement à une néovascularisation et un effet antiapoptotique. Cependant, les effets directs de CXCL12a sur les cardiomyocytes ne sont pas encore complètement élucidés.<p>L’objectif général de ce travail était de contribuer à la compréhension des mécanismes d’action de CXCL12a sur les cardiomyocytes néonataux de rat que celui-ci agisse seul ou dans le cadre d’une thérapie hybride.<p>Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié les effets non génomiques de CXCL12a en nous focalisant sur l’homéostasie calcique et ses conséquences fonctionnelles. Nous avons investigué la modulation des flux calciques par CXCL12a en chargeant le cytoplasme de cardiomyocytes néonataux de rat en culture avec le Fluo-4 acétoxyméthyl ester, indicateur fluorescent du niveau de calcium. CXCL12a augmente le calcium intracytoplasmique. La réponse calcique dépend de la liaison de CXCL12a à CXCR4 et majoritairement de l’ouverture des canaux calciques dépendants de l’inositol triphosphate (IP3Rs). Le flux calcique induit par la caféine (un agoniste des récepteurs à ryanodine) est diminué lorsque les IP3Rs sont bloqués. Ceci peut s’expliquer par une interaction entre ces 2 canaux. L’incubation avec le CXCL12a augmente in vitro la fréquence de battement des cardiomyocytes et cet effet est additif à celui de la forskoline (un activateur de l’adénylate cyclase). In vivo, l’administration intramyocardique de CXCL12a augmente le dP/dt max (indice de contractilité cardiaque) du ventricule gauche. <p>Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons étudié les effets génomiques de CXCL12a; le but de cette étude était double :(1) identifier de nouvelles voies de signalisation contribuant aux effets de CXCL12a sur les cardiomyocytes et (2) comparer les effets de CXCL12a administré seul aux effets du surnageant de CSM surexprimant CXCL12a. Nous avons construit le lentivirus pWXLd-CXCL12a-IRES-GFP pour transduire des CSM en culture. L’expression protéique de CXCL12a dans le surnageant des CSM transduites a été confirmée par ELISA et l’activité du CXCL12a a été vérifiée par le test à l’aequorine. Pour identifier de nouvelles voies de signalisation modulées à l’étage transcriptionnel, nous avons privilégié le microarray, méthodologie qui permet une approche globale sans à priori. Nous avons ensuite confirmé les résultats par une approche ciblée sur certains gènes par la technique de RTQ-PCR. Pour le microarray, les cardiomyocytes ont été incubés pendant 1 heure avec (a) du CXCL12a commercial &61480;&61493;µ&61517;&61481; dilué dans le milieu des cardiomyocytes sans FBS, (b) le milieu des cardiomyocytes sans FBS (échantillon témoin de a), (c) le surnageant de CSM transduites par le virus pWXLd-CXCL12a-IRES-GFP et (d) le surnageant de CSM transduites par le virus pWXLd-GFP (échantillon témoin de c). Un ensemble discret de 218 gènes correspondant à 0,63% du génome du rat étaient régulés. Parmi les 60 gènes communs rapidement modulés dans les deux conditions (a et c), 34 étaient sur-exprimés alors que 26 étaient sous-exprimés. L’analyse avec le logiciel David suggère que le CXCL12a seul à la dose de 5 μM ou présent dans le surnageant de CSM le surexprimant à la concentration d’environ 2 nM module des voies déjà connues comme la voie des MAPkinases et plusieurs voies liées à l’apoptose comme JAK/STAT, p53 et NOD ainsi que 2 nouvelles voies: le voie des adipocytokines et de PPAR. Par RTQ-PCR, nous avons confirmé la modulation positive par CXCL12a de JAK2 et AKT. De plus, CXCL12a réprime l’expression protéique de la LPL, l’expression génique de la FABP et de l’Angptl-4 et l’expression génique et protéique de l’adiponectine, protéines toutes impliquées dans le transfert des acides gras et leur β oxydation. <p>Nous avons ensuite investigué les effets génomiques de CXCL12a dans le cadre d’une thérapie hybride. L’analyse du microarray et l’analyse ciblée de quelques gènes ont permis de conclure que la modulation de l’expression génique dépend non seulement de la concentration en CXCL12a mais également de la présence d’autres facteurs soit issus directement du milieu de culture commercial des CSM soit issus du milieu conditionné des CSM.<p>Ce travail ouvre de nouvelles perspectives pour mieux comprendre le rôle de CXCL12a dans l’homéostasie calcique et le métabolisme des lipides et son impact dans la physiopathologie du cœur. De plus, ce travail appuie le fait que le développement clinique des thérapies hybrides doit être précédé d’une investigation complète des effets génomique et non génomiques de cette thérapie sur les cardiomyocytes. Cependant, il faut rester prudent car, à cause de l’environnement du myocarde sain ou malade, aucune étude fondamentale ne permet de prédire l’ensemble des effets in vivo.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished