Embora exista considerável progresso na área de biossensores, ainda é primordial aprimorar muitos desses dispositivos. Este trabalho tem por objetivo contribuir para o contínuo crescimento dos biossensores a base de enzimas e de moléculas de DNA, sendo dois biossensores eletroquímicos descritos. O primeiro trata-se de um biossensor enzimático utilizando tirosinase (Tyr) imobilizada por intermédio de cistamina (CYS) e glutaraldeído (GA) para a detecção de compostos fenólicos. Eletrodos de carbono impressos (SPCE) foram modificados com nanobastões de ouro (AuNRs) em filme de poli(amido amina) (PAMAM) geração 4 para o favorecimento da transferência direta de elétrons (DET) entre o eletrodo e o sítio ativo da enzima. Para caracterizar os AuNRs e AuNRs-PAMAM, espectroscopia de absorção no UV-Visível, espalhamento de luz dinâmico (DLS) e microscopia eletrônica de varredura (SEM) foram empregadas. As etapas do biossensor foram estudadas por voltametria cíclica e linear, amperometria e microscopia de força atômica (AFM) na presença de dois analitos: catecol (CAT) e dopamina (DA). A faixa linear para CAT foi de 2,8 a 30,3 μmol L-1 com um limite de detecção (LD) de 1,0μmol L-1 enquanto para a DA, a faixa linear foi de 27,8 a 448,7 μmol L-1 e LD de 10,0 μmol L-1. Além de apresentar ótima resposta frente a possíveis interferentes, o sensor também mostrou excelente desempenho em amostras reais, que atrelados aos testes de repetibilidade e reprodutibilidade mostram a estabilidade e acurácia do biossensor. O segundo sensor, trata-se de um sensor de DNA impedimétrico em eletrodo de ouro para a detecção da mutação c.68_69del relacionada à predisposição ao câncer de mama. A imobilização da sequência de captura (SH-ssDNA) no eletrodo ocorreu pela ligação ouro-enxofre (Au-S) e o modelo de hibridização escolhido foi a hibridização direta. O genossensor distinguiu eficientemente entre as sequências alvo (tarDNA) e não-complementar (ncsDNA), apresentando faixa linear de 1,0 a 200,0 nmol L-1 e LD de 0,14 nmol L-1. Os resultados sugerem que ambos biossensores têm potencial e que as estratégias propostas são promissoras para o desenvolvimento de outros biossensores. / Despite a considerable progress in the area of biosensors, it is still crucial to improve most of these sensors. This study aims to contribute to the ongoing growth of enzyme- and DNA-based biosensors, being described two electrochemical biosensors. The first one is an enzyme-based biosensor with immobilized Tyrosinase (Tyr), through cystamine (CYS) and glutaraldehyde (GA), for detection of phenolic compounds. Screen-printed carbon electrodes (SPCE) were modified by gold nanorods (AuNRs) stabilized with poly(amide amine) PAMAM generation 4 to facilitate direct electron transfer (DET) between electrode and enzyme active site. AuNRs and AuNRs-PAMAM were characterized using UV-Visible absorption spectroscopy, dynamic light scattering (DLS) e scanning electron microscopy (SEM). Biosensor stages were studied by cyclic and linear voltametry, amperommetry and atomic force microscopy (AFM) and tested agains two analytes: catechol (CAT) and dopamine (DA). Detection limit (LD) for CAT is 1 μmol L-1 and linear range from 2.8 to 30.3 μmol L-1, for DA, LD is 10.0 μmol L-1 and linear range 27.8 to 448.7 μmol L-1. Besides, the biosensor shows great response in the presence of interferents, it also had an excellent performance in real samples that along with repeatability and reproducibility tests indicate stability and accuracy of the biosensor. The second sensor is an impedimetric DNA sensor prepared on gold electrode to detect c.68_69del mutation related to breast cancer predisposition. Capture sequence (HS-ssDNA) immobilization occurred due to gold-sulfur bond (Au-S) and direct hybridization was the chosen hybridization model. The genosensor was able to distinguishing between target sequence (tarDNA) and non-complementary sequence (ncsDNA) and linear range and LD were found to be 1.0 to 200.0 nmol L-1 and 0.14 nmol L-1, respectively. Results suggest both biosensors have potential and proposed strategies are promising for other biosensors development.

Nesta dissertação, foram estudados os métodos de síntese de filmes poliméricos como matrizes hospedeiras da enzima tirosinase vislumbrando o desenvolvimento de biossensores mais seletivos e duradouros na detecção de compostos fenólicos. Os polímeros utilizados e preparados por cronoamperometria em acetonitrila foram: polipirrol (PPI), polimetiltiofeno (PMET) e copolímero PPI-PMET. Os filmes PPI-PMET apresentaram características intermediárias às dos filmes PPI e PMET, conforme se verificaram em espectros na região do infravermelho (FTIR), voltametria cíclica e microscopia de força atômica (AFM), evidenciando, assim, a formação de uma nova matriz polimérica. O processo de superoxidação do filme PPI-PMET foi estudado visando a uma imobilização mais eficiente da enzima, quando se obteve uma condição na qual a superoxidação ocorre somente nas cadeias de PPI. Biossensores amperométricos foram preparados a partir do uso da tirosinase extraída do abacate como fonte enzimática por imobilização física e realizada de maneiras diferentes em filmes não superoxidados e superoxidados. Foi feita a otimização das respostas dos filmes variando-se o pH, potencial de trabalho, concentração da enzima e tempo de imobilização da enzima para a detecção de catecol. Os resultados indicaram que a superoxidação do PPI nos filmes PPI-PMET favoreceu a imobilização da enzima, embora não fosse tão eficiente quando se comparou aos filmes com o PPI não superoxidado. Contudo, os biossensores, em geral, apresentaram grande sensibilidade ao catecol, com um limite de detecção baixo, da ordem de 0,12 µmol/L. / The synthesis methods of polymer films as host matrices of the enzyme tyrosinase were studied in this dissertation. It was expected the development of selective and everlasting biosensors for the detection of phenolic compounds. The used polymers were prepared by chronoamperometry in acetonitrile as followed: polypyrrole (PPI), polymethylthiophene (PMET) and copolymer PPI-PMET. The PPI-PMET films showed intermediate characteristics as the PPI and PMET films, as observed in the infrared spectra (FTIR), cyclic voltammetry and atomic force microscopy (AFM), thus indicating the formation of a new polymeric matrix . The process of overoxidized of PPI-PMET film was studied in order to achieve a more efficient immobilization of the enzyme, whilst it was achieved a condition in which overoxidized occurs only in the PPI chain. Amperometric biosensors were prepared from the use of tyrosinase extracted from avocado as an enzyme source by physical immobilization and performed in different ways in both overoxidized and non-overoxidized films. It was performed the optimization of the responses of the films by varying pH, operacuonial potential, enzyme concentration and time in the enzyme immobilization for the detection of catechol. The results showed that the overoxidized PPI in the films PPI-PMET favored the immobilization of the enzyme, although not as efficient when compared to the films with nom overoxidized PPI. Neverthless, the catechol biosensors showed a high sensitivity with a low detection limit in the order of 0.12 µmol/L.

Os problemas ambientais relacionados à crescente atividade industrial têm gerado preocupações aos órgãos governamentais e entidades de proteção ambientais, sendo necessários estudos de base que busquem novas alternativas para a recuperação de áreas poluídas e a solução de problemas operacionais relacionados com as técnicas empregadas. Um dos compostos mais encontrados em diversos efluentes industriais, principalmente de indústrias bioquímico-farmacêuticas, é o fenol que provoca um impacto danoso no ambiente devido ao fato de ser um poluente tóxico. O presente trabalho propõe, portanto, avaliar a oxidação e destruição do fenol através da utilização da enzima tirosinase extraída de vegetais, cujos resultados podem ser úteis para o tratamento de outros compostos fenólicos como o hormônio 17β-estradiol ou os que se encontram nos efluentes procedentes da produção de azeite (\"águas de vegetação\") após a recuperação dos polifenóis importantes como antioxidantes. A tirosinase tem a capacidade de transformar fenóis em produtos menos solúveis em água e menos danosos, permitindo assim uma agressão menor ao ambiente. Outro método de remoção do fenol também foi avaliado utilizando queratina extraída de penas de galinha, quitina e quitosana como bioadsorventes. A atividade enzimática foi determinada espectrofotometricamente com soluções de fosfato de potássio e L-tirosina. Para determinar a concentração de fenol aps a oxidação foi utilizada a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). Para estudar a adsorção do fenol aplicou-se o método colorimétrico a partir das soluções de tampão borato, 4 aminoantipirina e ferricianeto de potássio e as absorbâncias foram lidas em espectrofotômetro UV-Vis a 546nm, enquanto a determinação de polifenis presentes na \"água de vegetação\" foi realizada pelo método Folin-Ciocalteu. A quantidade de tirosinase nas batatas das variedades Ágata e Galette di Bologna apresentou-se muito baixa a ponto de modificarmos a matéria prima para testes em maçã, kiwi, banana e cogumelo, mas apenas o último mostrou uma atividade bastante considerável. Assim, esta matéria-prima foi usada em ensaios a diferentes temperaturas para a estimativa dos parâmetros termodinâmicos durante da oxidação do fenol e da inativação térmica da enzima. As melhores condições da oxidação do fenol com a enzima contida no extrato de cogumelo foram: 30°C, pH 6,6, concentração de enzima 328U/mL e de fenol 100mg/L. A queratina revelou-se o melhor adsorvente para a degradação do fenol tendo mostrado remoção de 98% do mesmo em condições ótimas. / Environmental problems related to growing industrial activity have generated concerns among government entities and environmental protection, being necessary more baseline studies that seek new alternatives for the recovery of polluted areas and solution of problems related to the operational techniques employed. One of the compounds most commonly found in many industrial effluents, mainly from biochemical and pharmaceutical industries, is phenol, which causes a detrimental impact on the environment due to its toxicity. Therefore, this work proposes the oxidation and destruction of phenol using the enzyme tyrosinase, extracted from plants, whose results could be useful in the future for the treatment of other phenolic compounds such as 17β-estradiol hormone or those found in the effluent coming from the production for olive oil (\"vegetation water\") after polyphenols recovery. Such an enzyme has the ability of transforming phenols into products less soluble in water and less dangerous, thereby allowing for a minor impact on the environment. Another method of phenol removal was also evaluated using keratin extracted from chicken feathers, chitin and chitosan as phenol biosorbents. Potassium phosphate buffer and L-tyrosine solutions were used for the determination of enzymatic activity, the high performance liquid chromatography (HPLC) for the determination of phenol concentration after oxidation, and a colorimetric method making use of solutions of borate buffer, 4-aminoantipyrine and potassium ferricyanide as well as reading of the absorbance at 546nm to investigate phenol biosorption, while the presence of polyphenols in \"vegetation water\" was determined by the Folin-Ciocalteu method. The presence of the tyrosinase in potato varieties Agata and Galette di Bologna was shown to be very low, thus suggesting to change the biosorbent material. So, additional tests were done on apples, kiwi, banana and mushroom, but only the last showed a considerable activity. Therefore, only such a raw material was used in tests at variable temperature to estimate the thermodynamic parameters of both phenol oxidation and thermsal inactivation of the enzyme. The optimum conditions for the phenol oxidation by tyrosinase were: 30°C, pH 6,6, enzyme concentration 328U/mL and of phenol 100mg/L. Keratin was shown to be the best adsorbent, exhibiting under optimum conditions no less than 98% phenol removal.

Os problemas ambientais relacionados à crescente atividade industrial têm gerado preocupações aos órgãos governamentais e entidades de proteção ambientais, sendo necessários estudos de base que busquem novas alternativas para a recuperação de áreas poluídas e a solução de problemas operacionais relacionados com as técnicas empregadas. Um dos compostos mais encontrados em diversos efluentes industriais, principalmente de indústrias bioquímico-farmacêuticas, é o fenol que provoca um impacto danoso no ambiente devido ao fato de ser um poluente tóxico. O presente trabalho propõe, portanto, avaliar a oxidação e destruição do fenol através da utilização da enzima tirosinase extraída de vegetais, cujos resultados podem ser úteis para o tratamento de outros compostos fenólicos como o hormônio 17β-estradiol ou os que se encontram nos efluentes procedentes da produção de azeite (\"águas de vegetação\") após a recuperação dos polifenóis importantes como antioxidantes. A tirosinase tem a capacidade de transformar fenóis em produtos menos solúveis em água e menos danosos, permitindo assim uma agressão menor ao ambiente. Outro método de remoção do fenol também foi avaliado utilizando queratina extraída de penas de galinha, quitina e quitosana como bioadsorventes. A atividade enzimática foi determinada espectrofotometricamente com soluções de fosfato de potássio e L-tirosina. Para determinar a concentração de fenol aps a oxidação foi utilizada a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). Para estudar a adsorção do fenol aplicou-se o método colorimétrico a partir das soluções de tampão borato, 4 aminoantipirina e ferricianeto de potássio e as absorbâncias foram lidas em espectrofotômetro UV-Vis a 546nm, enquanto a determinação de polifenis presentes na \"água de vegetação\" foi realizada pelo método Folin-Ciocalteu. A quantidade de tirosinase nas batatas das variedades Ágata e Galette di Bologna apresentou-se muito baixa a ponto de modificarmos a matéria prima para testes em maçã, kiwi, banana e cogumelo, mas apenas o último mostrou uma atividade bastante considerável. Assim, esta matéria-prima foi usada em ensaios a diferentes temperaturas para a estimativa dos parâmetros termodinâmicos durante da oxidação do fenol e da inativação térmica da enzima. As melhores condições da oxidação do fenol com a enzima contida no extrato de cogumelo foram: 30°C, pH 6,6, concentração de enzima 328U/mL e de fenol 100mg/L. A queratina revelou-se o melhor adsorvente para a degradação do fenol tendo mostrado remoção de 98% do mesmo em condições ótimas. / Environmental problems related to growing industrial activity have generated concerns among government entities and environmental protection, being necessary more baseline studies that seek new alternatives for the recovery of polluted areas and solution of problems related to the operational techniques employed. One of the compounds most commonly found in many industrial effluents, mainly from biochemical and pharmaceutical industries, is phenol, which causes a detrimental impact on the environment due to its toxicity. Therefore, this work proposes the oxidation and destruction of phenol using the enzyme tyrosinase, extracted from plants, whose results could be useful in the future for the treatment of other phenolic compounds such as 17β-estradiol hormone or those found in the effluent coming from the production for olive oil (\"vegetation water\") after polyphenols recovery. Such an enzyme has the ability of transforming phenols into products less soluble in water and less dangerous, thereby allowing for a minor impact on the environment. Another method of phenol removal was also evaluated using keratin extracted from chicken feathers, chitin and chitosan as phenol biosorbents. Potassium phosphate buffer and L-tyrosine solutions were used for the determination of enzymatic activity, the high performance liquid chromatography (HPLC) for the determination of phenol concentration after oxidation, and a colorimetric method making use of solutions of borate buffer, 4-aminoantipyrine and potassium ferricyanide as well as reading of the absorbance at 546nm to investigate phenol biosorption, while the presence of polyphenols in \"vegetation water\" was determined by the Folin-Ciocalteu method. The presence of the tyrosinase in potato varieties Agata and Galette di Bologna was shown to be very low, thus suggesting to change the biosorbent material. So, additional tests were done on apples, kiwi, banana and mushroom, but only the last showed a considerable activity. Therefore, only such a raw material was used in tests at variable temperature to estimate the thermodynamic parameters of both phenol oxidation and thermsal inactivation of the enzyme. The optimum conditions for the phenol oxidation by tyrosinase were: 30°C, pH 6,6, enzyme concentration 328U/mL and of phenol 100mg/L. Keratin was shown to be the best adsorbent, exhibiting under optimum conditions no less than 98% phenol removal.

Compostos de cobre(II) dinucleares, contendo ligantes nitrogenados, foram preparados, caracterizados por diversas técnicas espectroscópicas (UV/Vis, IV e EPR) e tiveram sua reatividade frente a células melanomas (B16F10 e TM1) verificada. Estes compostos são miméticos da tirosinase, enzima contendo em seu sítio ativo dois íons de cobre, presente em bactérias, plantas, animais e humanos, sendo responsável pela oxidação de fenóis a catecóis e destes às correspondentes quinonas. São enzimas relacionadas também à melanogênese, isto é, síntese de melanina, com formação de polímeros eumelanina e feomelanina, responsáveis pela pigmentação de nossa pele, olhos e cabelos. Os compostos mononucleares correspondentes foram também preparados e estudados, para efeito de comparação. Os resultados indicaram que os complexos dinucleares são mais ativos, tanto como miméticos da tirosinase, quanto em relação à citotoxicidade frente a melanomas, que os análogos mononucleares, mostrando que a estrutura é um fator determinante de ambas as atividades biológicas aqui estudadas. Ensaios de interação com as biomoléculas DNA e albumina humana (HSA) através de espectroscopia de UV/Vis e dicroísmo circular (CD) respectivamente, também foram realizados e complementaram os estudos. Atividade nuclease significativa foi observada para os complexos dinucleares, em presença de peróxido de hidrogênio, através de ensaios de clivagem em gel de agarose, buscando uma possível elucidação dos mecanismos de ação dos complexos em estudo. / Dinuclear copper(II) complexes with nitrogenated ligands were prepared, characterized by spectroscopic techniques (UV/Vis, IR and EPR) and had their reactivity verified towards melanoma cells (B16F10 and TM1). These compounds are tyrosinase mimics, an enzyme present in bacteria, fungi, animals and humans, capable of catalyzing the oxidation of phenols to catechols, and catechols to the corresponding quinines, and containing two copper ions in its active site. Tyrosinases are also enzymes related to melanogenesis, assisting the formation of eumelanin and pheomelanin polymers, responsible for the colour of our eyes, skin and hair. The corresponding mononuclear copper(II) complexes were also prepared and comparative studies were performed. The results indicated that the dinuclear species are more reactive than the mononuclear ones, both as tyrosinase mimics as in cytotoxicity damage to melanoma cells, showing that the structure of such species is a determining factor of both biological activities. Experiments at the interactions of these complexes with the biomolecule DNA and human serum albumim, were also conducted by UV/Vis and circular dichroism spectroscopies, respectively, and complemented the previous studies. Nuclease activity was also assessed, in the presence of hydrogen peroxide, monitored by cleavage assays in agarose gel, in order to contribute to the elucidation of the mechanisms of action of these complexes

Uma série de três complexos de cobre(II) dinucleares, contendo ligantes nitrogenados e grupos aromáticos (compostos 2, 4 e 6), foi sintetizada e caracterizada por diversas técnicas espectroscópicas (UV/Vis, IV e EPR). Esses compostos tiveram sua atividade tirosinase avaliada à temperatura ambiente, através da oxidação de L-di-hidroxifenilalanina (L-dopa), e sua citotoxicidade investigada frente a células melanomas, comparada às de complexos análogos de cobre(II) mononucleares (compostos 1, 3 e 5). A influência da luz UVB, que estimula a melanogênese, também foi verificada. A exposição das células à radiação de intensidade (13 ± 2) mJ/cm2 aumentou os danos causados, principalmente em presença das espécies dinucleares. A citotoxicidade dos diferentes complexos foi determinada frente a duas linhagens de melanomas humanos (SKMEL-05 e SKMEL-147), após 24 e 48h de incubação. Células com maior teor de melanina foram mais sensíveis aos efeitos dos complexos. Verificou-se um aumento na porcentagem de células na fase sub-G1 do ciclo celular após tratamento por 24 ou 48h com estes complexos, ao contrário do verificado frente a queratinócitos não tumorais. Testes clonogênicos também indicaram maior atividade do composto (2) contendo dois centros de cobre em sua estrutura, com diminuição significativa no número de células sobreviventes após tratamento. Ensaios complementares mostraram a redução dos íons de cobre(II) nos compostos (1) e (2) em presença de melanina e a formação de espécies reativas de oxigênio (radicais hidroxil e ânions superóxido), através de espectroscopia EPR ou do uso de sondas fluorescentes. Adicionalmente, foi constatado um aumento no nível de vacúolos citoplasmáticos após tratamento com o complexo (2), indicando indução à autofagia, corroborada pelo monitoramento das proteínas LC3 e tubulina, implicadas neste processo de morte celular. Os resultados apontam para a ocorrência de pelo menos dois mecanismos de ação dos complexos frente aos melanomas, por processo apoptótico e autofágico. Indicam ainda que esta reatividade frente a melanomas é fortemente dependente da estrutura dos complexos de cobre, sendo mais significativa para os dinucleares / A series of dinuclear copper(II) complexes containing nitrogen ligands and aromatic groups (compounds 2, 4 and 6), were synthesized and characterized by various spectroscopic methods (UV/Vis, IR and EPR). These complexes had their tyrosinase activity evaluated at room temperature, through the oxidation of L-di-hidroxyphenylalanine (L-dopa), and its cytotoxicity toward melanoma cells investigated, in comparison with the toxicity of the corresponding mononuclear complexes (compounds 1, 3 and 5). The influence of UVB light, that stimulates melanogenesis, was also verified. The exposition of the cells to radiation of intensity (13 ± 2) mJ/cm2, increased the caused damage, especially in the presence of dinuclear species. The cytotoxicity of the different complexes was determined toward two cell lines of human melanomas (SKMEL-05 e SKMEL-147), after 24 and 48h incubation. Cells containing higher leveis of melanin were more sensitive to the effects of the complexes. An increasing in the percentage of cells in the sub-G1 phase of cellular cycle was verified after treatment for 24 or 48h with these complexes. On the contrary, this effect was not observed with non-tumor keratinocytes. Clonogenic tests also indicated higher activity of compound 2 containing two copper centers in its structure, with a significant decrease in the number of survival cells after the treatment. Complementary assays show the reduction of copper(II) ions in complexes (1) and (2), in the presence of melanin, as well as the formation of reactive oxygen species (hydroxyl radicais and superoxide anions) via EPR spectroscopy or the use of fluorescent labels. Further, an increase in the levei of cytoplasmatic vacuoles was verified after treatment with complex (2), indicating induction to autophagy, which was corroborated by monitoring the proteins LC3 and tubulin, implicated in this process of cell death. The results pointed to the occurrence of at least two mechanisms of action of these complexes toward melanomas, apoptotic and autophagic processes. Also, they indicated that the reactivity of the studied compounds is strongly dependent on its structural features, being more remarkable to the dinuclear ones.

Compostos de cobre(II) dinucleares, contendo ligantes nitrogenados, foram preparados, caracterizados por diversas técnicas espectroscópicas (UV/Vis, IV e EPR) e tiveram sua reatividade frente a células melanomas (B16F10 e TM1) verificada. Estes compostos são miméticos da tirosinase, enzima contendo em seu sítio ativo dois íons de cobre, presente em bactérias, plantas, animais e humanos, sendo responsável pela oxidação de fenóis a catecóis e destes às correspondentes quinonas. São enzimas relacionadas também à melanogênese, isto é, síntese de melanina, com formação de polímeros eumelanina e feomelanina, responsáveis pela pigmentação de nossa pele, olhos e cabelos. Os compostos mononucleares correspondentes foram também preparados e estudados, para efeito de comparação. Os resultados indicaram que os complexos dinucleares são mais ativos, tanto como miméticos da tirosinase, quanto em relação à citotoxicidade frente a melanomas, que os análogos mononucleares, mostrando que a estrutura é um fator determinante de ambas as atividades biológicas aqui estudadas. Ensaios de interação com as biomoléculas DNA e albumina humana (HSA) através de espectroscopia de UV/Vis e dicroísmo circular (CD) respectivamente, também foram realizados e complementaram os estudos. Atividade nuclease significativa foi observada para os complexos dinucleares, em presença de peróxido de hidrogênio, através de ensaios de clivagem em gel de agarose, buscando uma possível elucidação dos mecanismos de ação dos complexos em estudo. / Dinuclear copper(II) complexes with nitrogenated ligands were prepared, characterized by spectroscopic techniques (UV/Vis, IR and EPR) and had their reactivity verified towards melanoma cells (B16F10 and TM1). These compounds are tyrosinase mimics, an enzyme present in bacteria, fungi, animals and humans, capable of catalyzing the oxidation of phenols to catechols, and catechols to the corresponding quinines, and containing two copper ions in its active site. Tyrosinases are also enzymes related to melanogenesis, assisting the formation of eumelanin and pheomelanin polymers, responsible for the colour of our eyes, skin and hair. The corresponding mononuclear copper(II) complexes were also prepared and comparative studies were performed. The results indicated that the dinuclear species are more reactive than the mononuclear ones, both as tyrosinase mimics as in cytotoxicity damage to melanoma cells, showing that the structure of such species is a determining factor of both biological activities. Experiments at the interactions of these complexes with the biomolecule DNA and human serum albumim, were also conducted by UV/Vis and circular dichroism spectroscopies, respectively, and complemented the previous studies. Nuclease activity was also assessed, in the presence of hydrogen peroxide, monitored by cleavage assays in agarose gel, in order to contribute to the elucidation of the mechanisms of action of these complexes

Neste trabalho relata-se pela primeira vez a determinação de adenosina por um biossensor baseado em tirosinase. O biossensor foi desenvolvido mediante a modificação de um eletrodo de carbono impresso (SPE) com nanopartículas de ouro (AuNPs), tirosinase (Tyr) e Nafion, denominado biossensor Nafion/Tyr/AuNPs/SPE. As AuNPs sintetizadas possuem diâmetro médio de 15,0 ± 1,1 nm e sua função é melhorar a via de condução de elétrons entre a enzima e o eletrodo. Utilizou-se o aprisionamento com filme Nafion® para evitar a lixiviação enzimática da superfície do eletrodo. A tirosinase imobilizada apresentou boa atividade frente ao substrato catecol. Verificou-se que a adenosina atua como um inibidor do tipo não-competitivo. O biossensor é estável durante pelo menos 45 dias. Além disso, foi realizada a eletro-oxidação da adenosina para sua determinação. O biossensor apresenta sensibilidade superior em comparação com SPE, AuNPs/SPE e Nafion/AuNPs/SPE. As curvas de calibração revelaram duas faixas lineares para as concentrações de adenosina, de 1,0 × 10-5 mol L-1 até 5,0 × 10-5 mol L-1 e entre 6,0 × 10-5 mol L-1 e 1,2 × 10-4 mol L -1. O limite de detecção (3 × (desvio padrão + média dos brancos)/coeficiente angular da curva) foi de 7,0 × 10-7 mol L-1. / In this work we report for the first time the determination of adenosine by a biosensor based on tyrosinase. The biosensor was developed by modifying a screen-printed carbon electrode (SPE) with gold nanoparticles (AuNPs), tyrosinase (Tyr) and Nafion, denoted as Nafion/Tyr/AuNPs/SPE biosensor. The synthesized AuNPs have a mean diameter of 15.0 ± 1.1 nm and their function is to improve the electron conduction pathway between the enzyme and the electrode. The entrapment with Nafion® film was selected to prevent the enzyme lixiviation from the electrode surface. Immobilized tyrosinase showed good activity with the catechol substrate. It was found that adenosine acts as a non-competitive type inhibitor. The biosensor is stable for at least 45 days. In addition, the electro-oxidation of adenosine was performed for its determination. The biosensor has superior sensitivity compared to SPE, AuNPs/SPE and Nafion/AuNPs/SPE. Calibration curves revealed two linear ranges for adenosine concentrations of 1,010-5 mol L-1 up to 5,010-5 mol L-1 and from 6,010-5 mol L-1 to 1,210-4 mol L-1. The detection limit (3 × (standard deviation + mean of blanks)/slope of the curve) was 7,010-7 mol L-1.

Neste trabalho relata-se pela primeira vez a determinação de adenosina por um biossensor baseado em tirosinase. O biossensor foi desenvolvido mediante a modificação de um eletrodo de carbono impresso (SPE) com nanopartículas de ouro (AuNPs), tirosinase (Tyr) e Nafion, denominado biossensor Nafion/Tyr/AuNPs/SPE. As AuNPs sintetizadas possuem diâmetro médio de 15,0 ± 1,1 nm e sua função é melhorar a via de condução de elétrons entre a enzima e o eletrodo. Utilizou-se o aprisionamento com filme Nafion® para evitar a lixiviação enzimática da superfície do eletrodo. A tirosinase imobilizada apresentou boa atividade frente ao substrato catecol. Verificou-se que a adenosina atua como um inibidor do tipo não-competitivo. O biossensor é estável durante pelo menos 45 dias. Além disso, foi realizada a eletro-oxidação da adenosina para sua determinação. O biossensor apresenta sensibilidade superior em comparação com SPE, AuNPs/SPE e Nafion/AuNPs/SPE. As curvas de calibração revelaram duas faixas lineares para as concentrações de adenosina, de 1,0 × 10-5 mol L-1 até 5,0 × 10-5 mol L-1 e entre 6,0 × 10-5 mol L-1 e 1,2 × 10-4 mol L -1. O limite de detecção (3 × (desvio padrão + média dos brancos)/coeficiente angular da curva) foi de 7,0 × 10-7 mol L-1. / In this work we report for the first time the determination of adenosine by a biosensor based on tyrosinase. The biosensor was developed by modifying a screen-printed carbon electrode (SPE) with gold nanoparticles (AuNPs), tyrosinase (Tyr) and Nafion, denoted as Nafion/Tyr/AuNPs/SPE biosensor. The synthesized AuNPs have a mean diameter of 15.0 ± 1.1 nm and their function is to improve the electron conduction pathway between the enzyme and the electrode. The entrapment with Nafion® film was selected to prevent the enzyme lixiviation from the electrode surface. Immobilized tyrosinase showed good activity with the catechol substrate. It was found that adenosine acts as a non-competitive type inhibitor. The biosensor is stable for at least 45 days. In addition, the electro-oxidation of adenosine was performed for its determination. The biosensor has superior sensitivity compared to SPE, AuNPs/SPE and Nafion/AuNPs/SPE. Calibration curves revealed two linear ranges for adenosine concentrations of 1,010-5 mol L-1 up to 5,010-5 mol L-1 and from 6,010-5 mol L-1 to 1,210-4 mol L-1. The detection limit (3 × (standard deviation + mean of blanks)/slope of the curve) was 7,010-7 mol L-1.

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No. of bitstreams: 1 DissGGIR.pdf: 2422738 bytes, checksum: f8e990325874e84e9c54a573f901f2c7 (MD5) Previous issue date: 2016-02-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / In this work, carbon black Vulcan XC-72R was functionalized using five different treatments, the oxidizing agents employed were: nitric acid, sulfuric acid and hydrogen peroxide. The physical characterization of functionalized samples was carried out using scanning electron microscopy (SEM) and Raman spectroscopy. The results suggested that the treatments did not significantly alter the morphology of the material in most cases and showed an increase in the number of defects attributed to the introduction of oxygenated functional groups. Glassy carbon electrodes (GCE) were modified with aqueous dispersions of materials in dihexadecyl hydrogen phosphate (DHP). For the electrochemical characterization of the electrodes were performed studies of cyclic voltammetry employing the probe potassium hexacyanoferrate (III). For all cases there was an increase in the electroactive area as a result of the functionalization. Subsequently, the response of the electrodes to different analytes (dopamine, catechol, paracetamol and hydroquinone) was evaluated, the electrode modified in a mixture of nitric and sulfuric acid 1:1 (CB–HNO3/H2SO41:1–DHP/GCE) showed the highest analytical signal for the different compounds tested. Calibration curves were constructed for the determination of dopamine using the GCE electrode, the electrode prepared with unmodified CB (CB–DHP/GCE) and the CB–HNO3/H2SO41:1–DHP/GCE electrode, the sensitivities of the analytical curves (angular coefficients of the analytical curves) were: 0.334, 3.65 and 6.54 A cm−2 L mol−1, respectively. These results show a significant increase in sensitivity as a result of the functionalization xvii of CB suggesting an advantage over the use of unmodified material for electroanalytical applications. Then, an analytical procedure for the determination of sodium benzoate (sodium salt of benzoic acid) based on enzyme inhibition was developed, where the tyrosinase enzyme was immobilized at the surface of the CB– HNO3/H2SO41:1–DHP/GCE electrode (biosensor). Studies of the inhibition mechanism and optimization of operating conditions were performed. The corresponding analytical curves had linear concentration ranges between 4.90 × 10−7 and 1.92 × 10−5 mol L−1 and a detection limit of 2.1 × 10−7 mol L−1. / Neste trabalho funcionalizou-se o carbon black Vulcan XC-72R utilizando-se cinco tratamentos diferentes, empregando como agentes oxidantes: ácido nítrico, ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio. A caracterização física das amostras funcionalizadas foi realizada empregando-se microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia Raman. Analisando-se os resultados obtidos tem-se que os tratamentos ácidos não alteraram significativamente a morfologia do material. Por outro lado, este tratamento proporcionou um aumento do número de defeitos atribuídos à introdução de grupos funcionais oxigenados. Foram modificados eletrodos de carbono vítreo (do inglês, glassy carbon electrode, GCE) com dispersões aquosas dos materiais em dihexadecil hidrogenofosfato (DHP). Para a caracterização eletroquímica dos eletrodos foram realizados estudos de voltametria cíclica empregando-se a sonda hexacianoferrato de potássio (III). Em todos os casos houve aumento da área eletroativa do eletrodo como consequência da funcionalização do material de carbono. Posteriormente, avaliou-se a resposta dos eletrodos frente a diferentes analitos (dopamina, catecol, paracetamol e hidroquinona), o eletrodo modificado em mistura de ácido nítrico e sulfúrico 1:1 (CB–HNO3/H2SO41:1–DHP/GCE) apresentou maior sinal analítico para os diferentes compostos investigados. Foram construídas curvas de calibração para a determinação de dopamina utilizando o eletrodo GCE, o eletrodo preparado com CB sem funcionalizar (CB–DHP/GCE) e o eletrodo CB–HNO3/H2SO41:1– DHP/GCE. As sensibilidades (coeficientes angulares das curvas analíticas) foram xv 0,334, 3,65 e 6,54 A cm−2 mol L−1, respectivamente. Estes resultados mostram um aumento significativo da sensibilidade como consequência da funcionalização do CB, sugerindo uma vantagem sobre o uso do material sem modificação para aplicações eletroanalíticas. Em seguida de denvolveu-se um procedimento analítico para a determinação de benzoato de sódio (sal de sódio do ácido benzoico) baseado na inibição enzimática da tirosinase imobilizada na superfície do eletrodo CB– HNO3/H2SO41:1–DHP/GCE (biossensor). Foram realizados estudos de mecanismo de inibição e otimização das condições de operação. A curva analítica correspondente apresentou uma faixa linear de concentração de 4,90 × 10−7 a 1,92 × 10−5 mol L−1 e um limite de detecção de 2,1 × 10−7 mol L−1 .