Neste trabalho relata-se pela primeira vez a determinação de adenosina por um biossensor baseado em tirosinase. O biossensor foi desenvolvido mediante a modificação de um eletrodo de carbono impresso (SPE) com nanopartículas de ouro (AuNPs), tirosinase (Tyr) e Nafion, denominado biossensor Nafion/Tyr/AuNPs/SPE. As AuNPs sintetizadas possuem diâmetro médio de 15,0 ± 1,1 nm e sua função é melhorar a via de condução de elétrons entre a enzima e o eletrodo. Utilizou-se o aprisionamento com filme Nafion® para evitar a lixiviação enzimática da superfície do eletrodo. A tirosinase imobilizada apresentou boa atividade frente ao substrato catecol. Verificou-se que a adenosina atua como um inibidor do tipo não-competitivo. O biossensor é estável durante pelo menos 45 dias. Além disso, foi realizada a eletro-oxidação da adenosina para sua determinação. O biossensor apresenta sensibilidade superior em comparação com SPE, AuNPs/SPE e Nafion/AuNPs/SPE. As curvas de calibração revelaram duas faixas lineares para as concentrações de adenosina, de 1,0 × 10-5 mol L-1 até 5,0 × 10-5 mol L-1 e entre 6,0 × 10-5 mol L-1 e 1,2 × 10-4 mol L -1. O limite de detecção (3 × (desvio padrão + média dos brancos)/coeficiente angular da curva) foi de 7,0 × 10-7 mol L-1. / In this work we report for the first time the determination of adenosine by a biosensor based on tyrosinase. The biosensor was developed by modifying a screen-printed carbon electrode (SPE) with gold nanoparticles (AuNPs), tyrosinase (Tyr) and Nafion, denoted as Nafion/Tyr/AuNPs/SPE biosensor. The synthesized AuNPs have a mean diameter of 15.0 ± 1.1 nm and their function is to improve the electron conduction pathway between the enzyme and the electrode. The entrapment with Nafion® film was selected to prevent the enzyme lixiviation from the electrode surface. Immobilized tyrosinase showed good activity with the catechol substrate. It was found that adenosine acts as a non-competitive type inhibitor. The biosensor is stable for at least 45 days. In addition, the electro-oxidation of adenosine was performed for its determination. The biosensor has superior sensitivity compared to SPE, AuNPs/SPE and Nafion/AuNPs/SPE. Calibration curves revealed two linear ranges for adenosine concentrations of 1,010-5 mol L-1 up to 5,010-5 mol L-1 and from 6,010-5 mol L-1 to 1,210-4 mol L-1. The detection limit (3 × (standard deviation + mean of blanks)/slope of the curve) was 7,010-7 mol L-1.

Uma série de três complexos de cobre(II) dinucleares, contendo ligantes nitrogenados e grupos aromáticos (compostos 2, 4 e 6), foi sintetizada e caracterizada por diversas técnicas espectroscópicas (UV/Vis, IV e EPR). Esses compostos tiveram sua atividade tirosinase avaliada à temperatura ambiente, através da oxidação de L-di-hidroxifenilalanina (L-dopa), e sua citotoxicidade investigada frente a células melanomas, comparada às de complexos análogos de cobre(II) mononucleares (compostos 1, 3 e 5). A influência da luz UVB, que estimula a melanogênese, também foi verificada. A exposição das células à radiação de intensidade (13 ± 2) mJ/cm2 aumentou os danos causados, principalmente em presença das espécies dinucleares. A citotoxicidade dos diferentes complexos foi determinada frente a duas linhagens de melanomas humanos (SKMEL-05 e SKMEL-147), após 24 e 48h de incubação. Células com maior teor de melanina foram mais sensíveis aos efeitos dos complexos. Verificou-se um aumento na porcentagem de células na fase sub-G1 do ciclo celular após tratamento por 24 ou 48h com estes complexos, ao contrário do verificado frente a queratinócitos não tumorais. Testes clonogênicos também indicaram maior atividade do composto (2) contendo dois centros de cobre em sua estrutura, com diminuição significativa no número de células sobreviventes após tratamento. Ensaios complementares mostraram a redução dos íons de cobre(II) nos compostos (1) e (2) em presença de melanina e a formação de espécies reativas de oxigênio (radicais hidroxil e ânions superóxido), através de espectroscopia EPR ou do uso de sondas fluorescentes. Adicionalmente, foi constatado um aumento no nível de vacúolos citoplasmáticos após tratamento com o complexo (2), indicando indução à autofagia, corroborada pelo monitoramento das proteínas LC3 e tubulina, implicadas neste processo de morte celular. Os resultados apontam para a ocorrência de pelo menos dois mecanismos de ação dos complexos frente aos melanomas, por processo apoptótico e autofágico. Indicam ainda que esta reatividade frente a melanomas é fortemente dependente da estrutura dos complexos de cobre, sendo mais significativa para os dinucleares / A series of dinuclear copper(II) complexes containing nitrogen ligands and aromatic groups (compounds 2, 4 and 6), were synthesized and characterized by various spectroscopic methods (UV/Vis, IR and EPR). These complexes had their tyrosinase activity evaluated at room temperature, through the oxidation of L-di-hidroxyphenylalanine (L-dopa), and its cytotoxicity toward melanoma cells investigated, in comparison with the toxicity of the corresponding mononuclear complexes (compounds 1, 3 and 5). The influence of UVB light, that stimulates melanogenesis, was also verified. The exposition of the cells to radiation of intensity (13 ± 2) mJ/cm2, increased the caused damage, especially in the presence of dinuclear species. The cytotoxicity of the different complexes was determined toward two cell lines of human melanomas (SKMEL-05 e SKMEL-147), after 24 and 48h incubation. Cells containing higher leveis of melanin were more sensitive to the effects of the complexes. An increasing in the percentage of cells in the sub-G1 phase of cellular cycle was verified after treatment for 24 or 48h with these complexes. On the contrary, this effect was not observed with non-tumor keratinocytes. Clonogenic tests also indicated higher activity of compound 2 containing two copper centers in its structure, with a significant decrease in the number of survival cells after the treatment. Complementary assays show the reduction of copper(II) ions in complexes (1) and (2), in the presence of melanin, as well as the formation of reactive oxygen species (hydroxyl radicais and superoxide anions) via EPR spectroscopy or the use of fluorescent labels. Further, an increase in the levei of cytoplasmatic vacuoles was verified after treatment with complex (2), indicating induction to autophagy, which was corroborated by monitoring the proteins LC3 and tubulin, implicated in this process of cell death. The results pointed to the occurrence of at least two mechanisms of action of these complexes toward melanomas, apoptotic and autophagic processes. Also, they indicated that the reactivity of the studied compounds is strongly dependent on its structural features, being more remarkable to the dinuclear ones.

Nesta dissertação, foram estudados os métodos de síntese de filmes poliméricos como matrizes hospedeiras da enzima tirosinase vislumbrando o desenvolvimento de biossensores mais seletivos e duradouros na detecção de compostos fenólicos. Os polímeros utilizados e preparados por cronoamperometria em acetonitrila foram: polipirrol (PPI), polimetiltiofeno (PMET) e copolímero PPI-PMET. Os filmes PPI-PMET apresentaram características intermediárias às dos filmes PPI e PMET, conforme se verificaram em espectros na região do infravermelho (FTIR), voltametria cíclica e microscopia de força atômica (AFM), evidenciando, assim, a formação de uma nova matriz polimérica. O processo de superoxidação do filme PPI-PMET foi estudado visando a uma imobilização mais eficiente da enzima, quando se obteve uma condição na qual a superoxidação ocorre somente nas cadeias de PPI. Biossensores amperométricos foram preparados a partir do uso da tirosinase extraída do abacate como fonte enzimática por imobilização física e realizada de maneiras diferentes em filmes não superoxidados e superoxidados. Foi feita a otimização das respostas dos filmes variando-se o pH, potencial de trabalho, concentração da enzima e tempo de imobilização da enzima para a detecção de catecol. Os resultados indicaram que a superoxidação do PPI nos filmes PPI-PMET favoreceu a imobilização da enzima, embora não fosse tão eficiente quando se comparou aos filmes com o PPI não superoxidado. Contudo, os biossensores, em geral, apresentaram grande sensibilidade ao catecol, com um limite de detecção baixo, da ordem de 0,12 µmol/L. / The synthesis methods of polymer films as host matrices of the enzyme tyrosinase were studied in this dissertation. It was expected the development of selective and everlasting biosensors for the detection of phenolic compounds. The used polymers were prepared by chronoamperometry in acetonitrile as followed: polypyrrole (PPI), polymethylthiophene (PMET) and copolymer PPI-PMET. The PPI-PMET films showed intermediate characteristics as the PPI and PMET films, as observed in the infrared spectra (FTIR), cyclic voltammetry and atomic force microscopy (AFM), thus indicating the formation of a new polymeric matrix . The process of overoxidized of PPI-PMET film was studied in order to achieve a more efficient immobilization of the enzyme, whilst it was achieved a condition in which overoxidized occurs only in the PPI chain. Amperometric biosensors were prepared from the use of tyrosinase extracted from avocado as an enzyme source by physical immobilization and performed in different ways in both overoxidized and non-overoxidized films. It was performed the optimization of the responses of the films by varying pH, operacuonial potential, enzyme concentration and time in the enzyme immobilization for the detection of catechol. The results showed that the overoxidized PPI in the films PPI-PMET favored the immobilization of the enzyme, although not as efficient when compared to the films with nom overoxidized PPI. Neverthless, the catechol biosensors showed a high sensitivity with a low detection limit in the order of 0.12 µmol/L.

Embora exista considerável progresso na área de biossensores, ainda é primordial aprimorar muitos desses dispositivos. Este trabalho tem por objetivo contribuir para o contínuo crescimento dos biossensores a base de enzimas e de moléculas de DNA, sendo dois biossensores eletroquímicos descritos. O primeiro trata-se de um biossensor enzimático utilizando tirosinase (Tyr) imobilizada por intermédio de cistamina (CYS) e glutaraldeído (GA) para a detecção de compostos fenólicos. Eletrodos de carbono impressos (SPCE) foram modificados com nanobastões de ouro (AuNRs) em filme de poli(amido amina) (PAMAM) geração 4 para o favorecimento da transferência direta de elétrons (DET) entre o eletrodo e o sítio ativo da enzima. Para caracterizar os AuNRs e AuNRs-PAMAM, espectroscopia de absorção no UV-Visível, espalhamento de luz dinâmico (DLS) e microscopia eletrônica de varredura (SEM) foram empregadas. As etapas do biossensor foram estudadas por voltametria cíclica e linear, amperometria e microscopia de força atômica (AFM) na presença de dois analitos: catecol (CAT) e dopamina (DA). A faixa linear para CAT foi de 2,8 a 30,3 μmol L-1 com um limite de detecção (LD) de 1,0μmol L-1 enquanto para a DA, a faixa linear foi de 27,8 a 448,7 μmol L-1 e LD de 10,0 μmol L-1. Além de apresentar ótima resposta frente a possíveis interferentes, o sensor também mostrou excelente desempenho em amostras reais, que atrelados aos testes de repetibilidade e reprodutibilidade mostram a estabilidade e acurácia do biossensor. O segundo sensor, trata-se de um sensor de DNA impedimétrico em eletrodo de ouro para a detecção da mutação c.68_69del relacionada à predisposição ao câncer de mama. A imobilização da sequência de captura (SH-ssDNA) no eletrodo ocorreu pela ligação ouro-enxofre (Au-S) e o modelo de hibridização escolhido foi a hibridização direta. O genossensor distinguiu eficientemente entre as sequências alvo (tarDNA) e não-complementar (ncsDNA), apresentando faixa linear de 1,0 a 200,0 nmol L-1 e LD de 0,14 nmol L-1. Os resultados sugerem que ambos biossensores têm potencial e que as estratégias propostas são promissoras para o desenvolvimento de outros biossensores. / Despite a considerable progress in the area of biosensors, it is still crucial to improve most of these sensors. This study aims to contribute to the ongoing growth of enzyme- and DNA-based biosensors, being described two electrochemical biosensors. The first one is an enzyme-based biosensor with immobilized Tyrosinase (Tyr), through cystamine (CYS) and glutaraldehyde (GA), for detection of phenolic compounds. Screen-printed carbon electrodes (SPCE) were modified by gold nanorods (AuNRs) stabilized with poly(amide amine) PAMAM generation 4 to facilitate direct electron transfer (DET) between electrode and enzyme active site. AuNRs and AuNRs-PAMAM were characterized using UV-Visible absorption spectroscopy, dynamic light scattering (DLS) e scanning electron microscopy (SEM). Biosensor stages were studied by cyclic and linear voltametry, amperommetry and atomic force microscopy (AFM) and tested agains two analytes: catechol (CAT) and dopamine (DA). Detection limit (LD) for CAT is 1 μmol L-1 and linear range from 2.8 to 30.3 μmol L-1, for DA, LD is 10.0 μmol L-1 and linear range 27.8 to 448.7 μmol L-1. Besides, the biosensor shows great response in the presence of interferents, it also had an excellent performance in real samples that along with repeatability and reproducibility tests indicate stability and accuracy of the biosensor. The second sensor is an impedimetric DNA sensor prepared on gold electrode to detect c.68_69del mutation related to breast cancer predisposition. Capture sequence (HS-ssDNA) immobilization occurred due to gold-sulfur bond (Au-S) and direct hybridization was the chosen hybridization model. The genosensor was able to distinguishing between target sequence (tarDNA) and non-complementary sequence (ncsDNA) and linear range and LD were found to be 1.0 to 200.0 nmol L-1 and 0.14 nmol L-1, respectively. Results suggest both biosensors have potential and proposed strategies are promising for other biosensors development.

Submitted by Heitor Rapela Medeiros (heitor.rapela@ufpe.br) on 2015-03-03T18:28:11Z No. of bitstreams: 2 SOUZA, M.P.C- Dissertação de Mestrado.pdf: 1380346 bytes, checksum: 1b3f996a1ee811e62ac14e86cd7864ab (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-03T18:28:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 SOUZA, M.P.C- Dissertação de Mestrado.pdf: 1380346 bytes, checksum: 1b3f996a1ee811e62ac14e86cd7864ab (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / CAPES / Opuntia ficus-indica (L.) Mill. é uma cactácea amplamente cultivada nas zonas áridas e semiáridas do mundo, devido ao seu enorme potencial produtivo e suas múltiplas utilidades na área alimentícia, farmacêutica, agrícola, cosmética e outras. Assim, este trabalho objetivou caracterizar físico-quimicamente o óleo e o extrato nebulizado de Opuntia ficus-indica (L.) Mill. e avaliar as potencialidades deste vegetal, visando sua utilização no desenvolvimento de um novo fitocosmético. A caracterização foi realizada por análise térmica, espectroscopia na região do infravermelho, cromatografia gasosa acoplada ao espectro de massas, espectroscopia na região do ultravioleta e por testes farmacopéicos. Na avaliação das potencialidades verificou-se a atividade antioxidante, antimicrobiana, fotoprotetora e inibidora da enzima tirosinase. As análises farmacopéicas, espectroscópicas e térmicas do óleo e do extrato nebulizado de Opuntia fícus-indica permitiram caracterizá-los físicoquimicamente e verificar a estabilidade térmica dos mesmos. Através do CG-EM foi detectado que o óleo é rico em ácidos graxos saturados e insaturados, principalmente em ácido linoléico (~65%). Quanto à avaliação das potencialidades dos produtos derivados de Opuntia fícus-indica foi detectado que, nas condições do estudo, os mesmos não apresentaram atividade antioxidante e nem antimicrobiana. Com relação à inibição da enzima tirosinase, apenas o extrato nebulizado demonstrou atividade inibitória. Quanto à avaliação do potencial fotoprotetor do óleo, foi observado que o mesmo não apresentou FPS significativo e nem potencializou o FPS de formulações cosméticas contendo filtros solares orgânicos. Apesar disto, a utilização dos produtos de Opuntia fícus-indica em fitocosméticos pode ser justificada pelas suas propriedades eudérmicas.

Considerando o melanoma a forma mais agressivas de câncer de pele e mais resistente aos tratamentos convencionais, o presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade de um novo complexo de platina (II) com derivado de hidantoína (CX42) em células de melanoma humano e murino. Foram utilizados também para comparação células da pele (fibroblastos, queratinócitos e melanócitos) e os compostos cisplatina (CIS) e complexo de hidantoína isolado (NN10). Ensaios de viabilidade, ciclo e morte celular foram realizados. Investigou-se também a atividade da enzima tirosinase, principal enzima que regula a síntese de melanina durante o processo conhecido como melanogênese. Como resultados, obteve-se a diminuição da viabilidade celular e parada de ciclo na fase G0/G1 nas células de melanoma, principalmente na linhagem murina B16F10, frente ao composto CX42. Em células B16F10, foi possível observar estímulo na melanogênese, com aumento da atividade da enzima tirosinase. O CX42 apresentou uma atividade com efeito citostático nas células de melanoma, não sendo observado efeito citotóxico nas células da pele. Ainda, com a prévia estimulação da melanogênese, o CX42 apresentou-se mais efetivo, aumentando a morte celular em 40% por apoptose. Portanto, conclui-se que o CX42 diminuiu a viabilidade celular e seu efeito foi mais intenso quando as células apresentavam-se pigmentadas, demonstrando indução da tirosinase e da morte celular, atributo importante para potenciais novos fármacos anti-melanoma. / Since melanoma is one of the most aggressive forms of skin cancer and more resistant to conventional treatments, the present study aimed to evaluate the activity of a new platinum complex (II) with hydantoin derivative (CX42) in melanoma cells human and murine. Skin cells (fibroblasts, keratinocytes and melanocytes) were used as control and the compounds cisplatin (CIS) and hydantoin compound alone (NN10) were also evaluated. Viability assays, cell cycle analysis and cell death characterization were performed. Likewise, the activity of tyrosinase, the key enzyme that regulates melanin synthesis during the process known as melanogenesis, was also investigated. The results demonstrated a reduction in cell viability and cell cycle arrest in G0/G1 phase of murine melanoma B16F10 treated with CX42. In B16F10 cells, it was also observed melanogenesis stimulation with increased activity of tyrosinase. The CX42 showed a selective cytostatic effect on melanoma cells, however no toxic effects were observed in skin cells. In addition, with prior stimulation of melanogenesis, the CX42 demonstrated to be more effective, increasing apoptosis cell death in 40%. Therefore, the results demonstrated that CX42 decreased cell viability and the intensity of its effect is associated with cell pigmentation, demonstrating an association between tyrosinase high activity and induction of cell death which is an important attribute for new potential anti - tumoral drugs.

Melanina é um polímero constituído por uma grande heterogeneidade de monômeros tendo como característica comum a presença de grupos indóis. Por outro lado, a eumelanina produzida pela oxidação enzimática da tirosina é um polímero mais simples constituído principalmente de monômeros 5,6-dihidroxindol (DHI) e de indol-5,6-quinona (IQ). Tirosinase é a enzima chave na produção de melanina, sendo que a sua atividade cinética é medida em função da formação do intermediário dopacroma. Nanopartículas (NPs) de sílica são partículas nanométricas compostas de oxido de silício e são obtidas pelo processo sol-gel desenvolvido por Stöber de hidrólise e condensação de tetraetilortosilicato (TEOS), usando etanol como solvente em meio alcalino. As NPs foram funcionalizadas com 3-Aminopropiltrietoxissilano (ATPES) e depois com glutaraldeído. Este último permitiu a imobilização da tirosinase na superfície da sílica. Caracterizamos as NPs antes e após a reação da enzima, a atividade catalítica da enzima ligada à NP e o mecanismos de formação de melanina na superfície da sílica. As NPs foram caracterizadas por espectrofotometria de absorção e de reflectância, termogravimetria e microscopia eletrônica. A síntese da NP de sílica retornou partículas esféricas com 55nm de diâmetro e a funcionalização da partícula mostrou modificar eficientemente a sua superfície. A imobilização da tirosinase por ligação covalente foi de 99,5% contra 0,5% da adsorção física. A atividade da tirosinase foi caracterizada pela formação de dopacroma. O Km da enzima imobilizada não sofreu alteração em comparação com a tirosinase livre, mas a eficiência catalítica - que considera a eficiência recuperada - foi de apenas 1/3 para a enzima ligada covalentemente, significando que 2/3 das enzimas ligadas não estão ativas. Obtivemos NPs revestidas com melanina a partir de oxidação de tirosina solubilizada em duas preparações: NP com tirosinase ligada covalentemente na superfície e NP funcionalizada com glutaraldeido dispersa em solução de DHI e IQ. O revestimento de melanina foi na forma de um filme fino com espessura ~1,9nm, conferindo perfil de absorção luminosa equivalente ao da própria melanina. Mostramos que o mecanismo de polimerização passa pela oxidação da tirosina pela tirosinase, que gera intermediários oxidados (principalmente DHI e IQ) que vão para solução (mesmo quando a tirosinase está ligada covalentemente na sílica). Estes intermediários ligam-se ao glutaraldeido e a superfície da sílica passa a funcionar como ambiente de polimerização da melanina. / Melanin is a polymer consisting of a large heterogeneity of monomers having as a common feature the presence of indole groups. Contrarily, eumelanin produced by enzymatic oxidation of tyrosine is a simpler polymer consisting mainly of 5,6-dihidroxindol (DHI) and indole-5,6-quinone (IQ) monomers. Tyrosinase is the key enzyme in melanin production, and its kinetic activity is measured by the formation of the intermediate dopacroma. Nanoparticles (NPs) are made of silica nanoparticles of silicon oxide and are obtained by sol-gel method developed by Stöber of hydrolysis and condensation of tetraethylorthosilicate (TEOS), using ethanol as solvent in an alkaline medium. NPs were functionalized with 3-Aminopropyltriethoxysilane (ATPES) and then with glutaraldehyde. The latter allows the immobilization of tyrosinase on the silica surface. We characterized NPs before and after the reaction of the enzyme, the catalytic activity of the enzyme bound to the NP and melanin-forming mechanisms on the silica surface. NPs were characterized by absorption spectrophotometry and reflectance, electron microscopy and thermogravimetric analysis. The synthesis of silica NP returned spherical particles of 55nm diameter and particle functionalization showed efficiently modify its surface. The immobilization of tyrosinase by covalent bond was 99.5% versus 0.5% by physical adsorption. The activity of tyrosinase was characterized by the formation of dopacroma. The Km of the immobilized enzyme did not change compared to the free tyrosinase, but the catalytic efficiency - considering the recovered efficiently - was only 1/3 for the enzyme covalently bound, meaning that 2/3 of the enzymes are not connected active. We obtained melanin coated NPs from tyrosine oxidation in two preparations: NP with covalently bound tyrosinase in the NP surface and NP functionalized with glutaraldehyde dispersed in DHI and IQ solution. The melanin coating was in the form of a thin film with the thickness of ~ 1,9 nm, giving light absorption profile equivalent to that of melanin itself. We showed that the polymerization mechanism involves the oxidation of tyrosine by tyrosinase, which generates oxidized intermediates (especially DHI and lQ) that go into solution (even when tyrosinase is covalently bound to the silica). These intermediates bind the glutaraldehyde and the surface of the silica begins to function as an environment for melanin polymerization.

Considerando o melanoma a forma mais agressivas de câncer de pele e mais resistente aos tratamentos convencionais, o presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade de um novo complexo de platina (II) com derivado de hidantoína (CX42) em células de melanoma humano e murino. Foram utilizados também para comparação células da pele (fibroblastos, queratinócitos e melanócitos) e os compostos cisplatina (CIS) e complexo de hidantoína isolado (NN10). Ensaios de viabilidade, ciclo e morte celular foram realizados. Investigou-se também a atividade da enzima tirosinase, principal enzima que regula a síntese de melanina durante o processo conhecido como melanogênese. Como resultados, obteve-se a diminuição da viabilidade celular e parada de ciclo na fase G0/G1 nas células de melanoma, principalmente na linhagem murina B16F10, frente ao composto CX42. Em células B16F10, foi possível observar estímulo na melanogênese, com aumento da atividade da enzima tirosinase. O CX42 apresentou uma atividade com efeito citostático nas células de melanoma, não sendo observado efeito citotóxico nas células da pele. Ainda, com a prévia estimulação da melanogênese, o CX42 apresentou-se mais efetivo, aumentando a morte celular em 40% por apoptose. Portanto, conclui-se que o CX42 diminuiu a viabilidade celular e seu efeito foi mais intenso quando as células apresentavam-se pigmentadas, demonstrando indução da tirosinase e da morte celular, atributo importante para potenciais novos fármacos anti-melanoma. / Since melanoma is one of the most aggressive forms of skin cancer and more resistant to conventional treatments, the present study aimed to evaluate the activity of a new platinum complex (II) with hydantoin derivative (CX42) in melanoma cells human and murine. Skin cells (fibroblasts, keratinocytes and melanocytes) were used as control and the compounds cisplatin (CIS) and hydantoin compound alone (NN10) were also evaluated. Viability assays, cell cycle analysis and cell death characterization were performed. Likewise, the activity of tyrosinase, the key enzyme that regulates melanin synthesis during the process known as melanogenesis, was also investigated. The results demonstrated a reduction in cell viability and cell cycle arrest in G0/G1 phase of murine melanoma B16F10 treated with CX42. In B16F10 cells, it was also observed melanogenesis stimulation with increased activity of tyrosinase. The CX42 showed a selective cytostatic effect on melanoma cells, however no toxic effects were observed in skin cells. In addition, with prior stimulation of melanogenesis, the CX42 demonstrated to be more effective, increasing apoptosis cell death in 40%. Therefore, the results demonstrated that CX42 decreased cell viability and the intensity of its effect is associated with cell pigmentation, demonstrating an association between tyrosinase high activity and induction of cell death which is an important attribute for new potential anti - tumoral drugs.

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Made available in DSpace on 2014-07-29T16:11:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO DEFINITIVA c ficha catalografica.pdf: 2149699 bytes, checksum: ebcbff0f45d07e12d12a9708947a59eb (MD5) Previous issue date: 2009-07-15 / Tyrosinase (E.C.1.14.18.1) is an enzyme of industrial interest that catalyses the ohydroxylation of monophenols (monophenolase activity) and the oxidation of o-diphenols to reactive o-quinones (diphenolase activity), both reactions using molecular oxygen. Pycnoporus sanguineus (L. ex Fries) Murril, is a white rot fungi capable of producing tyrosinase and widely distributed in nature. It is found in regions of mild climate and in tropical forest. The production and characterization of tyrosinase from P. sanguineus were investigated. The selection of inductors, determination of the luminosity influence, biomass and culture media in the production of tyrosinase and the effect of inhibitors on enzyme activity were determined. The fungus produced intracellular tyrosinase and the higher activity was observed using 0.15% L-tyrosine as inducer, in the presence of light, with inoculum of 10 mycelium discs, medium malt extract broth 2%, incubation at 30°C, and constant agitation of 150 rpm, during 2 days. 6 mmol.L-1 salicylhydroxamic acid (SHAM) and 6 mmol.L-1 phenylthiourea (PTU) inhibited 100% of the tyrosinase activity. 0.1 mmol.L-1 sodium azide inhibited 4.15% of tyrosinase activity, while no inhibition was observed after addition of 0.1 mmol.L-1 of phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF). Using L-dopa as substrate, the intracellular crude extract presented optimum pH of 6,6, optimum temperature of 45°C, low stability at 50°C, maintaining about 50% of the activity after 15 min of incubation. The tyrosinase production was confirmed by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, using commercial fungal tyrosinase as positive control / A tirosinase (E.C.1.14.18.1), também conhecida como polifenoloxidase ou catecolase, é uma enzima de interesse industrial que catalisa a o-hidroxilação de monofenóis (atividade monofenolase) e a subseqüente oxidação do o-difenol resultante em o-quinonas reativas (atividade difenolase), usando oxigênio molecular. O Pycnoporus sanguineus (L. ex Fries) Murril, um fungo de decomposição branca (white rot) capaz de produzir a tirosinase, é amplamente distribuído na natureza, sendo encontrado em regiões de clima mais ameno e em florestas tropicais. A produção e caracterização da tirosinase produzida por P. sanguineus foi investigada. Foi realizada seleção de indutores, determinação da influência da luminosidade, biomassa e meios de cultura na produção de tirosinase, bem como o efeito de inibidores sobre a atividade enzimática. O extrato bruto enzimático foi caracterizado quanto ao pH ótimo, temperatura ótima e termoestabilidade. Os resultados obtidos demonstraram que o fungo produziu tirosinase intracelular e a mais alta atividade ocorreu com a utilização de 0,15% de L-tirosina como indutor, na presença de luz, com inóculo de 10 discos de micélio fúngico, meio caldo extrato de malte 2%, incubação à 30°C e agitação de 150 rpm, durante 2 dias. Ácido salicilhidroxâmico (SHAM) 6 mmol.L-1 e feniltiouréia (PTU) 6 mmol.L-1 inibiram 100% da atividade de tirosinase. Azida sódica 0,1 mmol.L-1 inibiu 4,15% da atividade de tirosinase, enquanto nenhuma inibição foi observada após adição de fluoreto de fenilmetanosulfonil (PMSF) 0,1 mmol.L-1. Utilizando a L-dopa como substrato, o extrato bruto intracelular apresentou pH ótimo de 6,6, temperatura ótima de 45°C, baixa estabilidade à temperatura de 50°C, mantendo apenas cerca de 50% de atividade após 15 minutos de incubação. A produção da tirosinase foi comprovada através de eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante, tendo como controle positivo tirosinase fúngica comercial