La toxine stable à la chaleur de type b (STb) est une des toxines produites par les souches Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) impliquée dans le développement de la diarrhée. Une étude antérieure par Goncalves et al. (2009) a démontré que les cellules ayant internalisé la toxine STb démontraient une morphologie qui rappelle l’apoptose. Le changement du potentiel membranaire observé par Goncalves et al. (2009) nous a incité à vérifier la capacité de la toxine STb à induire l’apoptose des cellules HRT-18 et IEC-18 par la voie intrinsèque. Les cellules HRT-18 et IEC-18 ont été traitées avec de la toxine purifiée pour une durée de 24 heures puis ells ont été récoltées et examinées pour des caratéristiques de l’apoptose. L’activation des caspases-9 et -3, mais pas de la caspase-8, a été observée dans les deux lignées cellulaires à l’aide des substrats fluorescents spécifiques pour chaque caspase. L’ADN extrait des cellules HRT-18 et IEC-18 a révélé une fragmentation lorsque migré sur gel d’agarose. La condensation et la fragmentation des noyaux ont été observées en microscopie à fluorescence suite à une coloration de l’ADN au Hoechst 33342. Les indices apoptotiques des cellules HRT-18 et IEC-18 traitées avec des quantités croissantes de STb montrent une dose-réponse pour les deux lignées. L’activation de la caspase-9 est une indication que la voie intrinsèque de l’apoptose est activée dans les cellules HRT-18 et IEC-18. L’absence de l’activation de la caspase-8 démontre que la voie extrinsèque n’est pas impliquée dans la mort cellulaire médiée par STb. / Heat-stable toxin b (STb) is one of the toxins produced by Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) strains implicated in the development of diarrhea. A previous study conducted by Goncalves et al. (2009) showed that cells having internalized STb toxin demonstrated apoptotic-like morphology. The change in the mitochondrial membrane potential observed by Goncalves et al. (2009) prompted us to verify the ability of STb toxin to induce apoptosis via the intrinsic pathway in HRT-18 and IEC-18 cells. Both cell lines were treated with purified STb toxin for a period of 24 hours, harvested, and examined for apoptotic features. Activation of caspases-9 and -3, but not -8, was observed in HRT-18 and IEC-18 cells as determined with the use of fluorescent substrates specific to each caspase. Extracted DNA revealed DNA laddering when migrated on agarose gels. Nuclear condensation and fragmentation of Hoechst 33342 stained DNA of HRT-18 and IEC-18 cells were visualized by fluorescence microscopy. Apoptotic indexes of HRT-18 and IEC-18 cells treated with increasing amounts of STb toxin revealed dose-dependent responses in both cell lines. The activation of caspase-9 is an indication of the intrinsic pathway being activated in HRT-18 and IEC-18 cells by STb toxin. The lack of caspase-8 activation demonstrates that the extrinsic pathway of apoptosis is not involved in the programmed cell death mediated by STb.

Erst kürzlich wurde der Lipolyse-stimulierte Lipoproteinrezeptor (LSR, engl. lipolysis-stimulated lipoprotein receptor) als der zelluläre Oberflächenrezeptor von CDT und Iota-Toxin, zweier Vertreter der Iota-Toxin-Familie der clostridialen Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine, identifiziert. In dieser Arbeit sollte geprüft werden, ob CST, ein weiterer Vertreter der Iota-Toxin-Familie, ebenfalls LSR für den Zelleintritt nutzt. Zunächst wurden die Toxinkomponenten CSTa und CSTb erstmals rekombinant hergestellt. Dazu wurden die für CSTa und CSTb codierenden Genabschnitte mittels PCR amplifiziert und anschließend in einen Expressionsvektor kloniert. Als Expressionsvektor wurde in dieser Arbeit der pHis1522-Vektor verwendet. Zur Amplifizierung wurden die Plasmide in E. coli transformiert und anschließend aufgereinigt. Die Proteinexpression erfolgte in B. megaterium, weil dieses Bakterium sich bereits zur Expression anderer clostridialer Toxine bewährt hatte. Zur Aufreinigung der 6xHis-getaggten Proteine wurde die Nickel-Affinitätschromatographie eingesetzt. Als nächstes wurde gezeigt, dass die rekombinant hergestellten Toxinkomponenten CSTa und CSTb biologisch aktiv waren. Dazu wurden CaCo2-Zellen mit CST behandelt und anschließend die Morphologie der Zellen untersucht. CaCo2-Zellen, die mit CSTa und CSTb behandelt wurden, wiesen Vergiftungserscheinungen wie eine typische Zellabrundung auf. Mit dem „Aktin-Nach-ADP-Ribosylierungs-Assay“ und der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung von TRITC-Phalloidin-gefärbtem Aktin wurde gezeigt, dass das rekombinant hergestellte CST Aktin-ADP-ribosylierende Eigenschaften besaß. Nachdem gezeigt war, dass rekombinant hergestelltes CST sich wie ein biologisch aktives, binäres Aktin-ADP-ribosylierendes Toxin verhält, konnte mithilfe der Vergiftung von H1-HeLa(+LSR)-Zellen und nativen H1-HeLa-Zellen, die kein LSR exprimierten, nachgewiesen werden, dass die Wirkung des Toxins LSR-abhängig ist. FACS-Analysen und Kolokalisationsstudien mit Alexa488-gefärbtem CSTb und Antikörper-gefärbtem LSR erbrachten zusätzlich den Beweis, dass CSTb auf der Zelloberfläche an LSR bindet und bei der Aufnahme in die Zellen mit LSR in endozytischen Vesikeln kolokalisiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das C. spiroforme Toxin (CST) ebenfalls LSR als Rezeptor für den Zelleintritt verwendet.

Le travail de cette thèse a permis de comparer les adaptations mises en place par le système nerveux après différentes méthodes d’altération et de récupération. Nos deux premières études portaient sur l’altérations de la réponse des afférences musculaires suite à une injection de toxine botulique. La troisième étude analysait la relation entre le phénotype musculaire et la réponse des afférences métabosensibles. Les deux dernières études analysaient si le vieillissement et l’activité physique altéraient la boucle sensori-motrice et la réponse des afférences métabosensibles. Les résultats de ce travail de thèse indiquent que la réponse des afférences mécano- et métabosensibles ont des profils de récupération qui diffèrent et que la réponse des afférences métabosensibles est dépendante en partie du phénotype musculaire. Enfin, le vieillissement induit une altération la boucle sensori-motrice, et l’entrainement permet de récupérer selon les muscles. L’activité des afférences métabosensibles est aussi altéré par les vieillissement mais l’entrainement ne permet pas de récupération. / This thesis work compared nervous system adaptations after different methods of alteration and recovery. The two first studies were about muscle afferents response alterations following botulinum toxin injections. The third study analyzed the relation between muscle phenotype and metabosensitive response. The two last studies analyzed whether aging and physical activity could alter the metabosensitive response and the sensory-motor loop. Results indicate that mechano- and metabosensitive afferents response have different recovery pattern and that metabosensitive afferents response is in part dependent on the muscle phenotype. Aging results indicate an alteration of the sensory-motor loop and depending on the muscle, training allows a recovery. Metabosensitive afferents response is also altered but training does not induce a recovery.

Les systèmes toxine-antitoxine (TA) sont très répandus au sein des génomes bactériens. Ces opérons bicistroniques de petite taille ont été découverts sur des plasmides à bas nombre de copies. Dans ce contexte génétique, les systèmes TA confèrent un avantage sélectif à leurs molécules-hôtes en tuant les bactéries-filles qui ne les ont pas héritées par le mécanisme de tuerie post-ségrégationnelle (PSK, post-segregational killing). Ces systèmes génétiques sont également appelés modules d’addiction étant donné qu’ils rendent la descendance des bactéries qui les contiennent dépendantes de leur présence. Alors que leur rôle dans les molécules d’ADN épisomiques est relativement bien établi, le sens biologique de la présence d’homologues à ces systèmes épisomiques au sein des chromosomes bactériens est sujet à d’intenses débats. L’idée que les systèmes TA chromosomiques confèrent un avantage sélectif a été mise en évidence dans plusieurs modèles. Selon ces modèles, les systèmes TA permettent aux bactéries de mieux faire face à des conditions environnementales stressantes. <p>Entre-temps, la compréhension de l’évolution des génomes bactériens a connu des avancées significatives. L’impressionnante capacité d’adaptation des bactéries est aujourd’hui majoritairement attribuée au transfert horizontal de gènes (THG) provoqué par les éléments génétiques mobiles (phages, plasmides, transposons…). Dans le débat du rôle des systèmes TA chromosomiques, très peu d’attention a été accordée aux relations phylogénétiques et interactions entre systèmes plasmidiques et chromosomiques co-existant au sein d’un même hôte ainsi qu’à l’impact du THG sur leur évolution. Notre travail de thèse vise à mieux comprendre la biologie des systèmes TA en tenant compte de ces paramètres. Nous nous sommes intéressés à des systèmes homologues au système plasmidique ccdF. Nous avons étudié expérimentalement les 4 systèmes ccd (ccd1, ccd2, ccd3 et ccd4) qui co-habitent au sein du chromosome d’Erwinia chrysanthemi 3937 (une bactérie phytopathogène), leurs interactions intragénomiques et les interactions de ces systèmes avec le système plasmidique ccdF. Ce cadre expérimental a mené à la construction du modèle d’anti-addiction. Ce modèle propose que certains systèmes chromosomiques puissent conférer un avantage sélectif à leurs hôtes bactériens en interférant avec le PSK médié par leurs homologues plasmidiques. Cet avantage sélectif pourrait permettre la fixation de systèmes TA latéralement acquis au sein des populations bactériennes. Nous avons également recherché de nouveaux systèmes ccd au sein des génomes bactériens afin d’avoir un aperçu de leur distribution, des contextes génétiques dans lesquels ils existent et de l’implication du THG dans leur dispersion. Les réflexions qui ont accompagné notre recherche nous ont mené à proposer une synthèse sur le rôle des systèmes TA (plasmidiques et chromosomiques). Celle-ci se nourrit des avancées qui ont été effectuées, ces dernières années, dans la compréhension de l’évolution des génomes bactériens, de la théorie hiérarchique de la sélection naturelle et des processus non-adaptatifs et contingents qui pourraient expliquer la présence et la propagation des systèmes TA au sein des génomes bactériens sans que ceux-ci en soient les agents causaux. <p><p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les systèmes toxine-antitoxines (TA) sont abondants dans la majorité des génomes bactériens séquencés à ce jour. Ces systèmes codent une toxine stable qui inhibe soit la transcription, soit la traduction, et une antitoxine qui contrecarre l’effet de la toxine par formation d’un complexe avec celle-ci. L’antitoxine est instable suite à sa dégradation continue par les protéases ATP-dépendantes. Afin de maintenir un ratio antitoxine :toxine constant en condition normale de croissance, l’expression des systèmes TA est régulée négativement au niveau transcriptionnel par le complexe toxine-antitoxine.<p><p>Au début de notre travail, cinq systèmes TA étaient identifiés dans le chromosome d’E. coli. Il avait été montré par notre laboratoire que parmi ces systèmes, seul yefM-yoeB était activé en condition de surproduction de la protéase ATP-dépendante Lon. Ce résultat était surprenant puisque Lon était connue pour dégrader également l’antitoxine RelB du système chromosomique relBE. Un des objectifs de notre travail était de comprendre les mécanismes sous-jacents à cette spécificité. Nous avons montré que l’antitoxine YefM était dégradée à la fois par Lon et les protéases ClpAP et ClpXP. Nous avons également montré qu’en condition de surproduction de Lon, YefM était fortement instable (t1/2~ 10 min. vs 60 min en condition normale). Cette instabilité accrue permet donc l’activation du système yefM-yoeB, c’est-à-dire la libération de la toxine YoeB du complexe qu’elle forme avec YefM. Nous avons également avons montré que le t1/2 de RelB n’était pas affecté par la surproduction de Lon, ce qui explique pourquoi le système relBE n’est pas activé dans ces conditions. Notre hypothèse était qu’un cofacteur soit nécessaire à la dégradation de RelB par Lon et que celui-ci serait limitant dans nos conditions expérimentales. Le crible génétique que nous avons réalisé n’a cependant pas permis d’identifier de cofacteur de dégradation ni de régulateur transcriptionnel en trans du système relBE. <p><p>Un deuxième volet de notre travail de thèse a consisté en l’étude de la fonction des systèmes TA chromosomiques. L’hypothèse prévalente au début de notre travail était que les systèmes TA soient intégrés dans les voies adaptatives de réponses au stress. Cependant, le résultat de leur activation était controversé. L’hypothèse du groupe de Gerdes était que leur activation mène à un état bactériostatique réversible alors que le groupe d’Engelberg-Kulka montrait que le système mazEF était un système de mort programmée. Afin d’éclaircir le rôle des cinq systèmes TA dans la physiologie d’E. coli, nous avons testé l’effet de nombreux stress sur la croissance et la viabilité de souches sauvages et de souches délétées de ces systèmes. Aucune des conditions que nous avons testées n’a entraîné une diminution de la viabilité excluant de manière définitive l’hypothèse de la mort programmée. De plus, l’inhibition de croissance causée par ces différents stress s’est avérée être indépendante des cinq systèmes, de même que la phase de récupération suivant les différents stress. Enfin, nos expériences de compétition ont clairement démontré que les cinq systèmes ne procuraient aucun avantage sélectif aux bactéries dans des conditions de compétition en carence nutritive. Les systèmes TA étudiés dans ce travail ne jouent donc aucun rôle dans l’adaptation aux stress que nous avons testé puisqu’ils n’améliorent ni l’aptitude (fitness), ni la compétitivité des bactéries dans ces conditions. <p><p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'inflammasome est une plateforme moléculaire composée d'un récepteur de l'immunité innée tels que NLRP3 ou NLRP1b, de la protéine adaptatrice ASC et de la caspase-1. Il joue un rôle essentiel dans le déclenchement de la réponse inflammatoire via l'activation de la caspase-1 qui mène à la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telle que l'IL-1ß. Dans un premier axe de recherche, nous avons mis en évidence que les macrophages de souris déficientes pour ASC traités avec l'activateur de l'inflammasome NLRP1b, la toxine létale de bacillus anthracis, étaient capables de sécréter la forme mature de l'IL-1ß en absence de clivage de la caspase-1 pourtant décrit comme un événement indispensable à son activité. En reconstituant des macrophages caspase-1 KO avec une forme mutante non-clivable de la caspase-1, nous avons démontré que la forme entière de la caspase-1 est capable d'induire la sécrétion d'IL-1ß en réponse à la toxine létale alors qu'elle n'est pas fonctionnelle au sein de l'inflammasome NLRP3.Dans un second axe de recherche, mon travail de thèse s'est intéressé à comprendre le rôle de l'inflammasome au cours de la progression tumorale. En effet, l'IL-1ß est une cytokine fréquemment retrouvée dans le microenvironnement tumorale mammaire suggérant donc l'activation de l'inflammasome au sein des tumeurs. Au moyen d'un modèle de tumeurs in vivo, nous avons montré que l'absence de la caspase-1 et de ASC dans les cellules immunitaires chez la souris conduit à une réduction de la croissance tumorale. De plus, l'absence de ces deux protéines provoque également un plus fort recrutement et une meilleure activité des cellules NK au sein des tumeurs.En plus d'identifier un nouveau mécanisme d'activation de la caspase-1, mon travail de thèse a permis de mettre en évidence le rôle de l'inflammasome dans l'altération des cellules NK au cours de la progression tumorale mammaire. Ces données permettent d'envisager l'inflammasome comme une cible thérapeutique dans le cancer / The inflammasome is a molecular platform composed of an innate immune receptor such as NLRP3 or NLRP1b, of the adaptor protein ASC and of the caspase-1. It plays an essential role in triggering inflammatory response through the activation of caspase-1 that leads to the secretion of pro-inflammatory cytokines such as IL-1ß.In a first research axis, we showed that ASC deficient mice macrophages treated with an NLRP1b inflammasome activator, the lethal toxin of Bacillus anthracis, were able to secrete the mature form of IL-1ß in absence of any cleavage of caspase-1 previously described as an essential event for its function. By reconstituting caspase-1 KO macrophages with an uncleavable mutant form of caspase-1, we showed that the entire form of the protein is able to induce IL-1ß secretion upon lethal toxin treatment but is nonfunctional upon NLRP3 inflammasome activation.In a second research axis, my PhD work focused on underlying the inflammasome role during tumor progression. Indeed, IL-1ß is frequently found within breast tumor microenvironment suggesting that inflammasome is activated in tumors. Using in vivo tumor model, we showed that the absence of caspase-1 of ASC in immune cells lead to a delay tumor growth. In addition, the absence of these two proteins also causes a stronger recruitment and an enchanced activity of NK cells within mammary tumors

La pathogénicité des souches d'Escherichia coli producteurs de Shiga-Toxines (STEC) dans les fromages est peu connue à ce jour et bien que la prévalence des STEC dans les matrices au lait cru soit élevée, le nombre de cas épidémiologiques liés à leur consommation reste rare. L'objectif de la thèse est d'apporter des éléments de compréhension de cette pathogénicité en axant nos travaux sur (i) la caractérisation génétique de souches isolées de produits laitiers, (ii) l'étude de l‘inhibition de l'adhésion des EHEC grâce aux globules gras du lait et des fromages au lait cru. Les données de l'étude sur la diversité génétique par PFGE d'une Une collection de souches de STEC isolées de produits au lait cru présentent une grande diversité de profils de macrorestriction révélés par électrophorèse en champ pulsé (PFGE). L'analyse de leur profil de virulence par approche rt-qPCR a montré que, à l'exception de quelques gènes (stx1/2 chez les STEC O26:H11 et les gènes stx1, nleF et Z6065 chez les STEC O157:H7), ces souches isolées de produits laitiers possèdent le patrimoine génétique propre à déclencher les pathologies à EHEC. Des associations entre les globules gras et les EHEC ont été mise en évidence par microscopie à épi fluorescence. Nos travaux ont également montré une inhibition de l‘adhésion de deux souches EHEC à des enthérocytes en culture (modèle in vitro).Enfin, des tests d‘adhésion des EHEC dans une matrice fromagère appauvrie ou non en globules gras, en modèle souris ont été réalisés. Les données ont montré que la présence de globules gras induit un retard d‘excrétion des EHEC d‘un jour. Les globules gras induisent également une variation du site d‘implantation (de 6 cm) au niveau du colon. Nos travaux apportent des connaissances sur la pathogénicité des STEC issus de produits laitiers. Néanmoins, des études complémentaires sont nécessaires pour statuer sur la pathogénicité des STEC isolés de fromages au lait cru et apporter des réponses concrètes aux industriels de cette filière et aux instances décisionnelles pour l‘établissement d‘une éventuelle réglementation. / Pathogenic Shiga toxin producing Escherichia coli (STEC) are foodborn pathogens wordwild and their pathogenicity in dairy products are yet not well define. Despite their presence in such foodstuff, STEC outbreaks or isolated infectious cases due to consumption of dairy products remain rare. The main objectif of this thesis was to evaluate the potential pathogenicity of STEC in dairy products. This work was divided into two main axes: (i) the genetic characterization of STEC isolated from dairy products and (ii) the inhibition of EHEC adhesion to intestinal tract due to Milk Fat Globule (MFG) of milk and raw milk cheeses. A collection of STEC strains from dairy products showed a hight genetic diversity by PFGE analysis. Virulence profil analysis by rt-qPCR showed that dairy STEC strains present genes implicated into disease enhancement, exception of stx1/2 genes for O26:H11 STEC and stx1, nleF et Z6065 genes for O157:H7 STEC. Interactions between STEC cells and MFG, in raw milk, were confirmed by epifluorescence microscopy. EHEC adherence inhibition property of MFG to enterocytes was demonstrated by an in vitro approach. EHEC adhesion test managed in streptomycin treated CD1 mice demonstrated that the presence of MFG in cheese matrices used to feed animals induced a lag of excretion of EHEC cells one day post-feeding. Moreover, MFG induced a shift of 6 cm of the primo-implantation site of EHEC. Our study provides knowledge about pathogenicity of STEC isolated from dairy products. However, further studies are needed to determine the pathogenicity of the isolated products STEC in raw milk cheeses and provide practical solutions to industrial and risk assessment managers to developed potential reglementations.

Staphylococcus aureus (S. aureus) est un pathogène humain majeur dont l’impact sur la santé publique est majoré par les phénomènes de résistance et de tolérance aux antibiotiques. Au cours de cette thèse, nous avons identifié deux nouveaux systèmes toxine-antitoxine (STA) de type I appartenant au core génome et exprimés par S. aureus nommés sprG2/SprF2, sprG3/SprF3. Ces nouveaux STA sont homologues au STA sprG1/SprF1 localisé dans un îlot de pathogénie. Nous avons montré que des interactions croisées influençant le niveau des ARN sprG et SprF pouvaient avoir lieu entre les STA homologues sprG/SprF, mais que celles-ci n’avaient pas d’impact sur la neutralisation spécifique de chaque toxine SprG par son antitoxine SprF. Nous avons démontré que les peptides encodés par sprG2 et sprG3 sont bactériostatiques, contrairement aux peptides encodés par sprG1 qui sont bactéricides. Nous avons démontré que l’expression des ARN sprG et SprF pouvait varier en réponse à des stress environnementaux comme un stress hyperosmotique ou un stress oxydatif. Pour le STA sprG1/SprF1, nous avons démontré que l’antitoxine SprF1 pourrait participer à l’entrée en persistance de S. aureus, en atténuant la traduction globale via son association aux ribosomes. Ainsi, SprF1 est le premier exemple d’une antitoxine ARN avec une double fonction de neutralisation de la toxine sprG1 via son extrémité 3’ et de fixation aux ribosomes pour atténuer la traduction de S. aureus via son extrémité 5’. Ensemble, ces travaux de thèse suggèrent que les STA sprG/SprF seraient impliqués dans l’adaptation de S. aureus au stress antibiotique ou dans l’échappement au système immunitaire. / Staphylococcus aureus (S. aureus) is a human pathogen that causes nosocomial and community-associated infections. The antibiotic resistance and tolerance of S. aureus increase its impact on public health. During my PhD thesis, we identified two novel type I toxin-antitoxin systems (TAS) located in the core genome and expressed in S. aureus named sprG2/SprF2 and sprG3/SprF3. These TAS are homologues of the sprG1/SprF1 TAS, encoded in a pathogenicity island. We showed that cross-interactions affecting sprG and SprF RNA level can occur between sprG/SprF homologous TAS, but without any impact on the specific neutralization of a sprG toxin by its SprF antitoxin. We demonstrated that overexpression of sprG2- and sprG3-encoded peptide induce bacteriostasis, as opposed to the sprG1-encoded peptides that induced S. aureus death. We showed that sprG and SprF RNA levels can be modulated by environmental triggers such as hyperosmotic and oxidative stresses. Concerning sprG1/SprF1, we demonstrated in S. aureus strain N315 that the SprF1 antitoxin could be involved in persister cells formation, by a translation attenuation mechanism via its association with the ribosomes. SprF1 is the first example of an untranslated RNA antitoxin with a dual function that neutralize sprG1 toxin and that bind to ribosome to attenuate S. aureus translation. Altogether, these thesis experiments suggest an involvement of the sprG/SprF TAS in S. aureus adaptation to antibiotic stress or in the escape of the immune system.

Zielstellung: Ziel dieser kumulativen Dissertationsarbeit war die vergleichende Untersuchung der Wirtsantwort in verschiedenen Mauslinien nach Infektion mit Streptobacillus (S.) moniliformis und Rodentibacter (R.) pneumotropicus mit Anzeigeparametern für die Klinik, die Pathologie und die Immunantwort. Es sollten neue erregerspezifische enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) evaluiert und durch die Bestimmung der Immunglobulin G (IgG)-Subklassen mausstammspezifische Unterschiede in der Immunantwort aufgezeigt werden. Darüber hinaus waren Sentinelsysteme zu bewerten. Material und Methoden: Es wurden BALB/c und C57BL/6-Mäuse intranasal mit S. moniliformis- oder R. pneumotropicus infiziert und mit Kontaktsentinels vergesellschaftet. Zusätzlich wurde benutzte Einstreu der Infektionskäfige auf Käfige mit nichtinfizierten CD1-Mäusen (Einstreu-Sentinels) übertragen. Die Infektionsgruppen wurden über 4 Wochen, die Sentinels mindestens 7 Wochen alle 12 Stunden klinisch untersucht und die Verläufe dokumentiert. Am Ende der Experimente bzw. bei Erreichen spezifischer Abbruchkriterien wurden die Mäuse tierschutzgerecht euthanasiert und definierte Organproben für pathohistologische und bakteriologische Untersuchungen gewonnen. Die Erreger wurden dabei massenspektrometrisch sowie mittels polymerase chain reaction (PCR) differenziert und in Proben des Respirationstraktes quantitativ erfasst. Erregerspezifische Antikörper wurden in tracheonasaler Spülflüssigkeit und im Serum in eigens etablierten ELISA‘s auf Basis von Ganzzellextrakten bestimmt. Weiterhin erfolgte die Messung des Verhältnisses der IgG-Subtypen IgG1 und IgG2 im ELISA. Ergebnisse: Der Infektionsversuch mit S. moniliformis bestätigte mit einer Mortalität von 75% die bekannte hohe Infektionsanfälligkeit der C57BL/6-Mäuse im Gegensatz zu BALB/c, die keine Krankheitsanzeichen entwickelten. Die wichtigsten pathologischen Manifestationen waren eitrig-nekrotisierende Lymphadenitiden und Pneumonien in Verbindung mit der Reisolation des Infektionsstammes. Mithilfe des etablierten ELISA‘s gelang der Nachweis erregerspezifischer IgG-Antikörper im Serum der Tiere beider Linien. Bei den Kontaktsentinels konnte, bis auf eine Ausnahme, weder kulturell, noch serologisch eine Infektion nachgewiesen werden. Gleiches gilt für alle Einstreu-Sentinels. Molekularbiologisch wurde aber Erreger-DNA in den Lungen der Sentinels festgestellt. Die Infektion mit einem R. pneumotropicus Stamm, welcher genotypisch positiv für alle drei bekannten RTX-Toxine dieses Erregers war, führte zu einer unerwartet hohen Morbidität und Mortalität in beiden Mauslinien. In frühzeitig euthanasierten Tieren beider Linien konnten katarrhalisch-eitrige bis nekrotisierende Bronchopneumonien sowie eine Dissemination des Belastungsstammes in zahlreiche innere Organe nachgewiesen werden. In überlebenden Tieren beider Linien wurde eine deutliche Kolonisation respiratorischer Schleimhäute mit dem Belastungsstamm trotz z.T. hoher mukosaler IgA-Spiegel und Serokonversion im Blut nachgewiesen. Überlebende C57BL/6 Mäuse zeigten eine signifikant niedrigere Bakterienlast in inneren Organen als BALB/c Mäuse. In allen Kontaktsentinels, aber nicht in einem einzigen Einstreu-Sentinel, konnte kulturell und indirekt serologisch eine Infektion mit R. pneumotropicus nachgewiesen werden. Die Bestimmung der IgG-Subklassen in den Seren der C57BL/6-Mäuse beider Infektionsstudien ergab eine Verschiebung des Verhältnisses IgG2/IgG1 von unter 0,8 vor zu über 1,6 nach Infektion. Dies weist auf eine T-Helferzell (Th) 1-dominierte Immunantwort hin. BALB/c-Mäuse behielten dagegen ein Verhältnis unter 0,8 auch nach der Infektion bei, sodass auf eine Th2- Antwort zu schließen war. Schlussfolgerungen: Sowohl für S. moniliformis als auch für R. pneumotropicus konnten Tiermodelle mit diversen Anzeigeparametern etabliert werden, welche für Folgestudien zur Pathogenese oder Immunprophylaxe genutzt werden können. Für beide Erreger wurden neue sensitive und spezifische ELISA-Protokolle in die Diagnostik eingeführt. Kontaktsentinels, aber nicht Einstreu-Sentinels, sind gut geeignet, um R. pneumotropicus-Infektionen nachzuweisen. Die beobachtete stammspezifische Klinik, Pathologie und Immunantwort der C57BL/6-Mäuse nach experimenteller S. moniliformis-Infektion sprach für eine pathologische Th1-Immunantwort. Im Gegensatz dazu war im R. pneumotropicus – Infektionsversuch die Th1-Immunantwort der C57BL/6-Mäuse mit einer effektiveren Reduktion des Erregers in inneren Organen assoziiert. Die unerwartet hohe Morbidität und Mortalität im R. pneumotropicus –Infektionsversuch weist auf eine besonders hohe Virulenz des eingesetzten Stammes hin, sodass in dieser Arbeit erstmalig ein septikämischer Verlauf in Wildtyp-Mäusen nach intranasaler R. pneumotropicus-Infektion nachgewiesen werden konnte.:Inhaltsverzeichnis (I) Abkürzungsverzeichnis (III) 1 Einleitung (1) 2 Literatur (3) 2.1 Streptobacillus moniliformis (3) 2.1.1 Allgemeine Charakteristika (3) 2.1.2 Differenzierung von Streptobacillus spp.(4) 2.1.3 Serologische Methoden zum indirekten Nachweis einer Streptobacillus moniliformis - Infektion (5) 2.1.4 Epidemiologie der durch Streptobacillus moniliformis hervorgerufenen Zoonose (6) 2.1.5 Klinik und Pathologie der Streptobacillus moniliformis-Infektion bei Nagetieren (8) 2.1.6 Klinik und Pathologie der Streptobacillus moniliformis-Infektion in Menschen und anderen Nebenwirten (9) 2.1.7 Pathogenese und Virulenzfaktoren (10) 2.1.8 Prävalenz in Nagern (11) 2.1.9 Sanierung Streptobacillus moniliformis infizierter Nagetierbestände und Prävention (12) 2.2 Rodentibacter (R.) pneumotropicus und heylii (Pasteurella (P.) pneumotropica Biotyp Jawetz und Heyl) (14) 2.2.1 Allgemeine Charakteristika (14) 2.2.2 Ursprüngliche Einteilung in Biotypen und Reklassifikation zu Rodentibacter spp. (14) 2.2.3 Differenzierung von Rodentibacter spp. (15) 2.2.4 Serologische Methoden zum indirekten Nachweis einer Rodentibacter- Infektion (15) 2.2.5 Übertragung (15) 2.2.6 Klinik und Pathologien der Rodentibacter-Infektion in Nagern (16) 2.2.7 Pathogenese und Virulenzfaktoren (18) 2.2.8 Prävalenz (19) 2.2.9 Sanierung Rodentibacter pneumotropicus infizierter Nagetierbestände und Prävention (20) 2.3 Mäuse als Versuchstiere (22) 2.3.1 Inzucht-Stämme (22) 2.3.1.1 Merkmale, Verwendung und Historie der BALB/c-Wildtypmäuse (22) 2.3.1.2 Merkmale, Verwendung und Historie der C57BL/6-Wildtypmäuse (23) 2.3.1.3 Unterschiede der Immunreaktionen in C57BL/6- und der BALB/c- Mäusen (23) 2.3.2 Auszucht-Stämme (24) 2.3.2.1 Merkmale, Verwendung und Historie der CD1-Wildtypmäuse (24) 2.4 Gesundheitsmonitoring in Labortierhaltungen (25) 2.4.1 Empfehlungen der Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA) (25) 2.4.2 Sentinelsysteme für das Gesundheitsmonitoring in Labormausbeständen (26) 3 Publikationen (28) 3.1 Fornefett J, Krause J, Klose K, Fingas F, Hassert R, Eisenberg T, Grunwald T, Müller U, Schrödl W, Baums CG. Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6J mice infected with Streptobacillus moniliformis. Microbes and Infection. 2018;20(2):101-110 (28) 3.2 Fornefett J, Krause J, Klose K, Fingas F, Hassert R, Benga L, Grunwald T, Müller U, Schrödl W, Baums CG. Comparative analysis of humoral immune responses and pathologies of BALB/c and C57BL/6 wildtype mice experimentally infected with a highly virulent Rodentibacter pneumotropicus (Pasteurella pneumotropica) strain. BMC Microbiology. 2018;18(1):45 (39) 4 Übergreifende Diskussion (51) 5 Zusammenfassung (59) 6 Summary (61) 7 Literaturverzeichnis (63) 7.1 Fachliteratur (63) 7.2 Internet (76) 7.3 Gesetzestexte (78) Anhang (79) i Ergänzende Abbildungen (79) ii Ergänzendes Material zu 3.1 “Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6J mice infected with Streptobacillus moniliformis” (81) iii Ergänzendes Material zu 3.2 “Comparative analysis of humoral immune responses and pathologies of BALB/c and C57BL/6 wildtype mice experimentally infected with a highly virulent Rodentibacter pneumotropicus (Pasteurella pneumotropica) strain” (83) Liste mit weiteren Veröffentlichungen Danksagung / Objective: Aim of this cumulative doctoral thesis was the comparative analysis of the host response in different mice strains infected with Streptobacillus (S.) moniliformis and Rodentibacter (R.) pneumotropicus with readout parameters for clinics, pathology and immune response. New pathogen specific enzyme linked immunosorbent assay’s (ELISA) were evaluated. Differentiation of immunoglobulin (Ig) G subclasses was conducted to reveal differences in the immune response between the two mice strains. Furthermore, sentinel systems were assessed. Materials and methods: BALB/c and C57BL/6 mice were infected intranasally with S. moniliformis or R. pneumotropicus and housed together with contact sentinels. Soiled bedding from infection cages was transmitted to cages with uninfected CD1 mice (bedding sentinels). Infection groups were observed for 4 weeks, sentinels for at least 7 weeks and the clinical course was documented. At the end of the experiments or when predefined termination criteria were reached, animals were humanely killed. Predefined organ samples were collected for pathohistological and bacteriological screenings. Pathogens were differentiated via mass spectrometry and via polymerase chain reaction (PCR). The specific bacterial load was quantified in samples of the respiratory tract. Pathogen-specific antibodies were detected in tracheonasal lavages and sera using newly established ELISAs based on whole cell extracts. Determination of the ratios of the IgG subtypes (IgG1 to IgG2) was conducted using ELISAs. Results: The S. moniliformis experiment confirmed the known high susceptibility of C57BL/6 mice with a mortality of 75%. This was in contrast to BALB/c, which developed no signs of illness. The major pathologies were purulent-necrotizing inflammations of the lymph nodes and the lung associated with detection of the challenge strain. Specific IgG-antibodies were detected in sera of both mice strains by the newly established ELISAs. In contact and bedding sentinels the infection was not detected by culture or indirectly by serology, except for one contact sentinel. However, pathogen DNA was detectable in the lungs of these animals via PCR. The infection with the R. pneumotropicus strain, which is genotypically positive for all 3 known RTX toxins of this pathogen, leaded to an unexpected high morbidity and mortality in both mice strains. In early losses a catharal-purulent to necrotizing bronchopneumonia as well as dissemination of the challenge strain in various inner organs was recorded. Efficient colonization of the respiratory mucosa through the challenge strain was detected in survivors of both lines despite high mucosal IgA levels and seroconversion in the blood. Surviving C57BL/6 mice showed a significant lower bacterial burden in inner organs than BALB/c. All contact sentinels were culturally and serologically positive for R. pneumotropicus infection in contrast to all bedding sentinels. Differentiation of IgG subclasses in sera of C57BL/6 mice of both experiments revealed a shift of the IgG2/IgG1 ratio from 0.8 prior to infection to 1.6 post infection suggesting a T helper (Th) 1-prone immune response. BALB/c mice remained under 0.8 after infection indicating a Th2-prone immune response. Conclusions: New animal models with various readout parameters were established for both S. moniliformis and R. pneumotropicus. These models can be used in future studies on pathogenesis and immunoprophylaxis. Sensitive und specific ELISA-protocols were established for both pathogens. Contact sentinels but not bedding sentinels are appropriate for detection of R. pneumotropicus-infections. The observed distinct clinic, pathology and immune response of C57BL/6 mice experimentally infected with S. moniliformis indicated on the one hand a pathological Th1 immune response. On the other hand, the Th1 response of C57BL/6 mice to R. pneumotropicus infection was associated with a more efficient clearance of the challenge strain in internal organs. The unprecedented high morbidity and mortality in the R. pneumotropicus experiment indicates high virulence of this strain. Accordingly, this work revealed for the first time septicaemia in wildtype mice after intranasal R. pneumotropicus-infection.:Inhaltsverzeichnis (I) Abkürzungsverzeichnis (III) 1 Einleitung (1) 2 Literatur (3) 2.1 Streptobacillus moniliformis (3) 2.1.1 Allgemeine Charakteristika (3) 2.1.2 Differenzierung von Streptobacillus spp.(4) 2.1.3 Serologische Methoden zum indirekten Nachweis einer Streptobacillus moniliformis - Infektion (5) 2.1.4 Epidemiologie der durch Streptobacillus moniliformis hervorgerufenen Zoonose (6) 2.1.5 Klinik und Pathologie der Streptobacillus moniliformis-Infektion bei Nagetieren (8) 2.1.6 Klinik und Pathologie der Streptobacillus moniliformis-Infektion in Menschen und anderen Nebenwirten (9) 2.1.7 Pathogenese und Virulenzfaktoren (10) 2.1.8 Prävalenz in Nagern (11) 2.1.9 Sanierung Streptobacillus moniliformis infizierter Nagetierbestände und Prävention (12) 2.2 Rodentibacter (R.) pneumotropicus und heylii (Pasteurella (P.) pneumotropica Biotyp Jawetz und Heyl) (14) 2.2.1 Allgemeine Charakteristika (14) 2.2.2 Ursprüngliche Einteilung in Biotypen und Reklassifikation zu Rodentibacter spp. (14) 2.2.3 Differenzierung von Rodentibacter spp. (15) 2.2.4 Serologische Methoden zum indirekten Nachweis einer Rodentibacter- Infektion (15) 2.2.5 Übertragung (15) 2.2.6 Klinik und Pathologien der Rodentibacter-Infektion in Nagern (16) 2.2.7 Pathogenese und Virulenzfaktoren (18) 2.2.8 Prävalenz (19) 2.2.9 Sanierung Rodentibacter pneumotropicus infizierter Nagetierbestände und Prävention (20) 2.3 Mäuse als Versuchstiere (22) 2.3.1 Inzucht-Stämme (22) 2.3.1.1 Merkmale, Verwendung und Historie der BALB/c-Wildtypmäuse (22) 2.3.1.2 Merkmale, Verwendung und Historie der C57BL/6-Wildtypmäuse (23) 2.3.1.3 Unterschiede der Immunreaktionen in C57BL/6- und der BALB/c- Mäusen (23) 2.3.2 Auszucht-Stämme (24) 2.3.2.1 Merkmale, Verwendung und Historie der CD1-Wildtypmäuse (24) 2.4 Gesundheitsmonitoring in Labortierhaltungen (25) 2.4.1 Empfehlungen der Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA) (25) 2.4.2 Sentinelsysteme für das Gesundheitsmonitoring in Labormausbeständen (26) 3 Publikationen (28) 3.1 Fornefett J, Krause J, Klose K, Fingas F, Hassert R, Eisenberg T, Grunwald T, Müller U, Schrödl W, Baums CG. Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6J mice infected with Streptobacillus moniliformis. Microbes and Infection. 2018;20(2):101-110 (28) 3.2 Fornefett J, Krause J, Klose K, Fingas F, Hassert R, Benga L, Grunwald T, Müller U, Schrödl W, Baums CG. Comparative analysis of humoral immune responses and pathologies of BALB/c and C57BL/6 wildtype mice experimentally infected with a highly virulent Rodentibacter pneumotropicus (Pasteurella pneumotropica) strain. BMC Microbiology. 2018;18(1):45 (39) 4 Übergreifende Diskussion (51) 5 Zusammenfassung (59) 6 Summary (61) 7 Literaturverzeichnis (63) 7.1 Fachliteratur (63) 7.2 Internet (76) 7.3 Gesetzestexte (78) Anhang (79) i Ergänzende Abbildungen (79) ii Ergänzendes Material zu 3.1 “Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6J mice infected with Streptobacillus moniliformis” (81) iii Ergänzendes Material zu 3.2 “Comparative analysis of humoral immune responses and pathologies of BALB/c and C57BL/6 wildtype mice experimentally infected with a highly virulent Rodentibacter pneumotropicus (Pasteurella pneumotropica) strain” (83) Liste mit weiteren Veröffentlichungen Danksagung

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable d’infections nosocomiales sévères associées à un taux élevé de mortalité. Le système de sécrétion de Type III (SST3) et les effecteurs qu’il injecte sont considérés comme des facteurs de virulence prépondérants de P. aeruginosa. Récemment nous avons caractérisé, un groupe de souches ne possédant pas les gènes du SST3, mais dont la virulence repose sur la sécrétion d’une nouvelle toxine de 172 kDa, nommée Exolysine (ExlA) qui provoque la perméabilisation de la membrane des cellules hôtes. ExlA est sécrétée dans le milieu par une porine de la membrane externe, nommée ExlB, formant ainsi un nouveau système de sécrétion à deux partenaires (TPS), ExlBA. Outre le domaine TPS du coté N-terminal de la protéine, impliqué dans sa sécrétion, ExlA possède différents domaines ; des répétitions hémagglutinines, cinq motifs Arginine-Glycine-Acide Aspartique (RGD) et un domaine C-Terminal faiblement conservé. Des tests de cytotoxicité sur des cellules eucaryotes ont montrés que la délétion du domaine C-terminal abolissait l’activité toxique d’ExlA. En utilisant un modèle de liposomes et différents types de cellules eucaryotes, comme les globules rouges, nous avons démontré qu’ExlA forme des pores membranaires de 1.6 nm. De plus, par un criblage cellulaire à haut-débit d’une banque de mutants obtenus par une mutagenèse de transposition, nous avons montré qu’un facteur bactérien additionnel était requis dans la toxicité d’ExlA. En effet, parmi les 7 400 mutants, nous avons identifiés 3 transposons insérés dans des gènes codant pour le pili de type IV, démontrant ainsi que cet appendice impliqué dans l’adhésion des bactéries participe à la toxicité d’ExlA, en permettant un contact rapproché entre la bactérie et les cellules hôtes. Un criblage de macrophages primaires de souris KO pour différentes protéines impliquées dans la voie de l’activation de l’inflammasome, nous a permis de démontrer que le pore formé par ExlA est responsable de l’activation de la Caspase-1 par l’inflammasome NLRP3 conduisant à la maturation de l’interleukine-1ß. Une étude bio-informatique a révélé la présence de gènes homologues à exlA chez d’autres espèces de Pseudomonas non pathogènes, comme P. putida, P. protegens, P. entomophila. Nous avons montré que ces bactéries environnementales sont aussi capables de provoquer une mort cellulaire dépendante de la Caspase-1. Finalement, un criblage d’une banque de macrophages dont les gènes ont été invalidés par la technologie CRISPR/cas9 a révélé que plusieurs protéines du système immunitaire, indirectement liées à l’activation de la Caspase-1 sont impliquées dans la mort cellulaire médiée par ExlA. De plus, nous avons montré que plusieurs sgRNAs ciblant un microARN, mir-741, était grandement enrichi dans les macrophages ayant résisté à une infection avec ExlA. Mir-741 régule l’expression d’enzymes (St8sIa1 et Agpat5) impliquées dans la voie de biosynthèse des sphingolipides et des glycérophospholipides, suggérant ainsi que l’activité d’ExlA requiert un environnement lipidique particulier. / Pseudomonas aeruginosa is a human opportunistic pathogen responsible for nosocomial infections associated with high mortality. The type III secretion system (T3SS) and T3SS-exported toxins have been considered as key infectivity virulence factors. Our team recently characterized a group of strains lacking T3SS, but employing a new pore-forming toxin of 172 kDa, named Exolysin (ExlA) that provokes cell membrane disruption. In this work we demonstrated that the ExlA secretion requires ExlB, a predicted outer membrane protein encoded in the same operon, showing that ExlA-ExlB define a new active Two-Partner Secretion (TPS) system. In addition to the TPS secretion signals, ExlA harbors several distinct domains, which comprise hemagglutinin domains, five Arginine-Glycine-Aspartic acid (RGD) motifs and a non-conserved C-terminal region lacking any identifiable sequence motifs. Cytotoxic assays showed that the deletion of the C-terminal region abolishes host-cell cytolysis. Using liposomes and eukaryotic cells, including red blood cells, we demonstrated that ExlA forms membrane pores of 1.6 nm. Based on a transposon mutagenesis strategy and a high throughput cellular live-dead screen, we identified additional bacterial factors required for ExlA-mediated cell lysis. Among 7 400 mutants, we identified three transposons inserted in genes encoding components of the Type IV pili, which are adhesive extracellular appendices. Type IV pili probably mediate close contact between bacteria and host cells and facilitate ExlA cytotoxic activity. These findings represent the first example of cooperation between a pore-forming toxin of the TPS family and surface appendages to achieve host cell intoxication. Using mice primary bone marrow macrophages we showed that ExlA pores provoke activation of Caspase-1 via the NLRP3-inflamasomme followed by the maturation of the pro-interleukin-1ß. Mining of microbial genomic databases revealed the presence of exlA-like genes in other Pseudomonas species rarely associated with human infections P. putida, P. protegens and P. entomophila. Interestingly, we showed that these environmental bacteria are also able to provoke Caspase-1 cleavage and pro-inflammatory cell death of macrophages. Finally, genome-wide loss-of-function CRISPR/cas9 RAW library screen revealed that several components of the immune system response, indirectly linked to Caspase-1 are involved in the ExlA-mediated cell lysis. Moreover, we found at least three sgRNAs targeting miRNA, mir-741 were highly enriched in resistant macrophages challenged by ExlA. This miRNA regulates enzymes (St8sIa1 and Agpat5) in the sphingolipids and glycerophololipids biosynthesis pathways, suggesting that ExlA activity may require proper lipid environment.