La maurocalcine (MCa) est une toxine de 33 acides aminés initialement issue du venin du scorpionScorpio maurus palmatus, et est considérée comme faisant partie de la famille des CPP(Cell Penetrating Peptides) depuis de nombreuses années déjà. La MCa présente donc un intérêtthérapeutique certain dans le domaine de la délivrance intracellulaire de cargos, et lestravaux exposés ici cherchent à caractériser au mieux les propriétés de pénétration de la moléculenative ainsi que celle de certains de ses variants.Après avoir quantifié l’internalisation de plusieurs variants tronqués (linéaires), j’ai pu mettreen évidence le fait que tous ces analogues testés ont une capacité à être internalisés bien plusélevée que celle des CPP de référence (notamment Tat et la pénétratine). Parmi ces variants,l’analogue MCaUF1−9 présente l’avantage d’un temps de rétention relativement élevé au seindes cellules, ainsi que d’une accumulation légèrement accrue en environnement acide (ce quiadvient lors de la formation tumeurs solides). Ce nouveau CPP possède donc un certain potentielthérapeutique mais l’étude de la MCa native, remarquablement stable in vivo, reste plusque jamais d’actualité. / Maurocalcine (MCa) is a 33-mer toxin originally isolated from the venom of the scorpioScorpio maurus palmatus, and has been considered as a cell-penetrating peptide (CPP) for severalyears. MCa presents a therapeutic interest for the intracellular delivery of cargoes, andthis thesis aims to characterise the cell penetration properties of the native molecule as well assome of its variants’.After quantifying several truncated (linear) variants’ internalisation, I have been able tohighlight the fact that all of those analogs possess a higher internalization ability than those ofstandard CPP (especially Tat and penetratin). Among those variants, the analog MCaUF1−9 hasa relatively high rentention time within cells, as well as a slightly increased accumulation whenin an acidic environment (which occurs during solid tumours formation). This new CPP showsa certain therapeutic potential but the study of nativeMCa, remarkably stable in vivo, remainsa priority.

Une des principales limites de la chimiothérapie du cancer est le manque de sélectivité des agents cytotoxiques vis-à-vis des cellules tumorales, entrainant de nombreux effets secondaires. L’intérêt de la vectorisation est d’administrer l’agent cytotoxique sélectivement aux cellules cancéreuses et ainsi d’éviter de faire subir l’action du médicament aux cellules saines. Cette thèse a pour but de synthétiser des prodrogues multivalentes qui utilisent la sous unité B de la toxine de Shiga (STxB) comme agent de vectorisation, ciblant préférentiellement les cellules cancéreuses Gb3-positives. Les deux agents cytotoxiques choisis, un dérivé de la camptothécine et de l’auristatine, ont été liés de façon covalente auvecteur via un espaceur bifonctionnel clivable par le glutathion. L’espaceur a également été remplacé par un répartiteur multivalent susceptible de délivrer une quantité plus importante d’agent cytotoxique à l’intérieur des cellules tumorales.Parallèlement à ce projet de vectorisation d’un agent thérapeutique, des sondes IRM capables de marquer in vivo les tumeurs possédant à leur surface le récepteur Gb3 ont été synthétisées. L’IRM a une très bonne définition spatiale, mais souffre d’un manque de sensibilité. Pour augmenter le contraste, nous avons utilisé une stratégie reposant sur lamultivalence des espaceurs liés à des molécules de DOTA-Gd, un agent de contraste classiquement utilisé en IRM. Ces dernières ont été fixées à STxB via un répartiteur multivalent (des nano-bâtonnets d’or). Le signal IRM est plus intense et donc plus facile à détecter. Enfin, nous avons développé une nouvelle méthode chimique basée sur la ligationoxime pour optimiser la création de conjugués entre STxB et des antigènes comme outils de vaccination. Le conjugué STxB-ovalbumine a permis une meilleure présentation de l’antigène par les cellules dendritiques, conduisant chez la souris à une induction efficace de lymphocytes T. / Pas de résumé en anglais

Les systèmes toxine-antitoxine (TA) sont composés d’une toxine intracellulaire qui cible un processus cellulaire essentiel et qui est neutralisée par une antitoxine. Ces systèmes sont très abondant chez les bactéries et sont impliqués dans la réponse aux stress, la formation de biofilm, le phénomène de persistance, etc.<p>Mon projet de thèse a porté sur l’étude de la diversité des systèmes TA à deux niveaux. Dans un premier temps, plusieurs toxines de la famille RelE provenant de différentes espèces bactériennes et associées à des antitoxines non-canoniques ont été étudiées. Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons caractérisé l’activation spécifique de deux systèmes TA d’Escherichia coli au niveau de la régulation transcriptionnelle du système et de l’activation de la toxine. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les systèmes toxine-antitoxine sont divisés en trois classes suivant la nature et le mode d’action de l’antitoxine. Ils sont fortement représentés au sein du règne bactérien et se trouvent sur des éléments génétiques mobiles qu’ils stabilisent dans la population bactérienne, mais aussi sur les chromosomes bactériens où leur fonction n’a pas encore été établie avec certitude. Au cours de ce travail, nous avons étudié les systèmes toxine-antitoxine bactériens de classe II, qui sont généralement composés de deux gènes organisés en opéron. Le premier gène code pour une antitoxine qui antagonise l’activité de la toxine, le produit du second gène. L’antitoxine, en complexe avec la toxine, est également capable de réguler l’expression de l’opéron en se fixant au promoteur de l’opéron. Lors du commencement de cette étude, les systèmes toxine-antitoxine étaient divisés en 10 familles sur base des similarités de séquences partagées par les toxines. A chaque famille de toxine était associée une famille d’antitoxine. <p>\ / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les systèmes toxine-antitoxine (TA) sont composés de deux gènes organisés en opéron retrouvés chez la quasi-totalité des bactéries ainsi que chez les archées. Ils ont été découverts sur des plasmides, où ils induisent une tuerie post-segregationnelle (PSK). En effet, l’antitoxine est instable car elle est dégradée par une protéase ATP dépendante. Lors de la réplication, si un plasmide portant un système TA n’est pas transmis à la cellule fille, celle-ci recevra tout de même une partie du cytoplasme de la cellule mère qui contenait des protéines de toxine et d’antitoxine. Cette dernière étant instable, et sans synthèse de novo, la toxine va se retrouver libre d’affecter sa cible cellulaire. Un système TA crée donc une addiction au plasmide qui le porte, stabilisant celui-ci.<p>Les systèmes TA se retrouvent également, dans un nombre de copies variable, au sein du chromosome. Dans ce cas, plusieurs hypothèses existent quant à leur fonction, comme la mort cellulaire programmée, la réponse au stress, la stabilisation de régions génomiques non essentielles, ou l’anti-addiction au plasmide.<p>L’origine et l’évolution des systèmes TA restent inconnues, alors qu’ils présentent des aspects intrigants. En effet, les toxines CcdB et MazF ont des séquences et des activités toxiques très différentes, malgré une structure proche ;les toxines RelE et ParE présentent des séquences proches, mais des fonctions différentes. À l’heure actuelle, les deux hypothèses concernant l’origine évolutive des systèmes TA sont soit qu’ils seraient tous issus d’un ancêtre commun, soit qu’ils auraient été réinventés plusieurs fois au cours de l’évolution, à partir d’un nombre limité de gènes.<p>Au cours de cette thèse, nous avons abordé la question de l’origine et l’évolution des systèmes TA de plusieurs manières :par la reconstruction de phylogénies et de séquences ancestrales, et par l’étude d’un système chromosomique particulier au sein de nombreuses souches d’Escherichia coli. Enfin, nous nous avons décidé d’analyser le contexte génomique des systèmes TA chromosomiques. Ces travaux ont notamment permis de mieux comprendre l’évolution des systèmes TA, et de conforter l’hypothèse selon laquelle ils seraient des éléments égoïstes, évoluant au sein des génomes sans gain d’aptitude pour l’hôte.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’introduction commence avec la description de toxines d’origines bactérienne et végétale, en particulier la toxine Shiga ainsi que les toxines de la même famille (chapitre 9.1.2). Les petites molécules inhibitrices de ces toxines sont ensuite résumées dans le chapitre 9.1.3, en particulier le composé Retro-2. L’efficacité de ces toxines à atteindre leurs cibles reposant sur le trafic intracellulaire, un aperçu général de l’endocytose et du trafic endosomal sont présentés (chapitre 9.2). Puis, l’entrée de la voie rétrograde est décrite (chapitre 9.2.5), avec un intérêt particulier porté sur la clathrine, le rétromère et GPP130, une protéine qui circule de manière continue entre le Golgi, la membrane plasmique et les endosomes. Les protéines SNARE, en particulier la syntaxine-5 et le syntaxine-16, sont ensuite introduites (chapitre 9.2.6). Après une brève section sur les micro-ARNs de la famille 199 (chapitre 9.3), l’introduction se termine avec la description des techniques clés utilisées au cours de mon travail, tels que la chimie click bio-orthogonale, la synchronisation du trafic antérograde par rétention grâce à des hameçons spécifiques (RUSH), et la ligation par proximité basé sur des anticorps (chapitre 9.4).Ci-inclus, mon article en cours de soumission ouvre la partie résultats (chapitre 10.1), dans laquelle je présente l’intérêt de la chimie click bio-orthogonale pour identifier les cibles cellulaires de Retro-2. Je décris un des candidats potentiels, Sec16A, et illustre comment grâce à la technique de RUSH, perturber la fonction de Sec16A conduit à la relocalisation partielle de la syntaxin-5 au niveau du reticulum endoplasmique via l’inhibition du transport antérograde de la syntaxine-5. La seconde partie de l’article décrit comment la relocalisation de la syntaxine-5 induit l’inhibition du trafic de la toxine Shiga des endosomes au TGN. Je présente une nouvelle interaction entre la syntaxine-5 et la protéine TGN GPP130, qui ont déjà été caractérisées en relation avec le trafic de la toxine Shiga. Mon travail connecte à la fois les facteurs de trafic avec le trafic rétrograde au niveau de l’interface endosome-TGN. De manière frappante, cette interaction est très probablement basée sur une fonction non-SNARE de la syntaxine-5 car le domaine de fixation sur GPP130 est structurellement non lié à toute fonction SNARE.En collaboration avec Juan Francisco Aranda et Carlos Fernandez aux Etats-Unis, nous avons placés des micro-ARNs dans un contexte de régulation endogène du trafic rétrograde de la toxine Shiga (chapitre 11.2). Une discussion plus approfondie sera apportée dans le chapitre 12.Enfin, une vue d’ensemble des projets en cours est apportée dans la section des perspectives (chapitre 12), dans laquelle les collaborations plus approfondies sont mises en lumière.Mots clés : transport rétrograde, toxine Shiga, toxine de la famille Shiga, STxB, syntaxin-5, Sec16A, GPP130, Retro-2, Retro-2.1, chimie click sans cuivre, identification des cibles de petites molécules, spétrométrie de masse, function non-SNARE, inhibition du trafic antérograde, miARN, miR199, rétromère, VPS26 / The introduction of my PhD manuscript starts with describing plant and bacterial toxins (chapter 9.1), in particular Shiga toxin and Shiga-like toxins (SLTs) (chapter 9.1.2). Small molecule inhibitors of these toxins are summarized afterwards in chapter 9.1.3, notably the Retro-2 compound. Since these toxins rely on intracellular trafficking to reach their molecular targets, a general overview of endocytosis and endosomal trafficking is provided (chapter 9.2). Next, the retrograde route entry is presented (chapter 9.2.5), with focus on clathrin, the retromer and GPP130, a protein that constantly cycles between Golgi, plasma membrane, and endosomes. SNARE proteins, particularly syntaxin-5 and syntaxin-16, are then introduced (chapter 9.2.6). After a brief section of the micro RNA family 199 (chapter 9.3), the introduction finishes with the description of some salient techniques that were used in my work, such as - bio-orthogonal Click-Chemistry, anterograde trafficking synchronization with the retention using selective hooks (RUSH) assay, and the antibody-based proximity ligation assay (chapter 10.6.1, 0, 10.11.1).Herein, my submitted publication opens the results part (chapter 11.1), in which I present the utility of biorthogonal click chemistry for the search of the cellular targets of Retro-2, a small molecule inhibitor that was previously shown to protect cells and animals against Shiga toxin and ricin. I describe that Sec16A is a likely cellular target candidate, and illustrate using the RUSH approach how interfering with Sec16A functions leads to the partial relocalization of syntaxin-5 to the endoplasmic reticulum (ER) by slowing-down its anterograde transport. The second part of the paper describes how syntaxin-5 relocalization causes the inhibition of Shiga toxin trafficking from endosomes to the TGN. I present a novel interaction between syntaxin-5 and the Golgi protein GPP130, which both have been already described in relation to Shiga toxin trafficking. My work connects both trafficking factors in retrograde trafficking at the endosomes-TGN interface. Strikingly, I demonstrate that this interaction is most probably based on a non-SNARE function of syntaxin-5.In collaboration with Juan Francisco Aranda and Carlos Fernandez in the US, we put micro RNAs into an endogenous regulation context of Shiga toxin retrograde trafficking (chapter 11.2). An extended discussion will be given in chapter 12.Last, a general outlook of ongoing projects is given in the perspectives section (chapter 13), in which further collaborations are highlighted.Keywords: Retrograde transport, Shiga toxin, Shiga-like toxin (SLT), STxB, syntaxin-5, Sec16A, GPP130, Retro-2, Retro-2.1, azide-functionalized Retro-2, copper-free click chemistry, small molecule target identification, mass spectrometry, non-SNARE function, anterograde trafficking inhibition, miRNA, miR199, retromer, VPS26

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, das Vorkommen subklinischer und klinischer Eutergesundheitsstörungen in 33 Milchviehherden in Jalisco, Mexiko, aufzuzeigen. Von 2937 mittels CMT untersuchten Eutervierteln zeigten 1996 (66,9%) eine positive und hiervon 1087 (37%) eine deutlich bis stark positive Reaktion. Im Abgleich mit den bakteriologischen Untersuchungen ergab sich eine Prävalenz an subklinischen Mastitiden in Höhe von 43,7%. Klinische Mastitiden ließen sich zu 2,5% nachweisen. 53,8% der untersuchten Milchproben zeigten bakteriologisch keinen Keimgehalt. Aus den übrigen Proben konnten zu 15,6% KNS, 14,0% Corynebacterium spp. 6,7% S. agalactiae, 5,9% S. aureus, 4,1% coliforme Keime, 3,7% Streptococcus spp. und 1,7% sonstige Keime (Bacillus spp., Nocardia spp., Candida spp.) isoliert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass neben den kontagösen Mastitiserregern wie S. aureus und S. agalactiae minorpathogene Erreger zu einem hohen Anteil am Mastitisgeschehen in Jalisco beteiligt sind. Mit Hilfe der Pulsfeldgelelektrophorese konnte gezeigt werden, dass in jedem der Betriebe, in denen S. aureus isoliert werden konnte, überwiegend ein einzelner Genotyp für das Mastitisgeschehen verantwortlich war. Die betriebsspezifischen Genotypen zeigten überwiegend eine enge Verwandtschaft zu den Genotypen aus anderen Betrieben. Hierdurch konnte der kontagiöse Charakter dieses Mastitiserregers und ein dominierendes Vorkommen bestimmter S. aureus-Klone belegt werden. Durch die Besichtigung der Betriebe und Befragung der Betriebsleiter konnten Defizite in der Haltungs- und Melkhygiene aufgezeigt werden. Sie korrelierten statistisch signifikant mit erhöhter Mastitisprävalenz und mit erhöhten Nachweisraten von kontagiösen Mastitiserregern. Vorbeugende, kontrollierende und korrigierende Maßnahmen wurden vorgeschlagen und erörtert. Durch die genannten Programme zur Vorbeuge und Kontrolle der Mastitis könnte die Milchproduktion in Jalisco und Mexiko um bis zu 20% gesteigert und somit das starke Defizit des mexikanischen Milchsektors sowie die hohen Milchpulverimportmengen minimiert werden. Da die verminderte bakteriologische Qualität der Milch von an subklinischer Mastitis erkrankten Kühen außerdem, insbesondere vor dem Hintergrund des hohen Rohmilchkonsums, ein mögliches gesundheitliches Risiko für den Verbraucher darstellt, wurden 17 der aus den Betrieben isolierten S. aureus-Isolate auf ihr Toxinbildungsvermögen und ihre Toxin-Genmuster hin untersucht. Nur bei einem Stamm konnte ein Amplifikat für das SEI Gen nachgewiesen werden. Keiner der untersuchten Stämme beherbergte Gene für die SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEG, SEJ und das TSST-1. Trotz dieser geringen Nachweisrate sollte in Mexiko durch Einführung eines konsequent durchgeführten Mastitiskontrollprogramms Milch mit einer höheren hygienischen Wertigkeit produziert und somit das vom Lebensmittel Milch für den Verbraucher ausgehende gesundheitliche Risiko reduziert werden. / Aim of the present work was to prove the occurrence of subclinic and clinic disturbances of udder health in 33 herds of dairy cattle in Jalisco, Mexico. 1996 (66.9 %) out of 2937 udder quarters examined by means of CMT showed a positive reaction, 1087 (37%) out of these reactions were from clearly up to significantly positive reactions. Compared to the bacteriological examinations the prevalence for subclinic mastitides came up to 43.7%. On the other hand clinical mastitides could be proved in 2.5%. In 53.8% of the examined quarter milk samples there was no bacteriological pathogen content. From the rest of the samples we could isolate CNS (15.4%), Corynebacterium spp. (13.9%) S. agalactiae (6.6%), S. aureus (5.8%), coliform pathogens (3.6%) and others (Bacillus spp., Nocardia spp., Candida spp.) (1.7%). These results demonstrate a significant share of minor pathogens beside contagious mastitis pathogens as S. aureus and S. agalactiae in masititis incidents in Jalisco. By means of the pulsed-field-gel-electrophoresis we proved that in each of those farms where S. aureus had been isolated, only one genotype was responsible for mastitis incidents. The farm specific genotypes mostly showed a close relationship to the genotypes of other farms. Therefore the contagious character of mastitis pathogens and the dominating occurrence of certain S. aureus clones could be proved. By inspecting the farms and questioning work managers deficits in hygienic keeping and milking could be demonstrated. Statistically they correlate significantly with an increased mastitis prevalence and increased proving rates of contagious mastitis pathogens. Prophylactic, controlling and correcting measurements were supposed and discussed. Those prophylactic and controlling programmes for mastitis could elevate milk production in Jalisco and Mexico by up to 20% and therefore reduce the large deficit in the Mexican milk sector as well as the large amount of import of powdered milk. The decreased bacteriological quality of milk of cows with subclinical mastitis means a possible health risk for the consumer, especially considering the consumption of raw milk. Therefore 17 S. aureus isolates of those farms were examined according to their toxigenic ability and their toxin gene pattern. Only in one strain an amplification for the SEI gene could be proved. None of the examined strains contained genes for SEA, SEB, SEC, SED SEE, SEG, SEJ and TSST-1. In spite of this low proving rate milk of a higher hygienic value should be produced in Mexico by introducing a mastitis controlling programme carried out consequently and thereby reducing the health risk of milk as a comestible for the consumer.

La toxine stable à la chaleur de type b (STb) est une des toxines produites par les souches Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) impliquée dans le développement de la diarrhée. Une étude antérieure par Goncalves et al. (2009) a démontré que les cellules ayant internalisé la toxine STb démontraient une morphologie qui rappelle l’apoptose. Le changement du potentiel membranaire observé par Goncalves et al. (2009) nous a incité à vérifier la capacité de la toxine STb à induire l’apoptose des cellules HRT-18 et IEC-18 par la voie intrinsèque. Les cellules HRT-18 et IEC-18 ont été traitées avec de la toxine purifiée pour une durée de 24 heures puis ells ont été récoltées et examinées pour des caratéristiques de l’apoptose. L’activation des caspases-9 et -3, mais pas de la caspase-8, a été observée dans les deux lignées cellulaires à l’aide des substrats fluorescents spécifiques pour chaque caspase. L’ADN extrait des cellules HRT-18 et IEC-18 a révélé une fragmentation lorsque migré sur gel d’agarose. La condensation et la fragmentation des noyaux ont été observées en microscopie à fluorescence suite à une coloration de l’ADN au Hoechst 33342. Les indices apoptotiques des cellules HRT-18 et IEC-18 traitées avec des quantités croissantes de STb montrent une dose-réponse pour les deux lignées. L’activation de la caspase-9 est une indication que la voie intrinsèque de l’apoptose est activée dans les cellules HRT-18 et IEC-18. L’absence de l’activation de la caspase-8 démontre que la voie extrinsèque n’est pas impliquée dans la mort cellulaire médiée par STb. / Heat-stable toxin b (STb) is one of the toxins produced by Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) strains implicated in the development of diarrhea. A previous study conducted by Goncalves et al. (2009) showed that cells having internalized STb toxin demonstrated apoptotic-like morphology. The change in the mitochondrial membrane potential observed by Goncalves et al. (2009) prompted us to verify the ability of STb toxin to induce apoptosis via the intrinsic pathway in HRT-18 and IEC-18 cells. Both cell lines were treated with purified STb toxin for a period of 24 hours, harvested, and examined for apoptotic features. Activation of caspases-9 and -3, but not -8, was observed in HRT-18 and IEC-18 cells as determined with the use of fluorescent substrates specific to each caspase. Extracted DNA revealed DNA laddering when migrated on agarose gels. Nuclear condensation and fragmentation of Hoechst 33342 stained DNA of HRT-18 and IEC-18 cells were visualized by fluorescence microscopy. Apoptotic indexes of HRT-18 and IEC-18 cells treated with increasing amounts of STb toxin revealed dose-dependent responses in both cell lines. The activation of caspase-9 is an indication of the intrinsic pathway being activated in HRT-18 and IEC-18 cells by STb toxin. The lack of caspase-8 activation demonstrates that the extrinsic pathway of apoptosis is not involved in the programmed cell death mediated by STb.

Avec pour problématique une importante variabilité des lots de production vaccinale contre la diphtérie, une analyse intégrative du métabolisme central, du fer et du transcriptome de Corynebacterium diphtheriae, cultivé en conditions les plus proches de la culture industrielle, ont permis d’élargir les connaissances sur le comportement de la bactérie en conditions de production industrielle, et plus particulièrement sur l’existence de corrélations entre activité métabolique et virulence. L'analyse du métabolisme central et la comparaison de l'expression des gènes de C. diphtheriae, ont permis de mettre en évidence l'importance du maltose dans l'établissement de la virulence. Ce sucre, largement présent dans notre alimentation, est ainsi rencontré par la bactérie lors de son processus de colonisation de l'hôte. La consommation du maltose lors de la phase stationnaire, coïncident avec la production de la toxine, semble ainsi liée aux réactions de maintenance et à la production de métabolites secondaires plutôt qu'à la croissance. Plusieurs gènes liés à la capture et au catabolisme du maltose sont liés à la production de la toxine diphtérique. Cependant, les mécanismes de régulation sont complexes, impliquant plusieurs régulateurs. Une étude sur les besoins en fer de la bactérie et les liens avec la pathogénicité a été réalisée. En effet, le gène de la toxine diphtérique est régulé par DtxR, répresseur activé par Fe2+. Elle a permis d'évaluer la capacité de stockage en fer de la bactérie et la limite de concentration intracellulaire pour obtenir une production de toxine. Un effort a été apporté afin de visualiser les ferritines synthétisées par la bactérie par la technique NanoSIMS. Enfin, l'analyse de l'expression des gènes de C.diphtheriae cultivé en condition de limitation en fer et supplémentée en fer a apporté une quantité d'informations sur les liens entre métabolisme central et du fer, virulence et stress oxydatif. Cette démarche a été mise à profit afin de proposer à l'industriel des pistes d'optimisations du procédé et d’améliorations de la productivité en toxine diphtérique. Via l’ajustement de certains paramètres physico-chimiques (visant l'oxygénation et une meilleure métabolisation du maltose), il est possible d'obtenir un gain de production significatif (titre final en toxine multiplié par 2,5). La productivité spécifique en toxine peut être également multipliée par 2,2 par une astucieuse étape de dilution et recyclage de la biomasse en fin de culture / Faced with an important variability in production yields of vaccines against diphtheria, a dynamic systemic approach, including central and iron metabolism and transcriptome analysis, led to an improved knowledge of Corynebacterium diphtheriae physiology, notably as regards the connection of central metabolism and virulence. Gene expression analysis coupled to metabolic characterization enabled a correlation between maltose consumption and virulence to be established. Because of the typical human diet, maltose is present in the human oropharynx where it may serve as a key nutrient source for C. diphtheriae. Maltose consumption during stationary phase, coupled with toxin production, seems to be linked to maintenance and secondary metabolites rather than growth. Several genes, including uptake and catabolism of maltose, are related to diphtheria toxin production. However, mechanisms of regulation are complex and may involve several transcriptional regulators. Bacterial iron requirements and its relation to pathogenicity were considered. Indeed, diphtheria toxin gene is regulated by Fe2+ activated DtxR. These studies revealed that C. diphtheriae is able to store an important quantity of intracellular iron within ferritin-like proteins visualized by NanoSIMS microscopy and the definition of an intracellular threshold concentration provoking expression of toxin production. Finally, genome-wide gene expression analysis of C.diphtheriae in iron starvation and iron excess conditions provided information on relations between central and iron metabolism, virulence establishment and oxidative stress. The resulting knowledge was exploited to suggest process optimization strategies to enhance toxin production, currently being assessed by the industrial partner. Adjusting some key physico-chemical parameters (targeting oxygenation and better maltose metabolization) enabled significant gains in toxin production (2.5 fold increase). Specific productivity could be increased by 2.2 thanks to a novel biomass dilution and recycling step at the end of the culture

Bacillus thuringiensis (Bt) est une bactérie produisant des inclusions protéiques cristallines à pouvoir insecticide et elle est largement exploitée à l'échelle industrielle. Dans cette étude, des souches de Bt ont été isolées du sol libanais. Nous avons étudié en premier la présence des principaux gènes cry1A codant pour des δ-endotoxines actives sur les lépidoptères. Les souches possédant ces gènes ont été testées pour leur toxicité sur des larves d'Ephestia kuehniella (E. kuehniella). Une souche nommée Lip, étant quatre fois plus toxique sur ces larves que la référence mondiale Bt subsp. kurstaki HD1, fut sélectionnée pour une étude plus approfondie. Après clonage et séquençage, nous avons identifié une nouvelle toxine de type Cry1Aa : Cry1Aa22 et une nouvelle variante de la toxine Cry1Ac. Ces dernières se sont montrées plus toxiques sur des larves d'E. kuehniella, et plus stables en présence des protéases intestinales de ces larves que Cry1Aa et Cry1Ac de HD1 permettant d'expliquer la toxicité élevée de la souche sauvage. D'autre part, nous avons optimisé la construction d'un modèle de membrane biomimétique incluant la membrane de la bordure en brosse intestinale (BBM) des larves d'E. kuehniella. Ces membranes nous ont servi à l'étude de l'interaction des toxines Cry1Aa et Cry1Ac de Lip et celles de HD1. Les toxines de Lip ont interagit différemment et avec une plus grande affinité avec ces modèles que celles de HD1.Tous ces résultats montrent que Lip est une souche intéressante pour une exploitation industrielle et que le modèle de membrane biomimétique est une alternative permettant la prédiction de l'affinité des toxines Cry. / Bacillus thuringiensis (Bt) is a bacterium that synthesizes insecticidal proteic crystallin inclusions and is widely used at an industrial scale. In this study, Bt strains were isolated from Lebanese soil. We studied the presence of the main cry1A genes encoding for δ-endotoxins active on Lepidoptera. Strains harboring these genes were tested for their toxicity against Ephestia kuehniella (E. kuehniella) larvae. The strain named Lip, being four folds more toxic to the larvae than the reference strain Bt subsp. kurstaki HD1, was selected for further study. We identified a novel Cry1Aa toxin, Cry1Aa22, and a variety of the Cry1Ac toxin after cloning and sequencing of the corresponding genes. These toxins were more toxic to E. kuehniella larvae and more stable in the presence of these larvae's intestinal midgut juice than Cry1Aa and Cry1Ac of HD1. Moreover, we optimized the construction of a biomimetic membrane model based on the intestinal brush border membrane (BBM) of E. kuehniella larvae. These models were used to study the interaction of Cry1Aa and Cry1Ac of Lip and HD1. Toxins of Lip interacted differently and with a greater affinity with these model membranes than toxins of HD1.These results show that Lip is an interesting Bt strain that could be exploited at an industrial scale. On another hand, the biomimetic membrane constructed in this study could be an alternative allowing the prediction of the Cry toxin's affinity.