A toxoplasmose é uma protozoose de alta prevalência no Brasil, causada pelo Toxoplasma gondii, sendo transmitida pela ingestão de alimentos contaminados com oocistos, excretados em fezes de felinos, ou cistos, em carnes cruas ou mal cozidas. A doença é usualmente assintomática, mas em fetos ou pacientes com imunodepressão, pode ser devastadora. Neste trabalho, estudamos a prevalência sorológica da infecção em animais de diferentes regiões do estado de São Paulo, tanto de vida livre, cães (200/ABC) como indicadores ambientais, e gatos (100/São Paulo) como hospedeiros definitivos, e em animais de produção, bovinos (200/Taquarituba), suínos (200/Osasco), caprinos( 200/Botucatu), ovinos (200/São Manuel) e frangos de corte(185/Botucatu), além de estudos parasitológicos em gatos e águas sob suspeita. Foram padronizados ELISA para cada espécie animal, utilizando índices adequados e reprodutíveis, com confirmação por Western Blotting e determinação da avidez em amostras positivas. A prevalência da toxoplasmose animal foi determinada sendo crescente em suínos (8.5%), bovinos (11%), caprinos (17%), ovinos (31%), felinos (40%) e cães (50,5%), não sendo encontrada em frangos de corte. Em suínos, caprinos, cães e gatos, a freqüência de anticorpos de baixa avidez sugere que a transmissão da infecção é constante durante a vida do animal, mas em bovinos e ovinos não foram encontrados anticorpos de baixa avidez, sugerindo infecção precoce ou sazonal na vida do animal. Pela alta taxa de infecção recente em felinos, é possível prever uma fração significativa de animais excretando oocistos, embora sem comprovação parasitológica. A avaliação da presença de anticorpos anti-T.gondii deve ser criteriosa, sendo que os reagentes de hemaglutinação para uso humano fornecem resultados erráticos nesta medida. A pesquisa de oocistos na água é de baixa sensibilidade, devendo ser feita em materiais colhidos no período de suspeita da transmissão. Em São Paulo, o risco de transmissão da toxoplasmose está relacionado a quase todas as fontes de infecção pesquisadas, tornando necessários estudos para o melhor manejo dos animais de consumo humano e tratamento de água, com eliminação de gatos errantes. / Toxoplasmosis, caused by Toxoplasma gondii and highly prevalent protozoan disease in Brazil, is mainly transmitted by ingestion of contaminated food and water, both by oocysts, excreted in cat feces, or cysts from undercooked meat from warm-blooded animals. Usually asymptomatic, it is extremely severe in the fetus or immunosuppressed patients. In this work, we studied the serological prevalence of toxoplasmosis in animals from several regions of the São Paulo State, both free living, as dogs (ABC) as environmental contamination index, and cats (São Paulo, as definitive hosts, or livestock as cattle (Taquarituba), swine (Osasco), goats (Botucatu), sheep (São Manuel) and fowls (São Paulo), with parasitological studies in cats and suspicious drinking water. We standardized ELISA for each species, using reproducible and adequate indexes, with Western blot confirmation and avidity assays in positive samples. Toxoplasmosis prevalence was increasing in swine (8.5%), cattle (11%), goats (17%), sheep (31%), cats (40%) and dogs (50.5%), without positive sample in fowls. Goats, pigs, dogs and cats presented 5-20% low avidity antibody samples, suggesting sustained transmission during animal life, but cattle and sheep presented only high avidity samples, suggesting an seasonal or early in life infection. Due to the high recent infection rate in cats, it is possible to preview a significant oocyst excreting cat frequency, despite parasitological evidence. Antibody determination must be carefully evaluated, as human hemagglutination reagents give erratic information. Oocyst detection in drinking water presented very low sensitivity and must be performed only in water collected at the period of the infection. In São Paulo, almost all of tested sources are able of toxoplasmosis transmission, reinforcing the need of better management of livestock, adequate water treatment and elimination of free living cats.

A toxoplasmose afeta cerca de um bilhão de pessoa em todo mundo, é geralmente assintomática, apesar de doença ocular ou doenças grave e letal em fetos, pacientes com HIV e transplantados. A sorologia é a principal ferramenta para o diagnóstico e determinação de incidência, que é uma tarefa difícil, devido à alta prevalência na maioria dos países. Estudos de incidência são ideais em crianças, mas este grupo é protegido pela sociedade e de difícil abordagem por métodos invasivos como a punção venosa. A saliva pode ser uma ótima alternativa por sua coleta não ser invasiva, aceitável para crianças, e conter pequenas quantidades de IgG, eliminada através da mucosa gengival e fluido crevicular. Métodos de detcção de anticorpos disponíveis no mercado estão focados em amostras de soro, com baixa sensibilidade e são raros os relatos de pesquisas com material biológico alternativo, como a saliva. Sendo assim, padronizamos imunoensaios com alta sensibilidade para detecção de anticorpos anti- T. gondii na saliva frente a amostras de soro de 20 voluntários adultos. A sensibilidade e especificidade dos nossos dot-ELISA e ELISA de captura com proteína A foram semelhantes entre soro e saliva. Também testamos 100 amostras de saliva de universitários em nossos ensaios, onde mostramos uma frequência da toxoplasmose de 19% (IC 95% 12-28%). Imunoensaios para detecção de IgG anti-T. gondii em saliva são uma ferramenta muito promissora para estudos epidemiológicos da toxoplasmose em crianças ou outros grupos protegidos. / Toxoplasmosis that affects about one billion people worldwide is usually asymptomatic, despite ocular disease and severe and lethal disease in fetuses, AIDS patients and transplant recipients. Serology is the main approach for diagnosis and incidence determination is a difficult task due to high prevalence in most countries. Incidence studies are feasible in children but this age group is protected and difficult to approach by invasive methods as venipuncture. Saliva could be obtained by non-invasive procedure, acceptable for children, and it contains small amounts of IgG from mucosal and gingival crevicular fluid. Available antibody detection methods are focused in serum samples, with low sensitivity and few reports of alternative biological material, like saliva. Here, we standardized immunoassays with high sensitivity for detection of anti-T. gondii IgG in paired saliva and serum sample from 20 adult volunteers, which allows DOT-ELISA and a Protein A IgG capture assay. The sensitivity and specificity of the saliva DOT-ELISA were similar to sera ELISA. We also tested 100 saliva samples from university graduates in all assays, showing 19% (95%CI 12-28%) frequency of toxoplasmosis in this group, lower than reported for our area. Protein A IgG capture saliva assay was also efficient with similar results. Immunoassay with saliva IgG for toxoplasmosis is a very promising tool for use for the epidemiology of toxoplasmosis in children or other protected groups.

A manipulação comportamental é uma das principais correntes teóricas utilizadas para explicar as alterações comportamentais presentes em roedores parasitados pelo Toxoplasma gondii. Vários estudos propõem que o parasitismo pelo protozoário provoca mudanças metabólicas, imunológicas e neuropatológicas que possibilitam o desenvolvimento de mudanças no comportamento dos indivíduos infectados. Contudo, alguns fatores relacionados ao desenvolvimento da manipulação comportamental, ainda, não estão bem elucidados, entre eles, destaca-se o possível efeito do genótipo da cepa infectante nas modificações comportamentais. Neste trabalho, avaliamos o efeito da infecção crônica por cepas cistogênicas geneticamente distintas de T. gondii no comportamento de camundongos. Foram desenvolvidos modelos de infecção experimental com as cepas ME-49 (tipo II) e VEG (tipo III) em camundongos isogênicos BALB/c para avaliação da resposta imune humoral por ELISA, quantificação de parasitas em cistos cerebrais por PCR em tempo real e testes comportamentais como Esquiva Inibitória, Labirinto de Barnes, Labirinto em Cruz Elevado, Campo Aberto e Labirinto em Y visando, respectivamente, a avaliação da aprendizagem - memória, ansiedade, atividade locomotora e aversão ao odor do felino. Nossos dados mostram que camundongos infectados pela cepa VEG apresentaram redução mais acentuada da capacidade de recuperação de memória de longo prazo e alterações motoras mais proeminentes do que os animais infectados pela cepa ME-49. Na avaliação da aversão ao odor do felino, verificamos que a infecção pela cepa VEG induziu uma alteração comportamental mais acentuada no hospedeiro, nas fases iniciais da infecção, do que a infecção pela cepa ME-49, sendo este efeito observado tanto na presença de urina pura de gato como do aminoácido L-felinina. Nossos resultados sugerem que o genótipo da cepa infectante pode influenciar o desenvolvimento de alterações comportamentais em animais infectados pelo T. gondii, tornando o hospedeiro mais suscetível e exposto ao predador, sobretudo em infecções causadas por cepas do tipo III. / The behavioral manipulation is the main theoretical current used to explain the behavioral changes present in rodents parasitized by Toxoplasma gondii. Several studies suggest that protozoan parasitism causes metabolic, immunological and neuropathological changes that allow the development of changes in the behavior of infected individuals. However, some factors related to the development of behavioral manipulation are still not well understood, among them, the possible effect of the genotype of the infecting strain on behavioral modifications is highlighted. In this study, we evaluated the effect of chronic infection by genetically distinct cystogenic strains of T. gondii on the behavior of mice. Experimental models were developed with the ME-49 (type II) and VEG (type III) strains in isogenic BALB / c mice to evaluate the humoral immune response by ELISA, quantification of parasites in brain cysts by real-time PCR and behavioral tests as Passive Avoidance, Barnes Maze, Elevated Plus Maze, Open Field and Y - Maze aiming, respectively, evaluation of learning - memory, anxiety, locomotor activity and aversion to feline odor. Our data showed that mice infected with the VEG strain showed a more pronounced reduction in long-term memory retrieval capacity and more prominent motor alterations than the animals infected with the ME-49 strain. In the evaluation of feline odor aversion, we observed that infection by the VEG strain induced a more marked behavioral change in the host in the early stages of infection than the infection by the ME-49 strain, and this effect was observed both in the presence of urine pure cat as the amino acid L-felinine. Our results suggest that the genotype of the infecting strain may influence the development of behavioral changes in T. gondii infected animals, making the host more susceptible and exposed to the predator, especially in infections caused by type III strains.

INTRODUÇÃO: A toxoplasmose é uma infecção que ocorre em todo o mundo, mas tem a sua maior incidência em áreas tropicais. Trata-se de uma infecção comum na América Central e do Sul, especialmente em locais de clima moderado, mas também está associada a condições socioeconômicas e de má higiene. Apresenta um impacto significativo na Saúde pública, principalmente em decorrência do risco de transmissão vertical da doença para o feto. A infecção congênita ainda ocorre apesar da disponibilidade de exames para o diagnóstico e da terapêutica na gestante. Resulta, na maioria dos casos, da aquisição da infecção primária na gestação. OBJETIVOS: O objetivo deste estudo foi estimar a incidência anual da toxoplasmose congênita nos nascimentos ocorridos na Região Metropolitana de São Paulo, no período de 1984 a 2006, usando dados de soroprevalência de uma amostra representativa desta população, através da modelação matemática. MÉTODOS: Uma análise sorológica retrospectiva anti-toxoplasma da cidade de Caieiras, Região Metropolitana de São Paulo, em 1990, foi realizada para analisar a função de soroprevalência dependente da idade. Foram utilizadas 250 amostras de soros para análise de soroprevalência em idades de 1 a 40 anos e 199 soros amostras para a soroprevalência em crianças de 0 a 15 meses, e decaimento dos anticorpos de origem materna. Além disso, avaliou-se a força de infecção e a média de idade de aquisição da primeira infecção. O aumento na proporção de indivíduos imunes a cada intervalo de idade foi usado para calcular a proporção de novas infecções. Para a avaliação dos riscos de aquisição da toxoplasmose, foi tomado o número total de nascimentos ocorridos em um determinado ano como o número de gestantes por ano. RESULTADOS: A soropositividade para as mulheres em idade fértil foi 64,9% e 67,7% para os recém-nascidos. A idade média de aquisição da toxoplasmose nesta comunidade foi 10,74 anos e a estimativa da meia-vida dos anticorpos de origem materna nestas crianças foi 2,32 meses. A estimativa anual da incidência de toxoplasmose congênita variou de 9,5 a 10,6 por 1000 nascimentos, no período de estudo. CONCLUSÕES: A soroprevalência da toxoplasmose permitiu estimar a incidência de toxoplasmose congênita na Região Metropolitana de São Paulo, usando modelagem matemática que pode fornecer estimativas coerentes sobre a magnitude do problema / INTRODUCTION: Toxoplasmosis is an infection that occurs worldwide, but has its incidence higher in tropical areas. It is a common infection in Central and South America, especially in places of moderate climate, but too associated with poor socioeconomic conditions and hygiene. It has a significant impact from the public health perspective, mainly due to the risk of disease transmission through pregnancy. Congenital infection still occurs, despite the availability of diagnostic examinations and widespread therapy in pregnant women. It is the result, in most cases, of primary infection of a pregnant woman. OBJECTIVES: Our purpose is to estimate annual incidence of toxoplasmosis in births occurred in Sao Paulo Metropolitan Region from 1984 to 2006, using seroprevalence data of a representative population sample, through mathematical modelling. METHODS: Retrospective anti-toxoplasma serology analysis from Caieiras City, Sao Paulo Metropolitan Region, in 1990, was conducted in order to fit age-dependent continuous seroprevalence function. It was used 250 sera samples to analyze seroprevalence in ages from 1 to 40 years and 199 sera samples to discuss the seroprevalence in children from 0 to 15 months and the decay of maternal antibodies. As well it was studied strength of infection and the average age of acquisition of the first infection. The increase in proportion of immune individuals at each age interval was used to calculate the proportion of new infections. To estimate risk to acquire toxoplasmosis, it was taken the total number of deliveries in a given year as the number of pregnant women per year. RESULTS: The seropositivity for women of childbearing age was 64.9% and for newborns 67.7%.The average age of acquisition of toxoplasmosis in this community was 10.74 years and estimate for the half-life of maternal antibodies in children was 2.32 months. The estimated annual incidence of congenital toxoplasmosis varied from 9.5 to 10.6 per 1000 births in the period of study. CONCLUSIONS: Toxoplasmosis seroprevalence model allowed a good estimation of the incidence of congenital disease in Sao Paulo Metropolitan Region

As zoonoses urbanas, doenças que afetam muitos indivíduos em países tropicais, especialmente crianças, são infecções que podem ser adquiridas pelo homem através do contato com animais de estimação, pela ingestão de carne ou água contaminada. Para sua prevenção, é fundamental a educação para medidas de higiene e profilaxia com relação ao manuseio dos alimentos, animais de estimação e higiene pessoal. Isto poderia ser feito através de ensino intensivo, ministrado por profissionais treinados durante o primeiro ciclo do Ensino Fundamental. No presente trabalho, estudamos este tipo de ensino e a prevalência destas doenças, usando a toxoplasmose como modelo, em 164 alunos do primeiro ciclo do ensino fundamental da Escola Estadual Antonio de Pádua Vieira, com coleta de saliva. Foi desenvolvido ELISA de alta sensibilidade em saliva concentrada por etanol. Após 12 (doze) meses, a fixação do conteúdo foi avaliada por questionário. Havia uma prevalência de 50% de contato com Toxoplasma gondii nessa população, mostrando a relevância do problema. As crianças sob intervenção mostraram fixação do conhecimento, para ambas as fontes principais de contaminação mostrando a importância da intervenção, em comparação com crianças sem intervenção. As crianças sem toxoplasmose mostraram uma melhor eficiência na fixação da informação. Nossos dados sugerem que intervenções curtas têm um grande efeito de fixação de informações em escolares e que a saliva pode ser um material para a detecção de contato com a toxoplasmose. / Urban zoonoses affect large proportion of the population in tropical countries, specially school children. Those infections could be acquired by contact with pets, or ingestion of water or meat contaminated by agents. Education in preventive hygiene measures, as adequate cleaning and cooking are essential in this age group. Intensive teaching during short interventions by trained personal could be effective. Here, we study this type of educational intervention, using toxoplasmosis as a model, in 164 school children in the first years of elementary grades in a public São Paulo school, E.E.P.G. Antonio de Pádua Vieira, with saliva sampling. We had standardize a specific anti T. gondii IgG assay in etanol concentrade saliva. After 12 months, the knowledge of this population was tested by questionnaire. There are a 50% prevalence of contact with T.gondii during the intervention, showing the importance of zoonosis in this group. After one year, most children who assisted the intervention recalled correctly the main transmission ways of the zoonosis, showing fixation by short intervention, as compared to non-intervened shoolchildren of the same age group. Children who had no contact with T.gondii show higher recall proportion. Our data suggest that shorts interventions are effective in the knowledge fixation in schoolchildren and that saliva, a non invasive sampling, could be an alternative material for detection of contact with toxoplasmosis.

Toxoplasma gondii é o agente etiológico da toxoplasmose, podendo causar diferentes formas da doença, entre elas, a toxoplasmose congênita cuja frequência varia significativamente de acordo com o país estudado. Na França, foi estimada em 1-3 casos/1.000 nativivos, enquanto nos EUA cerca de 1/10.000, porém não existem estimativas da prevalência de infecção congênita no Brasil. Toxoplasma gondii possui três linhagens clonais conhecidas como genótipos I, II e III que se relacionam aos três tipos descritos de acordo com a classificação da patogenicidade do parasita em camundongos, estando os três tipos associados a infecções humanas de maior patogenicidade, menor patogenicidade e patogenicidade intermediária, respectivamente. Os três genótipos já foram identificados na América do Norte e Europa, sendo o genótipo II predominante em infecções congênitas. O presente estudo teve como objetivo determinar a freqüência dos genótipos I, II e III de T. gondii em 85 amostras de líquido amniótico de gestantes brasileiras com toxoplasmose confirmada e adquirida durante a gestação, todas oriundas de São Paulo. Para tal, foi utilizada a técnica de multiplexnested- PCR-RFLP com amplificação simultânea de quatro fragmentos pertencentes a três genes do parasita: 3-SAG2, 5-SAG2, SAG3 e GRA6 Das 85 amostras iniciais, 76 foram positivas pelo sistema de multiplexnested- PCR (92,7%), tendo sido possível analisar o maior número de amostras no sistema que amplifica a região do gene SAG3 (69,7%), seguido do sistema 3-SAG2 (44,7%), do sistema 5-SAG2 (40,8%), e finalmente do sistema GRA6 (25%). Nas 76 amostras submetidas à genotipagem foram encontrados: 1,3% (1 amostra) do genótipo I; 71,1% (54 amostras) do genótipo II; 6,6% (5 amostras) do genótipo III; e 21% (16 amostras) para as quais não foi possível definir o genótipo parasitário após clivagem enzimática, tendo sido as mesmas submetidas ao sequenciamento. Das 16 amostras, duas não puderam seqüenciadas por falta de DNA remanescente e das 14 analisadas: duas foram definidas como tipo III, apresentando 100% de homologia com o protótipo VEG, e duas foram definidas como tipo II apresentando 100% de homologia com o protótipo ME49. Em 10 amostras foram observadas misturas de duas ou mais bases, em uma ou mais posições nucleotídicas da sequência de DNA do fragmento amplificado, sendo identificadas como recombinantes. Além disso, seis amostras identificadas pela técnica de multiplex-nested-PCR-RFLP como tipo II foram selecionadas aleatoriamente para a confirmação dos resultados e, em quatro das seis amostras, foi observada mistura de bases em outras posições nucleotídicas do fragmento amplificado, regiões estas não analisadas pela RFLP. A técnica de multiplex-nested-PCR seguida de RFLP mostrou-se útil, porém apresenta limitações no que se refere à genotipagem de amostras de líquido amniótico, uma vez que, após sequenciamento, foram reveladas várias recombinações genéticas nos fragmentos amplificados que haviam sido previamente identificados como tipo II. Sendo assim, sugerimos que, a genotipagem de T. gondii, diretamente de amostras biológicas ou após isolamento do parasita deva ser realizada pela amplificação de múltiplos genes de T. gondii e sequenciamento de todos os fragmentos amplificados / Toxoplasma gondii is the etiologic agent of toxoplasmosis and may cause different forms of the disease, including congenital toxoplasmosis whose frequency varies significantly according to the country. In France, it was estimated in 1-3 cases/1,000 live births, while in the U.S. it is 1/10.000. The prevalence of congenital infection in Brazil is unknown. Toxoplasma gondii has three clonal lineages known as genotypes I, II and III which are related to the three types described according to the pathogenicity in mice, associated with human infections of high pathogenicity, low pathogenicity and intermediate pathogenicity, respectively. The three genotypes have been identified in North America and Europe, and the genotype II is the predominant one in congenital infections. This study aimed at determining the frequency of genotypes I, II and III of T. gondii in 85 amniotic fluid samples from pregnant women living in Sao Paulo, Brazil who presented with seroconversion to Toxoplasma gondii during gestation. The multiplex-nested- PCR-RFLP was performed using four different markers: 3\'-SAG2, 5\'-SAG2, SAG3 and GRA6. Eighty-five samples were initially included, but only 76 were positive in the multiplex-nested-PCR (92.7%). It was possible to examine the larger number of samples by the SAG3 gene system (69.7%), followed by 3\'-SAG2 gene (44.7%), 5\'-SAG2 gene (40.8%), and finally GRA6 gene (25%). From the 76 samples that were genotyped by the multiplexnested- PCR-RFLP, 1.3% (1 sample) was genotype I; 71.1% (54 samples) were genotype II; 6,6% (5 samples) were genotype III, and 21% (16 samples) could not be identified by RFLP and were therefore sequenced. Sequencing analysis revealed: two genotype II samples, presenting with 100% of homology with the ME49 prototype, and two were genotype III showing 100% of homology with the VEG prototype. Ten samples presented with mixture of two or more nucleotide bases in one or more nucleotide positions of the total amplified DNA sequence, so they were classified as recombinant. In addition, six samples identified by the multiplex-nested-PCR-RFLP as type II were randomly selected to confirm the results, and in four of the six samples, we observed a mixture of nucleotide bases in positions that were not analyzed by the RFLP. The technique of multiplex-nested-PCR-RFLP has proved to be useful, however, it is limited when amniotic fluid samples genotyping is concerned because after sequencing, several genetic recombinations were evidenced in samples that had been previously identified as genotype II. Therefore, we suggest that the genotyping of T. gondii, directly from biological samples or after isolation of the parasite should be performed using different targets to amplify multiple T. gondii genes followed by sequencing of all amplified fragments

by Yu Wing Sze. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2001. / Includes bibliographical references (leaves 119-126). / Abstracts in English and Chinese. / Thesis Committee --- p.ii / Statement --- p.iii / Acknowledgements --- p.iv / Abstract --- p.vi / 摘要 --- p.viii / Table of Contents --- p.x / List of Tables --- p.xvi / List of Figures --- p.xvii / List of Abbreviations --- p.xx / Chapter CHAPTER 1 --- General Introduction --- p.1 / Chapter CHAPTER 2 --- Literature Review --- p.3 / Chapter 2.1 --- Toxoplasma gondii --- p.3 / Chapter 2.1.1 --- Morphology and Life Cycle of T. gondii --- p.3 / Chapter 2.1.2 --- Routes of Transmission --- p.7 / Chapter 2.2 --- Toxoplasmosis --- p.8 / Chapter 2.2.1 --- Influences and Symptoms --- p.8 / Chapter 2.2.2 --- Treatment of Toxoplasmosis --- p.10 / Chapter 2.2.2.1 --- Antitoxoplasma Drugs --- p.10 / Chapter 2.2.2.2 --- Toxoplasma Vaccines --- p.12 / Chapter 2.3 --- Major T. gondii Surface Antigen - P30 --- p.16 / Chapter 2.4 --- Plants as Bioreactors --- p.19 / Chapter 2.4.1 --- Advantages of Plant Bioreactors --- p.19 / Chapter 2.4.2 --- Plant-based Vaccines --- p.20 / Chapter 2.4.2.1 --- VP2 Capsid Protein of Mink Enteritis Virus --- p.21 / Chapter 2.4.2.2 --- Hepatitis B Surface Antigen --- p.21 / Chapter 2.4.2.3 --- Norwalk Virus Capsid Protein --- p.22 / Chapter 2.5 --- Tobacco Expression System --- p.23 / Chapter 2.5.1 --- Transformation Methods --- p.23 / Chapter 2.5.1.1 --- Agrobacterium-mediated Transformation --- p.23 / Chapter 2.5.1.2 --- Direct DNA Uptake --- p.24 / Chapter 2.6 --- Phaseolin and Its Regulatory Sequences --- p.26 / Chapter CHAPTER 3 --- Expression of P30 in Transgenic Tobacco --- p.28 / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.28 / Chapter 3.2 --- Materials and Methods --- p.29 / Chapter 3.2.1 --- Chemicals --- p.29 / Chapter 3.2.2 --- Oligos: Primers and Adapters --- p.29 / Chapter 3.2.3 --- Plant Materials --- p.31 / Chapter 3.2.4 --- Bacterial Strains --- p.31 / Chapter 3.2.5 --- Construction of Chimeric Genes --- p.31 / Chapter 3.2.5.1 --- Modification of pET-ASP30ΔPI --- p.32 / Chapter 3.2.5.2 --- Cloning of P30 into Vectors with Different Promoters --- p.38 / Chapter 3.2.5.2.1 --- Cloning ofP30 into Vector with CaMV 35S Promoter --- p.38 / Chapter 3.2.5.2.2 --- Cloning of P30 into Vector with Maize Ubiquitin 1 Promoter --- p.38 / Chapter 3.2.5.2.3 --- Cloning of P30 into Vector with Phaseolin Promoter --- p.38 / Chapter 3.2.5.2.4 --- Cloning of P30 into Vector with Phaseolin Promoter and Phaseolin SP --- p.39 / Chapter 3.2.5.3 --- Cloning of P30 into Agrobacterium Binary Vector pBI121 --- p.44 / Chapter 3.2.6 --- Transformation of Agrobacterium by Electroporation --- p.49 / Chapter 3.2.7 --- "Transformation, Selection and Regeneration of Tobacco " --- p.50 / Chapter 3.2.8 --- GUS Assay --- p.51 / Chapter 3.2.9 --- Synthesis of Single-stranded DIG-labeled DNA Probe --- p.51 / Chapter 3.2.10 --- Extraction of Genomic DNA from Leaves --- p.52 / Chapter 3.2.11 --- PCR of Genomic DNA with P30 Specific Primers --- p.53 / Chapter 3.2.12 --- Southern Blot Analysis of Genomic DNA --- p.53 / Chapter 3.2.13 --- Extraction of Total RNA from Leaves or Developing Seeds --- p.54 / Chapter 3.2.14 --- Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction of Total RNA --- p.55 / Chapter 3.2.15 --- Sequencing of RT-PCR Product --- p.56 / Chapter 3.2.16 --- Northern Blot Analysis of Total RNA --- p.56 / Chapter 3.2.17 --- Extraction of Total Protein from Leaves or Mature Seeds --- p.57 / Chapter 3.2.18 --- Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) --- p.58 / Chapter 3.2.19 --- Purification of 6xHis-tagged Proteins --- p.58 / Chapter 3.2.20 --- Western Blot Analysis of Total Protein --- p.59 / Chapter 3.2.21 --- In vitro Transcription and Translation --- p.60 / Chapter 3.2.21.1 --- Construction of Transcription Vector Containing Chimeric P30 Gene --- p.60 / Chapter 3.2.21.2 --- In vitro Transcription --- p.60 / Chapter 3.2.21.3 --- In vitro Translation --- p.60 / Chapter 3.3 --- Results --- p.65 / Chapter 3.3.1 --- Construction of Chimeric P30 Genes --- p.65 / Chapter 3.3.2 --- "Tobacco Transformation, Selection and Regeneration " --- p.65 / Chapter 3.3.3 --- Detection of GUS Activity --- p.67 / Chapter 3.3.4 --- Detection of P30 Gene in Transgenic Plants --- p.69 / Chapter 3.3.4.1 --- PCR of Genomic DNA --- p.69 / Chapter 3.3.4.2 --- Southern Blot Analysis --- p.72 / Chapter 3.3.5 --- Detection of P30 Transcript in Transgenic Plants --- p.75 / Chapter 3.3.5.1 --- RT-PCR --- p.75 / Chapter 3.3.5.2 --- Sequencing of RT-PCR Product --- p.79 / Chapter 3.3.5.3 --- Northern Blot Analysis --- p.79 / Chapter 3.3.6 --- Detection of P30 Protein in Transgenic Plants --- p.83 / Chapter 3.3.6.1 --- Western Blot Analysis of Total Protein and Ni-NTA Purified Proteins --- p.83 / Chapter 3.3.7 --- In vitro Transcription and Translation --- p.92 / Chapter 3.3.7.1 --- In vitro Transcription --- p.92 / Chapter 3.3.7.2 --- In vitro Translation --- p.92 / Chapter CHAPTER 4 --- Discussion --- p.97 / Chapter 4.1 --- General Conclusion --- p.97 / Chapter 4.2 --- Further Speculations and Investigations --- p.100 / Chapter 4.2.1 --- Other Protein Detection Procedures --- p.100 / Chapter 4.2.2 --- In vitro Transcription and Translation --- p.100 / Chapter 4.2.3 --- Gene Silencing at Transcription and/or Post-transcription Levels --- p.101 / Chapter 4.2.4 --- Gene Silencing at Translation and/or Post-translation Levels --- p.102 / Chapter (A) --- AUG Context Sequence --- p.102 / Chapter (B) --- Codon Usage --- p.103 / Chapter (C) --- N-end Rule --- p.107 / Chapter (D) --- Phaseolin Sorting Signal --- p.107 / Chapter CHAPTER 5 --- Future Perspectives --- p.109 / Chapter 5.1 --- Codon Modification of the P30 Gene --- p.110 / Chapter 5.2 --- Fusion of the P30 Gene with the LRP Gene --- p.117 / Chapter CHAPTER 6 --- Conclusion --- p.118 / References --- p.119

Submitted by Fabíola Silva (fabiola.silva@famerp.br) on 2016-10-03T18:10:48Z No. of bitstreams: 1 karinadeoliveirayounan_dissert.pdf: 994368 bytes, checksum: d0380b444a2b69e0b3248499e6a74c26 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-03T18:10:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 karinadeoliveirayounan_dissert.pdf: 994368 bytes, checksum: d0380b444a2b69e0b3248499e6a74c26 (MD5) Previous issue date: 2014-08-22 / Introduction: The parasite Toxoplasma gondii infects a high percentage of individuals worldwide and disturbances resulting from this infection contribute to the aggravations of health conditions and may affect the intellectual development of children and adults. It has been suggested that the D antigen (Rh0) a glycoprotein that is the biochemical basis Rh but is absent in the nervous tissue, influence the motor response in the presence of T. gondii infection. Objectives: This study aims to evaluate the motor response and the reaction time for visual stimulus in the presence and in the absence of infection by the parasite T. gondii in individuals with good visual acuity, Rh positive and Rh negative. Methods: 212 volunteers from both sexes underwent visual acuity testing and measurement of average response time to visual stimulus (ART) by using a specific software. The collected blood samples were used to identify the erythrocyte RH phenotypes (positive and negative) and antibodies of IgG class anti-T. gondii (presence or absence). Average response times were compared according to sex, presence (reagents) and absence (non-reagent) infection and erythrocyte Rh phenotypes (positive and negative). The t test for comparison of average and the values of Odds Ratio (OR) and 95% confidence interval were calculated using the GraphPad Instat (version 6.3) software. The p-value equal to or less than 0.05 was considered significant. Results: The differences between the average age of reagents individuals (n = 134) and non-reagent (n = 38) to T. gondii were considered statistically significant (54.1 ± 18.7 vs 34.4 ± 18.9; p = 0.0001). The Rh phenotype positive (n = 189) was present in 89% of individuals, while the Rh-negative (n = 23) in 11%. The ART of reagents individuals for T. gondii was lower in males (0.672 ± 0.303) than in females (0.819 ± 0.270) (p = 0.0036). This same difference was observed between the non-reagent (0.475 ± 0.140 vs 0.791 ± 0.323), respectively (p <0.0001). Infected men (0.658 ± 0.282) had higher ART xi than uninfected men (0.488 ± 0.129) for T. gondii, both Rh positive (p = 0.0004). Women, infected or not, did not differ for ART even when compared by phenotype (positive or negative) Rh. Conclusions: Rh positive men infected with T. gondii have a higher ART than uninfected Rh positive men. Infected women do not differ in ART compared to women uninfected by T. gondii. / Introdução: O parasito Toxoplasma gondii infecta elevado percentual de indivíduos em todo o mundo e os distúrbios resultantes da infecção contribuem para os agravos da saúde e podem acometer o desenvolvimento intelectual de crianças e adultos. Tem sido proposto que o antígeno D (Rh0), uma glicoproteína que constitui a base bioquímica sistema Rh mas que se encontra ausente no tecido nervoso, influencia a resposta motora na presença de infecção por T. gondii. Objetivos: O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta motora e o tempo de reação a estímulos visuais na presença e na ausência de infecção pelo parasito T.gondii em indivíduos com boa acuidade visual, Rh positivos e Rh negativos. Métodos: foram analisados 212 indivíduos voluntários, de ambos os sexos, submetidos a exame de acuidade visual e teste de medição de tempo médio de reação a estímulos visuais (TMR) com o uso de um software específico. As amostras de sangue coletadas foram utilizadas na identificação dos fenótipos eritrocitários Rh (positivo e negativo) e dos anticorpos da classe IgG, anti-T. gondii (presença ou ausência). Os tempos médios de reação foram comparados de acordo com o sexo, presença (reagentes) e ausência (não reagentes) de infecção e fenótipos eritrocitários Rh (positivo e negativo). O teste t para comparação das médias e os valores de Odds Ratio (OR) e do intervalo de confiança a 95% foram calculados com o uso do software GraphPad Instat (versão 3.06). O valor p igual ou menor que 0,05 foi considerado significante. Resultados: As diferenças entre as médias de idade de indivíduos reagentes (n=134) e não reagentes (n=78) ao T. gondii foram consideradas estatisticamente significante (54,1 ± 18,7 vs 34,4 ± 18,9; p=0,0001). O fenótipo Rh positivo (n=189) esteve presente em 89% dos indivíduos, enquanto o Rh negativo (n=23) em 11%. O TMR dos indivíduos reagentes para o T. gondii foi menor no sexo masculino (0.672 ± 0.303) que no feminino (0.819 ± 0.270) (p=0,0036). Esta mesma diferença foi observada entre os não reagentes (0.475 ± 0.140 vs 0.791 ± 0.323), respectivamente (p<0,0001). Homens infectados (0.658 ± 0.282) apresentam TMR maiores que homens não infectados (0.488 ± 0.129) por T. gondii, ambos Rh positivo (p=0,0004). Mulheres, infectadas ou não, não diferiram quanto ao TMR mesmo quando comparadas pelo fenótipo Rh (positivo ou negativo). Conclusões: Homens Rh positivos infectados por T. gondii apresentam TMR maior que homens Rh positivos não infectados. Mulheres infectadas não diferem quanto ao TMR em comparação a mulheres não infectadas por T. gondii.

Submitted by Carvalho Dias João Paulo (joao.dias@famerp.br) on 2018-04-09T14:42:14Z No. of bitstreams: 1 fernandohenriqueamurata_dissert.pdf: 1552059 bytes, checksum: 21664cbdf1320b051bb618047511b2eb (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-09T14:42:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fernandohenriqueamurata_dissert.pdf: 1552059 bytes, checksum: 21664cbdf1320b051bb618047511b2eb (MD5) Previous issue date: 2016-04-13 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP / Introduction: T. gondii infection is high in Brazil and could lead to the development of serious sequelae such as ocular and neurological injuries, especially when it occurs during pregnancy for the risk of congenital transmission, and in immunocompromised patients. Clinical diagnosis is often difficult because the majority of affected people do not develop symptoms, therefore the use of serological and molecular methods are essential to support the diagnosis. Thus the use of sensitive and specific tests for the diagnosis of this condition is necessary. Objectives: To investigate and characterize the infection by T. gondii in their serological and molecular aspects in the northwest region of São Paulo. Methods: Peripheral blood samples were collected from patients treated in the Outpatient Clinic of High Risk Pregnancy and Fetal Medicine, and Retinopathy to analyze the serological methods (ELISA and ELFA) and molecular (cnPCR, Nested PCR and qPCR). Amniotic fluid samples were collected from pregnant women with suspect toxoplasmosis to perform the cnPCR. The results were compared using the Kappa index and calculated the sensitivity (S), specificity (SP), positive predictive value (PPV) and negative (NPV). Results: For the group of pregnant women, serological tests showed good agreement when applied to the Kappa index, G1: IgG = 0.83, IgM = 1.0; G2: IgG = 1.0, IgM = 0.78. When compared to IgM class antibodies by ELISA and ELFA had S = 75.5%, E = 100.0%, PPV = 100.0%, NPV = 87.8% and S = 79.2%, and = 100.0%, PPV = 100.0%, NPV = 89.5%, respectively. When compared to IgG showed S = 100.0%, E = 46.8%, PPV = 51.5%, NPV = 100.0% and 100.0% S = E = 38.3%, PPV = 47 7% NPV = 100.0%, respectively, and molecular methods performed by PCRs cnPCR (JW62 / 63), nested PCR, cnPCR (B22 / 23) and qPCR showed 0.0% S = E = 100, 0%, PPV = 0.0%, NPV = 63.9%, S = 5.7%, E = 100.0%, PPV = 100.0%, NPV = 65.3%, S = 7.5 % E = 98.9%, PPV = 80.0%, NPV = 65.5% and S = 1.9%, E = 100.0%, PPV = 100.0%, NPV = 64.4%, respectively. For the group of patients treated in the Retinopathy Clinic, serological tests for detection of anti-T. gondii IgG antibodies showed good agreement when applied to the Kappa index, G1: IgG = 0.97, IgM = 0.49; G2: = 0.85 IgG, IgM = 0.74. When compared to IgM class antibodies by ELISA and ELFA had S = 6.1% and = 96.8%, PPV = 62.5%, NPV = 53.7% and S = 3.7%, and = 98.9%, PPV = 75.0%, NPV = 53.7% respectively. When compared to IgG showed S = 96.3%, E = 34.6%, PPV = 56.6%, NPV = 91.4% and S = 95.1%, E = 35.7%, PPV = 56 , 7%, NPV = 89.2%, respectively, and the molecular methods performed by PCRs cnPCR (JW62 / 63), Nested, cnPCR (B22 / 23) and qPCR showed S = 1.8% and = 99.5 %, PPV = 75.0%, NPV = 53.3%, S = 2.4%, and 99.5%, PPV = 80.0%, NPV = 53.5%, S = 6.1% E = 98.4%, PPV = 76.7%, NPV = 54.2% and S = 8.5% and = 98.4%, PPV = 82.3%, NPV = 54.8%, respectively. For the group of neonates of 50 samples tested, 45 (90.0%) were positive for IgG 1 (2.0%) for IgM, 3 (6.0%) for IgA and 13 (26.0%) in cnPCR. Conclusion: The commercial serological tests for identifying anti- T. gondii IgG and IgM antibodies by ELISA and ELFA showed concordant results, and the molecular conventional PCR tests (cnPCR), Nested PCR and real-time PCR (qPCR) were discordant. / Introdução: A infecção por T. gondii é elevada no Brasil, podendo levar ao desenvolvimento de sequelas graves como lesões oculares e neurológicas, principalmente quando ocorre durante a gestação com risco de transmissão congênita, e em pacientes imunocomprometidos. A maioria dos indivíduos acometidos não desenvolvem sintomas, tornando o diagnóstico clínico difícil, sendo assim necessária a utilização de testes que auxiliem no diagnóstico, como o uso dos métodos sorológicos e moleculares. Desta forma, é essencial a utilização de testes sensíveis e específicos para o correto diagnóstico da doença. Objetivos: Investigar e caracterizar a infecção por T. gondii em seus aspectos sorológicos e moleculares em pacientes da região noroeste do Estado de São Paulo. Casuística e métodos: Foram coletadas amostras de sangue periférico de gestantes, neonatos e pacientes com doenças oculares sugestivas e não sugestivas de toxoplasmose, atendidos nos Ambulatórios de Gestação de Alto Risco e Medicina Fetal, e Retinopatia para realização dos métodos sorológicos (ELISA e ELFA) e moleculares (cnPCR, Nested PCR e qPCR). Foram coletadas também amostras de líquido amniótico para realização da cnPCR das gestantes com suspeita clínica de toxoplasmose. Os resultados foram comparados pelo índice Kappa, e calculados os valores de sensibilidade (S), especificidade (E), valor preditivo positivo (VPP) e negativo (VPN). Resultados: Para o grupo de gestantes analisadas, os testes sorológicos apresentaram concordância quando aplicados ao Kappa, G1: IgG = 0,83, IgM = 1,0; G2: IgG = 1,0, IgM = 0,78 . Quando comparados a pesquisa de anticorpos da classe IgM por ELISA e ELFA apresentaram S=75,5%, E=100,0%, VPP=100,0%, VPN=87,8% e S=79,2%, E=100,0%, VPP=100,0%, VPN=89,5%, respectivamente. Quando comparados com IgG apresentaram S=100,0%, E=46,8%, VPP=51,5%, VPN=100,0% e S=100,0%, E=38,3%, VPP=47,7%, VPN=100,0%, respectivamente, e para os métodos moleculares realizados pelas PCRs cnPCR (JW62/63), Nested PCR, cnPCR (B22/23) e qPCR apresentaram S=0,0%, E=100,0%, VPP=0,0%, VPN=63,9%, S=5,7%, E=100,0%, VPP=100,0%, VPN=65,3%, S=7,5%, E=98,9%, VPP=80,0%, VPN=65,5% e S=1,9%, E=100,0%, VPP=100,0%, VPN=64,4%, respectivamente. Para o grupo de pacientes atendidos no ambulatório de Oftalmologia, os testes sorológicos para pesquisa de anticorpos anti-T.gondii da classe IgG apresentaram boa concordância quando aplicados ao índice Kappa, G1: IgG = 0,97, IgM = 0,49; G2: IgG = 0,85, IgM = 0,74. Quando comparados à pesquisa de anticorpos da classe IgM por ELISA e ELFA, apresentaram S=6,1%, E=96,8%, VPP=62,5%, VPN=53,7% e S=3,7%, E=98,9%, VPP=75,0%, VPN=53,7%, respectivamente. Quando comparados com IgG apresentaram S=96,3%, E=34,6%, VPP=56,6%, VPN=91,4% e S=95,1%, E=35,7%, VPP=56,7%, VPN=89,2%, respectivamente, e para os métodos moleculares realizados pelas PCRs cnPCR (JW62/63), Nested, cnPCR (B22/23) e qPCR, apresentaram S=1,8%, E=99,5%, VPP=75,0%, VPN=53,3%, S=2,4%, E=99,5%, VPP=80,0%, VPN=53,5%, S=6,1%, E=98,4%, VPP=76,7%, VPN=54,2% e S=8,5%, E=98,4%, VPP=82,3%, VPN=54,8%, respectivamente. Para o grupo de neonatos, das 50 amostras analisadas, 45 (90,0%) foram positivas para IgG, 1 (2,0%) para IgM, 3 (6,0%) para IgA e 13 (26,0%) no cnPCR. Conclusão: Os testes sorológicos comerciais na identificação de anticorpos anti-T.gondii das classes IgG e IgM por ELISA e ELFA apresentaram resultados concordantes, e os testes moleculares PCR convencional (cnPCR), PCR Nested e PCR em tempo real (qPCR) apresentaram resultados discordantes.

INTRODUÇÃO: A toxoplasmose é uma infecção que ocorre em todo o mundo, mas tem a sua maior incidência em áreas tropicais. Trata-se de uma infecção comum na América Central e do Sul, especialmente em locais de clima moderado, mas também está associada a condições socioeconômicas e de má higiene. Apresenta um impacto significativo na Saúde pública, principalmente em decorrência do risco de transmissão vertical da doença para o feto. A infecção congênita ainda ocorre apesar da disponibilidade de exames para o diagnóstico e da terapêutica na gestante. Resulta, na maioria dos casos, da aquisição da infecção primária na gestação. OBJETIVOS: O objetivo deste estudo foi estimar a incidência anual da toxoplasmose congênita nos nascimentos ocorridos na Região Metropolitana de São Paulo, no período de 1984 a 2006, usando dados de soroprevalência de uma amostra representativa desta população, através da modelação matemática. MÉTODOS: Uma análise sorológica retrospectiva anti-toxoplasma da cidade de Caieiras, Região Metropolitana de São Paulo, em 1990, foi realizada para analisar a função de soroprevalência dependente da idade. Foram utilizadas 250 amostras de soros para análise de soroprevalência em idades de 1 a 40 anos e 199 soros amostras para a soroprevalência em crianças de 0 a 15 meses, e decaimento dos anticorpos de origem materna. Além disso, avaliou-se a força de infecção e a média de idade de aquisição da primeira infecção. O aumento na proporção de indivíduos imunes a cada intervalo de idade foi usado para calcular a proporção de novas infecções. Para a avaliação dos riscos de aquisição da toxoplasmose, foi tomado o número total de nascimentos ocorridos em um determinado ano como o número de gestantes por ano. RESULTADOS: A soropositividade para as mulheres em idade fértil foi 64,9% e 67,7% para os recém-nascidos. A idade média de aquisição da toxoplasmose nesta comunidade foi 10,74 anos e a estimativa da meia-vida dos anticorpos de origem materna nestas crianças foi 2,32 meses. A estimativa anual da incidência de toxoplasmose congênita variou de 9,5 a 10,6 por 1000 nascimentos, no período de estudo. CONCLUSÕES: A soroprevalência da toxoplasmose permitiu estimar a incidência de toxoplasmose congênita na Região Metropolitana de São Paulo, usando modelagem matemática que pode fornecer estimativas coerentes sobre a magnitude do problema / INTRODUCTION: Toxoplasmosis is an infection that occurs worldwide, but has its incidence higher in tropical areas. It is a common infection in Central and South America, especially in places of moderate climate, but too associated with poor socioeconomic conditions and hygiene. It has a significant impact from the public health perspective, mainly due to the risk of disease transmission through pregnancy. Congenital infection still occurs, despite the availability of diagnostic examinations and widespread therapy in pregnant women. It is the result, in most cases, of primary infection of a pregnant woman. OBJECTIVES: Our purpose is to estimate annual incidence of toxoplasmosis in births occurred in Sao Paulo Metropolitan Region from 1984 to 2006, using seroprevalence data of a representative population sample, through mathematical modelling. METHODS: Retrospective anti-toxoplasma serology analysis from Caieiras City, Sao Paulo Metropolitan Region, in 1990, was conducted in order to fit age-dependent continuous seroprevalence function. It was used 250 sera samples to analyze seroprevalence in ages from 1 to 40 years and 199 sera samples to discuss the seroprevalence in children from 0 to 15 months and the decay of maternal antibodies. As well it was studied strength of infection and the average age of acquisition of the first infection. The increase in proportion of immune individuals at each age interval was used to calculate the proportion of new infections. To estimate risk to acquire toxoplasmosis, it was taken the total number of deliveries in a given year as the number of pregnant women per year. RESULTS: The seropositivity for women of childbearing age was 64.9% and for newborns 67.7%.The average age of acquisition of toxoplasmosis in this community was 10.74 years and estimate for the half-life of maternal antibodies in children was 2.32 months. The estimated annual incidence of congenital toxoplasmosis varied from 9.5 to 10.6 per 1000 births in the period of study. CONCLUSIONS: Toxoplasmosis seroprevalence model allowed a good estimation of the incidence of congenital disease in Sao Paulo Metropolitan Region