Resumo: Caprinos machos em idade reprodutiva, sorologicamente negativos para Toxoplasma gondii, foram selecionados e distribuídos como apresentado a seguir: A - um caprino inoculado, via oral, com 2,0 x 105 oocistos da cepa P; B - um caprino inoculado, via subcutânea, com 1,0 x 106 taquizoítos da cepa RH e C - um caprino não inoculado mantido como controle. Após a inoculação dos machos com T. gondii, 12 cabras reprodutoras, não gestantes, sorologicamente negativas para as principais doenças reprodutivas, sobretudo toxoplasmose, foram sincronizadas. Em seguida, foram expostas à monta natural pelos machos, anteriormente inoculados: cinco cabras submetidas à monta natural pelo macho A (GI); cinco cabras submetidas à monta natural pelo macho B (GII) e duas cabras pelo macho C - controle (GIII). Nos soros das cabras obtidos nos dias -14, -7, -1 (antes da monta natural), e nos dias 3, 6, 9, 11, 14 e semanalmente até o parto, foi pesquisada a presença de anticorpos contra T. gondii pelo ELISA teste. Bioensaio em camundongos e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foram realizados em amostras de sêmen e tecidos dos machos, tecidos das fêmeas e de seus respectivos "produtos". Dez das 12 fêmeas utilizadas apresentaram anticorpos específicos contra T. gondii após a monta natural, sendo as cinco cobertas pelo macho inoculado com oocistos (GI) e cinco cobertas pelo caprino inoculado com taquizoítos (GII). Pelo bioensaio e pela PCR foi possível identificar, em várias datas experimentais em que ocorreu a monta natural, a presença do T. gondii nas amostras seminais dos caprinos inoculados. Posteriormente, após eutanásia, foi possível também isolar este parasito em algumas das amostras teciduais dos machos experimentais. Por estas mesmas técnicas de diagnóstico, identificou-se também a presença deste coccídio nas amostras teciduais das fêmeas experimentais, assim como de seus ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Male goats in reproductive age, serologically negative for Toxoplasma gondii, were selected and distributed according to the following arrangement: A - one goat inoculated orally with 2.0 x 105 oocysts of the strain P; B - one goat inoculated subcutaneously with 1.0 x 106 tachyzoites of the strain RH and C - one uninfected goat kept as control. After T. gondii inoculation, 12 nonpregnant female breeder goats serologically negative for the main reproductive diseases, especially toxoplasmosis, were synchronized and then exposed to natural mating by those males previously inoculated, being: five females submitted to natural mating by the male A (GI), five females exposed to natural mating by the male B (GII) and two females submitted to natural mating by the uninfected male (GIII). In sera obtained from all female goats on days -14, -7, -1, (before natural mating) and on days 3, 6, 9, 11, 14 and weekly until partum, the presence of antibodies against T. gondii was investigated by ELISA test. Bioassay in mice and PCR were performed on samples of semen and tissues of males and females and on their products which were stillbirths, fetus and offspring. Ten out of 12 females used showed specific antibodies against T. gondii after natural mating, being five from group GI and five from group GII. On several dates in which natural mating occurred, T. gondii was identified in semen samples of infected males by bioassay and PCR. Subsequently, after euthanasia, it was possible to isolate T. gondii in some of tissue samples from experimentally infected males. Moreover, by PCR and bioassay techniques it was also possible to identify T. gondii in tissue samples from experimentally infected females as well as their products (stillbirths, fetus and offspring). It was not possible to notice any clinical signs of toxoplasmosis Therefore, these results proved, for the first time, the sexual transmission of toxoplasmosis in goat species / Orientador: Alvimar José da Costa / Coorientador: Gilson Pereira de Oliveira / Banca: Odilon Vidotto / Banca: Carlos Noriyuki Kaneto / Banca: Flávio Ruas de Moraes / Banca: Paulo Henrique Franceschini / Doutor

Orientador: Alvimar Jose da Costa / Banca: Odilon Vidotto / Banca: Carlos Noriyuki Kaneto / Banca: Katia Denise Saraiva Bresciani / Banca: Paulo Henrique Franceschini / Resumo: Avaliou-se a transmissão congênita em cabras, infectadas e reinfectadas experimentalmente por T. gondii, em três fases gestacionais. Foram selecionadas 25 fêmeas, negativas para T. gondii e, destas, 20 foram inoculadas (cepa ME 49) e 15 reinoculadas (cepa VEG) com oocistos de T. gondii. As fêmeas foram distribuídas em cinco grupos experimentais (n=5): GI - reinfectadas no 40º dia de gestação (DG), GII - 80º DG, GIII - 120º DG, GIV - infectadas não reinfectadas e GV - não infectadas. Nos dias 0 (antes da inoculação), 3, 6, 9, 15, 21 e a cada sete dias pós-inoculação (DPI) e no 3º e a cada sete dias pós-reinoculação (DPR), foram realizados exames clínicos e sorológicos (RIFI-IgG). Quando as fêmeas apresentaram títulos IgG <1024 iniciou-se o manejo reprodutivo. Após a confirmação da gestação, as ultrassonografias foram realizadas a cada 15 dias até o término do período gestacional. Após as parições, as cabras e suas crias foram eutanasiadas para colheita de tecidos para avaliação de parasitismo por T. gondii (histopatologia, bioprova e PCR). Das crias colheu-se sangue para a realização da RIFI. No 9º DPI registrou-se hipertermia em todas as cabras inoculadas (P<0,05). A soroconversão dos animais primoinfectados ocorreu no 21º DPI, com títulos (IgG) entre 1024 e 16384. No 119º DPI ocorreu a estabilização da fase crônica da toxoplasmose (IgG <1024), em todas as fêmeas infectadas. Após as reinfecções as cabras permaneceram assintomáticas. Aumentos significativos de títulos IgG (≥1024) ocorreram no 28º, 7º e 3º DPR, nos grupos I, II, III, respectivamente (P<0,05). Severos distúrbios reprodutivos foram observados apenas em cabras reinfectadas, assim como determinadas lesões histológicas (renais e hepáticas) em suas respectivas crias. Títulos de anticorpos IgG foram registrados em todas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: We evaluated the congenital transmission in goats experimentally infected and re-infected with T. gondii in three stages of pregnancy. We selected 25 females negative for T. gondii and of these, 20 were inoculated (ME 49 strain) and re-inoculated 15 (VEG strain) with oocysts of T. gondii. The females were distributed into five experimental groups (n = 5): GI - re-infected after 40th days of gestation (DG), GII - 80th DG, GIII - 120 th DG, GIV - infected and not re-infected and GV - uninfected. On days 0 (before inoculation), three, six, nine, 15, 21 and seven days post-inoculation (DPI) and the 3rd and every seven days after reinoculation (DPR), we performed clinical and serological (IFAT -IgG). When the females had titers IgG <1024 began the reproductive management. After confirmation of pregnancy, the ultrasounds were performed every 15 days until the end of pregnancy. After parturition, the goats and their offspring were euthanized to collect tissue for assessment of parasitism by T. gondii (histopathology, bioassay and PCR). Blood's newborn was collected to perform the IFAT. In the 9th DPI was recorded hyperthermia in all inoculated goats (P <0.05). Seroconversion occurred in animal primoinfectados 21st DPI, with titers (IgG) between 1024 and 16384. At 119th DPI and then leveled off in the chronic phase of toxoplasmosis (IgG <1024) in all infected females. After the goats remained asymptomatic re-infections. Significant increases in securities IgG (≥ 1024) occurred in 28th, 7th and 3rd DPR, in groups I, II, III, respectively (P <0.05). Severe reproductive disorders were observed only in re-infected goats, as well as certain histological lesions (kidney and liver) in their offspring. IgG antibody titers were recorded in all offspring of goats re-infected. Tissue parasitism by T. gondii was diagnosed in both infected and re-infected goats... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Luiz Carlos de Mattos / Banca: Wilson Baleotti Junior / Banca: Marilanda Ferreira Bellini / Resumo: Introdução: A infecção por Toxoplasma gondii em gestantes associa-se aos riscos de transmissão congênita. Este protozoário infecta os humanos utilizando como rota de infecção o trato gastrintestinal, onde se dá a síntese dos antígenos fucosilados Lea e Leb que determinam os fenótipos do sistema histo-sanguíneo Lewis [Le(a+b-), Le(a+b+) e Le(a-b-)]. A expressão destes fenótipos resulta de interações epistáticas entre os genes FUT2 (Secretor) e FUT3 (Lewis) que codificam as fucosiltransferases FUTII e FUTIII, respectivamente. Mutações no gene FUT3 determinam a ausência de fucosilação dos oligossacarídeos precursores do tipo 1 resultando na expressão do fenótipo Le(a-b-). A infecção por T. gondii e a expressão dos antígenos Lewis ocorrem no mesmo órgão e, embora aparentemente independentes, podem estar relacionadas entre si. Objetivo: Investigar a associação o sistema histo-sanguíneo Lewis e a infecção por T. gondii da cepa RH. Material e Métodos: Foram selecionadas 209 amostras de soro e de DNA genômico estocadas no Laboratório de Imunogenética do Departamento de Biologia Molecular da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP, coletadas de gestantes atendidas no Ambulatório de Gestação de Alto Risco do Hospital de Base da Fundação Faculdade Regional de Medicina de São José do Rio Preto - FUNFARME. Uma triagem para detecção dos anticorpos anti-T. gondii foi realizada nas amostras de soro pelo método hemaglutinação indireta (HAI). O ensaio imunoenzimático (ELISA) foi empregado para identificar os anticorpos específicos da classe IgG contra a cepa RH. Cento e noventa e cinco amostras de soro que apresentaram resultados concordantes entre os dois testes foram selecionadas para compor os grupos "reagente" e "não reagente". Para inferir os fenótipos do sistema histo-sanguíneo Lewis, as amostras de DNA... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Toxoplasma gondii Infection in pregnant women is associated with risks of congenital transmission. This protozoa infects humans using as infection rout the gastro intestinal tract, where occur the synthesis of fucosylated Lea and Leb antigens which determine Lewis histo-blood group phenotypes [Le(a+b-), Le(a+b+), Le(a-b-)]. The expression of these phenotypes results from epistatic interactions between FUT2 (Secretor) and FUT3 (Lewis) genes which codes both the FUTII and FUTIII fucosyltransferases, respectively. Single nucleotide polymorphisms affecting FUT3 gene determine the absence of type 1 oligosaccharide precursor fucosylation and the expression of Le(a-b-) phenotype. The entrance of T. gondii and the expression of Lewis histo-blood group system occur in the same organ, probably there is some link between them. Objective: The aim of this study was to test the hypothesis that the Lewis histo-blood group system is associated with infection by T. gondii. Material e Method: A total of 209 serum sample and genomic DNA sample stored at the Immunogenetics Laboratory from the Molecular Biology Department of Medicine School in São José do Rio Preto - FAMERP, obtained from pregnant women who attended in the High-Risk Pregnancy Clinic of Hospital de Base were enrolled in this study. Anti-T. gondii antibodies were screened by indirect hemagglutination test. ELISA assays were used to identify specific IgG antibodies to RH strain. One hundred and ninety-five serum samples, with identical results between both tests were selected to compose the groups "reagent' and "non reagent". To infer the Lewis histo-blood group system phenotypes, genomic DNA samples corresponding to the serum sample were genotyped for the G428A mutation of the FUT2 gene and T202C and C314T of FUT3 gene by PCR-RFLP and PCR-SSP assays, respectively. The data were analyzed by Fisher's exact test... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2015-03-03T14:00:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 IsabelleRB.pdf: 1412800 bytes, checksum: bac7edd4cac638b6a9cf1189b964a174 (MD5) Previous issue date: 2008-08-12 / Congenital Toxoplasmosis results in severe systemic disease. If mother is infected for the first time during gestation, she can infect the fetus causing substantial damage. However, relatively little is known about the seroprevalence and epidemiological and economic factors of Toxoplasmosis infection in pregnancy in the most state in northeastern Brazil and knowledge about this can be essential in determining effective and acceptable prevention strategies. Our aim was to determine the prevalence of Toxoplasmosis in pregnant woman consulted by reference Maternity Escola Janu?rio Cicco in Natal, a city in Northeastern Brazil, which belongs to the public health system, correlating to the risk factors involved in the infection and to accomplish active Search in the Hospital of Pediatrics Prof? Heriberto Bezerra of the damages caused by the Toxoplasmic infection in children up to 12 years of age. The study was conducted from March to December 2007 and sera obtained from 190 pregnant women were tested for IgM and IgG antibodies avidity to Toxoplasma by Microparticle enzyme immunoassay (Abbott AxSYM system - Abbott Laboratories, Chicago, IL, USA). Data were examined with univariate analysis. Chi-squared (x2) and Odds ratio was calculated (IC 95% p 0,05). Of these women, 126 (66,3%) had only IgG antibodies high-avidity against T. gondii; 01 (0,52%) had a IgM and IgG high-avidity antibodies against T. gondii and 63 (33,1%) have neither IgM nor IgG against T. gondii. Our studies shown that the direct contact with cats or dogs was highly associated with the Toxoplasma gondii infection (OR, 2.72, p<0.001, 95% CI 1.46 5.02). The years school (p<0,001), socioeconomic status and knowledge about the disease (both p value 0.05) also were associated with Toxoplasmosis. The pattern of risk factors for infection presents regional variations, however our data corroborate others studies in Brazil. In children up to 12 years, one case of Congenital Toxoplasmosis was just registered in seven years (2000 - 2006). There were several suggestive cases, with signs and characteristic symptoms, but that the infection was not confirmed due to lack in the researches through laboratorial and images exams that addressed that it zoonosis / A Toxoplasmose cong?nita resulta em uma doen?a sist?mica severa. Devido ? m?e se infectar no primeiro trimestre da gesta??o, ela pode infectar o feto causando s?rios danos. Entretanto, h? pouca informa??o a respeito de soropreval?ncias e fatores econ?micos e epidemiol?gicos envolvidos na infec??o da gestante na maioria dos estados do Nordeste do Brasil e o conhecimento sobre isto pode ser essencial na determina??o e implementa??o de estrat?gias de preven??o. O objetivo desse trabalho foi determinar a preval?ncia da Toxoplasmose em gestantes atendidas na Maternidade Escola Janu?rio Cicco, em Natal, uma cidade do Nordeste do Brasil, correlacionando aos fatores de risco envolvidos na infec??o e realizar Busca ativa no Hospital de Pediatria Prof? Heriberto Bezerra dos agravos causados pela infec??o cong?nita e/ou p?s-natal por Toxoplasma gondii em crian?as at? 12 anos de idade. Esse estudo foi realizado de Mar?o a Dezembro de 2007 e o soro obtido das 190 gestantes foram testados para IgM e IgG antitoxoplasma pela t?cnica de Ensaio Imunoenzim?tico de Micropart?culas (Abbott AxSYM system - Abbott Laboratories, Chicago, IL, USA). Foi aplicada uma an?lise univariada no qual Qui-quadrado e Odds Ratio foram calculados (IC 95%, p 0,05). Das 190 mulheres, 126 (66,3%) tem somente IgG anti-Toxoplasma de alta avidez; 01(0,52%) tem IgM e IgG anti-Toxoplasma e 63 (33,1%) n?o tem nem IgM nem IgG de alta avidez anti-Toxoplasma. Esse estudo mostra que o contato direto com gatos ou c?es foi fortemente associado com a infec??o por Toxoplasma gondii (OR, 2.72, p<0.001, 95% CI 1.46 ? 5.02). Os anos de escolaridade (p<0,001), o status socioecon?mico e o conhecimento sobre a doen?a (ambos com p 0.05) tamb?m foram associados com a infec??o Toxopl?smica. O padr?o de fatores de risco para infec??o apresenta varia??es regionais, entretanto nossos dados corroboram outros estudos no Brasil. Em crian?as at? 12 anos, apenas um caso de Toxoplasmose cong?nita foi registrado em sete anos (2000 ? 2006). Houve diversos casos sugestivos, com sinais e sintomas caracter?sticos, mas que n?o foi confirmada a infec??o Toxopl?smica devido a car?ncia de aprofundamento nas pesquisas atrav?s de exames laboratoriais ou de imagem que direcionasse a essa zoonose

O objetivo do presente estudo foi avaliar a viabilidade de cistos de Toxoplasma gondii em carnes suínas processadas por maturação úmida por 14, 21 e 28 dias a 0º (&#177;1), assim como avaliar a distribuição dos cistos em órgãos e cortes comerciais de suínos experimentalmente infectados. Para tanto, dois experimentos foram conduzidos e em ambos, os suínos foram infectados com 3.000 oocistos do isolado TgCkBr57 (BrII). O lombo foi o corte muscular escolhido para sofrer o processo de maturação por ser o corte convencionalmente utilizado para o processo. O lombo direito de cada suíno foi submetido ao processo de maturação e o esquerdo foi mantido como controle, sem processamento. No Experimento 1 três suínos foram infectados. Dos lombos processados por maturação (n=3) e controle (n=3) realizou-se bioensaio em gatos e em camundongos e o período de maturação foi de 14 dias. Nesse ensaio também avaliou-se a distribuição de cistos teciduais pelo bioensaio em camundongos do cérebro, retina, língua, diafragma e coração e de cortes musculares: lombo (m. longissimus), copa (m. longissimus, spinalis dorsi, rhomboideus), filé mignon (m. psoas major), coxão-duro (m. biceps femoris), coxão mole (m. semimembranosus) e alcatra (m. gluteos medius). No Experimento 2 seis suínos foram infectados e foi realizado o bioensaio em camundongos dos lombos que ficaram sob maturação por 14 (n=2), 21 (n=2) e 28 (n=2) dias. Em ambos os experimentos, cistos de T. gondii presentes nos lombos permaneceram viáveis após 14 dias de maturação úmida, com confirmação pelo bioensaio em gatos e em camundongos. Nos períodos de 21 e 28 dias, pelo bioensaio observou-se que os camundongos não se infectaram, indicando que o processo inviabilizou os cistos. Quanto à distribuição dos cistos, estes foram isolados da copa, coração, diafragma e língua dos três suínos; do filé mignon, coxão duro e cérebro de dois suínos e da alcatra e lombo de um suíno. Nenhum camundongo infectou-se no bioensaio com o coxão mole e com a retina. Os resultados demonstram que a maturação em embalagem a vácuo por 14 dias em temperatura controlada (0ºC) não foi eficaz para inativação dos cistos de T. gondii, porém, o processo se mostrou eficiente quando a maturação foi feita por período igual ou superior a 21 dias. Cistos de T. gondii foram encontrados em praticamente todos os órgãos e cortes avaliados, demonstrando a ampla distribuição do parasita em suínos e a importância dessa espécie como fonte de infecção para o homem. / The objective of the present study was to evaluate the viability of Toxoplasma gondii cysts in pork processed by dry-aged for 14, 21 and 28 days at 0º (&#177; 1), as well as to evaluate the distribution of T. gondii cysts in organs and commercial cuts of experimentally infected pigs. For that, two experiments were conducted ans in both the pigs were infected with 3.000 oocysts of the isolate TgCkBr57 (BrII). The loin was the muscle chosen to undergo the dry-aged because it is the cut conventionally used for the process. The right loin of each pig was submitted to the dry-aged and the left was kept as control, without processing. In Experiment 1, three pigs were infected. From the loins processed by dry-aged (n=3) e controle (n=3), the bioassay was performed on cats and mice and the aged period of the loins was 14 days. This study, also avaluated the distribution of T. gondii tissue cysts by bioassay in mice of brain, retina, tongue, diaphragm and hear and of the muscles: loin (m. longissimus), coppa (m. longissimus, spinalis dorsi, rhomboideus), tender loin (m. psoas major), outside flat (m. biceps femoris), topside (m. semimembranosus) and top sirloin (m. gluteos medius) was evaluated. In Experiment 2, six pigs were infected and the bioassay was performed in mice of the loins aged for 14 (n=2), 21 (n=2) and 28 (n=2) days. In both experiments, T. gondii cysts of the loins remained viable after 14 days of dry-aged, confirmed by bioassay in cats and mice. At 21 and 28 days, the bioassay showed that the mice did not become infected, indicating that the process made the cysts unfeasible. As to the distribution of the cysts, T. gondii was isolated from the coppa, heart, diaphragm and tongue of the three pigs, to the tender loin, outside flat and brain of two pigs and to the top sirloin and loin of one pig. No mice were infected in the bioassay with the topside and with the retina. The results demonstrate that the dry-aged for 14 days at controlled temperature (0ºC) was not effective for inactivation of T. gondii cysts, however, the process was efficient when the dry-aged was done for a period egual or righter than 21 days. Toxoplasma gondii cysts were found in practically all organs and cuts evaluated, demonstrating the wide distribution of the parasite in pigs and the importance of this species as a source of infection for man.

A ovinocultura é um sistema de criação muito antigo em nosso país e ainda continua apresentando uma série de problemas que dificultam a produção econômica desses animais e necessitam de urgentes soluções. Visando minorar estes prejuízos esta pesquisa foi idealizada com o intuito de realizar um estudo minuncioso das principais enfermidades reprodutivas parasitárias e bacterianas. Todos os animais foram submetidos ao exame clínico geral e específico do sistema reprodutor e colheram-se amostras de soro, sêmen, abortamentos, lóquios, secreções, fezes e zaragatoa prepucial e vaginal dependendo da enfermidade a ser estudada. Não foi possível o isolamento nos fetos de nenhum agente etiológico. Conclui-se que a toxoplasmose é a enfermidade de maior importância nos rebanhos de estado de São Paulo e a de maior fator de risco em casos de abortamentos, a neosporose estaria relacionada principalmente com animais que apresentam repetição de cio, leptospirose foi observado em baixa titulação e a mais prevalente foi a Leptospira australis sorovar australis proveniente de animais silvestres, a campilobacteriose e a brucelose são as duas enfermidades da reprodução com menor ocorrência no estado. Foi isolado o primeiro caso de endometrite no Brasil por Histophilus somni. Foi isolado o primeiro caso de orquite por Actinobacillus seminis no estado de São Paulo. / Sheep industry is a traditional system in Brazil and presents a series of issues that complicate economical exploitation and urgently need solution. In order to reduce losses this research was idealized to carefully study the major bacterial and parasitary reproductive diseases. All animals were submitted to a general and specific reproductive system clinical examination. Blood, semen, abortions, lochia, vaginal discharges, feces, and preputial/vaginal swabs were collected according to the studied disease. It was not possible to isolate any etiological agent from aborted fetuses. The conclusion was that toxoplasmosis was the major disease on São Paulo herds and has the biggest risk factor in abortions, neosporosis would be related to animals that present heat repetition, leptospirosis was observed with low antibodies titles and the most prevalent was Leptospira australis sorovar australis arising from wild animals, campilobacteriosis and brucellosis are both the reproductive diseases with the lowest occurrence in the state. The first endometritis case caused by Histophilus somni. In Brazil was isolated. The first orchitis case caused by Actinobacillus seminis in São Paulo state was isolated.

As formas sintomáticas de toxoplasmose são um grave problema de saúde pública e ocorrem em cerca de 10 a 20% das pessoas infectadas. Com o objetivo de melhorar o diagnóstico molecular de toxoplasmose sintomática em pacientes brasileiros, este estudo avaliou o desempenho da PCR em tempo real (qPCR) na detecção do DNA de T. gondii testando dois conjuntos de iniciadores moleculares (B1 e REP-529) para diagnóstico molecular. A metodologia foi testada em 807 amostras clínicas com diagnóstico clínico conhecido, ELISA e PCR convencional (cPCR) em um período de 9 anos. Todas as amostras foram de pacientes com suspeita clínica de diferentes formas da toxoplasmose. De acordo com a curva mínima de limite de detecção (no CT), o REP-529 apresentou maior sensibilidade para detectar DNA de T. gondii do que B1. Ambos os conjuntos de iniciadores moleculares foram avaliados retrospectivamente usando o DNA de 515 amostras clínicas diferentes. Os 122 pacientes com resultado negativo na PCR em tempo real, provavelmente por terem infecção crônica, demonstraram alta especificidade (REP-529, 99,2% e B1, 100%). Das 393 amostras com ELISA positivo (IgG), 146 apresentaram diagnóstico clínico de toxoplasmose e cPCR positivo. As sensibilidades de REP-529 e B1 foram de 95,9% e 83,6%, respectivamente. A comparação dos desempenhos do REP-529 e B1 foi analisada prospectivamente em 292 amostras. Assim, a partir de um total de 807 amostras de DNA analisadas, 217 (26,89%) apresentaram PCR positivo, pelo menos em um conjunto de iniciadores e com toxoplasmose sintomática confirmada pelo diagnóstico clínico. O REP-529 foi positivo em 97,23%, enquanto o B1 amplificou apenas 78,80%. Depois de comparar várias amostras em um laboratório brasileiro de referência, este estudo concluiu que o conjunto de iniciadores REP-529 apresentou melhor desempenho do que B1. Essas observações foram baseadas após o uso de casos com diagnóstico clínico definido, ELISA e cPCR. / Symptomatic forms of toxoplasmosis are a serious public health problem and occur in around 10-20% of the infected people. Aiming to improve the molecular diagnosis of symptomatic toxoplasmosis in Brazilian patients, this study evaluated the performance of real time PCR (qPCR) in detecting T. gondii DNA testing two primer sets (B1 and REP-529) for molecular diagnosis. The methodology was assayed in 807 clinical samples with known clinical diagnosis, ELISA, and conventional PCR (cPCR) results in a 9-year period. All samples were from patients with clinical suspicion of several features of toxoplasmosis. According to the minimum detection limit curve (in CT), REP-529 had greater sensitivity to detect T. gondii DNA than B1. Both primer sets were retrospectively evaluated using 515 DNA from different clinical samples. The 122 patients without toxoplasmosis (with negative real-time PCR) provided high specificity (REP-529, 99.2% and B1, 100%). From the 393 samples with positive ELISA (IgG), 146 had clinical diagnosis for toxoplasmosis and positive cPCR. REP-529 and B1 sensitivities were 95.9% and 83.6%, respectively. Comparison of REP-529 and B1 performances was further analyzed prospectively in 292 samples. Thus, from a total of 807 DNA analyzed, 217 (26.89%) had positive PCR with, at least one primer set and with symptomatic toxoplasmosis confirmed by clinical diagnosis. REP-529 was positive in 97.23%, whereas B1 amplified only 78.80%. After comparing several samples in a Brazilian referral laboratory, this study concluded that REP-529 primer set had better perform than B1 one. These observations were based after using cases with defined clinical diagnosis, ELISA, and cPCR.

Introdução: A infecção aguda pelo Toxoplasma gondii em gestantes pode determinar infecção fetal através de passagem transplacentária. As crianças afetadas podem desenvolver coriorretinite e déficit neurológico, na ausência de tratamento adequado. Objetivos: Estimar a prevalência de toxoplasmose aguda em gestantes atendidas na maternidade do Hospital Nossa Senhora da Conceição, avaliando possíveis diferenças nas freqüências ao longo do período estudado; medir a incidência de toxoplasmose congênita (TC) e estimar a taxa de transmissão vertical em crianças nascidas neste hospital; avaliar a acurácia de testes diagnósticos em TC, aplicados no momento do nascimento, na população de crianças estudadas. Métodos: Inicialmente um estudo transversal foi desenvolvido para identificar as pacientes que apresentaram critérios de infecção aguda na gestação, atendidas na maternidade no momento do parto, entre outubro de 1998 e dezembro de 2005. Novas tecnologias foram introduzidas para detecção diagnóstica ao longo deste período. Entre outubro de 1998 e dezembro de 2001 (período 1), utilizou-se o método microparticle enzyme immunoassay – MEIA e entre janeiro de 2002 e dezembro de 2005 (período 2) foi utilizada a técnica de captura de IgM e o teste de avidez de IgG com o método enzyme linked fluorescent assay – ELFA (VIDAS). Os recém-nascidos identificados a partir deste estudo inicial foram incluídos em um estudo de coorte histórico, com tempo de acompanhamento aproximado de doze meses, para estabelecer o diagnóstico definitivo de toxoplasmose congênita, obtido em dois momentos: (1) logo após o nascimento; (2) aos 12 meses, aproximadamente. Para a definição de caso da infecção aguda na gestação e de toxoplasmose congênita foi utilizado o sistema de classificação elaborado por Lebech et al., com adaptações (quadro 1). Aqueles casos classificados como improváveis foram excluídos do cálculo da prevalência de toxoplasmose aguda em gestantes e de incidência de TC. Para avaliar a acurácia de testes diagnósticos em TC realizados no momento do nascimento utilizou-se, como padrão ouro para o diagnóstico definitivo, a concentração de anticorpos IgG em torno de 12 meses de vida. Um bebê infectado deve ter concentrações iguais ou mais elevadas de IgG nesta idade quando comparadas às encontradas no nascimento. Houve comparação independente e cega dos métodos diagnósticos avaliados em relação ao padrão ouro. A dosagem de anticorpos IgG e IgM em recém-nascidos foi processada com o método microparticle enzyme immunoassay (MEIA). Análise: Para comparar proporções foi utilizado o teste qui-quadrado com correção de Yates, teste exato de Fisher, quando necessário, e Teste t de Student para comparação entre médias de duas amostras independentes com distribuição simétrica. Na avaliação do desempenho de testes diagnósticos foram obtidos resultados de sensibilidade, especificidade, razões de verossimilhança (RV) positiva e negativa dos testes diagnósticos – hemograma, exame do líquor, ecografia transfontanelar, exame de fundo de olho (EFO) e a detecção de anticorpos IgM para toxoplasmose (MEIA) e do DNA do toxoplasma com reação em cadeia da polimerase – método Nested (RCP-Nested) séricos. Resultados: Em uma população de 41.112 gestantes, a prevalência de toxoplasmose aguda foi de 4,8 para cada 1.000 gestantes (IC95%: 4,2 a 5,6). Houve redução significativa na prevalência de toxoplasmose aguda nas gestantes deste hospital a partir do ano 2002 (P=0,008). O diagnóstico de toxoplasmose congênita foi definitivo em 37 crianças entre 40.727 nascidos vivos no período estudado, atingindo uma incidência de 0,9 para cada 1.000 nascimentos (IC95%: 0,6 a 1,3). Logo após o nascimento, entre os 200 recém-nascidos expostos ao T. gondii, resultado de 199 gestantes infectadas, 25 bebês apresentaram critérios diagnósticos de toxoplasmose congênita, atingindo taxa de transmissão vertical de 12,5% (IC 95%: 8,2% - 17,9%). Após o seguimento foram detectados mais 12 casos, aumentando esta taxa para 18,5% (IC 95%: 13,4% – 24,6%). Para avaliar a acurácia de testes diagnósticos aplicados no momento do nascimento, foram identificadas 31 crianças com TC, de acordo com o padrão ouro, entre 136 expostas ao protozoário intra-útero e que completaram seguimento até os 12 meses de vida. Os testes que apresentaram melhor desempenho isoladamente na predição do diagnóstico, foram detecção de anticorpos IgM específicos, EFO e RCPNested atingindo razões de verossimilhança positivas de 119,3 (IC95%: 7,40 – 1923,92), 49,9 (IC95%: 3,0 – 838,2) e 24,8 (IC95%: 3,22 – 190,35), respectivamente. A RV negativa para IgM foi 0,4 (IC95%: 0,3 – 0,6), mas para o EFO e RCP-Nested foi apenas 0,7 (IC95%: 0,6 – 0,9). Conclusão: A prevalência de toxoplasmose aguda em gestantes incluídas neste estudo foi inferior à encontrada na França e na Bélgica, mas foi mais elevada quando comparada às descritas na Suécia, Noruega, Dinamarca e Nova Iorque. A prevalência estimada neste estudo foi similar a de outros locais do Brasil, como Mato Grosso do Sul, mas inferior à obtida no Distrito Federal. Esta variabilidade nas estimativas pode estar relacionada com os diferentes métodos diagnósticos utilizados no rastreamento, ou ainda, com os diferentes fatores de risco envolvidos na transmissão da doença. Em nosso estudo, esta freqüência diminuiu a partir do ano de 2002, o que não pode ser atribuível à introdução do teste de avidez de IgG, uma vez que a média de idade gestacional na realização deste exame foi tardia. Entretanto, existe a possibilidade de que o teste de captura de IgM com o método ELFA tenha contribuído para diminuir os casos falso-positivos de IgM, o que poderá ser confirmado com futuros estudos. Estes resultados apontam que a introdução de novas tecnologias no laboratório deve ser acompanhada de esforços para melhorar as condições de acesso precoce das gestantes ao pré-natal de referência, com o objetivo de não perder a oportunidade para melhor discriminar as gestantes sem doença e evitar procedimentos invasivos, desnecessários e onerosos. A incidência de toxoplasmose congênita e a taxa de transmissão vertical foram elevadas. Estas freqüências podem estar subestimadas devido às perdas no seguimento. Para avaliar o efeito das perdas na validade do estudo, foram comparadas as características da população de gestantes e de recém-nascidos do grupo de bebês com seguimento completo em relação ao grupo que não retornou para o seguimento. Estas características foram semelhantes nos dois grupos, portanto, consideramos que o percentual de perdas, embora elevado, não prejudicou a validade do estudo. A identificação de 12 casos adicionais de TC com o seguimento dos bebês reforça a necessidade de monitoramento sorológico durante o primeiro ano de vida, mesmo sem evidência de infecção congênita ao nascimento. Na avaliação dos testes diagnósticos aplicados ao nascimento, a detecção de anticorpos IgM específicos no sangue do neonato, o EFO e o RCP-Nested sérico demonstraram melhor desempenho para identificar os bebês com TC. Entretanto, para afastar este diagnóstico, apenas o resultado não reagente de anticorpos IgM específicos apresentou maior utilidade, mas com efeito de pequena magnitude. / Introduction: The acute infection by Toxoplasma gondii in pregnant women may cause fetal infection by means of the transplacental transfer. Affected children may develop chorioretinitis and neurological deficit in the absence of a proper treatment. Objectives: To estimate the prevalence of acute toxoplasmosis in pregnant women cared for at the maternity ward of Hospital Nossa Senhora da Conceição, evaluating possible differences in frequencies along the period of study; to measure the incidence of congenital toxoplasmosis (CT), and estimate the rate of vertical transmission in children who were born in this hospital; to evaluate the accuracy of diagnostic tests in CT, applied at the moment of the birth, in the population of studied children. Methods: Initially a cross-sectional study was developed to identify the patients who presented criteria of acute infection in the pregnancy, cared for at the maternity ward at the moment of the labor, between October 1998 and December 2005. New technologies have been introduced for diagnostic detection along this period. Between October 1998 and December 2001 (period 1) the microparticle enzyme immunoassay – MEIA was used, while between January 2002 and December 2005 (period 2) the IgM capture technique and the IgG avidity test with the enzyme linked fluorescent assay – ELFA (VIDAS) method were used. Those newborns (NB) identified at this initial study were included in a historical cohort study, with an approximate follow-up time of twelve months, to establish the definitive diagnosis of congenital toxoplasmosis, obtained in two moments: (1) soon after birth; (2) at 12 months, approximately. For the definition of cases of acute infection in pregnancy and congenital toxoplasmosis, the classification system elaborated by Lebech et al. was used with adaptations (Picture 1). Those cases that were classified as unlikely were excluded from the prevalence calculation of acute toxoplasmosis in pregnant women and from the incidence of CT. In order to evaluate the accuracy of diagnostic tests in CT accomplished at the moment of birth, the concentration of IgG antibodies around 12 months of age was used as a gold standard for the ultimate diagnosis. An infected baby must have equal or higher concentrations of IgG at this age when compared to the ones found at birth. An independent and blind comparison of the diagnostic methods evaluated in relation to the gold standard was performed. The dosage of IgG and IgM antibodies in newborns was processed with the microparticle enzyme immunoassay (MEIA) method. Analysis: In order to compare proportions, a chi square test with Yates correction, an exact Fisher test when necessary, and a Student's t-test for comparison between means of two independent samples with symmetrical distribution were used. In the performance evaluation of diagnostic tests, results of sensitivity, specificity, positive and negative likelihood ratio (LR) of the diagnostic tests – hemogram, liquor test, transfontanellar ultrasonography brain scan, ophthalmoscopy, and detection of IgM antibodies for toxoplasmosis (MEIA) and the DNA of the toxoplasm with polymerase chain reaction – method Nested (PCR-Nested) serum were obtained. Results: In a population of 41,112 pregnant women, the prevalence of acute toxoplasmosis was 4.8 per 1,000 pregnant women (CI95%: 4.2 to 5.6). There was a significant decrease in the prevalence of acute toxoplasmosis in pregnant women of this hospital from 2002 on (P=0.008). The diagnosis of congenital toxoplasmosis was definitive in 37 children among 40,727 live births in the studied period, reaching an incidence of 0.9 per 1,000 births (CI95%: 0.6 to 1.3). Soon after the birth, among the 200 newborns exposed to the T. gondii, resulting from 199 pregnant women, 25 babies showed diagnostic criteria of congenital toxoplasmosis, reaching a vertical transmission rate of 12.5% (CI 95%: 8.2% - 17.9%). After the follow-up, another 12 cases were detected, increasing this rate to 18.5% (CI 95%: 13.4% – 24.6%). In order to evaluate the accuracy of diagnostic tests applied at the moment of birth, 31 children with CT were identified according to the gold standard, among 164 ones who were exposed to protozoan intra-uterus and who completed their follow-up until 12 months of age. The tests that showed better performance when isolate in the prediction of the diagnosis were the detection of specific IgM antibodies, ophthalmoscopy, and PCR-Nested reaching positive RV of 119.3 (CI95%: 7.40 – 1923.92), 49.9 (CI95%: 3.0 – 838.2), and 24.8 (CI95%: 3.22 – 190.35), respectively. The negative RV for IgM was 0.4 (CI95%: 0.3 – 0.6), but for ophthalmoscopy and PCR-Nested it was 0.7 (CI95%: 0.6 – 0.9) only. Conclusion: The prevalence of acute toxoplasmosis in pregnent women included in this study was lower than the one found in France and Belgium, but was higher when compared to the ones described in Sweden, Norway, Denmark, and New York. The estimated prevalence in this study was similar to the one from other locations in Brazil, such as Mato Grosso do Sul, but lower to the one obtained in Brasília. This variability in the estimates may be related to the different methods for diagnosis used in the screening or even to the different risk factors involved in the transmission of the disease. In our study, this frequency decreased from 2002 on, and this cannot be attributed to the introduction of the IgG avidity test, since the means of gestational age at the accomplishment of this test was late. However, there is a possibility that the IgM capture test with the ELFA method has contributed to decrease the frequency of false-positive cases of IgM, what can be confirmed with future studies. These results signal that the introduction of new technologies in the laboratory must be accompanied by efforts to improve conditions for an early access of pregnant women to the reference prenatal care, aiming to prevent the loss of opportunities of better discriminating pregnant women that are not sick and avoiding unnecessary and expensive invasive procedures. The incidence of congenital toxoplasmosis and the rate of vertical transmission were elevated. These frequencies may be underestimated due to the losses in the follow-up. In order to evaluate the effect of losses in the study validity, characteristics of the population of pregnant women and newborns belonging to the group of babies with full follow-up in relation to the group that did not return for the follow-up were compared. These characteristics were similar in the two groups, therefore we consider that the percentual of losses, even though high, did not endanger the validity of the study. The identification of twelve additional cases of congenital toxoplasmosis with the follow-up of the babies reinforces the need of a serological monitoring during the first year of life, even without any evidence of congenital infection at birth. In the evaluation of diagnostic tests applied at birth the detection of specific IgM antibodies in the blood of the newborn, the ophthalmoscopy, and the serum PCR-Nested showed a better performance to identify babies with CT. However, in order to discard this diagnosis, only the non-reagent IgM specific antibodies result showed higher utility, with a small magnitude effect though.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-05-20T13:52:26Z No. of bitstreams: 1 Adrianne Mota de Alcantara.pdf: 880772 bytes, checksum: d42422bf43cfe9ec3a3e1d6be2030d4e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-20T13:52:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Adrianne Mota de Alcantara.pdf: 880772 bytes, checksum: d42422bf43cfe9ec3a3e1d6be2030d4e (MD5) Previous issue date: 2016-02-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Toxoplasmosis is a zoonosis, caused by the protozoan parasite Toxoplasma gondii, which represents an important public health burden worldwide. It has been estimated that 30% of the human population is seropositive for T. gondii. Severe complications may occur in immunocompromised patients or after congenital infection. Free-range chickens are considered an important host in the epidemiology of Toxoplasmosis, since they are a source of infection for cats and humans. The purpose of this study was to investigate the frequence and viability of T. gondii in free-range chickens destined for human consumption in Recife, Pernambuco state, Brazil. Serum samples from 56 free-range chickens were submitted to Immunofluorescence Antibody Test (IFAT) for detection of anti-T. gondii IgG antibodies. Tissue samples from seropositive chickens were submitted to PCR and mouse bioassay. From the tissue and serum of the mice submitted were performed PCR and IFAT, respectively. Anti-T. gondii IgG antibodies were found in 46.43% (26/56) of chickens and in 25% (13/52) of inoculated mice submitted to bioassay. Suggestive clinical manifestation of toxoplasmosis was observed in five inoculated mice, with one death. The data obtained in the present study confirm that free-range chicken meat is a potential source of T. gondii infection for humans and it has an important role in the toxoplasmosis chain transmission, revealing the need for implementation of prevention and control of toxoplasmosis. / A toxoplasmose é uma importante zoonose que ocorre em todo o mundo, com uma estimativa de infecção de 30% da população humana, podendo ocorrer complicações em indivíduos imunocomprometidos e alterações neonatais em humanos. As aves domésticas são importantes hospedeiros intermediários de T. gondii por servirem de fonte de infecção do parasita para os felinos e seres humanos. O presente estudo teve como objetivo investigar a frequência e viabilidade de T. gondii em galinhas caipiras vendidas em feiras-livre de Recife – Pernambuco. Foram analisadas 56 amostras de soro de galinhas para a pesquisa de anticorpos IgG anti-T. gondii por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI). Amostras de tecidos das galinhas soropositivas foram submetidas à Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e ao bioensaio em camundongos. Foi realizada PCR e RIFI de tecido e soro dos camundongos submetidos ao bioensaio, respectivamente. Anticorpos IgG anti-T. gondii foram encontrados em 46,43% (26/56) das galinhas e em 25% (13/52) dos camundongos submetidos ao bioensaio. Sinais clínicos sugestivos de toxoplasmose foram observados em cinco dos camundongos inoculados e um óbito. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que a carne e vísceras de galinhas caipiras podem atuar como uma fonte de infecção por T. gondii para humanos nesta região, reforçando a importância dessas aves na cadeia epidemiológica da toxoplasmose e a necessidade de implementação de medidas de prevenção e controle da enfermidade.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-06-09T13:54:47Z No. of bitstreams: 1 Erika Fernanda Torres Samico Fernandes Cavalcanti.pdf: 913952 bytes, checksum: 42901e597e56c04af84eda7eabac98a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-09T13:54:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Erika Fernanda Torres Samico Fernandes Cavalcanti.pdf: 913952 bytes, checksum: 42901e597e56c04af84eda7eabac98a3 (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Toxoplasma gondii is an obligate intracellular coccidian protozoan that causes the toxoplasmosis, an important zoonosis. The study of the prevalence of this parasite in pigs have great importance since pork is one of the main sources of infection for humans when consumed raw or undercooked. This study aimed to determine the prevalence of antibodies, isolate and genetically characterize the Toxoplasma gondii in subsistence creations of pigs in the State of Pernambuco, Brazil. In the first study it was evaluated 224 blood samples and tissues from pigs slaughtered in municipal slaughterhouses for the presence of anti-Toxoplasma gondii antibodies by Indirect Immunofluorescence Assay (IFA). There was a significant relationship regarding the age of the animals and seropositivity (p <0.001). The positive animals had their tissues analyzed by bioassay techniques in mice, Histopathology, Immunohistochemistry (IHC) and Polymerase Chain Reaction (PCR). Of animals sampled, 38.0% (85/224) were positive in the IFA with titles ranging from 64 to 1024. In the histopathology, it was not observed injuries associated to toxoplasmosis in the evaluated tissues and in the IHC it was not obtained positive immunostaining. The PCR of pig tissues showed 14.1% (12/85) positive samples and in the mouse bioassay, 28.0% (5/18) of the samples were positive. The second study was realized with the purpose of discovering the genotypes of T. gondii in the region. It was realized a screening of positive animals in the serological tests, then, the tissues of positive animals were used for bioassay. Fifteen pools of tissues were used, of which, was obtained one isolate. The isolate obtained was characterized by RFLP -PCR, using 11 genetic markers (SAG1, SAG2, altSAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c228, c292, L358, PK1 e APICO). It was used the RH, ME49 and VEG strains of T. gondii, that belong to types I, II and III respectively as standard in genetic characterization of isolated swines. After this genetic analysis, it was identified genotype #65 (ToxoDB), considered an atypical strain and also the first record of this genotype in pigs worldwide. The results of this study allow to conclude that Toxoplasma gondii is installed in pig herds in the state of Pernambuco and strategic and integrated measures should be taken around the prophylaxis of this disease, to prevent and control the infections in pigs and humans in the studied region. / Toxoplasma gondii é um protozoário coccídio intracelular obrigatório causador da toxoplasmose, uma importante zoonose. O estudo da prevalência deste parasito em suínos é de grande importância uma vez que a carne suína é uma das principais via de transmissão para os humanos, quando consumida crua ou mal cozida. Objetivou-se neste estudo determinar a soroprevalência de anticorpos, isolar e caracterizar geneticamente Toxoplasma gondii em suínos de criações de subsistência no Estado de Pernambuco, Brasil. No primeiro grupo de estudo avaliaram-se 224 amostras de sangue e tecidos de suínos abatidos em matadouros municipais para a presença de anticorpos anti- T. gondii na técnica da reação de Imunofluorescência indireta (RIFI) utilizando o ponto de corte ≥ 64. Os animais soropositivos tiveram seus tecidos analisados pelas técnicas de bioensaio em camundongos, histopatologia, imunohistoquímica (IHQ) e reação em cadeia da polimerase (PCR). Dos animais amostrados, 38,0% (85/224) foram positivos na RIFI com títulos variando de 64 a 1024. Ocorreu associação significativa em relação à idade dos animais e a soropositividade (p<0,001). Na histopatologia, não foram observadas lesões associadas à infecção por T. gondii nos tecidos avaliados e na IHQ também não foram obtidas imunomarcações positivas. A PCR dos tecidos dos suínos positivos na sorologia revelou 14,1% (12/85) amostras positivas e no bioensaio em camundongos, 28,0% (5/18) das amostras foram positivas. O segundo grupo de estudo foi realizado com o objetivo de se conhecer os genótipos circulantes do T. gondii no estado de Pernambuco. Inicialmente foi feita uma triagem dos animais positivos na prova sorológica (RIFI) em 54,3% (50/92) e os tecidos dos animais positivos seguiram para a bioprova. Foram utilizados 15 pools de tecidos onde se obteve um isolado. Este isolado obtido foi caracterizado na PCR-RFLP utilizando 11 marcadores genéticos (SAG1, SAG2, altSAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c228, c292, L358, PK1 e APICO). Foram utilizadas as cepas de T. gondii RH, ME49 e VEG que pertencem aos tipos I, II e III respectivamente, como padrão na caracterização genotípica do isolado suíno. Após a análise genética identificou-se o genótipo #65(ToxoDB) considerado uma cepa atípica, sendo este o primeiro registro desse genótipo em suínos no mundo. Os resultados obtidos nesse estudo permitiram concluir que a infecção por Toxoplasma gondii ocorre nos suínos no estado de Pernambuco e que medidas estratégicas e integradas devem ser adotadas para prevenir e controlar as infecções em suínos e humanos na região estudada.