Le TNF-α est une cytokine pro-inflammatoire du système immunitaire qui, lorsque sa production est déréglée, induit de nombreuses pathologies chez l’homme (cachexie, arthrite rhumatoïde, etc.) Outre une régulation transcriptionnelle de cette cytokine, il existe aussi une régulation post-transcriptionnelle permettant un contrôle affiné de sa production. Le laboratoire de Biologie du Gène étudie cette régulation post-transcriptionnelle faisant intervenir une séquence consensus dans l’ARNm appelée séquence AU-riche (ou ARE pour AU-rich element) et les protéines qui y sont impliquées. Généralement, les ARNm porteurs d’ARE codent pour des protéines dont l’expression est transitoire. Ces gènes requièrent un contrôle très précis de leur expression et c’est pourquoi, en plus d’être soumis à de nombreux contrôles transcriptionnels, la traduction et la stabilité de leurs ARNm sont très finement régulées. La réponse immune innée implique de nombreux ARNm de ce type. Jusqu’à présent, la fonction de la protéine TIAR dans la régulation de l’expression du TNF-α n’a pas été complètement élucidée. Outre le TNF-α, la participation à la réponse immune innée de nombreuses protéines encodées par des ARNm porteurs d’ARE pourrait conférer à la protéine TIAR un rôle de régulateur essentiel dans le contrôle de l’inflammation. Nous avons donc générés plusieurs lignées de macrophages RAW 264.7 surexprimant la protéine TIAR entière ou différents mutants de TIAR afin de déterminer, par une analyse globale par puces à ADN, les ARNm cibles de TIAR au cours de la réponse immune. Cette approche nous a permis de démontrer que la protéine TIAR exerce un contrôle sur le métabolisme de l’ARNm du TNF-α et de MKP-1 (MAP kinase phosphatase 1), une phosphatase majeure dans la voie de signalisation de la MAPK p38. Cette voie de signalisation joue un rôle essentiel dans la stabilisation et la traduction de nombreux ARNm porteurs d’ARE encodant des protéines de la réponse inflammatoire. D’autre part, nous avons voulu étudier in vivo la fonction de la protéine TIAR au cours de la réponse immune. Nous avons, dans ce but, généré des souris transgéniques surexprimant l’isoforme courte de la protéine TIAR. Si nous n’avons pas encore pu mesurer les effets d’une surexpression de TIAR sur la réponse inflammatoire chez ces souris, ces individus transgéniques ont révélé qu’une expression anormale de la protéine TIAR induit une létalité importante au cours du développement embryonnaire. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La crête neurale (CN) est une structure transitoire apparaissant en bordure de la plaque neurale chez les embryons de vertébrés. Au cours du développement embryonnaire, les cellules de la CN prolifèrent, subissent une transition épithélio-mésenchymateuse, migrent et se différencient en de nombreux types cellulaires tels que des neurones et cellules gliales du système nerveux périphérique, des mélanocytes, des cellules musculaires lisses ou des élements du squelette cranio-facial. Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la prolifération et la spécification des cellules de la CN, nous avons étudié le rôle de deux facteurs de transcription, Hairy2 et Stat3, via des expériences de perte et gain de fonction chez l’embryon de xénope. <p>Le gène Hairy2 code pour un facteur de transcription bHLH-O répresseur. Il est exprimé précocement au niveau de la bordure de la plaque neurale incluant la CN présomptive. Nous avons montré que Hairy2 est requis pour la prolifération des cellules de la CN en aval de signaux FGFs et qu’il maintient les cellules dans un état indifférencié en réprimant l’expression précoce des gènes spécifiques de la CN. Hairy2 réprime aussi la transcription du gène Id3 codant pour un facteur HLH essentiel à la prolifération des cellules de la CN. Id3 affecte également Hairy2. Nous avons observé que la protéine Id3 interagit physiquement avec Hairy2 et bloque son activité, démontrant que les interactions entre Hairy2 et Id3 jouent un rôle important dans la prolifération et la spécification des cellules de la CN. <p>\ / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La vitesse de réplication du HIV-1(Human Immunodeficiency Virus type 1), qui semble corrélée de manière directe à la vitesse de progression de la maladie vers le stade SIDA, est essentiellement contrôlée au niveau transcriptionnel. La transcription du HIV-1 est régulée par la structure chromatinienne, des éléments agissant en cis localisés dans les LTRs, des facteurs de transcription agissant en trans et par la protéine virale trans-activatrice Tat (revu dans Quivy et al. 2007, Bisgrove et al. 2005, Rohr et al. 2003, Rabson and Graves 1997). En plus de l’enhancer localisé dans le LTR5’ du HIV-1, un enhancer intragénique, localisé dans le gène pol du HIV-1, inductible par le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) a été identifié. La localisation progressive de l’activité enhancer a permis de définir deux domaines distincts et indépendants dans cet enhancer intragénique :les fragments 5103 et 5105 localisés respectivement dans la partie centrale du gène pol et dans une région couvrant la fin du gène pol, le gène vif, le gène vpr et le premier exon codant des gènes tat et rev (Verdin et al. 1990). Les fragments 5103 et 5105 se comportent tous deux comme des enhancers inductibles par le PMA lorsqu’ils sont clonés en amont du promoteur de la thymidine kinase dans un vecteur rapporteur en cellules HeLa. Notre laboratoire a précédemment identifié trois sites de liaison pour les facteurs de transcription AP-1 dans le fragment 5103 (Van Lint et al. 1991). <p><p>Au cours de notre thèse, nous avons poursuivi la caractérisation de ces sites de liaison AP-1 et avons montré que les facteurs c Fos, JunB et JunD interagissent in vitro avec ces motifs. Pour chaque site, nous avons identifié des mutations qui abolissent la liaison des facteurs AP-1 sans altérer la séquence en acides aminés sous-jacente de la transcriptase inverse. Par des expériences de transfection transitoire, nous avons démontré que les sites AP 1 intragéniques sont entièrement responsables de l’activité enhancer PMA-dépendante du fragment 5103. De plus, l’activité PMA-inductible du fragment 5103 est inhibée par le mutant dominant négatif A-Fos à condition que les sites ne soient pas mutés. A l’inverse, l’expression ectopique de dimères forcés AP-1 affecte positivement l’activité enhancer du fragment 5103. Enfin, nous avons étudié le rôle biologique des sites AP-1 intragéniques dans la réplication virale et avons montré que ces sites contribuent positivement à l’infectivité du virus.<p><p>Durant la seconde partie de notre thèse, nous avons entamé la caractérisation physique et fonctionnelle du fragment 5105. Nos résultats de transfection transitoire montrent que l’activité PMA inductible du fragment 5105 est localisée dans le dernier tiers de ce dernier :le sous fragment 5105.3. L’analyse bioinformatique de cette région a permis de mettre en évidence un site de liaison pour les facteurs AP-1 in vitro. Des mutations ponctuelles permettent d’abolir la liaison des facteurs à leur site mais altèrent la séquence en acides aminés sous-jacente codant pour les protéines Tat et Rev. Nous avons montré que ce site est impliqué dans l’activité transcriptionnelle de ce fragment. L’expression ectopique du mutant dominant négatif A-Fos inhibe l’activité transcriptionnelle PMA-inductible du fragment 5105. Une analyse bioinformatique plus large nous a ensuite permis d’identifier in vitro, par retard de migration sur gel, 5 sites de liaison pour le facteur YY1 et 2 sites de liaison pour le facteur PU.1 dont les implications pour le virus restent encore à déterminer.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Hox transcription factors are extensively investigated in diverse fields of molecular and evolutionary biology. Hox genes belong to the family of homeobox transcription factors characterised by a 60 amino acids region called homeodomain. These genes are evolutionary conserved and play crucial roles in the development of animals. In particular, they are involved in the specification of segmental identity, and in the tetrapod limb differentiation. In vertebrates, this family of genes can be divided into 14 groups of homology. Common methods to classify Hox proteins focus on the homeodomain. Classification is however hampered by the high conservation of this short domain. Since phylogenetic tree reconstruction is time-consuming, it is not suitable to classify the growing number of Hox sequences. The first goal of this thesis is therefore to design an automated approach to classify vertebrate Hox proteins in their groups of homology. This approach classifies Hox proteins on the basis of their scores for a combination of protein generalised profiles. The resulting program, HoxPred, combines predictive accuracy and time efficiency. We used this program to detect and classify Hox genes in several teleost fish genomes. In particular, it allowed us to clarify the evolutionary history of the HoxC1a genes in teleosts. Overall, HoxPred could efficiently contribute to the bioinformatics toolbox commonly used to annotate vertebrate Hox sequences. This program was then evaluated in non-vertebrate species. Although not intended for the classification of Hox proteins in distantly related species, HoxPred showed a high accuracy in bilaterians. It has also given insights into the evolutionary relationships between bilaterian posterior Hox genes, which are notoriously difficult to classify with phylogenetic trees.<p><p>As transcription factors, Hox proteins regulate target genes by specifically binding DNA on cis-regulatory elements. Only a few of these target genes have been identified so far. The second goal of this work was to evaluate whether it is possible to apply computational approaches to detect Hox cis-regulatory elements in genomic sequences. Regulatory Sequence Analysis Tools (RSAT) is a suite of bioinformatics tools dedicated to the detection of cis-regulatory elements in genomes. We participated to the development of matrix-based pattern matching approaches in RSAT. After having performed a statistical validation of the pattern-matching scores, we focused on a study case based on the vertebrate HoxB1 protein, which binds DNA with its cofactors Pbx and Meis. This study aimed at predicting combinations of cis-regulatory elements for these three transcription factors. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Cupriavidus metallidurans CH34 est une béta-protéobactérie, résistante aux métaux lourds, isolée des sédiments d'une usine de métallurgie non-ferreuse en Belgique. <p>Le génome de cette bactérie contient un chromosome (3.6 Mb), un mégaplasmide (2.6 Mb) et deux plasmides pMOL28 (171 kb) et pMOL30 (234 kb) déjà connus pour porter des gènes de résistance aux métaux lourds. <p>Nous avons d'abord fait le catalogue des gènes impliqués dans la résistance aux métaux lourds et, ensuite, cherché à mesurer leur expression par deux approches transcriptomiques :RT-PCR et puces à ADN.<p> L'analyse du génome montre au moins 170 gènes relatifs à la résistance aux ions métalliques localisés sur les 4 réplicons, principalement sur les deux plasmides. Ces gènes codent essentiellement pour des systèmes d'efflux tel que les HME-RND (transport chimioosmotique avec flux de protons à contresens), les ATPases de type P ou encore pour le système de résistance aux ions Cu(II). Dans le génome de C. metallidurans, nous avons identifié 13 opérons qui codent pour des systèmes HME-RND, seuls trois, localisés sur les plasmides, sont surexprimés en présence de métaux lourds. Huit gènes codent pour des ATPases de type P, dont deux appartiennent à une classe dont les substrats ne sont pas métalliques. Deux ATPases appartiennent à une famille spécialisée pour l'efflux du Cu(II) et les quatre autres à une autre grande famille impliquée dans l'efflux des ions Cd(II), Pb(II) et Zn(II). Les analyses transcriptomiques montrent la surexpression des deux premières classes d'ATPases P en présence des métaux lourds. La mutagenèse du gène zntA (mégaplasmide), codant pour l'une des ATPases, provoque une diminution de la viabilité en présence de Zn(II), Cd(II) et dans une moindre mesure de Pb(II), Tl(I) et Bi(III). <p>Sur pMOL30, la résistance au cuivre implique un groupe de 19 gènes cop codant pour la résistance au cuivre au niveau du périplasme et du cytoplasme, et vraisemblablement pour une forme de stockage du cuivre essentiel. Ces 19 gènes sont surexprimés en présence de cuivre, mais une quinzaine de gènes proches semblent aussi requis pour une expression optimale de la résistance au cuivre. <p>L'annotation des plasmides a mis en évidence la parenté du plasmide pMOL28 avec le plasmide pHG1 (hydrogénotrophie, fixation du CO2) de C. eutrophus H16 et le plasmide pSym (fixation de l'azote) de C. taiwanensis, et chez pMOL30, la présence de deux îlots génomiques concentrant la plupart des résistances aux métaux lourds. Les puces montrent la surexpression de 83 sur 164 gènes dans pMOL28, et de 143 sur 250 gènes dans pMOL30. Elles montrent aussi que les gènes présents sur les deux plasmides sont davantage surexprimés que ceux localisés sur les deux mégaréplicons. Parmi les gènes surexprimés les plus intéressants du plasmide pMOL30, il faut mentionner des transposases tronquées et des gènes impliqués dans la synthèse des membranes (glycosyltransférases). L'analyse de l'expression des gènes plasmidiens de résistance aux métaux lourds montre la surexpression en présence de plusieurs ions métalliques ajoutés indépendamment et pas seulement par les substrats métalliques de ces opérons, ce qui suggère l'intervention de deux types de régulation dont les gènes correspondants sont aussi localisés sur le chromosome et le mégaplasmide.<p>Ce travail met en évidence la spécialisation de la bactérie dans la réponse à un grand spectre de concentrations de métaux lourds, jusqu'à la limite majeure de la toxicité observée pour les bactéries mésophiles hétérotrophes. Cette spécialisation correspond bien aux biotopes industriels de divers continents dans lesquels on l'a trouvée. <p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La grande famille des facteurs de transcription Ets est caractérisée par un domaine de liaison à l’ADN, le domaine ETS, qui présente une structure de type hélice-tour-hélice ailé et qui reconnaît la séquence nucléotidique GGAA/T. Ces facteurs sont des protéines modulaires, dont les domaines sont structurellement conservés, régulent la transcription de leurs gènes cibles. L’action régulatrice de ces facteurs de transcription, ainsi que leur spécificité, dépendent de leurs sites d’expression, du taux auquel ils sont exprimés ainsi que des modifications post-traductionnelles qui les touchent. Au sein de la famille Ets, les trois membres du groupe PEA3 - Erm, Pea3 et Er81 - sont impliqués dans divers processus tant physiologiques tels que le développement des neurones sensitifs et moteurs que pathologiques tels que la croissance et l’invasion tumorale ou l’apparition de métastases, au niveau mammaire notamment.<p><p>Notre travail a eu pour ambition de mieux comprendre les relations structure/fonction des membres du groupe PEA3, et plus particulièrement de Erm. <p><p>\ / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les protéines de la Famille Ets sont des facteurs de transcription qui reconnaissent par l'intermédiaire d'un domaine de liaison à l'ADN, appelé le domaine ETS, une séquence nucléotidique centrée sur un core consensus 5'-GGAA/T-3'. Le gène fev, un membre de cette famille, a été isolé chez l'humain après avoir été identifié dans une tumeur de Ewing chez l'enfant comme le résultat d'une translocation chromosomique. Une étude préliminaire de 1997 indiquait que chez l'Homme, Fev possède une expression tissulaire restreinte au petit intestin et à la prostate "adulte". Dans la première partie de ce travail, nous avons observé une surexpression de l'ARNm de ce facteur de transcription dans une large série d'adénocarcinomes prostatiques de différenciation variable en comparaison au profil d'expression observé dans un groupe témoin de prostates hyperplasiées. En recherchant des lignées cellulaires qui expriment ce facteur, nous avons mis en évidence la présence de ce messager dans la lignée humaine d'origine prostatique LNCaP. De même, les lignées humaines d'origine hématopoïétiques Dami/HEL92.1.7, K-562, KU-812 F et U-937 expriment ce facteur. Parallèlement, nous avons réalisé l'étude de l'expression de Fev dans le cerveau humain. En effet, chez le rat et chez la souris, l'homologue de Fev (mPet-1/Pet-1) est exprimé spécifiquement dans les neurones sérotoninergiques. Nous avons ainsi montré sur le cerveau humain que l'ARNm de Fev est exclusivement exprimé dans les noyaux du raphé qui contiennent les neurones sérotoninergiques. Il est co-exprimé avec deux marqueurs de ces neurones, la SERT/5-HTT et la TPH2.<p>Parallèlement, nos travaux de caractérisation fonctionnelle de la protéine Fev ont permis de définir ce facteur comme un répresseur transcriptionnel. En effet, ce facteur possède un domaine carboxy-terminal riche en résidus alanines qui lui confère, en partie, sa fonction de répresseur de la transcription (répression active); la délétion de cette région conduisant à une réduction drastique de l'effet répresseur. Parallèlement, nous avons montré que le domaine ETS de Fev est responsable d'une activité répressive passive par l'occupation des sites de liaison aux facteurs Ets. Néanmoins, nous ne connaissons pas, à l'heure actuelle, les gènes-cibles spécifiques qui sont directement réprimés par Fev dans les cellules dans lesquelles le gène est normalement exprimé. Nous avons tenté de développer, par établissement de clones stables, des modèles cellulaires où le gène d'intérêt est surexprimé, mais ces tentatives furent infructueuses. Cet effet drastique de Fev est conféré par la partie carboxy-terminale. Il est ainsi probable que la surexpression de ce répresseur transcriptionnel spécifique de certains gènes cibles de la famille Ets provoque des effets sur la survie des cellules en régulant des gènes indispensables à la croissance cellulaire, et ainsi empêchant la prolifération de clones cellulaires.<p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les biopuces à ADN permettent d’étudier à une échelle génomique une très grande variété de questions sur la physiologie et la différenciation cellulaires. Elles ont ainsi contribué de manière considérable aux progrès récents de nombreux domaines de la biologie et occuperont bientôt une place de choix dans le secteur du diagnostic médical. C’est la levure Saccharomyces cerevisiae qui a servi de modèle pour le développement de la première biopuce génomique. L’application de cette approche à la levure a permis d’explorer sous un angle nouveau l’étude de ses différents états de différenciation, de son cycle cellulaire, et de sa capacité d’adaptation à diverses conditions nutritionnelles ou à des conditions environnementales induisant un stress cellulaire. Plusieurs études ont plus particulièrement examiné la réponse des cellules de levure à une carence en azote ou en acides aminés. Cependant, une étude systématique de la réponse transcriptionnelle de la cellule aux différentes sources d’azote n’a jamais été entreprise en croissance confinée à l'état de régime. S. cerevisiae est capable d’utiliser plus d’une vingtaine de substances en tant que sources uniques d’azote pour la croissance. On distingue parmi les sources d’azote celles qui permettent une croissance optimale, appelées « bonnes » sources d’azote, des autres, appelées « mauvaises » sources d’azote. La levure possède plusieurs systèmes de régulation lui permettant de s'adapter à la condition azotée. Au niveau transcriptionnel, on recense trois régulations générales – la NCR (répression catabolique azotée), le GAAC (le contrôle général de la biosynthèse des acides aminés) et le système SPS (Ssy1-Ptr3-Ssy5) – et une multitude de régulations plus spécifiques.<p>En utilisant la technique des puces à ADN, nous avons généré une matrice d'expression de l'ensemble des gènes de la levure en croissance confinée à l'état de régime dans un milieu de culture contenant une parmi 21 sources d'azote différentes. Nous avons pu ainsi recenser systématiquement 506 gènes soumis à une régulation transcriptionnelle dépendante de l'azote.<p>En nous basant sur ces résultats, nous avons pu décrire l'ensemble des régulations transcriptionnelles engagées dans l'adaptation à la source d'azote fournie dans le milieu de culture. Parallèlement, nous avons défini deux grands groupes de sources d'azote en fonction du transcriptome de S. cerevisiae. Le premier groupe rassemble les composés qui exercent une répression catabolique azotée forte et dont la liste a été complétée. Fait nouveau, nous montrons que ces mêmes composés enclenchent aussi l'activation de la réponse aux protéines mal repliées (UPR). Au contraire, lorsque la source d'azote appartient au second groupe que nous avons défini, non seulement la croissance des levures est plus lente, la NCR levée et la réponse aux protéines mal repliées réprimée, mais nous montrons de façon inattendue que le contrôle général de la biosynthèse des acides aminés est activé. Plusieurs autres régulations qui ne sont pas impliquées dans le métabolisme azoté présentent un comportement différent en fonction de la source d'azote fournie. C'est le cas notamment des gènes dont l’expression est régulée selon l’apport en zinc et qui sont moins exprimés sur le milieu urée. De même, les gènes impliqués dans les résistances multiples aux drogues sont activés par le tryptophane.<p>En confrontant nos résultats à ceux obtenus dans le cadre de travaux indépendants, nous avons proposé plus d'une cinquantaine de nouveaux gènes cibles de la NCR. Beaucoup d'entre eux n'ont jamais été caractérisés expérimentalement. En utilisant des techniques avancées d'analyse de séquences primaires de protéines, nous avons pu proposer une fonction pour plusieurs de ces gènes. Ces analyses bioinformatiques et la réalisation d’expériences complémentaires à l’aide de biopuces à ADN nous ont permis de proposer que l'un d'entre eux code pour une protéine impliquée dans la déstabilisation d'ARN messagers lors de la carence azotée. Nous avons aussi identifié plusieurs nouveaux gènes appartenant à des régulons spécifiquement activés en réponse à un nombre restreint de sources d'azote. Il est probable que ces gènes soient impliqués dans le catabolisme des sources d'azote sur lesquelles ils sont activés. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished