Chez une multitude de métazoaires étudiés, une période de quiescence transcriptionnelle est observée chez le jeune embryon suite à la fécondation de l'ovocyte. La durée de cette période est spécifique à chaque espèce et chez le bovin, l'embryon n'active son propre génome qu'aux stades 8- à 16-cellules. Précédemment à cette activation de la transcription, l'embryon subsiste grâce à l'utilisation des ARNm et des protéines fournies par l'ovocyte. C'est également à partir de ces réserves que l'embryon doit puiser les différents facteurs impliqués dans l'activation de son génome au moment requis. Les expériences présentées dans cette thèse étaient destinées à améliorer nos connaissances de l'activation du génome embryonnaire chez le bovin. Dans un premier temps, la caractérisation de l'expression de plusieurs facteurs de transcription chez l'embryon a été effectuée et le rôle envisageable de ces facteurs dans l'activation du génome a aussi été démontré. Par la suite, nous avons établi une liste exhaustive de plus de 300 transcrits embryonnaires exprimés très tôt dès l'activation du génome. Cette étude du transcriptome a permis l'identification d'une multitude de gènes associés à la transcription et au maintient de la pluripotence que l'on retrouve chez les cellules embryonnaires. Afin de définir la fonction ou le rôle des différents joueurs identifiés lors de nos études, nous avons mis au point un procédé qui cible spécifiquement un transcrit donné et induit sa dégradation dans les ovocytes bovins sans toutefois induire des effets collatéraux dommageables sur la compétence au développement de ces ovocytes. Cette méthode utilise l'interférence ARN qui réduit à des niveaux très faibles la présence d'un transcrit ciblé, ce qui permet d'étudier les effets de sa perte de fonction. Cette méthode a permis d'établir le rôle crucial dans l'embryon d'un gène issu de nos premières études : MATRIN 3. La dégradation de l'ARN de MATRIN 3, une composante architecturale de la matrice nucléaire qui agit aussi au niveau de la transcription, s'est avérée avoir des effet néfastes sur la survie embryonnaire. Les informations fournies par la combinaison des études présentées dans cette thèse contribuent à dresser un portrait mieux défini de l'activation du génome chez le bovin.

Depuis plusieurs dizaines d’années, la population des anguilles européennes a souffert d’un dramatique déclin et est classée parmi les espèces hors de leurs limites biologiques depuis 1998. Différents phénomènes, tels que la pêche, les obstacles aux migrations, ou le réchauffement climatique, en sont à l’origine. Cependant, les perturbations environnementales, telles que les contaminations métalliques et organiques ou les épisodes d’hypoxie, participent probablement à la vulnérabilité de cette espèce. Or, l’estuaire de la Gironde est soumis à des contaminations poly-métalliques historiques, ainsi qu’à des contaminations organiques de différentes origines, et à des épisodes hypoxiques réguliers. Les travaux menés au cours de cette thèse, se sont donc composés d’études de terrain visant à identifier les contaminants majeurs chez les anguilles jaunes de l’estuaire de la Gironde, ainsi que leur voie de bio-accumulation et leurs impacts au niveau physiologique, biochimique et moléculaire. Ces études ont nécessité la mise en place d’expériences préliminaires ayant pour objectifs de vérifier les impacts de certaines procédures, telles que l’anesthésie et la mise en cage des anguilles jaunes. D’autre part, les impacts des deux principaux contaminants métalliques et organiques des anguilles européennes de l’estuaire de la Gironde, ont été testés, de façon individuelle et combinée, ainsi que ceux de l'hypoxie sur des anguilles pré-contaminées ou non, lors d’une étude expérimentale.Ainsi, ces travaux ont mis en évidence que les anguilles européennes installées dans la zone avale de l’estuaire, étaient susceptibles d’être soumises à des contaminations poly-métalliques plus importantes, essentiellement d’origine trophique, responsables d’une croissance pondérale moins élevée et de perturbations transcriptionnelles hépatiques et cérébrales. De plus, bien que les contaminations métalliques de ces anguilles ne mettent pas ne danger la santé humaine, les contaminations en PCB sont, en revanche, supérieures aux normes de consommation. D’autre part, ces travaux ont également mis en évidence des dérèglements mitochondriaux ainsi qu’un stress oxydant, au niveau branchial et cérébral chez des anguilles contaminées au Cd, et au niveau cérébral, branchial, hépatique et rénal chez les anguilles contaminées aux PCB. Enfin, la concomitance de ces deux contaminants et/ou d’un épisode d’hypoxie, réduit et/ou retarde les capacités de réponses transcriptionnelles de ces anguilles. Il semble donc que les différentes perturbations chimiques subies par les anguilles européennes au stade jaune au sein de l’estuaire de la Gironde participent de façon non négligeable à la vulnérabilité de cette espèce. / For several decades, the European eel has been suffering from a dramatic decline and has been classified among species beyond their biological limit since 1998. Different phenomena, as fishing, migration barriers, or global warming, are to blame. Environmental perturbations, as metallic and organic contaminations, or hypoxic episodes, probably take part to the vulnerability of this species. The Gironde estuary has been submitted to historic poly-metallic contaminations, to organic contaminations from different origins, and to regular hypoxic episodes. This thesis work is composed of field studies aimed to identify the main contaminants in yellow eel living in the Gironde estuary, their major bioaccumulation way and impacts on physiological, biochemical and molecular parameters. These studies needed preliminary experiments aimed to verify whether some field and handling procedures are consistent with ecotoxicological analyses. Moreover, impacts of the two main contaminants in European eels from the Gironde estuary have been assessed individually or combined, with those of hypoxia on pre-contaminated eels.Thus, these studies have demonstrated that European eels installed in the downstream area of the estuary, were likely to be subject to largest poly-metallic contaminations, mostly by food web, and responsible for a less weight gain and high liver and brain transcriptional disturbances. Furthermore, although the metal contamination of eels does not endanger human health, PCB contaminations are higher than consumption standards. On the other hand, these studies have also revealed oxidative stress and mitochondrial disorders in gills and brain of Cd-contaminated eels, and in brain, gills, liver and kidneys of PCB-contaminated eels. The combination of these two contaminants and/or an episode of hypoxia, reduces and/or delays the transcriptional responses ability of these eels. It seems that the different chemical disturbances, suffered by the yellow eels in the estuary of the Gironde, participate significantly to this species vulnerability.

Le virus de la leucémie bovine (BLV) est un rétrovirus complexe B-lymphotrope, identifié comme l'agent étiologique de la leucose bovine enzootique, une maladie lymphoproliférative qui affecte le bétail. L'infection par le BLV se caractérise par l'absence de virémie due à la latence du virus dans la majorité des cellules infectées. Cette latence résulte de la répression transcriptionnelle de l'expression virale in vivo et favorise très probablement le développement tumoral en permettant aux cellules infectées d'échapper à la réponse immunitaire développée par l'hôte infecté. Dès lors, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires régulant la latence du virus BLV ainsi que sa réactivation devrait permettre d'envisager de nouvelles stratégies afin de contrer le processus de transformation cellulaire développé par cet oncovirus.<p><p>Notre laboratoire a précédemment mis en évidence le rôle de l’acétylation des histones dans la régulation transcriptionnelle du BLV. Au cours de ce travail, nous avons poursuivi l’étude du contrôle épigénétique de l’expression génique du BLV en nous focalisant sur une autre modification épigénétique généralement associée à la répression des gènes :la méthylation de l’ADN. Nous avons montré une activation transcriptionnelle du promoteur BLV par différents inhibiteurs de la méthylation de l’ADN. Nous avons également mis en évidence, grâce à la technique du séquençage au bisulfite de sodium, que l’hyperméthylation des régions U3 et R du LTR5’ d’un provirus intégré est associée à un état de latence vraie dans une lignée cellulaire dérivée d’un lymphome (La lignée L267) mais pas à un état de latence dite défective (la lignée YR2). La surexpression des méthyltransférases de l’ADN (DNMTs) DNMT1 et 3A mais pas DNMT3B répriment l’activité du promoteur BLV. Plus encore, les inhibiteurs de DNMTs augmentent de manière synergique l’activation transcriptionnelle du promoteur BLV par la protéine transactivatrice TaxBLV, et ce, de manière dépendante des sites CRE. Au niveau mécanistique, la méthylation des dinucléotides CpG situés aux positions -154 et -129 (situés dans les sites CRE1 et CRE2, respectivement) par rapport au site d’initiation de la transcription (nucléotide +1) abolit in vitro la liaison des facteurs de transcription CREB/CREM/ATF aux sites de liaison CRE1 et CRE2. De manière intéressante, la méthylation spécifique du site CpG -129 est suffisante pour induire une forte répression de l’expression d’un gène rapporteur contrôlé par le promoteur BLV, ce qui suggère que la méthylation d’un site spécifique du promoteur BLV peut réprimer la transcription virale par inhibition directe de la liaison de facteurs de transcription à leur site de reconnaissance et, dès lors, que la méthylation de l’ADN contribue à la latence virale permettant au virus d’échapper au système immunitaire. <p><p>Notre laboratoire a précédemment déterminé la structure chromatinienne du promoteur du BLV et a mis en évidence la présence de deux sites hypersensibles au sein du LTR5’, inductibles par une combinaison de PMA+ionomycine. Au cours de la seconde partie de notre thèse, nous avons étudié la structure chromatinienne de la région située entre les deux LTRs au sein de provirus intégré dans différentes lignées cellulaires chroniquement infectées, grâce à la technique de l’indirect-end-labelling. Nous avons mis en évidence, dans le génome du provirus intégré dans la lignée cellulaire YR2, trois sites hypersensibles situés respectivement en aval du gène env (SH3) et en amont du LTR3’ (SH4 et SH5). La présence de ces sites est probablement due à l’altération locale de la structure nucléosomale dans ces régions. Nous avons observé qu’un remodelage de la structure chromatinienne de la région hypersensible SH3 dans la lignée YR2 se produit durant l’activation de l’expression génique par un inhibiteur d’histone-désacétylases, la TSA. Nous avons également étudié la structure de la région hypersensible SH3 d’un provirus intégré dans une lignée cellulaire productrice de virions, la lignée NBC-13. L’extension de la région SH3 est similaire à celle observée dans les cellules YR2 en conditions induites par la TSA. Ces résultats suggèrent une transition structurale de la chromatine associée à l’activation de l’expression des gènes viraux. Néanmoins, cette région possède les caractéristiques d’un silencer transcriptionnel lorsqu’il est cloné dans un vecteur rapporteur. <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La TriméthylGuanosine Synthase 1 de levure (Tgs1) à été identifiée à la suite d’un criblage double hybride en utilisant l’extrémité basique carboxy-terminale de la protéine SmB, cœur des snRNP, comme appât. Il a été également montré que Tgs1 interagit spécifiquement avec le domaine carboxyl-terminal basique KKD/E des protéines Nop58p et Cbf5p, deux composants protéiques du coeur des snoRNP. Le gène TGS1 n’est pas essentiel mais sa délétion confère un phénotype de cryo-sensibilité associé à un léger défaut d’épissage à basse température, associé à la rétention de U1 dans le nucléole. La recherche de substrats pour cette protéine a montré que Tgs1p est capable de méthyler la coiffe monométhylée des snARN et des snoARN transcrits par l’ARN polymérase II. La grande majorité des snoARN joue un rôle dans la sélection des sites de modifications de plusieurs classes d’ARN. Certains, par contre, sont impliqués dans la voie de synthèse des ribosomes, un processus comprenant de multiples étapes de clivages endo- et exoribonucléotidiques et ayant lieu dans le nucléole où les facteurs impliqués dans ces réactions se concentrent en plusieurs domaines distincts. Le point de départ de ce travail de thèse a été de tester un possible rôle de Tgs1p et/ou de la triméthylation dans la biosynthèse du ribosome.<p><p>Dans un premier temps, l’analyse du processing des ARN ribosomiques dans la souche délétée pour TGS1 nous a permis de mettre en évidence l’implication de Tgs1 dans la formation de l’ARNr de la petite sous-unité, l’ARNr 18S. Des mutants catalytiques de Tgs1, incapables de reconnaître et de modifier les coiffes m7G, ont été crées. L’analyse de la voie de biogenèse des ribosomes dans ces souches ne présente pas les défauts constatés dans la souche délétée, révélant que c’est la protéine et non sa fonction catalytique qui est requise. De plus, ces mutants sont autant défectueux dans l’épissage des ARN messagers, excluant toute implication du défaut d’épissage dans le ralentissement de la voie de biogenèse des ribosomes observé dans la souche délétée. L’ultrastructure des souches délétées pour TGS1 observée en microscopie électronique nous a permis de mettre en évidence un effet de l’absence de Tgs1 sur la morphologie nucléolaire. En effet, le nucléole dans ces souches ne présente plus de nucléole structuré, bi-compartimenté. Les analyses en microscopie à fluorescence ont confirmé la disparition de la ségrégation des deux compartiments nucléolaires, suggérant que le défaut dans la biogenèse des ribosomes puisse être une conséquence de la perte de cohérence du nucléole.<p>La caractérisation de l’environnement physique et fonctionnel de Tgs1 a été entreprise afin de mettre à jour des fonctions additionnelles de la protéine. Diverses approches ont été envisagées: la recherche de partenaires physiques par l’emploi d’un allèle de TGS1 étiquetté TAP permettant la purification puis l’analyse de partenaires physiques ainsi que la recherche de partenaires fonctionnels par la méthode du crible synthétique létal. La recherche de partenaires physiques a permis de révéler l’existence d’un grand nombre d’ARN non codants coprécipités avec Tgs1. Certains sont des substrats connus de la protéine mais un grand nombre d’ARN ne possédant pas de coiffes monométhylées. La recherche de partenaires fonctionnels a permis la découverte de candidats synthétiques létaux appartenant à deux groupes, un groupe lié à l’épissage des ARN messagers et un autre groupe constitué de membres du complexe SWR1, complexe impliqué dans la régulation transcriptionnelle par modification de la chromatine. Lors de ce crible de candidats synthétiques létaux, il est apparu que la délétion de TGS1 restaure partiellement le défaut de croissance à chaud induit par la délétion du gène RRP47, dont le produit est impliqué dans la maturation de l’extrémité 3’ de plusieurs types d’ARN non codants. Les travaux préliminaires effectués ne permettent pas encore d’expliquer un tel phénotype.<p><p>Au cours de ce travail de thèse, nous avons pu répondre à un certain nombre de questions sur la fonction et le rôle de Tgs1 dans la cellule. La fonction catalytique de Tgs1 dans la méthylation des coiffes m7G est clairement nécessaire à l’efficacité de l’épissage des ARN messagers mais le rôle de la triméthylation de la coiffe des snoARN n’est pas élucidé à ce jour. Le fait que la fonction catalytique de Tgs1 n’est pas impliquée dans le défaut dans la biogenèse des ribosomes et la découverte du rôle de la protéine dans la morphologie nucléolaire, laisse entrevoir l’existence de fonctions additionnelles de Tgs1 dans la cellule. La caractérisation de son environnement physique et fonctionnel abonde justement dans ce sens, mettant à jour plusieurs interactions probablement liées à sa fonction catalytique, notamment dans l’épissage des ARN messagers mais également un grand nombre d’interactions impliquant la participation de Tgs1 dans d’autres voies métaboliques. <p><p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Dans les cellules eucaryotes, l’expression d’un gène peut être régulée à de nombreux niveaux. Les études réalisées sur le contrôle de l’expression génique se sont généralement intéressées aux mécanismes de contrôle transcriptionnel. Cependant de nombreux exemples mettent de plus en plus en évidence l’importance des mécanismes post-transcriptionnels dans cette régulation. Les contrôles post-transcriptionnels de l’expression génique reposent essentiellement sur des interactions spécifiques entre les régions 5’ et 3’ non traduites de l’ARNm et des protéines agissant en trans qui contrôlent spécifiquement la maturation des ARNs messagers (ARNms), leur localisation cytoplasmique, leur stabilité et/ou leur traduction. Les éléments riches en adénine et en uridine (ARE), localisés dans la région 3’ non traduite de nombreux ARNms, font partie des séquences régulatrices les plus étudiées. Elles sont notamment présentes dans les ARNms codant pour des cytokines et des proto-oncogènes. Les protéines de liaison à l’ARN jouent donc un rôle central dans la régulation de l’expression des gènes. Les protéines TIA-1 et TIAR appartiennent à la famille des protéines qui fixent l’ARN et qui contiennent des domaines RRM (RNA Recognition Motif). Elles sont impliquées dans des mécanismes permettant la régulation de l’expression génique tels que l’épissage alternatif et la traduction. En particulier, elles participent à l’arrêt général de la traduction qui accompagne un stress environnemental en séquestrant les ARNms poly(A)+ non traduits dans des foci cytoplasmiques appelés granules de stress (SGs). Elles sont également impliquées dans la répression traductionnelle d’ARNms spécifiques en liant les ARE présents dans les extrémités 3’ non traduites de certains ARNms, et notamment des ARNs messagers codant pour le TNF-α et la cyclooxygénase-2 (Cox-2). L’invalidation des gènes tia-1 et tiar chez la souris conduit à une létalité embryonnaire élevée suggérant que ces protéines jouent également un rôle important au cours de l’embryogenèse. Afin de comprendre les mécanismes par lesquels les protéines TIA-1 et TIAR remplissent leurs différentes fonctions, nous avons réalisé un criblage par la technique du double hybride en levure afin d'identifier des partenaires d’interaction de ces deux protéines. Les protéines TIA-1 et TIAR interagissent avec les protéines FBPs (Fuse Binding Proteins). Celles-ci participent notamment à la maturation et à la dégradation des ARNs. Nous avons montré que les protéines FBPs co-localisent parfaitement avec TIA-1 dans le noyau et migrent dans les granules de stress en réponse à un stress oxydatif. De plus, des expériences de retard de migration sur gel réalisées à partir d’extrait cytosolique de macrophages ont montré que les protéines FBPs sont présentes dans le même complexe liant l’ARE du TNF-α que TIA-1. Enfin, la surexpression du domaine de liaison à l’ARN KH3 de FBP2 en fusion à l’EGFP induit la séquestration spécifique des protéines TIA-1 et TIAR dans des foci cytoplasmiques, empêchant ainsi leur accumulation nucléaire. Nos résultats indiquent que les protéines TIA-1/R et FBPs pourraient être fonctionnellement impliquées dans des étapes communes du métabolisme de l’ARN dans le noyau et/ou le cytoplasme. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La méthylation des cytosines de l’ADN est un niveau de contrôle essentiel de la transcription génique. Elle joue un rôle primordial dans plusieurs étapes du développement comme l’inactivation du chromosome X et l’empreinte génomique. De plus, il est de plus en plus évident que la méthylation de l’ADN participe à la cancérogenèse.<p><p>Actuellement, le monde de la méthylation de l’ADN n’en est encore qu’à l'aube de son histoire. En effet, les mécanismes moléculaires la gouvernant sont encore peu connus. La méthylation de l’ADN est caractérisée par deux concept clés :le verrouillage de la transcription des gènes et le ciblage en des régions spécifiques du génome. Au cours de notre travail de thèse de doctorat, nous avons poursuivi les avancées réalisées dans ces deux domaines.<p><p>Dans un premier temps, nous nous sommes attachés à l’étude de la répression transcriptionnelle entraînée par la méthylation de l’ADN. Grâce à plusieurs études récentes, il paraît de plus en plus clair que la méthylation agit de paire avec la structure de la chromatine. Nous avons donc concentré nos recherches sur l’interconnexion de celle-ci avec deux machineries impliquées dans la régulation de son degré de compaction :la désacétylation et la méthylation des histones. Par diverses expérimentations, nous avons démontré un lien étroit entre ces machineries répressives pour l’imposition d’un état silencieux de la transcription.<p><p>Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons dirigé notre attention sur le ciblage des Dnmt. Pour cela, nous avons mené deux stratégies de front. La première est une approche ciblée et consiste en l’étude de l’association des Dnmt avec l’oncoprotéine bien connue, Myc. La seconde approche est plus large. Grâce à l’utilisation de la technique du double hybride en levure, nous avons identifié de nouveaux partenaires des Dnmt, dont un qui pourrait s’avéré particulièrement intéressant :le protéine Cart1 (cartilage homeoproteine 1) impliquée dans le développement du système nerveux central.<p><p>En conclusion, notre travail de doctorat devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la méthylation de l’ADN ainsi que son implication dans les divers processus physiologiques mais aussi pathologiques auxquels elle participe.<p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’expression d’un gène donné est généralement le résultat de la dualité qui existe entre l’activation et la répression transcriptionnelle de ce gène. Au laboratoire, nous tentons de mieux comprendre la régulation de la transcription génique, et c’est dans ce cadre que nous étudions certaines protéines qui appartiennent à la famille de facteurs de transcription Ets.<p>Ces derniers sont caractérisés par un domaine de liaison à l’ADN hautement conservé, le domaine ETS, qui se lie sur les promoteurs de leurs gènes cibles au niveau de sites comportant le motif central 5’- GGAA/T -3’. <p>Certaines de ces protéines ont été montrées comme étant impliquées dans des processus du développement normal et cancéreux. <p><p>Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié le facteur transcriptionnel Fev dont l’expression est restreinte au noyau du raphé dans le cerveau, à la prostate et à l’intestin grêle. Nous avons participé à la caractérisation fonctionnelle de ce facteur permettant de le définir comme répresseur transcriptionnel. Plus particulièrement, nous avons identifié la partie carboxy-terminale riche en résidus alanine comme étant impliquée dans la répression. Afin de mieux comprendre le mécanisme moléculaire qui régit la répression induite par Fev, nous avons tenté d’identifier les partenaires protéiques impliqués dans ce processus transcriptionnel. Dans un premier temps, nous avons montré que Fev interagit physiquement avec les co-répresseurs transcriptionnels à activité histone désacétylase HDAC1 et HDAC3. Aussi, nous proposons de définir le rôle biologique de cette interaction. Par la suite, nous avons utilisé le système de criblage de banques par « double hybride en levures ». En utilisant comme appât soit Fev, soit sa partie carboxy-terminale, nous avons isolé plusieurs candidats interacteurs, dont la protéine DP103 qui est impliquée dans la régulation transcriptionnelle induite par d’autres facteurs de transcription de la famille Ets. Après avoir montré par co-immunoprécipitation que Fev interagit avec DP103, nous tentons de mettre en évidence la fonctionnalité de cette interaction. <p><p>Dans la seconde partie de ce travail, nous avons étudié Erm, un activateur transcriptionnel de la famille Ets, qui est exprimé dans certains types de tumeurs, telles que les cancers mammaires métastatiques, et qui y régule l’expression de métalloprotéases. Ce facteur joue aussi un rôle régulateur dans les lymphocytes CD4+ T helper de type 1 (Th1) via l’interleukine-12. Néanmoins, les cibles ainsi que le rôle de Erm ne sont pas encore clairement identifiés dans les lymphocytes. Dans cette partie du travail, nous avons initié une étude sur les voies de signalisation impliquées dans la régulation transcriptionnelle de Erm. Nous avons montré que dans la lignée cellulaire Molt4 d’origine lymphoblastique ce facteur de transcription est la cible de la cascade de signalisation impliquant la famille des protéines kinases C (PKC). Grâce à l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des différentes sous-familles des PKC, nous avons montré que la transcription de Erm est régulée par les PKC conventionnelles. Aussi, après avoir isolé un fragment de 0,5 Kpb du promoteur de Erm, en amont de l’exon 1a, nous avons identifié une région régulatrice qui est activée par la voie des PKC. <p><p>Ainsi, les approches que nous avons développées dans ce travail nous ont permis de progresser dans la caractérisation des facteurs de transcription Fev et Erm. / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La régulation transcriptionnelle des gènes constitue une étape clef de la biologie cellulaire. Parmi les mécanismes impliqués dans la répression génique, les modifications épigénétiques jouent un rôle fondamental. Deux machineries épigénétiques, la méthylation de l’ADN et les protéines du groupe Polycomb, établissent des profils moléculaires qui permettent de distinguer les formes active et inactive de la chromatine. L’établissement et la maintenance de la répression épigénétique des gènes interviennent dans de nombreux processus liés au développement tant biologiques (inactivation du chromosome X chez les mammifères femelles, empreinte génomique ou encore l’expression de gènes tissus-spécifiques) que pathologiques (cancers). <p><p>Au cours de notre thèse de doctorat, nous nous sommes attachés à l’étude des mécanismes par lesquels la méthylation de l’ADN est ciblée en des régions génomiques précises et participe à la répression de l’expression des gènes. La méthylation de l’ADN est catalysée par des enzymes, appelées méthyltransférases de l’ADN (DNMTs), qui transfèrent des résidus méthyls sur les cytosines. Cette modification chimique covalente constitue un niveau de contrôle transcriptionnel important :il existe une corrélation entre méthylation de l’ADN et répression de l’expression génique au niveau de sites génomiques spécifiques. En outre, il semble de plus en plus clair qu’une méthylation aberrante de l’ADN participe au processus de cancérogenèse. A l’heure actuelle, les mécanismes moléculaires par lesquels la méthylation contribue au développement, à la différenciation et à la répression génique restent peu connus. Les données de la littérature suggèrent l’existence d’un lien étroit entre la méthylation de l’ADN et la structure de la chromatine. Celle-ci est notamment régulée par des modifications post-traductionnelles des histones. Il apparaît de plus en plus évident que la méthylation de l’ADN et les modifications des histones prennent part à une «boucle de répression» assurant le maintien et la propagation d’états épigénétiques répressifs. L’étude des mécanismes de la répression médiée par les DNMTs s’avère donc étroitement liée à celle de la structure de la chromatine.<p><p>Dans ce contexte, notre travail de thèse est basé sur l’hypothèse selon laquelle les deux principaux systèmes épigénétiques, la méthylation de l’ADN et les protéines Polycomb, agiraient de concert. Les protéines Polycomb participent au système de mémoire cellulaire, régulent l’expression et la différenciation, agissent sous forme de complexes multimériques associés à la chromatine et interviennent dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Au cours de notre travail, nous nous sommes particulièrement intéressé à la protéine Polycomb EZH2 (Enhancer of Zeste) parce qu’elle possède une activité méthyltransférase d’histone sur les 27 de l’histone H3, impliquée dans la répression transcriptionnelle. <p><p>Dans un premier temps, nous avons mis en évidence un lien mécanistique entre les deux machineries épigénétiques principales, méthylation de l’ADN et protéines du groupe Polycomb. Nous avons montré qu’EZH2 interagit in vivo avec les DNMTs et purifie une activité méthyltransférase de l’ADN in vitro. Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine indiquent que les DNMTs fixent les régions promotrices de gènes cibles de EZH2 et que cette liaison est dépendante de la présence d’EZH2. Par ailleurs, l’analyse des promoteurs cibles d’EZH2 par séquençage au bisulfite suggère qu’EZH2 semble également requise pour la méthylation de l’ADN de ces séquences. Nos résultats permettent l’ébauche d’un modèle où EZH2 agit comme une plateforme de recrutement pour les DNMTs (Viré et al. Nature 2006).<p><p>Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons investigué le rôle de MeCP2 dans ce modèle. MeCP2 est une protéine à domaine MBD (methyl-binding domain) qui se fixe sélectivement aux cytosines méthylées. Le recrutement de MeCP2 représente un mécanisme majeur par lequel la méthylation de l’ADN réprime la transcription. Nos données montrent que MeCP2 interagit avec EZH2 in vitro et in vivo et que ces protéines fixent des régions promotrices communes. De plus, le niveau de méthylation des cytosines semble prérequis à la présence d’EZH2. Ce travail suggère que MeCP2 puisse recruter EZH2 à la chromatine et renforcer un état réprimé de la chromatine en agissant comme un pont entre deux modifications épigénétiques essentielles, la méthylation de l’ADN et les proteins Polycomb (Viré et al. soumis). <p>En conclusion, notre travail de doctorat devrait permettre un meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de l’épigénétique et plus particulièrement de cerner comment la méthylation de l’ADN est intimement connectée au remodelage de la chromatine, participe à la répression transcriptionnelle, est spécifiquement ciblée au sein du génome et contribue au développement et à la cancérogenèse.<p><p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ribosomal transcription produces RNAs essential for the structure and function of the ribosomes. The up-regulation of this transcription during growth is known to address the increased needs of the cell for proteins and thus for ribosomes. However, the mechanisms involved in this regulation are not well characterized. Our laboratory was the first to demonstrate a direct link between growth and ribosomal transcription. Stimulation of mammalian cells with serum or EGF causes an immediate increase in ribosomal RNA synthesis. This activation is dependant on the ERK pathway and on the phosphorylation of the architectural factor UBF by ERK. However, the increase of transcription resulting from this stimulation is not correlated with an increase in RNA polymerase I loading on the ribosomal genes but is rather explained by a higher elongation rate of the polymerase. We also showed that UBF blocks elongation when it is not phosphorylated and is permissive to it when it is phosphorylated by ERK. These results argue against the actual model suggesting that regulation occurs only at initiation level and demonstrate for the first time the existence of a regulation at the elongation level. Theoretically, ribosomal transcription could also be regulated at the level of gene activation since more than half of the ribosomal genes are silenced at ail times. According to the current view, DNA methylation is involved in the silencing process, but we have found that, at least in human cells, it is only important to silence a certain portion of the ribosomal genes. Loss of methylation following genetic inactivation of both DNA methyltransferase 1 and 3b in human colorectal carcinoma cell line results in a decrease in both ribosomal transcription and proliferation rates and in defects in ribosomal RNA processing and nucleolar structure. Moreover, loss of DNA methylation leads to an ingression of RNA polymerase II in the ribosomal locus thus probably causing the problems observed in these cells. We suggest that both DNA methylation and regulation of the elongation rates are essential mechanisms to maintain a high density of RNA polymerase I elongating complexes on the ribosomal genes in order to exclude RNA polymerase II and ensure an efficient ribosome biogenesis. / La transcription ribosomale synthétise les ARN qui sont au coeur de la fonction et de la structure des ribosomes. L'augmentation de cette transcription en condition de croissance est connue et répond aux besoins accrus de la cellule en protéines et donc en ribosomes. Toutefois, les mécanismes impliqués dans cette régulation étaient inconnus. Notre laboratoire a montré l'existence d'un lien direct entre la croissance et la transcription ribosomale. Nous avons montré que la stimulation de cellules de mammifères par le facteur EGF ou l'ajout de sérum cause une augmentation rapide de la transcription ribosomale. Cette activation est dépendante de la voie ERK qui cible le facteur architectural UBF. Nous avons aussi montré que cette stimulation n'entraîne pas de recrutement massif d'ARN polymérases 1 aux gènes ribosomaux, et ce malgré l'augmentation de la synthèse d'ARN ribosomaux. Par contre, la vitesse d'élongation de la polymérase explique quantitativement cette augmentation et celle-ci est régulée par l'état de phosphorylation d'UBF par ERK. Ces résultats remettent en question le modèle actuel de régulation unique au niveau de l'initiation des transcrits et démontrent pour la première fois l'existence d'une régulation au niveau de l'élongation. La proportion élevée de gènes ribosomaux silencieux suggère que ceux-ci puissent être activés et constituer un troisième niveau de régulation de la transcription ribosomale. La méthylation de l'ADN est suggérée comme étant importante pour l'établissement et le maintien de ces gènes dans un état silencieux. Or, nous avons montré que la méthylation de l'ADN explique l'état silencieux d'une partie et non de la totalité de ces gènes dans des cellules humaines en culture. De plus, nous avons montré que la perte de méthylation, suite à l'inactivation génique de DNMTl et 3b, entraîne une diminution de la transcription ribosomale et de la vitesse de prolifération ainsi que des défauts dans la transformation de TARN précurseur et dans la structure nucléolaire. De plus, la perte de méthylation entraîne une incursion de TARN polymérase II dans le locus ribosomal ce qui cause vraisemblablement les problèmes observés. Nous suggérons que la méthylation de l'ADN et la régulation de l'élongation des transcrits sont des mécanismes essentiels pour le maintien d'une forte densité de complexes en élongation sur les gènes ribosomaux de façon à exclure TARN polymérase II pour ainsi assurer une biogenèse efficace des ribosomes.

Plus de 20 million de personnes à travers le monde sont infectées par le virus T-lymphotrope humain de type 1 (HTLV-1), causant des leucémies à cellules T dans ~5 % des individus infectés. Le virus de la leucémie bovine (BLV), structurellement et fonctionnellement proche de HTLV-1, induit des leucémies à cellules B dans des modèles animaux suite à une infection naturelle (bovin) ou expérimentale (mouton). Les mécanismes moléculaires responsables du potentiel oncogène de ces deux virus restent largement incompris. Dans les deux maladies, leucémies T chez l’homme, leucémies B chez l’animal, le site intégration du virus dans les cellules leucémiques est très variable. Il est donc généralement admis que le potentiel oncogène du provirus est principalement lié à l’activité de l’oncoprotéine virale Tax. De manière paradoxale cependant, ni HTLV-1 ni BLV n’expriment de protéines virales au stade tumoral. Dans ce travail, nous avons étudié le transcriptome non codant des leucémies induites par BLV et HTLV-1 par séquençage à haut débit. Dans la première partie, nous démontrons que le provirus BLV n’est en fait pas silencieux dans les cellules tumorales. BLV produit un ensemble de dix microARNs (miRNAs) très abondants et extrêmement conservés dans toutes les tumeurs. Cette observation constitue la première description de miRNAs encodés par un rétrovirus. Les microARNs encodés par BLV sont transcrits par la RNA Polymérase III, stratégie qui permet leur production de façon indépendante de celle des messagers viraux ainsi que leur expression abondante dans le contexte tumoral caractérisé par l’absence d’activité RNA Polymérase II. Nous avons ensuite montré que, comme HTLV-1, BLV produit des transcrits encodés par le brin négatif du provirus. L’analyse par séquençage ARN à haut débit (RNA-Seq) de tumeurs induites par BLV montre l’absence d’expression virale à partir du promoteur viral situé dans le LTR 5’. Cependant, elle révèle la présence de deux transcrits viraux anti-sens non codants (AS1 et AS2) produits par le LTR 3’. Nous avons identifié ces transcrits dans toutes les tumeurs BLV analysées. Enfin, l’analyse RNA-Seq de tumeurs induites par HTLV-1 et BLV a révélé la présence d’interactions transcriptionnelles virus-hôte. Les gènes hôtes affectés sont significativement enrichis en gènes liés au cancer. Ces résultats suggèrent que les transcrits HTLV hbz et BLV AS1 jouent un rôle essentiel dans la tumorigenèse en interagissant avec le génome de l’hôte. Nous avons également détecté ce type de perturbation à des temps précoces dans le modèle expérimental BLV chez le mouton. Ces observations suggèrent que ces interactions virus-hôte constituent des événements précoces qui procurent un avantage sélectif aux clones associés, mais que d’autres altérations -génétiques et/ou épigenetiques- sont nécessaires à l’établissement de la tumeur. En conclusion, nos travaux vont permettre de mieux comprendre le rôle des interactions virus-génome hôte dans l’oncogenèse ainsi que la fonction de transcrits non codants dans le développement des cancers qu’ils soient ou non d’étiologie virale.<p><p>More than 20 million people are infected by Human T-cell Lymphotropic Virus type 1 (HTLV-1) worldwide and this will cause T-cell leukemia in 5% of them. Yet the molecular mechanisms that underlie the oncogenic potential of this virus remain largely unknown. Bovine Leukemia Virus (BLV) is closely related to HTLV1 and causes a very similar B-cell leukemia in cattle and sheep. As for HTLV1, the oncogenic mechanisms underlying BLV-induced leukemia remain poorly understood. In both diseases, leukemic cells harbor mainly one integrated provirus, yet the integration sites are very variable. As a consequence, it is generally assumed that the oncogenic effect of the provirus is largely mediated by the virally encoded Tax protein. Paradoxically, however, both HTLV1 and BLV proviruses are found to be epigenetically silenced in tumor cells. Thus Tax, as any other virally encoded protein, is not expressed in leukemic cells suggesting that other factors are involved in tumorigenesis. In this study we made three observations that might dramatically change the prevalent dogma of HTLV1 and BLV-induced leukemia. First, we demonstrated that the BLV provirus is not silent at all in tumor cells. A cluster of BLV-encoded microRNAs (miRNAs) is highly expressed, accounting for 40% of the miRNAs present in leukemic cells. This finding is the first description of retroviral-encoded miRNAs. BLV miRNAs are transcribed from five independent RNA Pol III units and are exceedingly conserved across BLV isolates (more than the protein coding genes), strongly supporting an essential yet still unknown function. Next we showed that – as HTLV1 – BLV strongly expresses antisense RNAs. High-throughput sequencing of RNA libraries (RNA-seq) from BLV associated tumors, as expected, showed no expression of viral mRNA from the 5’ LTR. However, it did reveal the presence of two novel non-coding antisense transcripts originating in the 3’ LTR of BLV. Finally, RNA-Seq analysis of HTLV-1 and BLV-induced tumors revealed that the viral 3’ LTR-driven antisense RNAs produced by both viruses interact with host genes localized in the vicinity of proviral integration. Enrichment analysis of affected host genes suggests a significant bias towards cancer-related genes. Host gene perturbations were also found at early stages post-infection in the BLV experimental model in sheep, suggesting that provirus-dependent cancer driver gene perturbations trigger initial amplification of the corresponding clones, requiring additional genetic and/or epigenetic changes to develop full blown leukemia. Overall, our findings reveal an unexpected role for BLV and HTLV antisense transcripts and contribute to the understanding of non-coding RNA-mediated mechanisms in leukemogenesis. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished