Introdução: A podocitopenia e a podocitúria são marcadores de injúria glomerular em podocitopatias (POD) e glomerulonefrites proliferativas (GNsP), e mesmo em fases iniciais destas doenças mecanismos pró-fibróticos indutores de glomeruloesclerose e fibrose renal progressiva estão ativados. Objetivo: Avaliar pacientes portadores de glomerulopatias biopsiados em diferentes tempos de evolução clínica, correlacionando lesões morfológicas dos compartimentos glomerular e túbulo-intersticial com a expressão dos RNAm de proteínas associadas ao podócito e de fatores pró-fibróticos no tecido renal. Materiais e Métodos: Foram incluídos no estudo oitenta e quatro pacientes adultos portadores de glomerulopatias de diferentes etiologias submetidos à biópsia renal por indicação clínica. As lesões histológicas foram individualizadas e a porcentagem de fibrose intersticial e atrofia tubular foi quantificada na coloração de Tricrômio de Masson. Foram mensurados no tecido renal o log 10 do RNAm pela reação em cadeia da polimerase em tempo real das proteínas associadas ao podócito alfa actinina-4, podocina e podocalixina e dos fatores pró-fibróticos fator de crescimento transformador ₁ (TGF₁), fator de crescimento do tecido conectivo (CTGF) e fator de crescimento derivado do endotélio A (VEGF-A). A secção livre de neoplasia de rins removidos por câncer renal foram usados como controles da expressão dos RNAm. Resultados: No grupo POD, os diagnósticos histopatológicos foram: Glomeruloesclerose segmentar e focal (n=20), GN membranosa (n=12), Nefropatia diabética (n=9) e Lesões mínimas (n=7); no grupo GNsP foram Nefropatia por IgA (n=15), GN membranoproliferativa (n=5), Nefrite lúpica (n=5) e GN proliferativa mesangial (n=4), e outros diagnósticos (n=7). O RNAm do tecido renal nos pacientes com POD e GNsP foi significativamente menor comparado ao dos controles para todos os genes estudados. A presença de crescentes, independente do estágio evolutivo, foi associada à maior expressão do RNAm de alfa actinina-4 (p=0,04), podocina (p=0,01) e podocalixina (p=0,038). O RNAm dos genes pró-fibróticos também estava inibido comparado a sua expressão no rim normal. Nas GNsP, o VEGF-A (p<0,001) e o CTGF (p<0,001) foram os genes com menor nível de expressão comparado aos controles. Em relação às biópsias com lesões crescênticas, tanto o RNAm do TGFβ1 (p=0,001) como do CTGF (p=0,041) tiveram maior expressão comparado ao RNAm das biópsias sem crescentes. Nas biópsias com fibrose intersticial superior a 30%, a expressão do RNAm de TGFβ1, (p=0,038) e do VEGF-A (p=0,040) foi maior do que nas biópsias com fibrose leve. O maior tempo entre o início da doença clínica e a realização da biópsia renal não teve influência detectável na expressão tecidual do RNAm dos biomarcadores estudados. Conclusões: Pacientes com podocitopatias ou glomerulonefrites proliferativas apresentaram inibição da expressão do RNAm de proteínas associadas ao podócito e de fatores indutores de fibrose renal, achados compatíveis com injúria podocitária e podocitopenia. Nas biópsias renais com maior grau de fibrose intersticial e atrofia tubular, assim também como naquelas com lesões crescênticas, a expressão do RNAm de fatores fibrogênicos como TGF-β1 e CTGF foi significativamente aumentada, o que pode sugerir supra-regulação de moléculas associadas a mecanismos de fibrose renal e patologia glomerular. / Introduction: Both podocitopenia and podocyturia are markers of glomerular injury in podocytopathies (POD) and proliferative glomerulonephritis (PGNs), and even in the early stages of these diseases pro-fibrotic mechanisms leading to glomerulosclerosis and progressive renal fibrosis are running. Objective: This study evaluated patients with glomerulopathies who were biopsied at different times of clinical evolution, correlating morphological lesions of the glomerular and tubulointerstitial compartments with renal messenger RNA (mRNA) expression of podocyteassociated proteins and pro-fibrotic factors. Materials and Methods: The study included eighty-four adult patients with glomerulopathies of different etiologies undergoing kidney biopsy as clinically indicated. The histological lesions were individualized and the percentage of interstitial fibrosis and tubular atrophy was quantified on Trichrome Masson staining. Tissue log 10 mRNA of the podocyte proteins alpha-actinin-4, podocin and podocalyxin and of the pro-fibrotic factors transforming growth factor β₁ (TGFβ₁), connective tissue growth factor (CTGF) and vascular endothelium growth factor A (VEGF-A) was measured by real time polymerase chain reaction. The sections free of neoplasia of kidneys removed for renal cancer were used as controls for the mRNA tissue expression. Results: Results: In the POD group, the histopathological diagnoses were: focal segmental glomerulosclerosis (n=20), membranous (n=12), diabetic nephropathy (n=9) and minimal changes (n=7); in PGNs group were IgA nephropathy (n=15), membranoproliferative (n=5), lupus nephritis (n=5) and mesangial proliferative (n=4), and other diagnoses (n=7). Messenger RNA expression of POD and PGNs groups was significantly lower compared to controls for all the studied genes. The presence of crescents, regardless of their evolutive stage, was associated with higher mRNA expression of alpha-actinin-4 (p=0.04), podocin (p=0.01) and podocalyxin (p=0.038). The mRNA of pro-fibrotic genes was also inhibited compared to their expression in normal kidneys. In PGNs, VEGF-A (p<0.001) and CTGF (p<0.001) were the genes with lowest mRNA levels compared to controls. Regarding the biopsies with crescentic lesions, both the mRNA of TGFβ1 (p=0.001) and CTGF (p=0.041) were highly expressed as compared to those of biopsies without crescents. In biopsies with moderate to severe interstitial fibrosis (more than 30%), the mRNA expression of TGFβ1 (p=0.038) and VEGF-A (p=0.040) was highly expressed compared to biopsies with mild fibrosis. A longer interval between the clinical disease and the performance of kidney biopsy did not have a detectable influence on tissue mRNA expression of the studied biomarkers. Conclusions: Patients with POD or PGNs presented inhibition of the mRNA expression of podocyte-associated proteins and pro-fibrotic factors, findings that are consistent with podocyte injury and podocitopenia. In renal biopsies with a higher degree of interstitial fibrosis and tubular atrophy, as well as those with crescentic lesions, the mRNA expression of fibrogenic factors such as TGF-β1 and CTGF was significantly increased, which may suggest upregulation of molecules associated with mechanisms of renal fibrosis and glomerular pathology.

Orientador: Claudio Chrysostomo Werneck / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T00:56:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vassequi-Silva_Tallita_M.pdf: 17060353 bytes, checksum: 04c3d8b469909adce6cf7a0f8977283d (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: As fibras elásticas são responsáveis por darem sustentação a tecidos, como artéria aorta, pele, pulmão. São compostas por dois componentes distintos, elastina e microfibrila, quando analisadas por microscopia eletrônica. Anteriormente, os pesquisadores acreditavam que a principal função da rede de microfibrila, composta principalmente de fibrilinas e MAGPs, era na formação das fibras elásticas. Mas, sabe-se hoje, que a rede de microfibrila também é essencial na sinalização molecular. As MAGPs são proteínas aparentemente importantes para a função estrutural das microfibrilas e seu desenvolvimento. Embora sua função biológica ainda não seja conhecida, muitos estudos têm demonstrado sua interação com várias moléculas in vitro, como as fibrilinas 1 e 2, tropoelastina, biglican, decorina e colágeno VI. Até o momento nenhuma patologia foi relacionada à deficiência ou mutações no gene da MAGP1. Entretanto, dados preliminares demonstram que camundongos deficientes em MAGP1, quando submetidos à angioplastia, desenvolvem mais neoíntima quando comparados com animais selvagens. O procedimento de angioplastia resulta muitas vezes no remodelamento vascular, levando a reestenose ou formação de neoíntima. Muitos estudos têm relacionado o TGF-ß com o processo de reestenose após angioplastia, justamente pelo fato desse fator de crescimento ser capaz de modular o desenvolvimento e remodelamento vascular. Levando em consideração dados recentes que demonstram que a MAGP1 tem a capacidade de interagir com o TGF-ß ativo, foi de nosso interesse tratar os camundongos deficientes em MAGP1 e selvagens com losartan (antagonista de TGF-ß) para verificar a função da MAGP1 e a possível participação de TGF-na formação de neoíntima. Os animais foram tratados com losartan ou placebo por 4 semanas e então submetidos ao ensaio de angioplastia, aferição da pressão sanguínea e dosagem de TGF-ß plasmático. Observou-se que todos os animais são normotensos e, que o tratamento com losartan resultou em uma redução na formação de neoíntima em comparação com os animais não tratados e que não houve diferença na formação de neoíntima entre os animais deficientes em MAGP1 comparados com selvagens. Não houve alteração dos níveis de TGF-ß total. Os dados sugerem que a MAGP1 parece não ser importante no processo de formação de neoíntima e que o tratamento com losartan é eficaz na redução da formação da neoíntima, sem alterar a pressão sanguínea e os níveis de TGF-ß / Abstract: Elastic fibers are responsible for providing support to tissues such as aorta, skin and lung. They are composed of two distinct components, elastin and microfibrils, when analyzed by electron microscopy. Previously, researchers believed that the main function of the microfibrils network, mainly composed of fibrilin and MAGPs, was the formation of the elastic fiber. But, today, we know that the microfibril network is essential for molecular signaling also. The MAGPs are proteins apparently important for the structural functions of the microfibrils and development. Although its biological function is not known yet, many studies have demonstrated its interaction with various molecules in vitro, such as fibrilin 1 and 2, tropoelastin, biglycan, decorin and type VI collagen. So far no pathology was related to MAGP1 deficiency or mutations. However, preliminary data show that MAGP1 deficient mice when assayed using angioplasty model they developed more neointima than wild-type animals. The angioplasty procedure often results in vascular remodeling, leading to restenosis. Many studies have shown that TGF-ß is related to this process mainly because this growth factor is able to modulate the development and vascular remodeling. Take into account recent data showing that MAGP1 has the ability to interact with active TGF-ß, it was our interest to treat the MAGP1 deficient and wild-type mice with losartan (antagonist of TGF-ß) to verify the MAGP1 function and possible involvement of TGF-? in the neointima formation. Mice were treated with losartan or placebo for 4 weeks and then tested on angioplasty, blood pressure measurement and serum TGF-ß. It was observed that all animals are normotensive, and that losartan treatment resulted in a neointima reduction compared with untreated animals. No difference in neointima formation was observed between the MAGP1 deficient and wild-type mice. There was no change in total serum TGF-ß levels. Data suggest that MAGP1, apparently is not important in neointima formation and the losartan treatment is effective in reducing neointima formation without affecting blood pressure and levels of TGF-ß / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Ricardo Della Coletta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-09T19:23:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sobral_LaysMartin_M.pdf: 14271407 bytes, checksum: 448e55c30e66d3c36643955fe6ab0225 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Miofibroblastos são células especializadas que exercem funções importantes em processos fibróticos através da síntese elevada de macromoléculas da matriz extracelular, proteases e citocinas. O exato mecanismo do surgimento (transdiferenciação) dos miofibroblastos permanece desconhecido, porém inúmeros estudos sugerem que o fator de crescimento transformante-'beta'1 (TGF-'beta'1) exerça um papel importante neste processo via ativação do fator de crescimento de tecido conjuntivo (CTGF). Em oposição aos efeitos de TGF-'beta'1, algumas citocinas inflamatórias, incluindo interferon 'gama' (IFN'gama'), parecem inibir a transdiferenciação dos miofibroblastos. O uso da droga imunossupressora ciclosporina A (CsA) é freqüentemente associada a inúmeros efeitos colaterais, sendo o aumento gengival fibrótico o de maior interesse para a área odontológica. Linhagens celulares de fibroblastos de gengiva normal tratadas com CsA expressam níveis elevados de TGF-'gama'1 e colágeno, que são intrínsecos do fenótipo miofibroblástico. Os objetivos deste estudo foram compreender a participação de TGF-'beta'1 e IFN'gama' na transdiferenciação dos fibroblastos gengivais em miofibroblastos e entender os mecanismos de ação destes fatores neste processo. Adicionalmente, nós verificamos a presença de miofibroblastos em aumentos gengivais induzidos por CsA. Nossos resultados demonstraram, através de 4 diferentes ensaios: transcriptase reversa-reação em cadeia da polimerase (RTPCR), western blot, imunofluorescência e citometria de fluxo, que TGF-'beta'1 induz e FNg bloqueia a transdiferenciação dos fibroblastos gengivais em miofibroblastos metabolicamente ativos em uma maneira dependente da dose e tempo. Nas células onde a expressão de CTGF foi significantemente reduzida por seqüências específicas de RNA de interferência, TGF-'beta'1 não foi capaz de promover a transdiferenciação dos miofibroblastos, revelando que TGF-'beta'1 é dependente da ativação de CTGF para induzir a transdiferenciação dos fibroblastos gengivais em miofibroblastos. IFN'gama' bloqueou a transdiferenciação dos miofibroblastos por estimular a expressão de Smad 7, uma proteína que regula negativamente a atividade de TGF-'beta'1. Interessantemente, miofibroblastos não foram associados aos aumentos gengivais induzidos por CsA, como revelado pelos modelos in vivo de injeções diárias de CsA em ratos Wistar e in vitro de tratamento de fibroblastos gengivais com CsA. Embora CsA tenha induzido a expressão de TGF-'beta'1, não demonstrou nenhum efeito na modulação dos níveis de CTGF. Nossos resultados demonstram que a indução da transdiferenciação dos miofibroblastos por TGF-'beta'1 é dependente da estimulação de CTGF. Adicionalmente, este estudo sugere que IFN'gama' pode ser clinicamente efetivo no tratamento de alterações fibróticas associadas à presença de miofibroblastos, pois atenua a excessiva produção de colágeno tipo I por estas células / Abstract: Myofibroblasts are the main cellular type involved in extracellular matrix deposition in fibrotic diseases. Relatively little is known about the underlying mechanisms that regulate myofibroblast emergence (transdifferentiation), however the regulatory cytokine transforming growth factor-beta 1 (TGF-'beta'1) has been traditionally considered an inducer of the myofibroblastic phenotype via activation of connective tissue growth factor (CTGF)-dependent pathway. Some inflammatory cytokines, particularly interferon g (IFN'gama'), show opposite effects to TGF-'beta'1, inhibiting myofibroblast transdifferentiation. Cyclosporin A (CsA) is a widely used immunosuppressant drug that causes significant side effects such as gingival overgrowth. Normal gingival fibroblast cell lines treated with CsA express high levels of TGF-'beta'1 and collagen, which are intrinsic of myofibroblasts. In the present study we examined whether TGF-'beta'1 and IFN'gama' can modulate transdifferentiation of gingival fibroblasts into myofibroblasts, and the biologic mechanisms behind those factors in this process. Additionally, we have analyzed the presence of myofibroblasts in CsA-induced gingival overgrowth. Our results demonstrated throughout a modality of experiments that included reverse trancriptasepolymerase chain reaction (RT-PCR), western blot, immunofluorescence and flow citometry analysis, that TGF-'beta'1 induces and IFN'gama' blocks fibroblast-myofibroblast transdifferentiation in a dose- and time-dependent manner. In fibroblasts with CTGF levels know-down by specific small interference RNA, TGF-'beta'1 effect on transdifferentiation was significantly reduced, revealing that CTGF plays a crucial role in mediating TGF-'beta'1 myofibroblast transdifferentiation. IFN'gama' blocked myofibroblast transdifferentiation by stimulating Smad 7 levels, a protein that negatively regulates TGF-'beta'1 signaling. Interestingly, myofibroblasts were not found in CsA-induced gingival overgrowth, as revealed by the in vivo model of daily injections of CsA in Wistar rats and by the in vitro model of gingival fibroblast cultures treated with CsA. Although CsA treatment stimulated TGF-'beta'1 expression by NG fibroblasts, it lacked to induce CTGF levels. Our results demonstrate that TGF-'beta'1 induction of transdifferentiation of gingival fibroblasts to myofibroblasts occurs via a CTGF dependent pathway. Additionally, this study suggests that IFN'gama' may be clinically effective in the treatment of fibrotic diseases associate with myofibroblast / Mestrado / Patologia / Mestre em Estomatopatologia

Orientadores: Lúcia Elvira Alvares, José Xavier Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T10:52:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sobreira_DeboraRodrigues_D.pdf: 9430834 bytes, checksum: 1c730ee238256c4ea0f303311fa3283b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os genes da família Dapper (Dpr) codificam proteínas adaptadoras capazes de ligar-se fisicamente a diferentes moléculas e modular as vias de sinalização Wnt e TGF-?. Diferentes análises funcionais revelaram que os Dpr atuam na especificação do eixo corporal e do tecido neural, nos movimentos morfogenéticos, no desenvolvimento do olho, na indução da cardiogênese, adipogênse e cicatrização. Diversos estudos foram realizados a fim de compreender o papel desempenhado pelos Dpr durante a embriogenêse dos vertebrados e na homeostase de tecidos adultos. Contudo, muitas questões ainda necessitam ser elucidadas. Este projeto de Doutorado teve como objetivo (1) descrever os sítios de expressão da família gênica Dpr durante a ontogênese dos membros de galinha, associando-a as vias de sinalização Wnt e TGF-? e (2) investigar a origem e a evolução desses genes durante a filogenia dos metazoários. Nossos resultados confirmaram que os genes Dpr são dinamicamente expressos durante o desenvolvimento dos membros de galinha, provavelmente, modulando os sinais Wnt e TGF-?. Os genes Dpr são encontrados no mesênquima indiferenciado dos membros em formação e em células progenitoras de condrócitos, pericôndrio e tendões. Esses resultados sugerem as moléculas Dpr como um novo grupo de marcadores do desenvolvimento dos membros em galinha. Já nossas análises filogenéticas revelaram que os Dprs surgiram durante a evolução dos organismos deuterostômios e um novo ortólogo dessa família de proteínas, denominado Dpr4, foi descrito. Acreditamos que o nosso trabalho irá fornecer bases para estudos moleculares com o intuito de estabelecer a função individual de cada membro da família Dpr, bem como auxiliar no entendimento sobre como estas proteínas podem interagir e cooperar entre si para modular diferentes vias de sinalização molecular em diferentes contextos celulares / Abstract: The Dapper (Dpr) genes form a small gene family of adaptor proteins important to several processes of vertebrates development, such as the specification of the body axis and neural tissue, morphogenetic movements, eye development, induction of cardiogenesis, adipogenesis and wound healing, by modulating the Wnt and TGF-? signaling pathways using specific conserved domains/motifs. Three Dpr genes have been identified in human and mouse, two in chicken, one in frog and two in zebrafish genome. Since the discovery of Dpr proteins, several assays have been performed in order to understand the role of this family during embryogenesis, although many questions still need to be elucidated. Thus, this PhD project aimed to (1) describe the possible role of Dpr genes during ontogeny of chicken regarding the regulation of Wnt and TGF-? signaling pathways and (2) investigate the origin and evolution of Dpr family over the course of metazoan evolution. Our results demonstrated that Dpr genes are involved in chicken limb development, probably, by modulating Wnt and TGF-? signals. Dpr genes were found in the undifferentiated limb mesenchyme, progenitor of chondrocytes, perichondrium and tendons. These results suggest that Dpr genes are good candidates to a new set of markers in chicken limb development. Furthermore, our phylogenetic analysis revealed that the Dprs arose late during the deuterostomes evolution and allowed the identification of a new Dpr paralog (Dpr4), meaning that a repertoire of four Dact genes is found in vertebrates. Thus, our work will provide the basis for molecular studies in order to establish the role of each individual member of this family as well as how the set of Dpr proteins can interact and cooperate to modulate different molecular signaling pathways in different cellular contexts / Doutorado / Biologia Tecidual / Doutora em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Ricardo Della Coletta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:48:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bersaneti_JoseliAssem_D.pdf: 811147 bytes, checksum: f8bb5e097207f57ec74bd4e214234d0b (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O aumento gengival induzido por ciclosporina A (CsA) é causado por um acúmulo excessivo de matriz extracelular, resultado da ação do fator de crescimento transformante-beta 1 (TGF-ß1) sobre a atividade dos fibroblastos gengivais. O presente estudo investigou in vitro os efeitos da superexpressão de Smad7, um inibidor da sinalização de TGF-ß1, nos eventos biológicos associados ao acúmulo de matriz extracelular induzido por CsA. Para verificar os efeitos inibitórios de Smad7, nós superexpressamos Smad7 em fibroblastos de gengiva normal (GN) de uma maneira estável. Células superexpressando Smad7 e células controle foram incubadas com CsA e a síntese de colágeno tipo I, produção e atividade de metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) e proliferação celular foram analisadas por ELISA, zimografia, curva de crescimento, método de incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU) e análise do ciclo celular. Os efeitos de CsA na viabilidade celular e apoptose dos fibroblastos de GN também foram avaliados. Análises de western blot e imunofluorescência para fosforo-Smad2 foram realizados para verificar a ativação da cascata de sinalização de TGF-ß1. Apesar do tratamento com CsA estimular a produção de TGF-ß1 tanto nas células controle quanto nos fibroblastos superexpressando Smad7, a via de sinalização de TGF-ß1 foi marcantemente inibida nas células superexpressando Smad7, como revelado pelos níveis reduzidos de fosforilação de Smad2. Nas células superexpressando Smad7, os efeitos de CsA na proliferação, síntese de colageno tipo I e produção e atividade de MMP-2 foram significativamente bloqueados. A superexpressão de Smad7 bloqueou a proliferação dos fibroblastos gengivais induzida por CsA via regulação de p27. CsA e a superexpressão de Smad7 não induziram morte celular. Os resultados deste estudo confirmaram que a expressão de TGF-ß1 é correlacionada com os eventos moleculares associados ao aumento gengival induzido por CsA, e sugerem que a superexpressão de Smad7 é efetiva no bloqueio de tais eventos, incluindo proliferação, síntese de colágeno tipo I e atividade de MMP-2 / Abstract: Cyclosporin A (CsA)-induced gingival overgrowth is attributed to an exaggerated accumulation of extracellular matrix, which is mainly due to an increased expression of transforming growth factor-beta1 (TGF-ß1). Herein the in vitro investigation of effects of overexpression of Smad7, a TGF-ß1 signaling inhibitor, in the events associated with CsA-induced extracellular matrix accumulation was performed. To assess the inhibitory effects of Smad7, we stably overexpressed Smad7 in fibroblasts from normal gingiva (NG). Smad7 overexpressing cells and controls were incubated with CsA and type I collagen synthesis, matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) production and activity, and cellular proliferation were evaluated by ELISA, zymography, growth curve, BrdUincorporation assay and cell cycle analysis. CsA effects on cell viability and apoptosis of NG fibroblasts were also evaluated. Western blot and immunofluorescence for phospho-Smad2 were performed to measure the activation of TGF-ß1 signaling. Although the treatment with CsA stimulated TGF-ß1 production in both control and Smad7 overexpressing fibroblasts, its signaling was marked inhibited in Smad7 overexpressing cells as revealed by low levels of Smad2 phosphorylation. In Smad7 overexpressed cells, the effects of CsA on proliferation, synthesis of type I collagen and MMP-2 production and activity were significantly blocked. Smad7 overexpression blocked CsA-induced fibroblast proliferation via p27 regulation. Neither CsA nor Smad7 overexpression induced cell death. The data presented here confirm that TGF-ß1 expression is related to the molecular events associated with CsA-induced gingival overgrowth, and suggest that Smad7 overexpression is effective in the blockage of those events, including proliferation, type I collagen synthesis and MMP-2 activity / Doutorado / Estomatologia / Doutor em Estomatopatologia

Orientadores: Patrícia Aline Bôer, José Antônio Rocha Gontijo / Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T01:30:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinhal_CarolinaStaut_M.pdf: 3126445 bytes, checksum: 41773c3f08c3abf04bd3ca94125158e1 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Alguns estudos vêm indicando que o consumo de dieta rica em gordura pode provocar, em longo prazo, desordens renais morfológicas e funcionais. O presente estudo foi realizado em ratas submetidas à dieta hiperlipídica (HFD) durante 3, 5, 7 e 9 semanas comparativamente àquelas que receberam dieta padrão (Co), avaliando-se, por immunoblotting, imunohistoquímica e técnicas histológicas, a expressão renal do receptor tipo 1 de angiotensina II (AT1) e de proteínas relacionadas à fibrose e transição epitélio mesenquimal (EMT), paralelamente ao estudo da função renal. Os resultados da análise por imunobloting e imunohistoquimica demonstraram aumento significativo na expressão de TGF?-1 renal após 3 semanas de dieta hiperlipídica comparativamente ao grupo Co. Paralelamente, verificamos aumento na expressão de ZEB2 nos rins de animais HFD acompanhado pela redução da expressão de E-caderina e aumento na deposição de colágeno e fibronectina. O estudo funcional demonstrou redução significativa na fração de excreção de sódio urinário nos animais HFD após 9 semanas de tratamento. Esta redução ocorreu em consequência da falha na excreção, tanto proximal quanto pós-proximal, de sódio e esteve associada ao decréscimo significativo do clearance de creatinina. A redução na taxa de filtração glomerular ocorreu paralelamente à proteinúria e ao aumento na expressão glomerular de desmina. Estes são os primeiros resultados demonstrando que, em ratas, o consumo de dieta hiperlipídica em logo prazo leva a EMT e acúmulo de colágeno nos rins aumentando a susceptibilidade para desenvolvimento de falência renal / Abstract: Evidence is emerging that highlights the far-reaching consequences of high fat diet (HFD) on kidney morphology and function disorders. The present study was performed in 3, 5, 7 and 9 week-old HFD female rats compared to appropriated gender and age-matched animals evaluating the kidney expression of AngII receptor and fibrotic and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) markers, by immunoblotting, immunohistochemical and histological techniques, in parallel with kidney function. In the current study, the time-course HFD-treated group showed, by immunoblotting and immunohistochemical analysis, a significant early time-course increase in the expression of TGF?-1 in the entire kidney of HFD-treated rats, compared to that observed in control group. Simultaneously, the study shows a transient increase in the expression of ZEB2 in HFD whole kidney accompanied by fall in the E-cadherin expression and increased collagen and fibronectin deposition. Also demonstrated a pronounced decrease in fractional urinary sodium excretion in long-term HFD-treated rats. The decreased FENa+ was accompanied by a fall in FEPNa+ and FEPPNa+ and occurred associated with significant decreased CCr and, certainly on the sodium filtered load. The reduction in the glomerular filtration rate occurred in parallel to proteinuria and glomerular desmin overexpression. In conclusion, from our present knowledge, these are the first showing that long-term HFD intake, enhance the susceptibility for adult renal disease and increased renal collagen expression and, subsequently should cause tubular and glomeruli EMT and renal failure at later time points in rats / Mestrado / Medicina Experimental / Mestra em Ciências

Orientador: Claudio Chrysostomo Werneck / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T20:38:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Braga_GuilhermeGambogi_D.pdf: 4636216 bytes, checksum: 190a4f198720c94edc5b356bdfbedb35 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A fibrilina-1 é um importante componente da rede de microfibrilas presentes nas fibras elásticas. Mutações no gene da fibrilina-1 leva ao surgimento da Síndrome de Marfan. Esta doença afeta a elastogênese de órgãos como pulmões, pele e sistema cardiovascular. Estudos recentes têm demonstrado que o desequilíbrio na atividade de TGF-beta é importante no aparecimento dos sinais e sintomas relacionados a essa síndrome. Estas alterações podem ser revertidas pelo uso de antagonistas de TGF-beta como o princípio ativo losartan. Os mecanismos pelo qual o losartan atua ainda não estão claramente descritos na literatura. Assim, utilizando um modelo de cultura de células primárias (fibroblastos de derme) derivadas de camundongos selvagens e deficientes em fibrilina-1, foi avaliado o perfil elastogênico por ensaios de imunofluorescência, zimografia in situ, Real-Time PCR, microscopia eletrônica de transmissão e varredura e western-blotting de diferentes proteínas de matriz extracelular e moléculas sinalizadoras importantes na síntese e degradação das fibras elásticas. Os dados apresentados sugerem uma redução conjunta da deposição das proteínas MAGP-1 (83%), Tropoelastina (87,5%) e Fibilina-1 (86%) na matriz extracelular; aumento na atividade e também dos níveis de expressão gênica relativa das metaloproteinases MMP-2 e MMP-9, ativação da cascata de sinalização canônica (SMAD-2) e não canônica (ERK1/2 e JNK-1) de TGF-beta e aumento nos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) nas culturas de fibroblastos de derme derivados de camundongos deficientes em fibrilina-1. Ao passo que ao utilizar o princípio ativo losartan (100?M/L) como tratamento para estas células ocorreu um aumento da deposição de MAGP-1 (71,5%) e Tropoelastina (68,5%) na matriz extracelular, redução da atividade e expressão gênica relativa das metaloproteinases MMP-2 e MMP-9 e inativação da sinalização canônica (SMAD-2) e não canônica (ERK1/2 e JNK-1) de atuação de TGF-beta. De uma maneira geral, nossos dados sugerem um aumento da degradação das moléculas componentes da fibra elástica em cultura de fibroblastos de derme derivados de camundongos deficientes em fibrilina-1 em função do aumento na expressão das MMPs 2 e 9. Este aumento da degradação da matriz extracelular pode ser resultado do menor nível de fibrilina-1 na matriz produzida por estas células, super ativando a sinalização canônica (SMAD-2) e não-canônica (ERK1/2 e JNK-1) de TGF-?, o que reflete na ativação de EROs e consequentemente a ativação das proteases. O tratamento com o losartan provavelmente faz o caminho inverso reduzindo a super ativação da cascata de sinalização de TGF-? bem como a ativação da metaloproteases, aumento indiretamente a deposição de MAGP-1 e Tropoelastina na matriz extracelular destas células / Abstract: Fibrillin-1 is an important component of the microfibrils network present in elastic fibers. Mutations in fibrillin-1 gene imply in the development of Marfan Syndrome. This disease affects elastogenesis in lungs, skin, cardiovascular system and eyes. Recent studies determined that unbalanced TGF-beta activity is an important factor in the symptoms observed this syndrome. These alterations can be reversed by the use of TGF-beta blockers such as the drug losartan. The mechanisms by which the drug losartan act are not described in the literature. Thus, using a model of primary culture cells (dermal fibroblasts) the elastogenic profile by immunofluorescence, zimograph in situ, Real-Time PCR, electronic microscopy and western-blotting of matrix proteins and signal molecules of elastic fiber synthesis and degradation was evaluated. The data presented suggest a joint reduction of the deposition of proteins MAGP-1 (83%), Tropoelastina (87.5%) and Fibilina-1 (86%) in the extracellular matrix; an increase in the activity and also the levels of gene expression of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9, activation of the signaling cascade canonical (SMAD-2) and not canonical (ERK1/2 and JNK-1) of TGF-beta and increased levels of reactive oxygen species (ROS) in cultures of fibroblasts in the dermis derived from mice deficient in fibrillin-1. While using the losartan drug (100 ?M/L) to treat these cells it was possible to observe an increase in deposition of MAGP-1 (71.5%) and Tropoelastina (68.5%) in the extracellular matrix, reduction of activity and gene expression of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 and inactivation of canonical signaling (SMAD-2) and not canonical (ERK1/2 and JNK-1) activity of TGF-beta. In general, our data suggest an increase in the degradation of molecules components of elastic fibers in culture of fibroblasts in the dermis derived from mice deficient in fibrillin-1 as a function in the increase in the expression of MMPs 2 and 9. This increase in the degradation of the extracellular matrix may be the result of lower levels of fibrillin-1 in the matrix produced by these cells, super activating the canonical signaling (SMAD-2) and non-canonical (ERK1/2 and JNK-1) of TGF-beta, which reflects the activation of ROS and consequently the activation of proteases The treatment with losartan probably takes the reverse path reducing the super activation of the signaling cascade of TGF-beta as well as the activation of metalloproteinases, indirectly increase in the deposition of MAGP-1 and Tropoelastina in the extracellular matrix of these cells / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19551号 / 医博第4058号 / 新制||医||1012(附属図書館) / 32587 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 川口 義弥, 教授 坂井 義治, 教授 羽賀 博典 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13031号 / 論医博第2113号 / 新制||医||1016(附属図書館) / 32989 / (主査)教授 妻木 範行, 教授 安達 泰治, 教授 開 祐司 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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