Disrupted in schizophrenia 1 (DISC1), located on chromosome 1, was first identified due to its disruption by a chromosomal translocation, t(1;11)(q42;q14). This translocation co-segregates with psychiatric illness in the Scottish family within which it was discovered. DISC1 is a component of the mitochondrial trafficking machinery and regulates trafficking of mitochondria in neurons, possibly implicating defective mitochondrial trafficking as a contributory factor in psychiatric illness. The product of another candidate gene for psychiatric illness, Glycogen synthase kinase 3β (GSK3β), is known to interact directly with DISC1 and has also been reported to be involved in mitochondrial trafficking. The interaction of these proteins has not been investigated in this process. The work in this thesis centres around a novel mouse model of the t(1:11) translocation. I use time-lapse imaging of live cells to show that hippocampal neurons cultured from this mouse model exhibit altered axonal mitochondrial trafficking, including reduced mitochondrial pausing. I also demonstrate that the DISC1 interactor GSK3β is a component of the mitochondrial trafficking machinery and investigate effects of the t(1:11) event upon this multi-protein complex. Finally, I demonstrate altered mitochondrial motility responses to overexpression of GSK3β in mutant neurons. Defective mitochondrial trafficking, particularly reduced pausing, could result in an altered distribution of mitochondria within neurons, leading to an impaired ability to respond to cellular conditions, such as the requirement to power synaptic vesicle release or the ion pumps that restore membrane potential following action potential generation. This could ultimately affect neuron viability, leading to brain dysfunction. My data therefore support a proposed disease mechanism whereby defective mitochondrial trafficking contributes to susceptibility to psychiatric illness in carriers of the t(1:11) translocation, and may be relevant to psychiatric illness in general.

Le ribosome est un complexe macromoléculaire impliqué dans la synthèse protéique de toutes les cellules vivantes. L’étape d’élongation de cette synthèse est un processus itératif débutant par la sélection au sein du ribosome d’un ARNt aminoacylé suivie par le transfert du peptide du site P- vers le site A- et de la translocation de l’ARNm et de l’ARNt. Le facteur d’élongation 2 (eEF2), qui catalyse la translocation, est l’un des acteurs majeur de cette étape d’élongation chez les eucaryotes. Cependant le mécanisme par lequel eEF2 induit ce processus est encore aujourd’hui inconnu. Dans cette étude structurale, nous présentons la première structure à haute résolution (3.1 Å) du complexe de pré-translocation résolu par cristallographie aux rayons X. La structure obtenue nous a permis d’identifier les différents composants du complexe de translocation et de proposer le rôle de l’His699 et celui de la diphtamide, modification post-traductionnelle d’eEF2, lors du stade de pré-translocation. / Elongation is the longest stage of protein synthesis that takes place on the ribosome and represents a cycle that begins with an aminoacyl-tRNA selection followed by the catalysis of peptide transfer from the P- to the A-site and mRNA-tRNA translocation. Elongation factor 2 (eEF2) is one of the key player of elongation cycle in eukaryotes that catalyzes translocation of mRNA and tRNA on the ribosome. However the mechanism how eEF2 induces translocation on the ribosome is unknown. Current work investigates the structural aspect of protein synthesis machinery in eukaryotes. In particular we present first high resolution structure of functional pretranslocation complex solved at 3.1 A by X-ray crystallography. The obtained structure allowed us to see several features of translocation complex and to propose the role of His699 and post translational modification of eEF2 diphthamide during at pretranslocation stage.

The translocation of a biopolymer through a narrow pore exists in universal cellular processes, such as the translocations of nascent proteins through ribosome and the degradation of protein by ATP-dependent proteases. However, the molecular details of these translocation processes remain unclear. Using computer simulations we study the translocations of a ubiquitin-like protein into a pore. It shows that the mechanism of co-translocational unfolding of proteins through pores depends on the pore diameter, the magnitude of pulling force and on whether the force is applied at the N- or the C-terminus. Translocation dynamics depends on whether or not polymer reversal is likely to occur during translocation. Although it is of interest to compare the timescale of polymer translocation and reversal, there are currently no theories available to estimate the timescale of polymer reversal inside a pore. With computer simulations and approximate theories, we show how the polymer reversal depends on the pore size, r, and the chain length, N. We find that one-dimensional transition state theory (TST) using the polymer extension along the pore axis as a reaction coordinate adequately predicts the exponentially strong dependence of the reversal rate on r and N. Additionally, we find that the transmission factor (the ratio of the exact rate and the TST rate) has a much weaker power law dependence on r and N. Finite-size effects are observed even for chains with several hundred monomers. If metastable states are separated by high energy-barriers, transitions between them will be rare events. Instead of calculating the relative energy by studying those transitions, we can calculate absolute free energy separately to compare their relative stability. We proposed a method for calculating absolute free energy from Monte Carlo or molecular dynamics data. Additionally, the diffusion of a knot in a tensioned polymer is studied using simulations and it can be modeled as a one-dimensional free diffusion problem. The diffusion coefficient is determined by the number of monomers involved in a knot and its tension dependence shows a maximum due to two dominating factors: the friction from solvents and “local friction” from interactions among monomers in a compact knot. / text

Nanopores (1 – 10 nm diameter) constructed in solid-state membranes, have shown promise as next-generation biopolymer analysis devices offering both high resolution and high throughput. One promising application of nanopores is in the analysis of nucleic acids, such as DNA. This involves translocation experiments in which DNA is placed in an ionic solution and is forced through a nanopore with the aid of an applied electric field. The modulation of ionic current through the pore during DNA translocation can then be correlated to various properties of the biopolymer such as the length. To optimally design and operate nanopore devices, it would be advantageous to develop an accurate computer simulation methodology to predict the physics of the translocation process. Hence, I have developed a physically accurate, computationally efficient simulation methodology to predict and analyze the physics of biopolymer translocation through solid-state (silicon nitride) nanopores. The overall theme of this thesis is to use this simulation methodology to thoroughly investigate important issues in the physics underlying translocation experiments and thereby determine the effects of key structural and operation parameters, such as nanopore dimensions, applied voltage, hydrodynamic interactions, solvent viscosity, and the polymer chain length. The results from these simulation studies can assist in not only proper nanopore design, but also help determine the proper experimental environments and parameters for nanopore operation.

Les porines sont des protéines « canal » qui assurent la diffusion non-spécifique des ions et nutriments au sein des bactéries à Gram-négatif. Elles sont également la voie d'entrée des antibiotiques hydrophiles, en particulier les β-lactames. Des mutations au sein des porines, ou leur sous-expression, ont été rapportées dans de nombreux cas d'infections multi-résistantes au cours de la dernière décade, soulignant le rôle de ces protéines dans la résistance aux antibiotiques.La première partie de ma thèse a porté sur l'étude des relations structure fonction au sein des deux porines non spécifiques de Providencia stuartii, Omp-Pst1 et Omp-Pst2. Il a été montré qu'Omp-Pst1 est majoritairement responsable de l'entrée des antibiotiques. Afin de comprendre comment évolue cette porine in situ, nous avons réalisé une étude comparative sur les variantes d'Omp-Pst1 issues de la souche sauvage et de deux isolats cliniques. Globalement, ces structures pointent vers un consensus dans l'adaptation des porines in situ, lequel repose sur l'accumulation de résidus chargés positivement dans les boucles extracellulaires et dans le canal. Cette observation est en accord avec les mesures de translocation effectuées à l'échelle de la porine unique, lesquelles montrent une diffusion ralentie des antibiotiques chargés négativement au travers des porines issues des isolats cliniques. Mis ensemble, nos résultats démontrent le rôle critique joué par les porines dans la résistance aux antibiotiques, lequel vise à diminuer l'influx de ces derniers tout en conservant l'habilité pour la bactérie de se nourrir.La deuxième partie de ma thèse s'est focalisée sur une fonction inédite des porines, à savoir leur rôle dans l'association intercellulaire et la genèse de biofilms bactériens. Les porines sont généralement exprimées sous la forme de trimères fonctionnels enchâssés dans la membrane externe des bactéries à Gram-négatif. Le mécanisme d'adhésion mis en évidence par mes travaux de thèse repose sur la formation de dimères de trimères de porines, associées face à face par leurs boucles externes, grâce à une interaction de type steric zipper. En exploitant un large panel de méthodologies biophysiques et d'imageries, nous avons caractérisé les propriétés adhésives d'Omp-Pst1 et Omp-Pst2, à la fois in vitro et in vivo. Nous avons également investigué le transport de petites molécules fluorescentes au travers de ces dimères de porines, afin de vérifier leur putative implication dans la communication intercellulaire. Nos résultats démontrent la capacité des porines Omp-Pst1 et Omp-Pst2 à former des jonctions intercellulaires et les suggèrent donc comme des cibles thérapeutiques prometteuses dans la lutte contre les infections bactériennes. / Present in the outer membrane of bacteria, porins are the main gateway for soluble molecules, such as nutrients and ions, into the bacteria. They are also the way taken by hydrophilic antibiotics to reach their targets and kill the cell. Under the strong selective pressure caused by antibiotic overuse, bacteria have evolved modified porins that are less permeable to antibiotics. Although not the only strategy developed by bacteria to survive drug treatment, it is an important factor in the spreading phenomenon of multidrug resistant infections.In order to gain further insights into the molecular determinants of antibiotic translocation, the first part of my thesis work aimed at resolving the crystallographic structures of Omp-Pst1 and Omp-Pst2, two non-specific porins encoded in the genome of Providencia stuartii. This bacterial species is not very invasive and, therefore, causes endemic rather than epidemic infections. However, these infections are often fatal given the intrinsically stringent MDR phenotype of this species. It has been shown that Omp-Pst1 is the main entrance for β-lactam antibiotics. To provide structural and functional insights into the contribution of P. stuartii porins to antibiotic resistance phenotypes, structural analysis was undertaken, not only from the wild type strain but also from two clinical mutant strains i.e. Omp-Pst1-99645 and Omp-Pst1-Nea16. Mutations result in more pronounced anion selectivity due to an increased number of positively charged amino acids lining the pore and mostly in the extracellular loops in both mutants compared to the wild type. To further determine whether these mutations contributed to a decrease in antibiotic uptake, we undertook the characterization of β-lactam antibiotics transport kinetics using electrophysiology studies at the single protein level. For the zwitterionic β-lactam tested, single-molecule conductance measurements evidenced a decrease in the association rate constant, in both mutants compared to the wild type. However, we observed instead an increase in these values for the negatively charged β-lactam, which is in good agreement with our structure-based analysis. All together, our results point towards porins playing a major role in the antibiotic resistance mechanism by reducing drug uptake.In the second part of my thesis work, we discovered that porins could self-associate to form adhesive junctions between two cells and could provide the initial scaffold for the establishment of biofilms at early stages of their developpement. The self-matching interaction is mediated by a steric zipper interaction and involves their extracellular loops. In order to confirm the adhesive proprieties of porins, we exploited a large panel of biophysical and imaging methods both in vitro and in vivo. Furthermore, we studied their diffusive proprieties in reconstituted liposomes, to explore whether these self-matching interactions between porins could play a role in cell-to-cell communication. Our results point at a major role of P. stuartii porins, Omp-Pst1 and Omp-Pst2, in cell-to-cell adhesion and make them promising targets to disrupt bacterial biofilm infections.

L’adressage des protéines vers leur correct emplacement est crucial pour la cellule. L’information d’adressage est fournie sous la forme d’une séquence signale par le polypeptide lui-même. Chez Escherichia coli, les protéines membranaires sont adressées vers la membrane de façon co-traductionnelle via la particule de reconnaissance du signal (SRP) tandis que les protéines sécrétées suivent la voie de translocation post-traductionnelle caractérisée par les protéines SecB et SecA qui sont impliquées dans le processus d’adressage. Ces deux voies convergent au niveau du canal de translocation des protéines SecYEG. Chose intéressante, SecYEG a la possibilité de recruter les domaines accessoires SecDF-YajC et YidC et ainsi former le complexe holotranslocon (HTL). La recherche actuelle sur la translocation des protéines se concentre principalement sur la structure et fonction du canal de translocation des protéines hétérotrimérique bactérien SecYEG qui est conservé. Peu de choses sont connues concernant la structure et la fonction des composants additionnels SecD, SecF et YidC formant la machinerie de translocation et qui sont essentiels pour E. coli. Ceci est dû principalement à l’absence d’un complexe holotranslocon SecYEG-DF-YidC (HTL) recombinant purifié. En conséquence, une analyse biophysique et structurale minutieuse de ce large complexe transmembranaire composé de sept sous-unités est toujours en suspens.En utilisant un nouveau système d’expression pour des complexes multi-protéiques basé sur la recombinaison de vecteur chez E. coli, nous avons avec succès surproduit l’holotranslocon SecYEG-DF-YajC-YidC et son sous-complexe composé de SecDF-YajC-YidC (DFYY). Nous avons également réussi à solubiliser avec l’aide de détergents et à purifier ces complexes. L’holotranslocon purifié a ensuite été utilisé afin de caractériser de façon biochimique le complexe et de déterminer la structure de l’holotranslocon. Premièrement, le complexe HTL semble être plus compétent pour l’insertion co-traductionnelle des protéines membranaires comparé à SecYEG isolé. Concernant la translocation post-traductionnelle d’une protéine de la membrane externe à tonneau β, dépendante de la présence de SecA et d’ATP, l’influence de la force proton motrice sur ce processus est augmentée. De plus, la présence du domaine accessoire semble améliorer l’attachement du ribosome au translocon. En utilisant des cellules déplétées de SecDF et YajC, nous avons identifié des substrats possibles de HTL qui doivent maintenant être confirmés et analysés manière plus approfondie par des expériences de translocation in vitro.Par la suite, nous avons résolu la structure de l’holotranslocon par cryo-microscopie électronique (ME) et analyse des particules isolées. En comparant les reconstructions de ME8du complexe HTL avec le sous-complexe de domaine accessoire SecDF-YajC-YidC, nous avons été capable de localisé le complexe principal SecYEG. La structure de HTL par cryo-ME a pu être affinée jusqu’à une résolution de 10.5 Å. Cette structure permet le placement des structures à haute résolution disponibles de SecYEG, SecDF et YidC afin de générer un modèle quasi-atomique de l’holotranslocon. Les jeu de données ainsi obtenus sont volumineux et souffrent d’un taux élevé de « faux positifs », probablement dû à des réactions de réticulation inter-complexe. C’est pourquoi ils nécessitent une évaluation minutieuse et les résultats intéressants devraient être confirmés par une méthode indépendante. Dans le futur, des études structurales du complexe ribosome-HTL par cryo-ME ainsi qu’une reconstitution de HTL dans des nanodisques vont être menées pour révéler la conformation de HTL en cours de translocation dans un environnement plus physiologique. Des études biochimiques complémentaires sur le mécanisme de co- et post-translocation par HTL et son spectre substrats abordent la question du rôle physiologique de l’holotranslocon dans la cellule. / Targeting of proteins to their proper location in the cell is crucial to the cell. The targeting information is provided in form of a signal sequence by the polypeptide itself. In Escherichia coli, membrane proteins are targeted co-translationally via the signal recognition particle (SRP) to the membrane whereas secretory proteins follow the post-translational translocation pathway characterized by the proteins SecB and SecA involved in the targeting process. Both pathways converge at the protein-conducting channel SecYEG. Interestingly, SecYEG has the possibility to recruit accessory domains SecDF-YajC and YidC, forming the holotranslocon (HTL) complex. Current research on protein translocation mostly focuses on the structure and function of the conserved bacterial heterotrimeric protein conducting channel SecYEG. Not much is known about the structure and function of the additional components of the translocation machinery SecD, SecF and YidC which are essential for E. coli. This is largely due to the lack of a purified, recombinant SecYEG-DF-YidC holotranslocon (HTL) complex. Accordingly, a thorough biophysical and structural analysis of this large, seven-membered transmembrane complex is still pending.Using a new recombineering-based vector system for expression of multi-protein complexes in E. coli, we successfully over-produced the SecYEG-DF-YajC-YidC holotranslocon and its subcomplex consisting of SecDF-YajC-YidC (DFYY). We also succeeded in detergent-solubilising and purifying these complexes. The purified holotranslocon was used to biochemically characterize the complex and to determine the structure of the holotranslocon. First of all, the HTL seems to be more competent for co-translational membrane proteins insertion compared to SecYEG alone. Regarding the post-translational translocation of a β-barrel outer-membrane protein, driven by SecA and ATP, the proton-motive force dependence of this process is increased. Furthermore, the presence of the accessory domains seems to enhance the binding of the ribosome to the translocon. By using cells depleted of SecDF and YajC, we identified possible HTL-substrates which have to be confirmed and further analyzed yet by in vitro translocation experiments.Subsequently, we solved by cryo-electron microscopy (EM) and single particle analysis the structure of the holotranslocon. By comparing the EM reconstructions of the HTL complex with the subcomplex of the accessory domains SecDF-YajC-YidC, we were able to localize the core complex SecYEG. The HTL cryo-EM structure could be refined to a resolution of 10.5 Å. This structure allows the placement of the available high–resolution crystal structure of SecYEG, SecDF, and YidC to generate a quasi-atomic model of the holotranslocon.6In order to confirm our quasi-atomic model, we made use of different crosslinking- and mass spectroscopy-based approaches (CLMS) to characterize the protein-protein interactions within the holotranslocon complex. These CLMS data sets are large and suffer from a high rate of ‘false positives’, possibly caused by inter-complex crosslinks. Thus, they need to be carefully evaluated and interesting fits should be confirmed by an independent method. In the future, structural studies of the ribosome-HTL complex by cryo-EM together with reconstitution of the HTL into nanodiscs will be undertaken to reveal the conformation of the actively translocating HTL in a more physiological environment. Additional biochemical studies on the molecular mechanism of co- and post-translocation by HTL and its substrate spectrum are addressing the question about the physiological role of the holotranslocon in the cell.

Les plantes hyperaccumulatrices peuvent accumuler des concentrations extraordinaires de métaux dans leurs parties aériennes (e.g. Ni, Zn et Cd). Cette thèse a été entreprise afin d’élucider : 1) comment le Ni est absorbé par les racines des hyperaccumulateurs, et 2) comment il circule dans les différents organes via le xylème et le phloème. Les travaux ont utilisé des cultures hydroponiques avec l’hyperaccumulateur de Ni et Zn Noccaea caerulescens en présence de concentrations faibles et élevées de Ni et Zn et en interaction avec Fe et Co ; des analyses isotopiques et d’expression de gènes ont été conduites. Les résultats ont montré que l’hyperaccumulateur N. caerulescens possède un système de transport du Ni à faible affinité et à haute efficacité. L’absorption du Ni semble impliquer principalement les transporteurs de Zn et Fe. Le transport par le xylème est la principale voie d'accumulation du Ni dans les jeunes feuilles et les feuilles âgées. Mais la translocation par le phloème est aussi une source importante de Ni pour les jeunes feuilles. Dans le phloème, le Ni est principalement chélaté par des acides organiques, de type malate. La thèse ouvre des perspectives pour l’optimisation des procédés de phytoextraction et d’agromine des sols contaminés. / Hyperaccumulating plants are capable of accumulating extraordinary concentrations of heavy metals, e.g. Ni, Zn and Cd, in their shoots. This thesis was conducted to assess: 1) how roots of hyperaccumulators absorb Ni, and 2) how Ni circulates in different organs via xylem and phloem. Methods used were hydroponic cultures with the Ni/Zn hyperaccumulator Noccaea caerulescens in the presence of low and high Ni and Zn solutions, and in competition with Fe, Co, and Rb and Sr. Isotope fractionation in the plant, and gene expression of the Zn transporter ZIP10 and the Fe transporter IRT1 were studied. Results showed that the hyperaccumulator N. caerulescens takes up Ni mainly via low-affinity transport system, which seemed to be Zn and Fe transporters. Xylem transport is the main source for Ni accumulation in both young and old leaves, while phloem translocation also acts as an important source for young leaves. Ni is enriched in phloem sap and mainly chelated by organic acids especially malate during phloem translocation.

La consommation excessive d’alcool concerne environ 20% de la population adulte en France. Il est établi qu’une consommation excessive aigue d’alcool engendre une augmentation de la morbi-mortalité en cas d’infection ou de traumatisme. La consommation chronique d’alcool augmente le risque de cancers et d’infection.Toutes ces conséquences médicales sont intimement liées à une altération des défenses de l’hôte induite par l’alcool. L’ingestion d’alcool et ses métabolites engendre une modification de la flore digestive appelée dysbiose ainsi qu’une augmentation de la perméabilité digestive. De cet effet local découle une augmentation du passage d’endotoxines dans le système veineux portal et systémique. Ainsi l’ensemble des éléments impliqués dans la réponse immunologique sont impactés de façon locale (Foie) et systémique par cette endotoxinémie chronique. Deux axes de recherche ont été privilégiés dans cette thèse: La translocation bactérienne et les sous-populations monocytaires. L’originalité de ce travail est l’étude de la cinétique des modifications immunologiques, chez des sujets alcoolo-dépendants (AD) hospitalisés pour un sevrage en alcool durant 2 à 6 semaines.La translocation bactérienne (TB) a été étudiée par l’analyse itérative de marqueurs sériques témoins de celle-ci: l’ADN 16S ribosomial en PCR temps réel, les taux sériques de LBP (LPS-Binding-Protein) et de CD14 soluble par ELISA. Les prélèvements veineux ont été effectués à jeun chez des sujets AD à J0 de leur sevrage et après 4 puis 6 semaines de sevrage. Avant le sevrage (J0) les 3 marqueurs sont plus élevés que dans une population témoin (p<0.001). Après 6 semaines de sevrage, les taux de LBP (p=0.04) et sCD14 (p=0.001) diminuent de manière significative sans revenir aux taux de la population témoin. La consommation de cannabis dans le mois précédent le sevrage est associée à une plus grande diminution des marqueurs LBP et sCD14 au cours du sevrage en alcool.Notre étude confirme une majoration de la TB chez les sujets AD non sevrés et l’impact potentiel du cannabis sur celle-ci. Elle montre également que le délai de sevrage de 6 semaines ne permet pas un retour à la normale des marqueurs de la TB.La répartition, le phénotype et la fonctionnalité des sous-populations monocytaires sanguines ont été étudiés à J0 et après 14 jours de sevrage en alcool chez des sujets AD. Avant le sevrage (J0), la fréquence des monocytes classiques (CD14+CD16-) est diminuée alors que celle des non classiques (CD14dimCD16+) est augmentée chez les sujets AD comparativement aux sujets contrôles. La fréquence des monocytes exprimant les TLR-2 et -4 est réduite chez les sujets AD. La sécrétion basale des cytokines IL-1, IL-6 et TNF est comparable chez les sujets AD et contrôles. En revanche après stimulation in vitro des monocytes par les ligands des TLR-2 et 4, respectivement peptidoglycanes (PGN) et lipopolysaccharides (LPS), la sécrétion d’IL-6 et de TNF est augmentée chez les sujets AD. Le sevrage de 14 jours restaure partiellement la distribution des sous-populations monocytaires. Nos résultats indiquent que la consommation chronique d’alcool altère la distribution, le phénotype et la fonctionnalité des monocytes chez les sujets AD, ces altérations s’améliorent en 14 jours de sevrage mais ne reviennent pas à la normale.Mon travail de thèse confirme l’impact de la consommation chronique d’alcool sur la translocation bactérienne et sur la réponse immune chez l’homme. Il précise la nature et la cinétique de cet impact. Mes résultats suggèrent également que le délai de retour à la normale semble être supérieur à 6 semaines. De nouvelles études permettront de mettre en évidence une cinétique plus précise de ces améliorations biologiques. Les résultats permettent d’envisager des recommandations cliniques quant à une durée d’abstinence pré-opératoire en cas de chirurgie programmée par exemple. / Excessive alcohol consumption concerns about 20% of the French adult population. An acute excessive alcohol consumption named “binge drinking” causes an increase in mortality and morbidity in case of trauma or infection. Chronic alcohol consumption causes an increased risk and severity of infections and increased risk of cancer. All these medical consequences are linked to changes in host defense induced by alcohol consumption. Indeed, alcohol and its metabolites generate modifications of the gut microbiota and increased gut permeability. This local effect causes an increase in endotoxin translocation into portal and systemic blood. Thus, all elements involved in the immune response, and in particular the monocytes as cellular component acting as first line of defense of the immune system, are affected by this chronic endotoxemia. Two research axes were studied during my thesis: Microbial translocation and monocyte subsets. The originality of this work was to study the kinetic of immunological changes induced by alcohol withdrawal in alcohol-dependent (AD) subjects hospitalized for an alcohol withdrawal during 2-6 weeks.Microbial translocation (MT) was studied by iterative analysis of serum markers: Bacterial 16S rDNA levels were measured using qPCR, Lipopolysaccharides-Binding protein (LBP) and soluble CD14 were quantified using ELISA. Blood samples were collected in fasten AD subjects at D0 of alcohol withdrawal and after 4 and 6 weeks of alcohol withdrawal. At D0, the 3 markers of MT were higher in AD subjects than in healthy controls (P<0.001). After 6 weeks of alcohol withdrawal, the serum level of LBP (p=0.04) and sCD14 (p=0.001) were significantly decreased but did not reach rates of healthy controls (HC). Cannabis use during the last month before alcohol withdrawal was associated with a greater decrease in sCD14 and LBP upon alcohol withdrawal. My study confirms an increase in MT in AD subjects and the potential impact of cannabis on this phenomenon, and shows that a 6-weeks abstinence period is not sufficient to return to normal blood biological parameters.Whether and how blood monocyte subsets were impaired in AD patients were studied as well as their evolution after alcohol withdrawal. The CD14+CD16- subset was decreased whereas the CD14dimCD16+ subset was expanded (p<0,001) in AD compared to HC. The frequencies of TLR2- and TLR4-expressing monocytes were reduced in AD compared to HC. Although the basal production of IL-1, IL-6 and TNF by monocytes in AD was comparable to HC, the PGN- and LPS-mediated IL-6 and TNF production were increased in AD. Frequencies of IL-6-expressing monocytes were higher in AD than HC. Alcohol withdrawal partially restored the distribution of monocyte subsets and the frequency of IL-6-producing monocytes, and increased the frequency of TNF-producing cells in response to LPS and PGN stimulation to levels comparable to those in HC. Our findings indicate that chronic alcohol use alters the distribution as well as the phenotypic and functional characteristics of blood monocyte subsets, which are partially restored following 2 weeks of alcohol withdrawal. These studies confirm and specify the impact of chronic alcohol consumption on microbial translocation and on the immune response. Our results also suggest that a period superior to 6 weeks is necessary to reach normal biological parameters. News studies will be necessary to specify the exact kinetic of these biological improvements.These results allow to consider clinical recommendations for a period of abstinence before programmed surgery for example.

Les translocations chromosomiques et les autres types de réarrangements peuvent, bien qu'associées à un phénotype normal, mener à la transmission d'un contenu génétique déséquilibré à la descendance. Il n'est pas possible de distinguer les chromosomes équilibrés des déséquilibrés, ce qui empêche toute sélection dans le cadre d'une fécondation in vitro (FIV). Nous avons ainsi mené une série de projets de recherche dont le but a été de mettre en évidence des caractéristiques spécifiques de ces spermatozoïdes déséquilibrés, afin de pouvoir les distinguer au cours d'une FIV. Nous avons montré que les spermatozoïdes déséquilibrés présentaient des taux de fragmentation de l'ADN plus élevés, étaient moins denses, et avaient un volume nucléaire supérieur. Ces constatations ont mené au développement d'une procédure de sélection des spermatozoïdes équilibrés chez les porteurs de réarrangements chromosomiques. En utilisant le hypo-osmotic swelling test (HOST), nous avons montré qu'une morphologie flagellaire spécifique était associée à un contenu chromosomique équilibré. Nous proposons d'utiliser cette procédure de sélection dans le cadre d'une ICSI, afin d'améliorer le pronostic reproductif chez les couples concernés. Nous proposons également d'évaluer la proportion de spermatozoïdes déséquilibrés chez chaque patient porteur de réarrangement chromosomique. En effet, bien que ce taux varie d'un patient à l'autre, il est stable dans le temps pour un patient donné. Il est de plus un élément déterminant dans le choix d'une des options de prise en charge : reproduction naturelle, insémination artificielle avec test de migration survie (TMS), ICSI avec sélection par HOST, et diagnostic préimplantatoire (DPI). / Chromosomal translocations and other balanced rearrangements, although usually associated with a normal phenotype, can lead to the transmission of an abnormal unbalanced genetic content to the offspring. Balanced and unbalanced spermatozoa are indistinguishable, making it impossible to select them prior to in vitro fertilization. We conducted a series of research projects aimed at evidencing specific characterics for unbalanced spermatozoa, in a way to ultimately distinguish them from balanced ones during in vitro fertilization. We showed that unbalanced spermatozoa had higher DNA fragmentation rates, were less dense, and that their nuclear volume was higher. This led to developing a selection procedure for balanced spermatozoa in rearrangement carriers. Using the hypo-osmotic swelling test (HOST), we showed that a specific flagellar morphology was associated with balanced chromosomal status. We suggest using this procedure prior to ICSI in order to improve the reproductive prognosis in those patients. We also suggest evaluating the proportion of unbalanced spermatozoa in every patient with a chromosomal rearrangement. Although this proportion varies among patients, it is stable over time for a given patient. We believe this is a decisive element in choosing between the different available options : natural conception, artificial insemination with discontinuous gradient centrifugation, ICSI with HOST-based selection, and pre-implantation genetic diagnosis (PGD).

Les translocations chromosomiques sont des événements cellulaires rares signatures de nombreux cancers, pouvant mener à l’expression de nouveaux gènes de fusion oncogènes ou à la dérégulation d’un oncogène existant. Cependant, le lien direct entre la formation de translocations et la tumorigenèse n’est pas toujours bien établi. Jusqu’à présent, la modélisation de translocations se limitait principalement à la surexpression du gène de fusion créé. Pour mieux comprendre leur contribution à l’oncogenèse, nous avons développé une nouvelle méthode pour induire des translocations oncogéniques de novo, afin de recréer plus fidèlement les premières étapes de la transformation cellulaire.Pour cela, nous nous appuyons sur la technologie des nucléases artificielles telles que les nucléases à doigt de zinc, les TALEN (TALE Nucleases) et le système CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats) pour générer des cassures ciblées de l’ADN et induire la formation de remaniements chromosomiques. Nous nous sommes particulièrement concentrés sur l’induction de la translocation modèle t(2;5)(p23;q32) et du gène de fusion NPM-ALK, associés au Lymphome Anaplasique à Grandes Cellules (ALCL), dans divers modèles cellulaires. Nous avons ainsi mis en évidence des propriétés oncogéniques du gène de fusion NPM-ALK exprimé sous son promoteur endogène suite à la formation du réarrangement chromosomique. Cependant, l’induction de la translocation dans des lymphocytes T primaires suggère que cet événement ne suffit pas à lui seul à initier l’oncogenèse, et nécessite probablement un contexte génétique ou épigénétique favorable. / Chromosomal translocations are signatures of numerous cancers and lead to expression of fusion genes that act as oncogenes. However, the wealth of genomic aberrations found in cancer makes it challenging to assign a specific phenotypic change to a specific aberration. We set out to use genome editing with Zinc Finger Nucleases (ZFN), Tale Effector Nucleases (TALEN), and the CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats) to induce de novo specific chromosomal translocations in human cells, thus generating new models to interrogate the contribution of tumor-related translocations in first steps of oncogenesis. We specially focused on Anaplastic Large Cell Lymphoma (ALCL) t(2;5) translocation and NPM-ALK consequent fusion gene. For the first time, we highlighted oncogenic properties for NPM-ALK fusion expressed under endogenous promoter. However, translocation induction in primary T cells suggests that t(2;5) is not sufficient to initiate ALCL oncogenesis, and likely requires favourable genetic or epigenetic or context.