O receptor P2X4 (canal iônico controlado por adenosina-5\'-trifosfato-ATP) está amplamente distribuído no sistema nervoso central e, após sua ativação, pode regular os níveis de cálcio intracelulares via permeação direta e por ativação de canais de cálcio voltagem-dependentes. Tem sido proposto que a atividade do receptor pode ser importante na plasticidade sináptica. Tendo em vista a importância do receptor P2X4, sobretudo na fisiologia do sistema nervoso central, é útil caracterizá-lo farmacologicamente e entender os mecanismos moleculares que regulam sua atividade. Examinamos o papel que resíduos específicos N- e C-terminais desempenham na atividade do receptor P2X4 humano, combinando técnicas de biologia molecular, bioquímica e patch-clamp em células de rim de embrião humano (células HEK-293T). Células HEK-293T expressando o receptor P2X4 wild-type apresentaram correntes iônicas, cujas amplitudes dependeram da concentração de ATP, fornecendo um valor de EC50 de 1,37 ± 0,21 µM. Os receptores mutantes E14A e D16A exibiram respostas ao ATP equiparáveis àquelas do receptor selvagem, ao passo que os mutantes Y15A e T17A não foram funcionais, apesar de serem expressos na membrana plasmática das células. A inibição de tirosina fosfatases por pervanadato diminuiu fortemente correntes induzidas por ATP. Subsequente análise de citometria de fluxo na presença de um anticorpo contra resíduos de fosfotirosina indicaram que, entre as células que expressam o receptor P2X4, a percentagem de células fosfo-tirosina-positivas é a mesma para os mutantes Y372A (86 ± 10%) e Y378A (79 ± 6.9%), mas substancialmente menor para os mutantes Y15A (35 ± 12%), Y367A (48 ± 6.4%) e Y372F (31 ± 1.7%), quando comparados com células que expressam o receptor wild-type (76 ± 5.6%). Resultados semelhantes foram obtidos quando quantificamos a expressão relativa de proteínas fosforiladas em resíduos de tirosina e expressamos através dos valores de intensidade de fluorescência média. Ensaios de western-blot revelaram que mesmo o mutante T17A é fosforilado em resíduos de treonina, sugerindo que o receptor P2X4 contém outros sítios de fosforilação. Entretanto, nenhum sinal de fosfotirosina foi detectado no receptor wild-type e nos mutantes, em que resíduos de tirosina foram substituídos por alanina ou fenilalanina. Não parece ser o resíduo Y15 o alvo de tal fosforilação, cabendo a ele um papel estrutural mais importante. Nossos dados também sugerem que a fosforilação em resíduos de tirosina de proteínas intermediárias regula a atividade do receptor P2X4. / The human P2X4 receptor (ATP-gated ion channel) is widely distributed in the CNS and, after activation, participates in regulation of levels of intracellular calcium through direct permeation and activation of voltage-dependent calcium channels with well-defined functions including synaptic plasticity. Given the importance of the P2X4 receptor, especially in CNS physiology, we investigated the role that specific N- and C-termini residues play in human P2X4 receptor activity, by combining techniques of molecular biology, biochemistry and patch-clamping in human embryonic kidney cells (HEK-293T cells). HEK-293T cells expressing the wild-type P2X4 receptor showed ionic currents whose amplitudes depended on the ATP concentration, providing an EC50 value of 1.37 ± 0.21 mM. E14A and D16A receptor mutants exhibited responses to ATP comparable to those ones of wild-type receptor, whereas Y15A and T17A mutants were not functional, despite being expressed in the plasma membrane of cells. The inhibition of tyrosine phosphatases by pervanadate decreased strongly ATP-induced currents. Subsequent flow cytometry analysis in the presence of an antibody against phosphotyrosine residues indicated that, among the cells that express the P2X4 receptor, the percentage of phosphotyrosine-positive cells was the same for Y372A (86 ± 10%) and Y378A (79 ± 6.9%) mutants, however, substantially lower for Y15A (35 ± 12%), Y367A (48 ± 6.4%) and Y372F (31 ± 1.7%) mutants when compared with cells expressing the wild-type receptor (76 ± 5.6%). Similar results were obtained by quantifying the relative expression of phosphotyrosine proteins. Western blot assays revealed that even the T17A mutant was phosphorylated at threonine residues, suggesting that the human P2X4 receptor also contains further phosphorylation sites. However, no phosphotyrosine-antibody signal was detected in the wild-type receptor and mutants in which tyrosine residues were replaced by alanine or phenylalanine. The residue Y15 is supposedly not the target of such phosphorylation, despite its important structural role. However, the present work indicates that tyrosine phosphorylation of intermediate signaling proteins regulates P2X4 receptor activity.

O receptor P2X4 (canal iônico controlado por adenosina-5\'-trifosfato-ATP) está amplamente distribuído no sistema nervoso central e, após sua ativação, pode regular os níveis de cálcio intracelulares via permeação direta e por ativação de canais de cálcio voltagem-dependentes. Tem sido proposto que a atividade do receptor pode ser importante na plasticidade sináptica. Tendo em vista a importância do receptor P2X4, sobretudo na fisiologia do sistema nervoso central, é útil caracterizá-lo farmacologicamente e entender os mecanismos moleculares que regulam sua atividade. Examinamos o papel que resíduos específicos N- e C-terminais desempenham na atividade do receptor P2X4 humano, combinando técnicas de biologia molecular, bioquímica e patch-clamp em células de rim de embrião humano (células HEK-293T). Células HEK-293T expressando o receptor P2X4 wild-type apresentaram correntes iônicas, cujas amplitudes dependeram da concentração de ATP, fornecendo um valor de EC50 de 1,37 ± 0,21 µM. Os receptores mutantes E14A e D16A exibiram respostas ao ATP equiparáveis àquelas do receptor selvagem, ao passo que os mutantes Y15A e T17A não foram funcionais, apesar de serem expressos na membrana plasmática das células. A inibição de tirosina fosfatases por pervanadato diminuiu fortemente correntes induzidas por ATP. Subsequente análise de citometria de fluxo na presença de um anticorpo contra resíduos de fosfotirosina indicaram que, entre as células que expressam o receptor P2X4, a percentagem de células fosfo-tirosina-positivas é a mesma para os mutantes Y372A (86 ± 10%) e Y378A (79 ± 6.9%), mas substancialmente menor para os mutantes Y15A (35 ± 12%), Y367A (48 ± 6.4%) e Y372F (31 ± 1.7%), quando comparados com células que expressam o receptor wild-type (76 ± 5.6%). Resultados semelhantes foram obtidos quando quantificamos a expressão relativa de proteínas fosforiladas em resíduos de tirosina e expressamos através dos valores de intensidade de fluorescência média. Ensaios de western-blot revelaram que mesmo o mutante T17A é fosforilado em resíduos de treonina, sugerindo que o receptor P2X4 contém outros sítios de fosforilação. Entretanto, nenhum sinal de fosfotirosina foi detectado no receptor wild-type e nos mutantes, em que resíduos de tirosina foram substituídos por alanina ou fenilalanina. Não parece ser o resíduo Y15 o alvo de tal fosforilação, cabendo a ele um papel estrutural mais importante. Nossos dados também sugerem que a fosforilação em resíduos de tirosina de proteínas intermediárias regula a atividade do receptor P2X4. / The human P2X4 receptor (ATP-gated ion channel) is widely distributed in the CNS and, after activation, participates in regulation of levels of intracellular calcium through direct permeation and activation of voltage-dependent calcium channels with well-defined functions including synaptic plasticity. Given the importance of the P2X4 receptor, especially in CNS physiology, we investigated the role that specific N- and C-termini residues play in human P2X4 receptor activity, by combining techniques of molecular biology, biochemistry and patch-clamping in human embryonic kidney cells (HEK-293T cells). HEK-293T cells expressing the wild-type P2X4 receptor showed ionic currents whose amplitudes depended on the ATP concentration, providing an EC50 value of 1.37 ± 0.21 mM. E14A and D16A receptor mutants exhibited responses to ATP comparable to those ones of wild-type receptor, whereas Y15A and T17A mutants were not functional, despite being expressed in the plasma membrane of cells. The inhibition of tyrosine phosphatases by pervanadate decreased strongly ATP-induced currents. Subsequent flow cytometry analysis in the presence of an antibody against phosphotyrosine residues indicated that, among the cells that express the P2X4 receptor, the percentage of phosphotyrosine-positive cells was the same for Y372A (86 ± 10%) and Y378A (79 ± 6.9%) mutants, however, substantially lower for Y15A (35 ± 12%), Y367A (48 ± 6.4%) and Y372F (31 ± 1.7%) mutants when compared with cells expressing the wild-type receptor (76 ± 5.6%). Similar results were obtained by quantifying the relative expression of phosphotyrosine proteins. Western blot assays revealed that even the T17A mutant was phosphorylated at threonine residues, suggesting that the human P2X4 receptor also contains further phosphorylation sites. However, no phosphotyrosine-antibody signal was detected in the wild-type receptor and mutants in which tyrosine residues were replaced by alanine or phenylalanine. The residue Y15 is supposedly not the target of such phosphorylation, despite its important structural role. However, the present work indicates that tyrosine phosphorylation of intermediate signaling proteins regulates P2X4 receptor activity.

Foi realizado um experimento com o objetivo de avaliar relações crescentes de treonina para lisina digestível em dietas formuladas com base no conceito de proteína ideal. Para tal, alojou-se 1.600 frangos de corte machos Ross x Ross 308 em arranjo fatorial com 3 relações entre treonina e lisina digestível (0,635; 0,660 e 0,685) e 2 fontes de treonina suplementar (Farelo de Soja (FS) e L-Treonina sintética (L-Thr)) com dois tratamentos controle (positivo e negativo). Assim, o experimento contou com oito tratamentos e oito repetições de 25 aves. Os tratamentos com as respectivas relações treonina:lisina digestível (TLD) e fontes de treonina foram: T1 (controle positivo) com relação TLD de 0,700 (FS+L-Thr); T2 (controle negativo) com relação 0,610 (FS); T3 com relação 0,635 (FS+L-Thr); T4 com relação 0,660 (FS+LThr); T5 com relação 0,685 (FS+L-Thr); T6 com relação 0,635 (FS); T7 com relação 0,660 (FS) e T8 com relação TLD 0,685 (FS). Todas as dietas foram formuladas para apresentarem o mesmo nível mínimo de nutrientes e energia sem restrição para o nível de proteína bruta. Não houve efeito da suplementação de treonina sobre as características avaliadas. Conversão alimentar (P=0,0095) e consumo de água (P=0,0113) foram significativamente melhores para a proteína intacta (FS) comparativamente às dietas com suplementação dos 3 primeiros AA limitantes (L-Thr). Contudo, a característica rendimento de peito apresentou resultado superior (P=0,0351) para as dietas suplementadas com treonina sintética. Não foi observado efeito dos tratamentos sobre as demais respostas estudadas. Desta forma, a menor relação entre treonina e lisina digestível estudada, ou seja, 0,610, foi suficiente para atender as exigências para ótimo desempenho dos frangos de corte dos 15 aos 37 dias de idade. Todavia, para a característica rendimento de peito recomenda-se a relação TLD mínima de 0,635. Em virtude de as melhores respostas terem sido obtidas com as dietas cuja fonte de treonina foi exclusivamente o FS, atribui-se estas respostas ao maior conteúdo de aminoácidos menos limitantes e aminoácidos não-essenciais contidos nas referidas dietas.

Novas informações assimiladas pelo sistema nervoso primeiramente ficam em um estado de labilidade para depois se estabilizarem através de um processo conhecido como consolidação, que envolve síntese de proteínas. Depois da reativação, uma memória previamente consolidada retorna ao seu estado de labilidade, e para que volte a ser estável, é necessário que haja novamente síntese de proteínas. Este segundo processo é chamado de reconsolidação. Recentemente os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na regulação da síntese protéica relacionados à formação de memória de longa duração vêm sendo esclarecidos. A proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) modula a plasticidade sináptica pela regulação da fosforilação de dois alvos: a proteína ribossomal S6K e a proteína de ligação 4E. A amígdala basolateral e o hipocampo dorsal são parte integrante do sistema neural envolvido na formação e expressão de diversos tipos de memórias. Estudos indicam que a via de sinalização da mTOR no hipocampo tem um papel importante na consolidação da memória de ratos submetidos a tarefa de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos e na reconsolidação da memória de medo contextual condicionado. Contudo, estudos anteriores não avaliaram o efeito da inibição de mTOR amigdalar sobre a memória de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos. O objetivo do presente trabalho é investigar o efeito da inibição de mTOR na amígdala basolateral por rapamicina na consolidação e reconsolidação da memória de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos e comparar estes resultados com a inibição de mTOR no hipocampo. Ratos Wistar machos foram submetidos à cirurgia estereotáxica para implantação de cânulas na amígdala basolateral e hipocampo dorsal. Os animais foram submetidos à tarefa de esquiva inibitória, um modelo animal de memória de caráter aversivo, e a tarefa de reconhecimento de objetos, um modelo animal de memória de caráter pouco aversivo. Para investigar o efeito da inibição de mTOR na consolidação e reconsolidação da memória, os animais receberam microinfusões de rapamicina intra-amigdalar e intra-hipocampal em diferentes tempos em torno do treino e do teste. Nós demonstramos que a via de sinalização de mTOR na amígdala basolateral é necessária para consolidação da memória de esquiva inibitória e de reconhecimento de objetos. Nós também mostramos que a reativação torna a memória novamente suscetível e sensível à inibição de mTOR por rapamicina. / Memory formation requires protein synthesis, but only recently the cellular and molecular mechanisms involved in the regulation of protein synthesis related to the formation of long term memory has been elucidated. During memory formation, new information is acquired by the central nervous system as an initially fragile trace that over time becomes stable through a process known as consolidation. After reactivation, previously consolidated memories might return to a labile state, requiring a new round of protein synthesis to be restabilized. This second process is called reconsolidation. The basolateral amygdala and dorsal hippocampus are part of the neural systems involved in the formation and expression of several types of memory. One key regulator of protein synthesis is mTOR, a protein critical for different forms of synaptic plasticity by regulation of two targets: S6K and 4EBP. Evidence indicates that the mTOR signaling pathway in hippocampus has an important role in consolidation in rats of inhibitory avoidance and object recognition in rats, as well as in reconsolidation of contextual fear conditioning. However, previous studies have not examinated the effect of amygdalar mTOR inhibition on reconsolidation of inhibitory avoidance and object recognition. The aim of the present study was to evaluate the effect of amygdalar mTOR inhibition by rapamycin on consolidation and reconsolidation of inhibitory avoidance and object recognition, and compare the results with those obtained with hippocampal mTOR inhibition. Male rats Wistar underwent stereotaxic surgeries for cannulae implantation above the basolateral amygdala or dorsal hippocampus. After recovery, the animals were trained in inhibitory avoidance, an aversive memory task, or object recognition, a less aversive task. To investigate the effect of mTOR inhibition on memory consolidation and reconsolidation, we administered rapamycin, a specific mTOR inhibitor, into the basolateral amygdala or the dorsal hippocampus before or after training or reactivation. Our results provide evidence that mTOR in the basolateral amygdala and hippocampus might play a role in inhibitory avoidance and object recognition memory formation and reconsolidation.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-04T13:05:15Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 791822 bytes, checksum: 6b6953e475a283ec75d3a8cad7b6dcc8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T13:05:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 791822 bytes, checksum: 6b6953e475a283ec75d3a8cad7b6dcc8 (MD5) Previous issue date: 2016-08-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Três experimentos foram realizados com o objetivo de determinar os coeficientes de digestibilidade ileal verdadeiros dos aminoácidos (CDiv) do farelo de soja, milho + farelo de soja e trigo+ farelo de soja utilizados nas formulações de rações para aves; determinar a relação ideal treonina:lisina digestível em dietas para frangos de corte suplementadas com fitase; e o efeito da xilanase e fitase sobre o desempenho, rendimento de carcaça e a histomorfometria intestinal de frangos de corte na fase inicial. No primeiro experimento 504 pintos machos da linhagem Cobb, com peso médio de 493g, foram distribuídos em delineamento inteiramente casualizado com 3 tratamentos (níveis de fitase 0, 500 e 1000 FTU), oito repetições e sete aves por gaiola, durante o período experimental de 14 a 23 dias de idade para determinação dos coeficientes de digestibilidade dos aminoácidos pelo método da coleta ileal do farelo de soja, milho+farelo de soja e do trigo+farelo de soja. Houve aumento do CDiv da metionina e da metionina+cistina do farelo de soja quando incluído 500FTU de enzima (p<0,05). O CDiv do milho + farelo de soja é maior para treonina quando utilizado 500 FTU (p<0,05). Não houve diferença significativa (p>0,05) no CDiv da metionina, arginina e histidina do trigo+farelo de soja com a inclusão dos níveis crescentes de enzima. Entretanto, houve diferença (p<0,05) no CDiv dos aminoácidos essenciais (lisina, treonina, metionina+cistina, isoleucina, fenilalanina e valina), assim como os não essenciais (cistina, alanina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, serina e tirosina). No segundo experimento, 2.500 frangos de corte machos (Cobb 500), com um peso inicial de 210 ± 5g de 8 e 18 dias de idade em delineamento experimental inteiramente casualizado com 10 tratamentos e 10 repetições com 25 aves por unidade experimental. Os tratamentos foram dois níveis de fitase (0 e 500FTU) x cinco relações treonina/Lisina digestível (58, 61, 64, 67 e 70%). Não houve efeito da suplementação de fitase sobre a conversão alimentar (P>0,05), mas observou-se efeito da fitase sobre o consumo de ração, ganho de peso e peso final das aves (P<0,05). As médias dos resultados de rendimento de carcaça e de cortes foram maiores (P<0,01) nas aves que receberam a adição de fitase nas dietas. No terceiro experimento, 420 frangos de corte machos com um peso inicial de 189 ± 5g de 8 e 21 dias de idade foram distribuídos em delineamento experimental inteiramente casualizado com 3 tratamentos e 20 repetições de 7 aves por unidade experimental. Os tratamentos foram dietas sem enzima, xilanase e xilanase + fitase. O consumo de ração pelas aves que receberam dietas com xilanase foi menor (p<0,05) do que para as aves dos demais tratamentos. Observou-se melhor conversão alimentar (p<0,05) nas aves que receberam a associação xilanase e fitase. Não houve efeito do uso enzimático sobre as resposta de rendimentos absolutos e relativos das aves até 21 dias de idade, assim como, não houve efeito sobre a altura de vilosidade do duodeno e jejuno. Nas mensurações do ileo, houve aumento das vilosidades das aves que receberam xilanase e fitase (p<0,05). / Three experiments were conducted in order to determine the true amino acids digestibility of soybean meal, corn + soybean meal and wheat + soybean meal used in poultry feed formulations; determine the ideal digestible threonine: digestible lysine ratio in diets for broilers supplemented with phytase; and the effect of xylanase and phytase on performance, carcass yield and intestinal histomorphometry in broilers in the initial phase. In the first experiment 504 male chicks from Cobb (493±5g), were distributed in a completely randomized design with 3 treatments (levels of phytase 0, 500 and 1000 FTU), six replicates and seven birds per cage during the trial period 14-23 days of age to determine the digestibility of amino acids by the method of ileal collection. There was an increase in the digestibility of methionine and methionine plus cystine soybean meal when included 500FTU enzyme (p<0.05). However, the coefficient of digestibility of lysine and threonine, and other amino acids not observed effect of adding phytase (p> 0.05). In the second experiment, 2,500 male broilers (Cobb 500), with an initial weight of 210±5g of 8 and 18 days of age in a completely randomized design with 10 treatments and 10 repetitions with 25 birds each. The treatments were two levels of phytase (0 and 500FTU) x five digestible threonine: digestible Lysine ratio (58, 61, 64, 67 and 70%). There was no effect of phytase supplementation on feed conversion (P>0.05), but there was effect of phytase on feed intake, weight gain and final weight of the birds (P <0.05). The mean carcass yield results and cuts were higher (P <0.01) in birds fed the addition of phytase in the diet. In the third experiment, 420 male broilers with an initial weight of 189 ± 5g of 8 and 21 days of age were distributed in a completely randomized design with 3 treatments and 20 repetitions of 7 birds each. Treatments were diets enzymes without enzyme, xylanase and xylanase + phytase. The xylanase enzyme was used was two times higher than the recommended half. The feed intake by birds fed diets with xylanase was lower (p<0.05) than for the birds of other treatments. There was better feed conversion (p <0.05) in birds fed xylanase and phytase association. There was no effect of the enzyme on the use of absolute and relative yields of response of birds up to 21 days of age, as there was no effect on villus height of the duodenum and jejunum. In the ileum the measurements, an increase of the villi of birds that received xylanase and phytase (p<0.05).

HOLANDA, Rocicler Oliveira. Propriedades vibracionais de L-Treonina e D-Treonina sob altas pressões. 2014. 119 f. Tese (Doutorado em Física) - Programa de Pós-Graduação em Física, Departamento de Física, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Edvander Pires (edvanderpires@gmail.com) on 2014-10-31T20:15:08Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_roholanda.pdf: 2595208 bytes, checksum: d4037f3a4f3d3f7bca8d38d5d6bac1ab (MD5) / Approved for entry into archive by Edvander Pires(edvanderpires@gmail.com) on 2014-10-31T21:05:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_roholanda.pdf: 2595208 bytes, checksum: d4037f3a4f3d3f7bca8d38d5d6bac1ab (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-31T21:05:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_roholanda.pdf: 2595208 bytes, checksum: d4037f3a4f3d3f7bca8d38d5d6bac1ab (MD5) Previous issue date: 2014 / In this work, crystals threonine (C4H9NO3) in the forms L and D were subjected to analysis by Raman spectroscopy. Initially there was an attempt to identify all of the Raman bands for the two samples by comparison with data from other work Raman spectroscopy of amino acids. In a second step we obtained the spectra of the material by varying the thermodynamic parameter hydrostatic pressure. For the D-threonine spectral experiments for the hydrostatic pressure due region was in the range of frequencies between approximately 30 cm-1 and 600 cm-1 and the change in pressure between 0.0 GPa and 8.5 GPa. The results show that the crystal D-threonine undergone two structural phase transitions, the first pressure range between 1.9 and 2.4 GPa and the second pressure range between 5.1 and 6.0 GPa. The crystals of the L-form were reviewed by the pressure of 27.0 GPa in the frequency range between approximately 50 cm-1 and 3300 cm-1. Changes associated with the external modes indicate that the material suffered three reversible phase transitions: the first at 1.6 GPa, 9.2 GPa in the second and a third at 15.5 GPa. A compared with a previous work on L-conformer is also provided. / Neste trabalho, cristais de treonina (C4H9NO3) nas formas L e D foram submetidos à análises através da técnica de espectroscopia Raman. Inicialmente realizou-se uma identificação de todas as bandas Raman para as duas amostras por comparação com dados de outros trabalhos de espectroscopia Raman em aminoácidos. Em uma segunda etapa obteve-se os espectros do material variando o parâmetro termodinâmico de pressão hidrostática. Para a D-treonina a região espectral para os experimentos realizados em função da pressão hidrostática esteve no intervalo de frequência entre aproximadamente 30 cm-1 e 600 cm-1 e a variação da pressão entre 0,0 GPa e 8,5 GPa. Os resultados mostram que o cristal de D-treonina sofreu duas transições de fase estruturais, primeiro no intervalo de pressão entre 1,9 e 2,4 GPa e a segunda no intervalo de pressão entre 5,1 e 6,0 GPa. Os cristais da forma L foram revistos até a pressão de 27,0 GPa no intervalo de frequência entre aproximadamente 50 cm-1 e 3300 cm-1. Modificações associadas aos modos externos indicam que o material sofreu três transições de fase reversíveis: a primeira em 1,6 GPa, a segunda em 9,2 GPa e uma terceira em 15,5 GPa. A comparação com um trabalho anterior sobre o L-confórmero também é fornecida.

Os hormônios tireoideanos têm importante papel na manutenção da homeostase metabólica, exercendo efeitos sobre o metabolismo glicêmico em diferentes níveis. Alterações nos níveis de hormônios tireoideanos, como ocorrem no hipertireoidismo e no hipotireoidismo, estão associados a aumento da resistência à insulina. A captação de glicose mediada pela insulina no músculo esquelético e no tecido adiposo, um dos fatores determinantes da homeostase glicêmica, é dependente da expressão do transportador de glicose tipo 4 (GLUT-4) na membrana celular destes tecidos. Visto que o gene do GLUT-4 é induzido pelos hormônios tireoideanos, alterações na concentração de triiodotironina (T3) tecidual podem explicar a associação entre alterações nos níveis de hormônios tireoideanos e resistência à insulina. No músculo esquelético a ativação do pro-hormônio tiroxina (T4) ao hormônio ativo T3 é regulada através da atividade da enzima desiodase tipo 2 (D2). Estudos em modelos animais nocaute para o gene da enzima D2 (D2K0) demonstraram resistência à insulina aumentada nestes animais. Em humanos, um polimorfismo da D2, no qual uma treonina (Thr) é trocada por uma alanina no codon 92 (D2 Thr92Ala), foi associado a redução da atividade da D2 em tecidos periféricos e maior resistência à insulina em pacientes com e sem diabetes mellitus tipo 2 (DM2). A associação entre o polimorfismo Thr92Ala da D2 e aumento de risco para DM2 não foi demonstrada nos estudos que avaliaram esta questão. Entretanto, visto que DM2 é uma doença poligênica e que os marcadores genéticos para esta doença tem tamanho de efeito pequeno, deve-se considerar falta de poder estatístico como uma possibilidade para explicar os resultados negativos. No primeiro artigo original que compõe esta Tese o objetivo foi avaliar se o polimorfismo Thr92Ala da D2 está associado com aumento de risco para DM2. Para tanto, planejou-se um estudo de caso-controle seguido de uma revisão sistemática e meta-análise da literatura. No estudo de caso-controle, foram incluídos 1057 pacientes com DM2 e 516 indivíduos controles saudáveis. A prevalência do genótipo Ala92Ala da D2 foi de 16,4% no grupo DM2 e 12,0% no grupo controle (p=0,03), resultando em uma razão de chances (RC) de 1,41 (IC95% 1,03-1,94, p=0,03). No mesmo trabalho realizou-se uma revisão sistemática com meta-análise de estudos observacionais que avaliaram a associação entre o genótipo Ala92Ala da D2 e DM2, sendo incluídos 4 estudos. A meta-análise dos 4 estudos, incluindo dados de um total de 11.033 pacientes, identificou uma RC 1,18 (IC95% 1,03-1,35, p=0,02) para a associação do genótipo Ala92Ala da D2 e DM2. Portanto, os resultados do estudo de caso-controle e da meta-análise demonstraram que o genótipo Ala92Ala da D2 está associado a aumento de risco para DM2 na população geral. A gestação caracteriza-se por uma série de alterações hormonais. Com respeito aos hormônios tireoideanos, há um aumento na produção e metabolização do T4. No metabolismo glicêmico, especialmente no terceiro trimestre, há um estado de resistência à insulina, induzido pela secreção de uma série de hormônios contra-reguladores da insulina pela placenta. A placenta também regula a transferência dos hormônios tireoideanos da mãe para o feto através da expressão das enzimas D2 e desiodase tipo 3 (D3). Portanto, em um contexto de resistência à insulina e de aumento de demanda pela produção de T4, um polimorfismo que está associado a redução da atividade da D2 em tecidos periféricos e maior resistência à insulina, pode associar-se a pior controle glicêmico durante a gestação. Portanto, o objetivo do segundo artigo original que compõe esta Tese foi de avaliar a associação entre o genótipo Ala92Ala da D2 e o controle glicêmico em gestantes. Neste estudo foram incluídas 110 gestantes (19 Ala92Ala e 91 Thr92Ala-Thr92Thr), que foram acompanhadas até o parto. Não foram identificadas diferenças no controle glicêmico ao longo da gestação, no peso neonatal ou em desfechos obstétricos entre os dois grupos. Em 30 amostras de placentas obtidas no momento do parto, realizou-se ensaios para avaliar a expressão da enzima D2. A atividade placentária da D2 das pacientes Ala92Ala foi 82% menor que nos demais genótipos (p<0,001). Pelas potenciais implicações terapêuticas no futuro, o entendimento dos mecanismos que explicam a associação entre redução na atividade da D2 e resistência à insulina e aumento do risco de DM2 são de especial interesse.

Foi realizado um experimento com o objetivo de avaliar relações crescentes de treonina para lisina digestível em dietas formuladas com base no conceito de proteína ideal. Para tal, alojou-se 1.600 frangos de corte machos Ross x Ross 308 em arranjo fatorial com 3 relações entre treonina e lisina digestível (0,635; 0,660 e 0,685) e 2 fontes de treonina suplementar (Farelo de Soja (FS) e L-Treonina sintética (L-Thr)) com dois tratamentos controle (positivo e negativo). Assim, o experimento contou com oito tratamentos e oito repetições de 25 aves. Os tratamentos com as respectivas relações treonina:lisina digestível (TLD) e fontes de treonina foram: T1 (controle positivo) com relação TLD de 0,700 (FS+L-Thr); T2 (controle negativo) com relação 0,610 (FS); T3 com relação 0,635 (FS+L-Thr); T4 com relação 0,660 (FS+LThr); T5 com relação 0,685 (FS+L-Thr); T6 com relação 0,635 (FS); T7 com relação 0,660 (FS) e T8 com relação TLD 0,685 (FS). Todas as dietas foram formuladas para apresentarem o mesmo nível mínimo de nutrientes e energia sem restrição para o nível de proteína bruta. Não houve efeito da suplementação de treonina sobre as características avaliadas. Conversão alimentar (P=0,0095) e consumo de água (P=0,0113) foram significativamente melhores para a proteína intacta (FS) comparativamente às dietas com suplementação dos 3 primeiros AA limitantes (L-Thr). Contudo, a característica rendimento de peito apresentou resultado superior (P=0,0351) para as dietas suplementadas com treonina sintética. Não foi observado efeito dos tratamentos sobre as demais respostas estudadas. Desta forma, a menor relação entre treonina e lisina digestível estudada, ou seja, 0,610, foi suficiente para atender as exigências para ótimo desempenho dos frangos de corte dos 15 aos 37 dias de idade. Todavia, para a característica rendimento de peito recomenda-se a relação TLD mínima de 0,635. Em virtude de as melhores respostas terem sido obtidas com as dietas cuja fonte de treonina foi exclusivamente o FS, atribui-se estas respostas ao maior conteúdo de aminoácidos menos limitantes e aminoácidos não-essenciais contidos nas referidas dietas.

Os hormônios tireoideanos têm importante papel na manutenção da homeostase metabólica, exercendo efeitos sobre o metabolismo glicêmico em diferentes níveis. Alterações nos níveis de hormônios tireoideanos, como ocorrem no hipertireoidismo e no hipotireoidismo, estão associados a aumento da resistência à insulina. A captação de glicose mediada pela insulina no músculo esquelético e no tecido adiposo, um dos fatores determinantes da homeostase glicêmica, é dependente da expressão do transportador de glicose tipo 4 (GLUT-4) na membrana celular destes tecidos. Visto que o gene do GLUT-4 é induzido pelos hormônios tireoideanos, alterações na concentração de triiodotironina (T3) tecidual podem explicar a associação entre alterações nos níveis de hormônios tireoideanos e resistência à insulina. No músculo esquelético a ativação do pro-hormônio tiroxina (T4) ao hormônio ativo T3 é regulada através da atividade da enzima desiodase tipo 2 (D2). Estudos em modelos animais nocaute para o gene da enzima D2 (D2K0) demonstraram resistência à insulina aumentada nestes animais. Em humanos, um polimorfismo da D2, no qual uma treonina (Thr) é trocada por uma alanina no codon 92 (D2 Thr92Ala), foi associado a redução da atividade da D2 em tecidos periféricos e maior resistência à insulina em pacientes com e sem diabetes mellitus tipo 2 (DM2). A associação entre o polimorfismo Thr92Ala da D2 e aumento de risco para DM2 não foi demonstrada nos estudos que avaliaram esta questão. Entretanto, visto que DM2 é uma doença poligênica e que os marcadores genéticos para esta doença tem tamanho de efeito pequeno, deve-se considerar falta de poder estatístico como uma possibilidade para explicar os resultados negativos. No primeiro artigo original que compõe esta Tese o objetivo foi avaliar se o polimorfismo Thr92Ala da D2 está associado com aumento de risco para DM2. Para tanto, planejou-se um estudo de caso-controle seguido de uma revisão sistemática e meta-análise da literatura. No estudo de caso-controle, foram incluídos 1057 pacientes com DM2 e 516 indivíduos controles saudáveis. A prevalência do genótipo Ala92Ala da D2 foi de 16,4% no grupo DM2 e 12,0% no grupo controle (p=0,03), resultando em uma razão de chances (RC) de 1,41 (IC95% 1,03-1,94, p=0,03). No mesmo trabalho realizou-se uma revisão sistemática com meta-análise de estudos observacionais que avaliaram a associação entre o genótipo Ala92Ala da D2 e DM2, sendo incluídos 4 estudos. A meta-análise dos 4 estudos, incluindo dados de um total de 11.033 pacientes, identificou uma RC 1,18 (IC95% 1,03-1,35, p=0,02) para a associação do genótipo Ala92Ala da D2 e DM2. Portanto, os resultados do estudo de caso-controle e da meta-análise demonstraram que o genótipo Ala92Ala da D2 está associado a aumento de risco para DM2 na população geral. A gestação caracteriza-se por uma série de alterações hormonais. Com respeito aos hormônios tireoideanos, há um aumento na produção e metabolização do T4. No metabolismo glicêmico, especialmente no terceiro trimestre, há um estado de resistência à insulina, induzido pela secreção de uma série de hormônios contra-reguladores da insulina pela placenta. A placenta também regula a transferência dos hormônios tireoideanos da mãe para o feto através da expressão das enzimas D2 e desiodase tipo 3 (D3). Portanto, em um contexto de resistência à insulina e de aumento de demanda pela produção de T4, um polimorfismo que está associado a redução da atividade da D2 em tecidos periféricos e maior resistência à insulina, pode associar-se a pior controle glicêmico durante a gestação. Portanto, o objetivo do segundo artigo original que compõe esta Tese foi de avaliar a associação entre o genótipo Ala92Ala da D2 e o controle glicêmico em gestantes. Neste estudo foram incluídas 110 gestantes (19 Ala92Ala e 91 Thr92Ala-Thr92Thr), que foram acompanhadas até o parto. Não foram identificadas diferenças no controle glicêmico ao longo da gestação, no peso neonatal ou em desfechos obstétricos entre os dois grupos. Em 30 amostras de placentas obtidas no momento do parto, realizou-se ensaios para avaliar a expressão da enzima D2. A atividade placentária da D2 das pacientes Ala92Ala foi 82% menor que nos demais genótipos (p<0,001). Pelas potenciais implicações terapêuticas no futuro, o entendimento dos mecanismos que explicam a associação entre redução na atividade da D2 e resistência à insulina e aumento do risco de DM2 são de especial interesse.

Novas informações assimiladas pelo sistema nervoso primeiramente ficam em um estado de labilidade para depois se estabilizarem através de um processo conhecido como consolidação, que envolve síntese de proteínas. Depois da reativação, uma memória previamente consolidada retorna ao seu estado de labilidade, e para que volte a ser estável, é necessário que haja novamente síntese de proteínas. Este segundo processo é chamado de reconsolidação. Recentemente os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na regulação da síntese protéica relacionados à formação de memória de longa duração vêm sendo esclarecidos. A proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) modula a plasticidade sináptica pela regulação da fosforilação de dois alvos: a proteína ribossomal S6K e a proteína de ligação 4E. A amígdala basolateral e o hipocampo dorsal são parte integrante do sistema neural envolvido na formação e expressão de diversos tipos de memórias. Estudos indicam que a via de sinalização da mTOR no hipocampo tem um papel importante na consolidação da memória de ratos submetidos a tarefa de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos e na reconsolidação da memória de medo contextual condicionado. Contudo, estudos anteriores não avaliaram o efeito da inibição de mTOR amigdalar sobre a memória de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos. O objetivo do presente trabalho é investigar o efeito da inibição de mTOR na amígdala basolateral por rapamicina na consolidação e reconsolidação da memória de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos e comparar estes resultados com a inibição de mTOR no hipocampo. Ratos Wistar machos foram submetidos à cirurgia estereotáxica para implantação de cânulas na amígdala basolateral e hipocampo dorsal. Os animais foram submetidos à tarefa de esquiva inibitória, um modelo animal de memória de caráter aversivo, e a tarefa de reconhecimento de objetos, um modelo animal de memória de caráter pouco aversivo. Para investigar o efeito da inibição de mTOR na consolidação e reconsolidação da memória, os animais receberam microinfusões de rapamicina intra-amigdalar e intra-hipocampal em diferentes tempos em torno do treino e do teste. Nós demonstramos que a via de sinalização de mTOR na amígdala basolateral é necessária para consolidação da memória de esquiva inibitória e de reconhecimento de objetos. Nós também mostramos que a reativação torna a memória novamente suscetível e sensível à inibição de mTOR por rapamicina. / Memory formation requires protein synthesis, but only recently the cellular and molecular mechanisms involved in the regulation of protein synthesis related to the formation of long term memory has been elucidated. During memory formation, new information is acquired by the central nervous system as an initially fragile trace that over time becomes stable through a process known as consolidation. After reactivation, previously consolidated memories might return to a labile state, requiring a new round of protein synthesis to be restabilized. This second process is called reconsolidation. The basolateral amygdala and dorsal hippocampus are part of the neural systems involved in the formation and expression of several types of memory. One key regulator of protein synthesis is mTOR, a protein critical for different forms of synaptic plasticity by regulation of two targets: S6K and 4EBP. Evidence indicates that the mTOR signaling pathway in hippocampus has an important role in consolidation in rats of inhibitory avoidance and object recognition in rats, as well as in reconsolidation of contextual fear conditioning. However, previous studies have not examinated the effect of amygdalar mTOR inhibition on reconsolidation of inhibitory avoidance and object recognition. The aim of the present study was to evaluate the effect of amygdalar mTOR inhibition by rapamycin on consolidation and reconsolidation of inhibitory avoidance and object recognition, and compare the results with those obtained with hippocampal mTOR inhibition. Male rats Wistar underwent stereotaxic surgeries for cannulae implantation above the basolateral amygdala or dorsal hippocampus. After recovery, the animals were trained in inhibitory avoidance, an aversive memory task, or object recognition, a less aversive task. To investigate the effect of mTOR inhibition on memory consolidation and reconsolidation, we administered rapamycin, a specific mTOR inhibitor, into the basolateral amygdala or the dorsal hippocampus before or after training or reactivation. Our results provide evidence that mTOR in the basolateral amygdala and hippocampus might play a role in inhibitory avoidance and object recognition memory formation and reconsolidation.