Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Neste trabalho, cristais de treonina (C4H9NO3) nas formas L e D foram submetidos à anÃlises atravÃs da tÃcnica de espectroscopia Raman. Inicialmente realizou-se uma identificaÃÃo de todas as bandas Raman para as duas amostras por comparaÃÃo com dados de outros trabalhos de espectroscopia Raman em aminoÃcidos. Em uma segunda etapa obteve-se os espectros do material variando o parÃmetro termodinÃmico de pressÃo hidrostÃtica. Para a D-treonina a regiÃo espectral para os experimentos realizados em funÃÃo da pressÃo hidrostÃtica esteve no intervalo de frequÃncia entre aproximadamente 30 cm-1 e 600 cm-1 e a variaÃÃo da pressÃo entre 0,0 GPa e 8,5 GPa. Os resultados mostram que o cristal de D-treonina sofreu duas transiÃÃes de fase estruturais, primeiro no intervalo de pressÃo entre 1,9 e 2,4 GPa e a segunda no intervalo de pressÃo entre 5,1 e 6,0 GPa. Os cristais da forma L foram revistos atà a pressÃo de 27,0 GPa no intervalo de frequÃncia entre aproximadamente 50 cm-1 e 3300 cm-1. ModificaÃÃes associadas aos modos externos indicam que o material sofreu trÃs transiÃÃes de fase reversÃveis: a primeira em 1,6 GPa, a segunda em 9,2 GPa e uma terceira em 15,5 GPa. A comparaÃÃo com um trabalho anterior sobre o L-confÃrmero tambÃm à fornecida. / In this work, crystals threonine (C4H9NO3) in the forms L and D were subjected to analysis by Raman spectroscopy. Initially there was an attempt to identify all of the Raman bands for the two samples by comparison with data from other work Raman spectroscopy of amino acids. In a second step we obtained the spectra of the material by varying the thermodynamic parameter hydrostatic pressure. For the D-threonine spectral experiments for the hydrostatic pressure due region was in the range of frequencies between approximately 30 cm-1 and 600 cm-1 and the change in pressure between 0.0 GPa and 8.5 GPa. The results show that the crystal D-threonine undergone two structural phase transitions, the first pressure range between 1.9 and 2.4 GPa and the second pressure range between 5.1 and 6.0 GPa. The crystals of the L-form were reviewed by the pressure of 27.0 GPa in the frequency range between approximately 50 cm-1 and 3300 cm-1. Changes associated with the external modes indicate that the material suffered three reversible phase transitions: the first at 1.6 GPa, 9.2 GPa in the second and a third at 15.5 GPa. A compared with a previous work on L-conformer is also provided.

Orientador: Gabriel Forato Anhê / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T19:01:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_ThiagoMatosFerreirade_D.pdf: 1239554 bytes, checksum: 87d5fc958173ca83a217021c9d866455 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A obesidade é caracterizada pela deposição ectópica de gordura no fígado. Este acúmulo de gordura hepática (NAFLD) pode gerar consequências graves, como a hepatite não alcoólica (NASH), fator de ricos para carcino hepatocelular (HCC). A morte de hepatócitos, evento chave na evolução da NAFLD para NASH, é causada pelo excesso de nutrientes e é dependente do estresse de retículo endoplasmático (RE). O estresse no RE resulta no acúmulo de proteínas não processadas desencadeia a "unfolded protein response" (UPR), podendo gerar apoptose. A mTOR é formada basicamente por dois complexos: mTOR1 e mTOR2; ambos são sensíveis a nutrientes, a insulina e a rapamicina. O complexo mTOR2/Rictor catalisa a fosforilação da AKT, aumentando a sinalização da insulina. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a relação entre ativação da mTOR, do estresse de RE e da apoptose em hepatócito expostos a ácidos graxos livres. Observamos que a apoptose causada pelo palmitato ativa o estresse de RE de maneira tempo dependente. Não observamos alterações na fosforilação de proteínas alvo específicas para o complexo mTOR1. No entanto, a fosforilação geral da mTOR foi estimulada pelo palmitato. Altas doses de rapamicina inibiram a apoptose e do estresse de RE causado pelo palmitato, sugerindo a participação do complexo mTOR2. Estes resultados ainda foram confirmados pelo silenciamento gênico da Rictor. A fosforilação em serina 473 da AKT apresenta um caráter transitório, elevando-se em tempos que precedem morte e o estresse de RE, e diminuindo em tempos prolongados concomitantemente à apoptose. A inibição da AKT pelo "AKT inhibitor" gerou diminuição da apoptose, do estresse de RE e da incorporação lipídica na linhagem de hepatoma. Estes dados sugerem que a AKT, como alvo preferencial da mTOR2 é necessária para geração de morte e da UPR. A glicose (33.3mM) gera morte as células HepG2 e esta é inibida com baixas doses de rapamicina, mostrando possível atividade via mTOR1 nesta resposta. De outro modo, a frutose (4.5mM) que também desencadeia apoptose das células de hepatoma, tem seu efeito inibido por doses maiores de rapamicina, indicando atividade mTOR2 neste processo. No entanto, a possibilidade de diferentes monossacarídeos recrutarem complexos diferentes de mTOR para desencadear apoptose ainda precisa ser melhor explorada / Abstract: Obesity is characterized by fat ectopic deposition in liver. This hepatic fat accumulation our non-alcoholic fat liver disease (NAFLD) can have serious consequences such as non-alcoholic hepatitis (NASH), that is a factor to liver cancer. The cell death of hepatocytes is an important event in the development to NAFLD to NASH, all that are caused by excess nutrients and dependent of endoplasmic reticulum (ER) stress. The ER stress is caused by accumulation of unfolded proteins triggers the unfolded protein response (UPR), which mau cause apoptosis. mTOR is basically formed by two complexes: mTOR1 and mTOR2, both are sensitive to nutrients, insulin and rapamycin. The mTOR2/Rictor complex catalyse AKT phosphorylation increasing the insulin pathway. All together, the aim of this study was evaluate the relationship between mTOR, ER stress and apoptosis in liver cells exposed to free fatty acids. We observed that apoptosis caused by palmitate activates ER stress in a manner dependent on time. We din¿t observed changes in phosphorylation of specific target proteins to mTOR1 complex. However, a general phosphorylation of mTOR was stimulated by palmitate. High doses of rapamycin inhibited apoptosis and ER stress caused by palmitate, suggesting the participation of the mTOR2 complex. These results were further confirmed by gene silencing of Rictor. The AKT phospholylation in serine 473 has a transitional character, rising in times that preceding cell death and ER stress, and decreasing concomitantly apoptosis in prolonged times. Inhibition of AKT by AKT inhibitor caused a decrease in apoptosis, ER stress and lipid incorporation in hepatoma cell line. These data suggest that AKT, preferential targets of mTOR2 is required for generation death and UPR. Glucose (33.3mM) generates HepG2 cell death and this is inhibited by low doses on rapamycin, showing possible mTOR1 activity. Otherwise, fructose (4.5mM) also triggers apoptosis of hepatoma cells; its effect is inhibited by higher doses of rapamycin, indicating mTOR2 activity in this process. However, the possibility of different monosaccharide recruit different complexes of mTOR to trigger apoptosis should be further explored / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T15:05:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_GustavoPereirade_M.pdf: 7665145 bytes, checksum: 3fef8dc5d333834f8117015fea3b10ef (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A produção de energia por meio de fontes renováveis é uma exigência atual para se atingir uma economia sustentável. Os organismos fotossintetizantes surgem nesse contexto como ferramentas importantes na produção de compostos carbônicos ricos em energia, com destaque para microalgas em que tais compostos podem atingir até 80% do peso seco. Entretanto, um fator ainda desfavorável para sua utilização é o seu baixo rendimento na produção de biomassa. A espécie Chlamydomonas reinhardtii, por exemplo, é capaz de duplicar apenas algumas vezes durante 24 horas. As vias que controlam o crescimento celular, portanto, são alvos promissores para modificação genética. Dentre essas vias, à via de sinalização sensível à rapamicina aparece como um controlador central. Com o intuito de entender melhor como esse controle é exercido ao nível da expressão gênica global, foi utilizado a ferramenta de sequenciamento de RNA em larga escala para obtenção dos transcriptomas de culturas (sincronizadas) sob inibição dessa via e na condição controle, em oito momentos ao longo de um ciclo celular de 24h. O controle exercido por essa via sobre o metabolismo e sobre o ciclo celular foi o foco das análises. Foi encontrado que a inibição da via da TOR é capaz de gerar uma resposta de direcionamento parcial do metabolismo para a produção de TAG em detrimento de moléculas complexas como proteínas. Esse direcionamento foi considerado parcial devido à ocorrência concomitante de reações catabólicas. Outros dados obtidos sugerem que a via da TOR, além de regular o metabolismo de uma maneira geral e diversas funções celulares, também exerce influência sobre o progresso do ciclo celular e sua inibição resulta no atraso do desenvolvimento das fases do ciclo. Diversos fatores reguladores da transcrição envolvidos no desenvolvimento, no crescimento e na regulação do ciclo celular, foram encontrados diferencialmente expressos e constituem possíveis genes chave no controle do crescimento. Eles representam alvos em potencial para modificação genética com intuito de otimizar as taxas de crescimento na primeira etapa do sistema de produção. Na busca de alternativas aos processos atuais de indução do acúmulo de cadeias carbônicas, os efeitos da combinação rapamicina e via da TOR representam uma abordagem interessante para pesquisas futuras para viabilização da utilização de microalgas como fonte de energia. Este estudo possibilitou um melhor entendimento da atuação da via da TOR no crescimento e progresso do ciclo celular em C. reinhardtii ao nível de expressão gênica / Abstract: The energy production through renewable sources is an actual demand for achieving a sustainable economy. In this context, photosynthesizing organisms come to light as important tools for the production of energy-rich carbonic compounds, especially the microalgae, in which these compounds can reach up to 80% of the dry weight. However, an unfavorable factor for its utilization is the low yield of biomass production. The species Chlamydomonas reinhardtii, for instance, is capable of achieving only some duplication after 24 hours. The pathways that control cell growth are therefore promising targets for genetic modification. Among them, the rapamycin-sensitive signaling pathway emerges as a central controller. With the aim of better understanding how this control is fulfilled by the means of global gene expression, the high throughput RNA sequencing technology was used. With it, the synchronized cultures transcriptome under the inhibition of this pathway and in the control condition, of eight points during a cellular cycle of 24 hours, were obtained. The metabolism and the cell cycle control by the TOR pathway was the main focus of the analysis. It was found that the inhibition of this pathway is capable to partially draw the metabolism towards TAG production to the detriment of producing more complex chains as proteins. This directing was considered partial due to the concomitant occurrence of catabolic reactions. Other data suggested that the TOR pathway, apart from the metabolism regulation in a general way and regulation of many other cellular functions, also influence the cell cycle progression and its inhibition retards the development of cell phases. Several transcription regulators involved in development, growth and cell cycle regulation were found out to be differentially expressed and are likely to constitute key genes in growth control. They represent potential targets for genetic modification aiming the optimization of growth rate in the first step of the production system. In the search for alternatives to the current process of inducing carbon chain accumulation, the effects of the combination between rapamycin and TOR pathway represent an interesting approach for future research intending to turn the utilization of microalgae as an energy source into a feasible option. This study enabled a better understanding of the role of the TOR pathway in growth and cell cycle progression of C. reinhardtii at the level of gene expression / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

A proteína serina/treonina fosfatase do tipo 1 (PP1) é a principal serina/treonina fosfatase envolvida na regulação de diversos processos tais como metabolismo, crescimento e divisão celular, síntese protéica e processamento de RNA. A holoenzima PP1 é constituída de uma subunidade catalítica conservada (PP1c) e subunidades reguladoras variáveis. Em mamíferos já foram identificados dezenas de polipeptídeos que associam-se direta ou indiretamente a PP1c, gerando holoenzimas com localizações celulares e especificidades distintas. Entre as proteínas que se associam a PP1c, muitas têm função inibitória como o inibidor-1 (I-1) e o inibidor-2 (I-2). A partir de extratos de micélios de Neurospora crassa foi purificada uma proteína, denominada INc-1, que atua in vitro como inibidor da atividade de fosforilase fosfatase de PP1c e constitui-se no primeiro exemplo de subunidade reguladora da PP1 descrito em fungos filamentosos. INc-1 apresenta diversas características bioquímicas comuns ao I-2 de mamíferos. Seqüências parciais de aminoácidos de três fragmentos proteolíticos obtidos de INc-1 permitiram a identificação de uma ORF (fase aberta de leitura) no genoma de N. crassa que provavelmente codifica INc-1. A análise dessa ORF mostrou que a sequência de aminoácidos do INc-1 é similar a do I-2, especialmente em regiões supostamente envolvidas em sua interação com a PP1c. Neste trabalho descrevemos a clonagem e a expressão em bactérias da sequência codificadora de INc-1. A atividade inibidora de PP1c de duas isoformas recombinantes purificadas, INc-1L e INc-1, foram avaliadas e comparadas. A forma denominada INc-1L apresenta em sua região aminoterminal um segmento de 38 aminoácidos derivado da retenção de um íntron, sem alterar a fase de leitura. Ambas proteínas recombinantes exibiram efeito inibidor sobre a atividade de fosforilase fosfatase de PP1c recombinante, sendo que a IC50 determinada para INc-1L foi de ~50nM e para INc-1 foi de ~11nM, sugerindo que a retenção do segmento de aminoácidos codificado pelo íntron na isoforma INc-1L diminui seu potencial inibitório. Verificamos também que o mRNA de INc-1 é expresso durante o crescimento vegetativo de N.crassa, apresentando níveis máximos na fase exponencial. / Type 1 protein serine/threonine phosphatases (PP1) play important roles in the regulation of many cellular functions including metabolism, cell growth and division, protein synthesis and pre-mRNA splicing. PP1 holoenzyme consists of one highly conserved catalytic subunit (PP1c) and variable regulatory subunits. A number of proteins that interact with PP1c have been described in mammals and the respective holoenzymes present distinct substrate specificity and/or different subcelular localization. Among the proteins that interact with PP1c, there are many with inhibitory effect such as inhibitor-1 (I-1) and inhibitor-2 (1-2). It has been demonstrated that a protein denominated INc-1, purified from Neurospora crassa extracts, specifically inhibits PP1c and has biochemical properties that resemble those of mammalian I-2. INc-1 is the first example of a PP1c regulatory subunit in filamentous fungi. Partial amino acid sequences of INc-1 led to the identification of an ORF (open reading frame) in Neurospora crassa genome which appears to encode INc-1. This ORF shows similarity with mammalian I-2 mainly in regions mapped as sites for interaction with PP1c. In this work we report the cloning and bacterial expression of the coding sequence for INc-1. The PP1c inhibitory activities of two recombinant isoforms, named INc-1L and INc-1, were compared. INc-1L aminoacid sequence presents an in frame segment of 38 residues encoded by an non-processed intron. 80th recombinant proteins showed inhibitory effect against phosphorylase phosphatase activity of recombinant PP1c, with IC50 of ~50nM for INc-1L and ~11nM for INc-1, suggesting that retention of the 38 residue segment decrease the inhibitory potential of INc-1L. We have also verified that INc-1 mRNA is expressed during N.crassa vegetative growth with maximum level at the exponential phase.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-06-22T19:42:13Z No. of bitstreams: 1 Ezequiel BorgesMelo.pdf: 3711016 bytes, checksum: 4169bfc0d8fb15318ce5eacdd7bda426 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-22T19:42:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ezequiel BorgesMelo.pdf: 3711016 bytes, checksum: 4169bfc0d8fb15318ce5eacdd7bda426 (MD5) Previous issue date: 2015-08-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) / Amino acids, having both the carboxylic group and amine group, may act as bidentate ligands and, depending on its radical group can also act as tridentate ligands. Amino acids complexed with transition metals have attracted the interest of chemists and physicists because of its possible applications and physical properties. L-threonine complexes with Cu+2 (Cu(II)(L-Threonine)2(H2O)), Co+2 (Co(II)(L-Threonine)2(H2O)2) e Zn+2 (Zn(II)(L-Threonine)2(H2O)2) transition metals already exist in the literature and their crystalline structures are different. However, L-threonine complexed with Ni+2 was not found in the literature. Thus, in this study, we used the amino acid L-threonine as a ligand and Ni+2 ion as the transition metal to obtain the crystal of L-threonine complexed with Ni. For that we used the Slow Evaporation crystal growth method, where a solution containing L-threonine and NiCl2.6H2O with molar ratio (2:1) and NaOH to get a basic pH, is allowed to stand for promoting the crystal growth. To get the crystal structure of this material, X-ray diffraction measures were carried in a APEX2 DUO diffractometer of the Crystallography Laboratory in the Physics Institute of UFG. The data analysis and the resolution of the structure were performed the package Bruker SHELXTL and also using the mechanism of structural determination by Direct Methods, one of the most used ways to overcome the phase problem in the structure determination of small molecules. L-threonine complexed with Ni has the chemical formula Ni(II)(L-Treonina)2(H2O)2 and crystallizes in the orthorhombic system with space group C2221. Thus, we identified that the Ni(II)(L-Treonina)2(H2O)2 crystal has a very similar crystalline structure as Co(II)(L-Treonina)2(H2O)2. Furthermore, the knowledge of the structure of this material opens up a range studies can be performed on it. / Aminoácidos, por terem tanto um grupo carboxílico como um grupo amina, podem agir como ligantes bidentados e, dependendo do seu grupo radical, podem agir também como ligantes tridentados. Aminoácidos complexados com metais de transição têm atraído o interesse de químicos e físicos devido as suas possíveis propriedade físicas e aplicações. Complexos de L-treonina com os metais de transição Cu+2 (Cu(II)(L-Treonina)2(H2O)), Co+2 (Co(II)(L-Treonina)2(H2O)2) e Zn+2 (Zn(II)(L-Treonina)2(H2O)2) já existem na literatura e os três possuem estruturas cristalinas diferentes. Entretanto, a L-treonina complexada com Ni+2 não foi encontrada na literatura. Desta forma, neste trabalho, utilizamos o aminoácido L-treonina como ligante e o íon Ni+2 como metal de transição para obter o cristal de L-treonina complexada com Ni. Para obter estes cristais, utilizamos o método de crescimento por Evaporação Lenta, onde uma solução contendo L-treonina e NiCl2.6H2O na proporção molar (2:1) mais NaOH, para deixar o pH básico, é deixada em repouso para promover o crescimento dos cristais. Para determinar a estrutura cristalina deste material, foram realizados medidas de Difração de Raios X no Difratômetro APEX2 DUO da Bruker, do Laboratório de Cristalografia do Instituto de Física da UFG. O tratamento dos dados e a resolução da estrutura foram realizados usando utilizando o pacote SHELXTL da Bruker e utilizando o mecanismo de determinação estrutural por Métodos Diretos, que é uma das alternativas mais utilizadas para contornar o problema das fases na determinação estrutural de pequenas moléculas. Com essas análises, foi determinado que a L-treonina complexada com Ni possui fórmula química Ni(II)(L-Treonina)2(H2O)2 e cristaliza na simetria ortorrômbica com grupo espacial C2221. Desta forma, identificamos que o cristal de Ni(II)(L-Treonina)2(H2O)2 tem a estrutura cristalina muito similar ao Co(II)(L-Treonina)2(H2O)2. Além disso, com o conhecimento da estrutura desse material, abre-se um leque estudos que podem ser realizados nele.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:54:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 105984 bytes, checksum: eac5b7c639b49b694da3dfe59f2995f8 (MD5) Previous issue date: 2006-02-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The experiment was carried out to estimate the level of digestible threonine for laying japanese quail in posture. It was used four hundred quails, with 57 days old and with averaging 75.50% of the rate egg production, during 63 days. A complete randomized experimental design was used with five treatments, eight replicates and ten quail per experimental unit. The basal diet was deficient in threonine, containing 20% of crude protein, 2.910 kcal of ME/kg and supplied with five levels of L-threonine 98% (0.018; 0.074; 0.128; 0.183 and 0.239%), corresponding of digestible threonine: digestible lysine ratios 0.65; 0.70; 0.75; 0.80 and 0.85, respectively to compose the experimental treatments. The following parameters were evaluated: feed intake (g/quail/day), threonine intake (mg/quail/day), egg production (%), production of commercial eggs (%), egg weight (g), egg mass (g/quail/day), feed conversion (kg feed/kg egg), feed conversion (kg feed /egg dozen), weight gain (g), egg quality (yolk (g and %), albumen (g and %) and shell (g and %)), egg length and width (mm) and specific gravity (g/cm3). Linear effect (P<0.05) was only observed in the threonine intake. It is ended that, the japanese quail doesn't demand more than 0.65% of digestible threonine to provided the best productive performance and quality of eggs, for a consumption of 149.2 mg of digestible threonine/day or a daily consumption of 14.34 mg of digestible threonine/g egg, corresponding to the digestible threonine: digestible lysine ratio of 0.65. / O experimento foi conduzido a fim de se estimar o nível de treonina digestível para codorna japonesa em postura. Foram utilizadas 400 codornas, com idade inicial de 57 dias e com taxa de postura média de 75,50%, durante 63 dias. Utilizou-se delineamento inteiramente casualizado com 5 tratamentos, 8 repetições e 10 aves por unidade experimental.A dieta basal foi deficiente em treonina, contendo 20% de proteína bruta, 2910 Kcal de energia metabolizável/kg, sendo suplementada com cinco níveis de L- treonina 98% (0,018; 0,074; 0,128; 0,183 e 0,239%), correspondendo à relação treonina digestível:lisina digestível de 0,65; 0,70; 0,75; 0,80 e 0,85, respectivamente para compor os tratamentos experimentais. As variáveis estudadas foram: consumo de ração (g/ave/dia), consumo de treonina (mg/ave/dia), produção de ovos por ave dia (%), produção de ovos comercializáveis (%), peso do ovo (g), massa de ovos (g/ave/dia), conversão alimentar por massa de ovos (kg de ração/kg de ovos), conversão alimentar por dúzia de ovos (kg de ração/dz de ovos), mudança de peso (g), componentes dos ovos (gema (g e %), albúmen (g e %) e casca (g e %)), altura e diâmetro dos ovos (mm) e gravidade específica (g/cm3). Observou-se efeito linear (P<0,05) somente no parâmetro de consumo de treonina. Conclui-se que para proporcionar os melhores resultados de desempenho e de qualidade de ovos, a codorna japonesa não exige mais que 0,65% de treonina digestível, para um consumo de 149,2 mg de treonina digestível/dia ou um consumo diário de 14,34 mg de treonina digestível/g de ovo, correspondendo à relação treonina digestível: lisina digestível de 0,65.

A proteína serina/treonina fosfatase do tipo 1 (PP1) é a principal serina/treonina fosfatase envolvida na regulação de diversos processos tais como metabolismo, crescimento e divisão celular, síntese protéica e processamento de RNA. A holoenzima PP1 é constituída de uma subunidade catalítica conservada (PP1c) e subunidades reguladoras variáveis. Em mamíferos já foram identificados dezenas de polipeptídeos que associam-se direta ou indiretamente a PP1c, gerando holoenzimas com localizações celulares e especificidades distintas. Entre as proteínas que se associam a PP1c, muitas têm função inibitória como o inibidor-1 (I-1) e o inibidor-2 (I-2). A partir de extratos de micélios de Neurospora crassa foi purificada uma proteína, denominada INc-1, que atua in vitro como inibidor da atividade de fosforilase fosfatase de PP1c e constitui-se no primeiro exemplo de subunidade reguladora da PP1 descrito em fungos filamentosos. INc-1 apresenta diversas características bioquímicas comuns ao I-2 de mamíferos. Seqüências parciais de aminoácidos de três fragmentos proteolíticos obtidos de INc-1 permitiram a identificação de uma ORF (fase aberta de leitura) no genoma de N. crassa que provavelmente codifica INc-1. A análise dessa ORF mostrou que a sequência de aminoácidos do INc-1 é similar a do I-2, especialmente em regiões supostamente envolvidas em sua interação com a PP1c. Neste trabalho descrevemos a clonagem e a expressão em bactérias da sequência codificadora de INc-1. A atividade inibidora de PP1c de duas isoformas recombinantes purificadas, INc-1L e INc-1, foram avaliadas e comparadas. A forma denominada INc-1L apresenta em sua região aminoterminal um segmento de 38 aminoácidos derivado da retenção de um íntron, sem alterar a fase de leitura. Ambas proteínas recombinantes exibiram efeito inibidor sobre a atividade de fosforilase fosfatase de PP1c recombinante, sendo que a IC50 determinada para INc-1L foi de ~50nM e para INc-1 foi de ~11nM, sugerindo que a retenção do segmento de aminoácidos codificado pelo íntron na isoforma INc-1L diminui seu potencial inibitório. Verificamos também que o mRNA de INc-1 é expresso durante o crescimento vegetativo de N.crassa, apresentando níveis máximos na fase exponencial. / Type 1 protein serine/threonine phosphatases (PP1) play important roles in the regulation of many cellular functions including metabolism, cell growth and division, protein synthesis and pre-mRNA splicing. PP1 holoenzyme consists of one highly conserved catalytic subunit (PP1c) and variable regulatory subunits. A number of proteins that interact with PP1c have been described in mammals and the respective holoenzymes present distinct substrate specificity and/or different subcelular localization. Among the proteins that interact with PP1c, there are many with inhibitory effect such as inhibitor-1 (I-1) and inhibitor-2 (1-2). It has been demonstrated that a protein denominated INc-1, purified from Neurospora crassa extracts, specifically inhibits PP1c and has biochemical properties that resemble those of mammalian I-2. INc-1 is the first example of a PP1c regulatory subunit in filamentous fungi. Partial amino acid sequences of INc-1 led to the identification of an ORF (open reading frame) in Neurospora crassa genome which appears to encode INc-1. This ORF shows similarity with mammalian I-2 mainly in regions mapped as sites for interaction with PP1c. In this work we report the cloning and bacterial expression of the coding sequence for INc-1. The PP1c inhibitory activities of two recombinant isoforms, named INc-1L and INc-1, were compared. INc-1L aminoacid sequence presents an in frame segment of 38 residues encoded by an non-processed intron. 80th recombinant proteins showed inhibitory effect against phosphorylase phosphatase activity of recombinant PP1c, with IC50 of ~50nM for INc-1L and ~11nM for INc-1, suggesting that retention of the 38 residue segment decrease the inhibitory potential of INc-1L. We have also verified that INc-1 mRNA is expressed during N.crassa vegetative growth with maximum level at the exponential phase.

Orientador: Jose Barreto Campello Carvalheira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T02:56:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendes_MariaCarolinaSantos_D.pdf: 2658779 bytes, checksum: 153ed5344815e7e59a41c04c4a965670 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A proteína mTOR é um proteína reguladora chave de vários processos celulares, dentre eles proliferação, crescimento e sobrevivência celular. Fatores de crescimento, oxigênio, status energético e a presença de aminoácidos são fundamentais para que todos esses processos ocorram normalmente. Descobertas realizadas nas últimas décadas mostraram que a via da mTOR encontra-se ativada em vários processos celulares, incluindo formação tumoral e angiogênese. A leucina é um aminoácido de cadeia ramificada que tem o maior potencial em ativar a via da mTOR. Devido sua capacidade de promover a síntese proteica e ganho de massa muscular, seu uso é constantemente estimulado em pacientes com câncer. No entanto, seus efeitos no crescimento tumoral não está claro. Dessa forma, realizamos um estudo cujo objetivo principal foi investigar os efeitos da dieta suplementada com leucina na modulação do crescimento tumoral em diferentes linhagens de células tumorais que se diferenciem em relação à ativação constitutiva da via IRS1/Akt/mTOR. Estudos in vivo e in vitro realizados demonstraram que as células que se diferenciam em relação à ativação da via IRS1/AKT/mTOR respondem de maneira distinta à suplementação com leucina. Linhagens de células tumorais que possuem a via da mTOR constitutivamente ativada, PC-3 e MCF-7, quando suplementadas com doses elevadas de leucina in vitro reduziram a proliferação celular e causaram retenção das células na fase G1 do ciclo celular. Já o xenoenxerto tumoral da PC-3 reduziu sua proliferação e aumentou a morte celular quando os animais foram suplementados com leucina na dieta. Nós também observamos aumento da atividade da mTOR e da p70S6K em todas as linhagens celulares quando suplementadas com leucina. O aumento da atividade da proteína mTOR foi acompanhado de redução na fosforilação de AKTser473 nas células que possuíam a via da PI3K hiperativada (PC-3 e MCF-7). Esse fato pode estar ocorrendo devido a ativação das alças de contraregulação ocasionadas pela estimulação excessiva provocada pela suplementação com leucina, naquelas linhagens celulares que já possuem a via hiperativada. Fato este comprovado pelo aumento da fosforilação em serina 307 da proteína IRS1. Dessa forma, nossos resultados sugerem que a ativação da via da mTOR é central para determinar a sensibilidade de tumores à dieta suplementada com leucina, podendo modular o desenvolvimento tumoral naquelas células que já possuem a via IRS1/AKT/mTOR constitutivamente ativada. O mecanismo pelo qual a leucina pode retardar o desenvolvimento tumoral em células que possuem a via da mTOR hiperativada parece estar relacionado com o eixo de regulação negativa p70S6K-PI3K, com consequente redução da fosforilação de AKT e liberação das vias apoptóticas nos tecidos tumorais / Abstract: mTOR is a key regulatory protein in various cellular processes including proliferation, cell growth and survival. Growth factors, oxygen, energy status and amino acids are all essential to these processes. New findings in the last few decades have shown that the mTOR pathway is activated in many cellular processes, including tumorigenesis and angiogenesis. The branched chain amino acid leucine has the greatest potential to activate the mTOR pathway. Due to its ability to promote protein synthesis and muscle mass gain, use of leucine is frequently utilized in patients with cancer. However, the effect of leucine on tumor growth is not clear. The aim of this study is therefore to investigate the effect of diet-supplemented leucine on the modulation of tumor growth in several tumor cell lines that differ in the constitutive activation status of the insulin receptor substrate 1 (IRS1)/AKT/mTOR pathway. Both in vitro and in vivo experiments demonstrated different cell proliferation responses when cells were exposed to high doses of leucine. Tumor cell lines PC-3 and MCF-7, which have a constitutively activated mTOR signaling, displayed reduced cell proliferation and G1 phase cell cycle arrest when supplemented with high doses of leucine in vitro. Likewise, leucine-supplemented PC-3 cell tumor xenografts displayed reduced proliferation and increased cell death. We also observed increased activity of mTOR and its downstream substrate p70S6K in all cell lines supplemented with leucine. Increased mTOR activity was accompanied by a reduction in AKT serine 473 (ser473) phosphorylation in cell lines with a hyperactivated PI3K pathway (PC-3 and MCF-7). This most likely occurred because leucine supplementation further increased mTOR and p70S6K activity, triggering the inhibitory p70S6K/IRS1 axis. In fact, we found increased IRS1 ser307 phosphorylation in hyperactivated cell lines (PC-3 and MCF-7) supplemented with high doses of leucine. Therefore, our results suggest that mTOR pathway activation is central to determining the sensitivity of tumors to leucine supplementation. Furthermore, this could affect the response to leucine-supplemented therapies of those tumors in which the PI3K pathway is constitutively activated. The mechanism for this appears to be related to the negative p70S6K/IRS1 regulation axis, with consequent reduction of AKT phosphorylation and the release of apoptotic pathways in tumor tissues / Doutorado / Fisiopatologia Médica / Doutora em Ciências

La capacidad de Mycobacterium tuberculosis para sobrevivir dentro del macrófago contribuye grandemente a su patogenicidad, latencia y persistencia durante la infección. Este bacilo induce alteraciones en el ambiente intrafagosomal e inhibe la maduración del fagosoma, favoreciendo su supervivencia intracelular. M. tuberculosis PknG secuestra al macrófago precisamente al evitar la fusión fagosoma-lisosoma. En este sentido, PknG representa una familia de dianas novedosas para enfrentar la necesidad de nuevos antimicrobianos para la tuberculosis latente. Aquí, apuntamos a: (i) elucidar la base estructural-molecular del ATP y Mg2+ como cofactores de PknG; (ii) caracterizar los parámetros cinéticos que gobiernan la formación del complejo PknG:ATP; e, (iii) identificar péptidos capaces de unirse a PknG para investigar experimentalmente su interactoma usando enfoques combinatorios como “Phage Display”. Nuestros resultados confirman que PknG se une exclusivamente al ATP con una constante de disociación (KD) de 108.8  22.9 µM. El Mg2+ estabiliza térmicamente a PknG de forma ATP-dependiente. Análisis de estado pre-estacionario muestran que la unión y disociación del ATP es rápida en el complejo PknG:ATP. Usando PknGN-Ext, TPR resolvimos la estructura cristalina en el estado unido al ADP mientras que demostramos que el ATP imposibilita la cristalización. Los análisis bioinformáticos de las librerías enriquecidas por Phage Display identificaron 57 potenciales peptidos que interactuarían con PknG. Una comparación cercana con el proteoma de M. tuberculosis proporcionó un subconjunto de 20 proteínas que podrían interactuar con PknG. Nuestros resultados confirmaron cinco proteínas asociadas a PknG previamente reportadas: PknG, DnaK chaperona, transportador ABC Rv1747, Proteína Ribosomal L23 y Factor de Elongación Tu, resaltando la validez de nuestra plataforma para descubrir el interactoma de PknG. Así, nuestros resultados revelan interacciones proteína-proteína putativas que podrían participar en la supervivencia micobacteriana, mientras que también proporcionan bases sólidas para desarrollar drogas antituberculosas al interrumpir estas interacciones o explotar estos peptidos tipo compuesto líder. / The ability of Mycobacterium tuberculosis to survive inside the macrophage greatly contributes to its pathogenicity, latency and persistence during infection. This bacillus induces alterations in the intraphagosomal environment and inhibits phagosome maturation, thus promoting mycobacterial survival. M. tuberculosis PknG hijacks the macrophage precisely by avoiding phagosome-lysosome fusion. In this sense, PknG represents a family of novel targets to cope with the need for new antimicrobials for latent tuberculosis. Here, we aimed to: (i) elucidate the structural-molecular basis of ATP and Mg2+ as PknG cofactors; (ii) characterize the kinetic parameters governing PknG:ATP complex formation; and, (iii) identify PknG-binding peptides to experimentally query PknG’s interactome using combinatorial approach such as Phage Display. Our results confirm that PknG exclusively binds to ATP with a dissociation constant (KD) of 108.8  22.9 µM. Mg2+ thermally stabilizes PknG in an ATP-dependent manner. Pre-steady-state analyses show that ATP binding and dissociation are rapid in the PknG:ATP complex. Using PknGN-Ext, TPR we solved the ADP-state crystal structure while showing that ATP precludes crystallization. Phage Display and bioinformatic analyses identified 57 potential PknG binders. A close comparison to the M. tuberculosis proteome provided a subset of 20 proteins that may interact with PknG. Our results confirmed five previously reported PknG-associated proteins: PknG, DnaK chaperone, ABC transporter Rv1747, Ribosomal Protein L23 and Elongation Factor Tu, highlighting our platform’s validity to uncover the PknG interactome. Altogether, our results reveal putative protein-protein interactions that may play a role in mycobacterial survival, while also providing solid bases for the development of anti-tuberculosis drugs by disrupting these interactions or exploiting these lead-like peptide molecules. / Tesis

Objetivo: avaliar a ingestão de nutrientes no período pré-concepcional e níveis séricos de ácidos graxos, durante a gestação, em gestantes portadoras de fetos com gastrosquise e gestantes portadoras de fetos normais. Métodos: estudo prospectivo caso-controle realizado no período de Julho de 2013 a Julho de 2015 no setor de Medicina Fetal do Hospital das Clínicas. O grupo gastrosquise (GG) foi constituído de 57 gestantes com gestações únicas, idade gestacional inferior a 34 semanas e feto com gastrosquise isolada. O grupo controle (GC) foi constituído de 114 gestantes portadoras de fetos normais pareadas de acordo com idade materna (± 2 anos), idade gestacional (± 2 semanas) e mesma classificação de índice de massa corpórea (IMC) no período pré-concepcional. Os dados referentes ao consumo dietético das gestantes foram obtidos a partir do questionário de frequência e consumo alimentar (QFCA) e o cálculo da ingestão dos nutrientes (macronutrientes; micronutrientes, ácidos graxos e aminoácidos) foi obtido a partir de programas específicos: Dietwin Profissional 2.0® and Virtuanutri®. Para a avaliação de níveis séricos de ácidos graxos (AG), as gestantes foram submetidas à coleta de sangue na entrada no estudo e no momento do parto. A comparação de AG foi realizada durante a gestação e no momento do parto. Com o objetivo de avaliar se as diferenças entre os grupos eram mais frequentes na primeira ou na segunda metade da gestação, uma nova análise foi realizada subdividindo o período gestacional 25 semanas e < 34 semanas. Resultados: no período pré-concepcional, a media diária de calorias ingerida foi maior (2382,43 vs. 2198,81; p = 0,041) no GG em comparação com GC. O consumo médio de metionina (763,89 vs 906,34; p = 0,036), treonina (1248,34 vs. 1437,01; p = 0,018) e crômio (54,66 vs. 59,49 p = 0,014) foi menor no GG em comparação ao GC. Na análise de ácidos graxos, observa-se que o total AG (p = 0,008), AG insaturados (p = 0,002) e a razão C18:1n9/C18:00 (p = 0,021) foi menor no GG em comparação ao GC durante a gestação; entretanto, a razão C16:00 / C18:2n6 (p = 0,018) foi maior no GG em comparação ao GC no mesmo período. Total AG (p = 0,044) e AG insaturados (p = 0,024) foi menor no GG em comparação ao GC no período <= 25 . AG insaturados (p = 0,025) e a razão C18:1n9/C18:00 (p = 0,013) foi menor no GG em comparação ao GC no período > 25 semanas e < 34 semanas. Conclusão: gestantes portadoras de fetos com gastrosquise apresentam dieta de baixa qualidade nutricional, com alto valor calórico e pobre em aminoácidos essenciais, no período pré-concepcional, e baixos níveis séricos de ácidos graxos durante a gestação / Objective: To evaluate the nutrients intake during the preconceptional period and the serum fatty acid levels during the gestation period of pregnant women with fetuses with gastroschisis and pregnant women with normal fetuses. Methods: A prospective case-control study was conducted at the Fetal Medicine Unit at Hospital das Clínicas from July 2013 to July 2015. The gastroschisis group (GG) comprised 57 pregnant women with singleton pregnancies of less than 34 weeks with fetuses with isolated gastroschisis, and the control group (CG) comprised 114 pregnant women with normal fetuses matched for maternal age (± 2 years), gestational age (± 2 weeks), and the same preconceptional body mass index (BMI). Nutritional assessments related to the preconceptional period were obtained using the Food Consumption Frequency Questionnaire and nutrient intakes (macronutrient, micronutrient, fatty acid and amino acid) were calculated using nutrition programs: Dietwin Profissional 20 ® and Virtuanutri ®. For the evaluation of serum fatty acid levels (FA), a blood sample was collected from each subject at the time they entered the study and at the time of delivery. The FA comparison was performed during gestation and at the time of delivery. In order to evaluate whether the differences between both groups were more frequent in the first or second half of gestation, a new analysis was performed, subdividing gesta 25 weeks and < 34 weeks. Results: during the preconceptional period, the median daily calorie intake was higher (2382.43 versus 2198.81; p = 0.041) in the GG than in the CG. The median intakes of methionine (763.89 versus 906.34; p = 0.036), threonine (1248.34 versus 1437.01; p = 0.018) and chromium (54.66 versus 59.49 p = 0.014) were lower in the GG than in the CG. By analyzing the serum fatty acid levels, total FA (p = 0.008), unsaturated FA (p = 0.002) and the C18:1n9/C18:00 ratio (p = 0.021) were lower in the GG than in the CG during gestation; however, the C16:00 / C18:2n6 ratio (p = 0.018) was higher in the GG than in the CG during the indicated period. Total FA (p = 0.044) and unsaturated FA (p = 0.024) were lower in the GG than in the CG at period <= 25 w k , and unsaturated FA (p = 0.025) and the C18:1n9/C18:00 ratio (p = 0.013) were lower in the GG than in the CG at period > 25 weeks and < 34 weeks. Conclusion: Pregnant women with fetuses with gastroschisis have low-nutritional-quality diet, which is both high in calories and poor in essential amino acids during the preconceptional period, and have low serum FA levels during pregnancy