Atualmente, a produtividade do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) pode ser reduzida devido à ocorrência de doenças em todo o território nacional, destacando-se a murcha de fusário, causada por Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli (Fop). No campo, o patógeno é disseminado a longas distâncias através das sementes infectadas e/ou contaminadas e a sua sobrevivência ocorre, principalmente, no solo. Os objetivos deste trabalho foram: avaliar a inibição do crescimento micelial de Fop por Trichoderma spp.; classificar a sensibilidade in vitro de Fop e Trichoderma spp., separadamente, a fungicidas e verificar a compatibilidade entre fungicidas químicos e biológicos para controle de Fop, presente nas sementes e no solo. Para avaliar a inibição do crescimento micelial de Fop, foram utilizados três isolados do patógeno, os quais foram confrontados, in vitro, com três isolados de Trichoderma spp. em testes de cultura pareada e produção de metabólitos voláteis a 20-22°C. Os experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado, com cinco repetições para cada isolado de Trichoderma. Para a classificação da sensibilidade in vitro de Fop e Trichoderma a fungicidas, foram avaliados os mesmos isolados anteriormente utilizados. Foram comparados dez fungicidas, em doses entre 0 a 100 mg L-1 que foram ajustadas de acordo com a CI50 de cada fungicida. Com base na percentagem de inibição do crescimento micelial, foram estimados os valores da concentração inibitória de 50% (CI50) e 100% (CI100) e selecionaram-se os fungicidas compatíveis com Trichoderma spp. A compatibilidade entre tratamentos químico e biológico foi avaliada através da inoculação artificial de sementes de feijão com um isolado de Fop (IAC 11.299-1) e infestação do mesmo no solo. As sementes foram tratadas com os fungicidas fludioxonil, flutriafol e tiofanato metílico, e com os três produtos biológicos, separadamente e em misturas. Avaliou-se o efeito dos tratamentos por meio dos testes de sanidade, germinação, comprimento de plântulas, massa da matéria seca em laboratório e índice de velocidade de emergência e porcentagem de emergência em estufa não climatizada. O efeito protetor dos tratamentos foi verificado através do teste de transmissão do patógeno solo-planta. Todos os isolados de Trichoderma apresentaram antagonismo in vitro contra Fop. No teste de cultura pareada foi observada uma redução de 15 a 20% no crescimento micelial do patógeno. No teste de produção de metabólitos voláteis, o isolado T12-1086G05 foi responsável pela maior inibição do crescimento micelial de Fop (10 a 48%). Os testes de sensibilidade in vitro mostraram que tiofanato metílico, flutriafol e fludioxonil foram compatíveis com Trichoderma (CI50 > 2 mg L-1). Com exceção do flutriafol e do GF 422 isolados e em mistura, todos os tratamentos foram eficientes na erradicação de Fop nas sementes, sem afetar a sua qualidade fisiológica. No teste de transmissão, verificou-se que a incidência de Fop foi de 5 a 40% no hipocótilo e de 5 a 30% nas raízes de feijoeiro provenientes de sementes tratadas com os produtos. / Currently, the common bean (Phaseolus vulgaris L.) productivity can be reduced due to the occurrence of diseases in all over the country, especially Fusarium wilt, caused by Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli (Fop). In the field, the pathogen is spread to long distances through infected and/or contaminated seeds and its survival occurs, mainly, in the soil. The objectives of this work were: to evaluate the micelial growth inhibition of Fop promoted by Trichoderma spp.; to classificate in vitro sensitivity of Fop and Trichoderma spp., separately, to fungicides and to verify the compatibility between chemical and biological fungicides to control Fop, applied on the seeds and on the soil. To evaluate the micelial growth inhibition of Fop, it was used three Fop isolates, which were in vitro confronted with three isolates of Trichoderma spp., by paired culture and antibiosis assays at 20-22°C. The experiments were conducted entirely casualized design, with five replications for each Trichoderma isolate. For the in vitro sensitivity classification, it was evaluated the same isolates of Fop and Trichoderma previously used. It was compared ten fungicides and the concentrations of 0 to 100 mg L-1, which were adjusted according to the IC50 of each fungicide. Based on the percentage of micelial growth inhibition, it was estimated the values of inhibitory concentration of 50% (IC50) and 100% ((IC100) and it was selected the compatible fungicides with Trichoderma spp. The compatibility between chemical and biological treatments were evaluated through artificial inoculation of common bean seeds with the Fop isolate IAC 11.299, following the infestation of the pathogen in the soil. Seeds were treated with fludioxonyl, flutriafol and tiofanate methyl, and with three biological products, separately and mixed. It was evaluated the treatment effects by the following assays: sanity, germination, seedling lenght, seedling dry matter in laboratory conditions and emergence speed rate and percentage of emergence in greenhouse conditions. The protective effect of the treatments was verified through the pathogen transmission experiment from soil to plant. All Trichoderma isolates showed in vitro antagonism against Fop. In the paired culture assay it was observed 15 to 20% reduction in the pathogen micelial growth. In the antibiosis assay, the isolate T12-1086G05 was responsible for the maximum micelial inhibition growth of Fop (10 to 48%). in vitro sensitivity experiments showed that thiofanate methyl, flutriafol and fludioxonyl were compatible with Trichoderma (IC50 > 2 mg L-1). Except the treatments with fluatrifol and GF 422 alone and in mixture, all the products were efficient in eradicating Fop in the seeds, without affect its physiological quality. In the transmission experiment, it was verified that the Fop incidence was 5 to 40% in the hypoticol and 5 to 30% in the common bean roots from seed treated with the products.

O projeto visou aumentar a produção de celulases em fungos T. harzianum IPT 821 e T. reesei QM 9414. Esporos foram submetidos à radiação UV-C. Células das colônias mais capacitadas ao crescimento foram sucessivamente cultivadas em meio solidificado, contendo concentrações progressivamente reduzidas fonte de carbono, de modo a resultar pressão ambiental seletiva e crescente. Após esta etapa as linhagens isoladas foram cultivadas em meio composto por bagaço de cana/farelo de trigo na proporção 80/20, 60% de umidade, 30°C por 72h. Uma linhagem, originária da cepa IPT 821, apresentou atividade de 3,7 FP U/gms, 50% superior em relação à parental: 2,6 U/gms (p=0,001; p<0,05). Análises das frações enzimáticas indicaram uma diferença significativa (p=0,001; p<0,05) na atividade de xilanase: 4,7 U/gms (mutante) e 4 U/gms (parental). Ensaios de hidrólise, Avicel como substrato (1% de sólidos; w/v) indicaram um aumento de quase 70% na hidrólise em 48h, da mutante em comparação à parental (8,7% (mutante) e 4,8% (parental), concentração enzimática de 2,5 FP U/gms). / This project aimed to increase cellulase production in fungi T. harzianum IPT 821 and T. reesei QM 9414. Spores were exposed to UV-C radiation. Colonies were plated and those showing best growth were successively cultivated in plates containing increasingly stress conditions reduced concentrations of the carbon source thus creating a progressive selective pressure. After this pre-selection step isolated strains were cultivated in medium comprising sugar cane bagasse and wheat straw, in the proportion of 80/20 respectively, 60% of moisture, 30°C for 72h. One strain, originated from IPT 821 strain, showed a cellulolytic activity of 3,7 U/gdw; 50% superior to the parental strain: 2,6 U/gdw (p=0,001; p<0,05). Analysis of the enzymatic cocktail showed significant difference (p=0,001; for p <0,05) on xylanase activity: 4,7 U/gdw (mutant strain) and 4 U/gdw (parental strain). Hydrolysis assays, using Avicel as substrate (1% w/v) showed an increase on hydrolysis of about 70%, in 48h (8,7% (mutant strain) and 4,8% (parental strain), enzyme load of about 2,5 U/gdw).

Um dos desafios relacionados à utilização de xilana para a fabricação de biofilmes, aditivos para fabricação de papéis, medicamentos e alimentos é a sua extração na forma polimérica e com alta pureza. Neste trabalho o material de partida para a obtenção de xilana foi o bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado quimio-termomecanicamente com álcali e sulfito, visando aproveitar esta fração, que corresponde a aproximadamente 25% (m/m). A composição química das xilanas no material original foi determinada, bem como o tipo e a proporção dos grupos pendentes. A extração de xilanas do bagaço de cana pré-tratado foi feita utilizando uma endoxilanase recombinante da família GH30, denominada xilanase VI, com mecanismo de ação dependente da presença de ácidos urônicos para a clivagem da cadeia principal de xilana. Partindo-se do DNA genômico de Trichoderma reesei QM6a, que contém o gene da xilanase VI, foi feita a clonagem em um vetor e este foi inserido em Escherichia coli Rosetta-gami, Pichia pastoris e Aspergillus nidulans A773. Os melhores resultados de expressão da xilanase VI foram obtidos em E. coli, porém os estudos com este sistema serão conduzidos em outro trabalho. A xilanase VI expressa em A. nidulans A773 foi parcialmente purificada e exibiu ótimos de atividade em pH 4-5 à 50 oC. Esta xilanase apresentou maior ação em glucuronoxilana de beechwood e em arabinoglucuronoxilana extraída de bagaço de cana, quando comparado à xilana de oat spelts e à medula de cana. Os dados de Km e Vmax em xilana beechwood exibiram valores de 0,783 mg/ml e 0,4675 UI/ml, respectivamente, em 10 min de reação. A extração enzimática do bagaço de cana pré-tratado com sulfito alcalino solubilizou 14% das xilanas e após uma extração alcalina o rendimento aumentou para 32%. A massa molar média das xilanas extraídas na etapa enzimática foi de 4000 Da, produzindo oligossacarídeos em vez de xilobiose ou xilose, mesmo após longos tempos de reação. Esta enzima se mostrou eficaz para a extração de xilanas de cadeias longas quando se comparada às xilanas extraídas por xilanases de outras famílias. / One of the challenges related to the use of xylan for the manufacture of biofilms, papermaking additives, drugs and food is its extraction in polymer form with high purity. In this project, the starting material for xylan isolation was the sugarcane bagasse pretreated with alkali-sulfite chemothermomechanical process, to recover this fraction, which corresponds to approximately 25% (w/w). The chemical composition of original xylans was determined, as well as the type and proportion of the pendant groups. Xylan extraction from pre-treated sugarcane bagasse was performed using a recombinant endoxylanase from the GH30 family, named xylanase VI, with an appendage-dependent mechanism of action for the xylan backbone cleavage. Starting from the genomic DNA of Trichoderma reesei QM6a, which contains the xylanase VI gene, cloning was done in a vector that was inserted into Escherichia coli Rosetta-gami, Pichia pastoris and Aspergillus nidulans A773. The highest xylanase VI expression results were obtained in E. coli, but studies with this system it will be conducted in future works. Xylanase VI expressed in A. nidulans A773 was purified and showed the higher activity at pH 4-5 at 50 oC. This xylanase present higher activities on beechwood glucuronoxylan and on arabinoglucuronoxylan extracted from sugarcane bagasse than on oat spelts xylan and sugarcane pith. Data for Km and Vmax in xylan beechwood showed values of 0.783 mg / ml and 0.4675 IU / ml, respectively, in 10 min of reaction. The enzymatic extraction of alkaline sulphite pretreated sugarcane bagasse solubilized 14% of the xylans followed by an alkaline extraction with yield of 32%. The average molar mass of xylans extracted in the enzymatic step was 4000 Da, producing oligosaccharides instead of xylobiose or xylose, even after long reaction periods. This enzyme proved effective for xylan extraction of long chains when compared to xylan hydrolysates by xylanases from other families.

O fungo filamentoso Trichoderma reesei é uma espécie de grande importância biotecnológica no que tange a degradação de biomassa lignocelulósica para a produção de bioetanol em larga escala. Seu sistema de enzimas celulolíticas é muito eficiente, apesar de ser possuir poucas celulases, sugerindo que o controle dessas enzimas vai além da regulação transcricional. Assim, neste trabalho nós obtivemos o perfil fosfoproteômico de T. reesei cultivado em glicose e bagaço de cana-de-açúcar a partir de análise fosfoproteômica LC-MS/MS por spectral counting. A comparação entre os perfis de fosfoproteínas obtidos das linhagens parental QM6a de T. reesei e dos mutantes knockout para TMK1 e TMK2 permitiu a demonstração de que essas MAPK agem de maneira interconectada com outras vias de transdução de sinal na célula, especialmente a via de TOR e de AMPc-PKA, para regulação da produção de celulases. Além disso, também demonstramos a regulação da resposta a estresse celular por TMK2, e o papel da fosforilação no controle direto de enzimas CAZy. Nossos resultados mostram que a fosforilação desempenha papel importante na regulação dessas enzimas e de outras funções celulares no fungo após a transcrição de seus respectivos genes. O agrupamento desses dados permite melhor entendimento da via de sinalização mediada pelas MAPK TMK1 e TMK2 de T. reesei, e como as modificações pós-traducionais promovidas por elas afetam no sensing de nutrientes celulares e, por consequência, na produção de enzimas celulolíticas, de forma direta ou indireta. / The filamentous fungus Trichoderma reesei has great biotechnological importance in regards to the lignocellulosic biomass degradation for large-scale production of bioethanol. Its cellulolytic system is very efficient, despite being composed by only a few cellulases, which suggests that the control of these enzymes goes beyond their transcriptional regulation. Thus, in this study, we performed a spectral counting LC-MS/MS analysis and achieved the phosphoproteomic profile of T. reesei grown either in glucose or sugarcane bagasse as sole carbon source. The comparison between the phosphoproteins profiles obtained from the parental strain QM6a and the knockout mutants for TMK1 and TMK2 allowed us to demonstrate that these MAPK act in an interconnected manner with other signaling transduction pathways, especially the TOR and cAMP-PKA pathways, in order to regulate the cellulases production. Furthermore, we were also able to determine the regulation of cellular stress response by TMK2, and the role of phosphorylation in the direct control of CAZymes. Our results show that phosphorylation plays an important role on the control of these enzymes and other cellular functions in T. reesei after the transcription of their respective genes. Taken together, this data allows better comprehension of the signaling pathways mediated by TMK1 and TMK2 in T. reesei, and how the post-translational modification promoted by these MAPK might affect the nutrient sensing and, therefore, the production of the cellulolytic enzymes, either directly or indirectly.

Epóxido hidrolases (EHs) são enzimas que catalisam a hidrólise de epóxidos a seus correspondentes dióis, apresentam potencial aplicação biotecnológica (separação de enantiômeros na produção de fármacos), estão envolvidas no metabolismo de ácidos graxos poliinsaturados e inibidores de EHs estão sendo estudados para possível utilização no tratamento de doenças. Uma enzima epóxido hidrolase (TrEH) do fungo filamentoso Trichoderma reesei QM9414 foi clonada, expressa, purificada e caracterizada funcionalmente e estruturalmente. A atividade de TrEH foi determinada com o substrato óxido de estireno (racêmico), demonstrando maior atividade nas temperaturas de 23 a 50 &deg;C, no pH 7,2 a 37 &deg;C, e as constantes cataliticas Km= 4,6 mM e kcat= 336 s-1. A enzima recombinante mostrou ser enantiosseletiva, pois hidrolisa preferencialmente (S)-(-)-óxido de estireno, (R)-(-)- epicloridrina e (S)-(-)-1,2-epoxibutano. Moléculas inibidoras da atividade de TrEH foram identificadas e algumas delas inibem até 60% o crescimento de T. reesei. A estrutura terciária de TrEH (1,7 Å) foi determinada por cristalografia, apresenta dobramento &alpha;/&beta;-hidrolase e não tem alta homologia com nenhuma outra estrutura de EH. TrEH é uma nova enzima epóxido hidrolase solúvel cujas propriedades mostram seu potencial de utilização em aplicações biotecnológicas. / Epoxide hydrolases (EHs) are enzymes that catalyze the hydrolysis of epoxides to their corresponding diols, present a potential biotechnological application (separation of enantiomers for the production of drugs), they are involved in the metabolism of polyunsaturated fatty acids and EH inhibitors are being studied for possible use in the treatment of diseases. An epoxide hydrolase enzyme(TrEH) from the filamentous fungus Trichoderma reesei QM9414 was cloned, expressed, purified and functionally and structurally characterized. The activity of TrEH was determined with the substrate styrene oxide (racemic), showing higher activity at temperatures of 23 to 50 &deg;C, at pH 7.2 at 37 &deg;C, and the catalytic constants Km= 4.6 mM and kcat= 336 s-1. The recombinant enzyme has been shown to be enantioselective, because it preferably hydrolyzes (S)-(-)-styrene oxide, (R)-(-)-epichlorohydrin and (S)-(-)-1,2- epoxybutane. TrEH inhibitors have been identified and some of them inhibit up to 60% growth of T. reesei . The tertiary structure of TrEH (1.7 &Aring;) was determined by crystallography, showing &alpha;/ &beta;-hydrolase folding and low homology with any other EH structure. TrEH is a new soluble epoxide hydrolase enzyme whose properties show its potential for use in biotechnological applications.

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This response occurs through changes in cellular metabolism, activating its defense mechanisms that include the performance of heat shock proteins (Hsp). The objective of this work was to identify the Hsp70 family of Trichoderma asperellum and to analyze the expression of three genes encoding proteins of this family during mycoparasitism and in situations of thermal and ethanol stress. The identification of the T. asperellum Hsp70 proteins was possible from the database analysis (JGI) of the T. asperellum genome, available, but not annotated. We identified a total of 12 proteins from the Hsp70 family in T. asperellum, three of which were selected for gene expression assays. Paired cultivation was carried out between T. asperellum and phytopathogens: Sclerotinia sclerotiorum and Fusarium oxysporum in three phases of mycoparasitism: pre-contact, contact and post-contact. We verified that the expression of Tahsp70a, Tahsp70b and Tahsp70c genes varies according to the phases of the mycoparasitism and the phytopathogen studied. Expression of hsp70 under thermal stress was evaluated at the 38 °C condition for 30 minutes, 1, 2 and 4 hours and at the conditions of 4, 10 and 32 °C for 1 hour. Ethanol stress was also performed for 1 hour. During the thermal stress Tahsp70a and Tahsp70b presented higher induction and the Tahsp70c gene had its highest induction in the cold shock at 4 °C. In ethanol stress the analyzed genes did not present significant expression. / O gênero Trichoderma ssp, constitui hoje o grupo de espécies de fungos mais estudadas e comumente usadas para atuar na agricultura como controle biológico contra fitopatógenos. Seu rápido crescimento micelial, associado a alta produção de conídios, síntese de diversos antibióticos e capacidade de viver de diversas formas (saprotrófica, simbionte ou micoparasita) são características que o tornam atraente para esse fim. A relação de micoparasitismo, bem como as oscilações nas condições ambientais, geram naturalmente estresse sobre as células desse fungo e consequente resposta ante o agente estressante. Esta resposta ocorre através de mudanças no metabolismo celular, ativando seus mecanismos de defesa que incluem o desempenho de proteínas de choque térmico (Hsp). O objetivo deste trabalho foi identificar a família Hsp70 de Trichoderma asperellum e analisar a expressão de três genes codificando proteínas desta família durante o micoparasitismo e em situações de estresse térmico e estresse por etanol. A identificação das proteínas Hsp70 de T. asperellum foi possível a partir de análises em banco de dados (JGI) do genoma de Trichoderma asperellum, disponível, mas não anotado. Identificamos no total 12 proteínas da família Hsp70 em T. asperellum, sendo três selecionadas para ensaios de expressão gênica. Foi realizado cultivo pareado entre T. asperellum e os fitopatógenos: Sclerotinia sclerotiorum e Fusarium oxysporum em três fases do micoparasitismo: pré-contato, contato e pós-contato. Verificamos que a expressão dos genes Tahsp70a, Tahsp70b e Tahsp70c varia de acordo com as fases do micoparasitismo e do fitopatógeno estudado. A expressão dos genes hsp70 em estresse térmico, foi avaliada na condição de 38 °C durante 30 minutos, 1, 2 e 4 horas e nas condições de 4, 10 e 32 °C por 1 hora, O estresse por etanol também foi realizado por 1 hora. Durante o estresse térmico, Tahsp70a e Tahsp70b apresentaram maior indução sendo que o gene Tahsp70c teve sua maior indução no choque frio à 4 °C. No estresse por etanol os genes analisados não apresentaram expressão significativa.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / A investigaÃÃo do potencial quÃmico de Trichoderma harzianum, um fungo antagonista, foi realizada. A composiÃÃo de Ãcidos graxos produzidos pelo fungo cultivado em Czapeck, peptona e caldo de batata, variando a fonte de carbono (glicose e manitol), nesse Ãltimo meio, foi determinada por CG/EM. Foram identificados os seguintes Ãcidos graxos na forma dos seus Ãsters metÃlicos: hexadecanÃico (C16:0), octadecanÃico (C18:0), 9-octadecenÃico (C18:1) e 9,12-octadienÃico (C18:2). Dos extratos orgÃnicos do fungo cultivado em peptona por 16 dias e BD (Batata-dextrose) por 24 dias foi possÃvel isolar o manitol e o composto antimicrobiano viridiofungina A, respectivamente. Extratos e fraÃÃes foram submetidos a testes antitumorais frente Ãs linhagens tumorais humanas MDA-MB435 (mama), HCT-8 (cÃlon) e SF-295 (glioblastoma) e cinco das fraÃÃes testadas apresentaram CI50 75% em pelo menos duas linhagens tumorais. A atividade alcooldesidrogenases (ADHs) de T. harzianum foi identificada e o microrganismo foi empregado como biocatalisador na reduÃÃo da (R)- carvona, acetofenona e seis alquilfenonas. Na maioria dos casos, os produtos de biorreduÃÃo foram obtidos. / The chemical potential of Trichoderma harzianum, an antagonist fungus, was investigated. The fatty acid composition of this fungus grown in Czapeck, peptone and potato, with different carbon source (glycose and manitol) in the later medium, was determined after GC/MS analysis. The following fatty acids, as their methyl esters, were identified: hexadecanoic (C16:0), octadecanoic (C18:0), 9-octadecenoic (C18:1) and 9,12-octadienoic (C18:2). From the organic extracts of the microorganism cultivated in peptone (16 days) and potatodextrose (21 days) broths, manitol and the antimicrobial viridiofungin A were isolated, respectively. Extracts and fractions were submitted to antitumor assays against the human cell tumor lines MDA-MB435 (mama), HCT-8 (colon) e SF-295 (glioblastoma) and five of them showed IC50 75 % in two or three cell lines. Alcohol dehydrogenases (ADHs) activity of T. harzianum was identified and this microorganism was used as biocatalyst in the reduction of (R)-carvone, acetophenone and six akylphenones. In most cases, the products of the bioreductions were obtained.

Celulases têm atraído muito interesse nos últimos anos devido a sua habilidade na bioconversão de material lignocelulolítico em glucose, a qual pode, então, ser convertida a etanol por fermentação. O complexo celulolítico capaz de degradar a celulose consiste de várias enzimas (principalmente celulases e &beta;-glucosidases) e proteínas auxiliadoras, que atuam em sinergismo para eficientemente hidrolizar a biomassa. Nesse estudo, investigou-se a hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado utilizando enzimas produzidas por T. harzianum e enzima comerial. O rendimento de hidrólise foi avaliado quanto a diferentes níveis de deslignificação de biomassa, graus de cristalinidade da celulose, composição dos coquetéis enzimáticos e adição de BSA. Estudos de difração de raios-X mostraram que a cristalinidade da lignocelulose não é um fator determinante na recalcitrância ao ataque enzimático. Além disso, a adição de BSA não teve qualquer efeito no rendimento da hidrólise. O mais eficiente coquetel enzimático foi obtido misturando o preparado comercial com o produzido pelo T. harzianum (rendimento acima de 97%). Esse desempenho está, provavelmente, relacionado com níveis adequados de &beta;-glucosidases e xilanases no coquetel. Devido a essa eficiente atividade celulolítica, o fungo T. harzianum tem um grande potencial em aplicação para hidrólise de biomassa. A celobiohidrolase I, uma exoglucanase, é a principal enzima secretada por esse fungo (cerca de 60% do total) e nesse estudo ela foi expressa em bioreator, purificada por cromatografia de troca iônica seguida de gel filtração e caracterizada bioquímica, biofísica e estruturalmente. Conforme confirmado por SAXS, tanto a CBHI inteira quanto seu domínio catalítico, obtido por digestão parcial com papaína, são monoméricos em solução e apresentam distância máxima (DMax) de 110 e 60 &Aring;, e raio de giro (Rg) de 20 e 27 &Aring;, respectivamente. Os resultados indicam que o linker é flexível em solução e confirmam o formato de girino da enzima. A CBHI possui atividade máxima em pH 5.0 e temperatura de 50 &deg;C, com atividade específica contra Avicel &reg e pNPC de 0,28 and 1,53 U/mg, respectivamente. Outras celulases de interesse foram também expressas para caracterização, no entanto, para essas, foi utilizado o sistema de expressão heteróloga em Aspergillus Níger ou Pichia pastoris. O domínio catalítico da endoglucanase I de T. harzianum foi expresso em A. Níger. A proteína tem atividade específica contra CMC de 15,8 U/mg e pH e temperatura ótima de 3 e 50 &deg;C, respectivamente. A proteína é estável nessas condições em até 3 dias de incubação (dados de ensaios de atividade residual). Estudos biofísicos de deslocamento térmico e dicroísmo circular apresentaram alguns parâmetros de estabilidade de estrutura terciária e secundária, respectivamente. A proteína perde estrutura terciária regular, em pH 5, em torno de 30 &deg;C mas sua estrutura secundária é desordenada somente em pH 9 (quando a 25 &deg;C). Experimentos de dicroísmo circular também indicaram a composição de estrutura secundária do domínio catalítico da EGLI de 6% de &alpha;-hélice e 42% de folhas- &beta;. / Cellulases have attracted an outstanding interest in the recent years because of its ability in the bioconversion of cellulose-containing raw materials into glucose, which can then be converted into ethanol by fermentation. The cellulase complex able to degrade cellulose consists of several enzymes (mainly cellulases and &beta;-glucosidases) and auxiliary proteins, which act in synergism to efficiently solubilize the biomass. In this study, we investigated the enzymatic hydrolysis of pretreated sugarcane bagasse using crude enzyme extracts produced by Trichoderma harzianum as well as from the extract in combination with a commercial cocktail. The influence of different levels of biomass delignification, degree of crystallinity of lignicellulose, composition of enzymatic activities and BSA on enzymatic hydrolysis yields was evaluated. Our X-ray diffraction studies showed that crystallinity of lignocellulose is not a key determinant of its recalcitrance toward enzymatic hydrolysis. In fact, under the experimental conditions, an increase in crystallinity of lignocellulosic samples resulted in increased glucose release by enzymatic hydrolysis. Furthermore, under the same conditions, the addition of BSA had no significant effect on enzymatic hydrolysis. The most efficient enzyme blends were obtained by mixing a commercial enzymatic cocktail with T. harzianum cellulase preparations (above 97%). Increased hydrolytic efficiencies appeared to correlate with having an adequate level of both &beta;-glucosidase and xylanase activities in the blends. Due to its elevated cellulolytic activity, the filamentous fungus T. harzianum has a considerable potential in biomass hydrolysis applications. The cellobiohydrolase I, an exoglucanase, is the main enzyme secreted by this fungus (about 60% of total) and in this study we have expressed, purified and performed an initial biochemical, biophysical and structural characterization. As confirmed by small angle X-ray scattering (SAXS) both full-length CBHI and its catalytic core domain (CCD), obtained by partial digestion with papain, are monomeric in solution and they have Dmax of 110 and 60 &Aring;, and Rg of 20 and 27 &Aring;, respectively. The results indicate that the linker is flexible in solution and confirmed the tadpole shape of the enzyme. CBHI displays maximum activity at pH 5.0 and temperature of 50 &deg;C, with specific activities against Avicel &reg and pNPC of 0,28 and 1.53 U/mg, respectively. Other celulases were also expressed, however, for them we have used the heterologous expression system in Aspergillus niger and Pichia pastoris. The catalytic domain of endoglucanase I from T. harzianum was expressed in A. niger and partially characterized. The protein has specific activity against CMC of 15.8 U/mg and optimum pH and temperature of 3 and 50 &deg;C, respectively. The protein is stable in these conditions until 3 days of incubation. Biophysical studies of termal shift and circular dichroism (CD) assays have showed some parameters of stability of tertiary and secondary structure of the protein. It loses regulary terciary structure in pH 5 around 30 &deg;C but the secondary structure is desordened only in pH 9 at 25 &deg;C. CD experiments also indicated the secondary structure compsition of the catalytic domain of EGLI: 6% de &alpha;-helices and 42% de &beta;-sheet.

Submitted by Celso Magalhaes (celsomagalhaes@ufrrj.br) on 2017-05-12T11:45:17Z No. of bitstreams: 1 2013 - Aldir Carlos da Silva.pdf: 2147745 bytes, checksum: 9bf6569c9f3905b19282cebf10a5b003 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T11:45:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013 - Aldir Carlos da Silva.pdf: 2147745 bytes, checksum: 9bf6569c9f3905b19282cebf10a5b003 (MD5) Previous issue date: 2013-12-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / The present study was conducted to evaluate if changes in rhizosphere pH of the growth media, controlled by the use of nitrogen sources could alleviate aluminum toxicity or effects caused by salinization. It is well documented that if a plant is absorbing and assimilating nitrate as a nitrogen source, it releases 0H - for growth substrate. If she is absorbing, assimilating, ammonia source releases H+. This occurs because the cells need to balance its electrochemical charge balance due to differential uptake of cations and anions. Despite being a general rule, scientific research directly use the nitrogen source in the growth medium, few have used other methods to add these sources, such as foliar application of nitrogen and its implications on load balancing. In this work, several alternative management of nitrogen application and its interactions with the toxicity caused by aluminum, excess salts and Trichoderma were studied. Sunflower (Helianthus annuus L.), Passionflower (Passiflora edulis f flavicarpa L.), Pineapple (Ananas comosus Merril), Coffee (Coffea arabica L), Almond (Terminalia catapa Linn) and Sombrero (Clitoria fairchildiana Howard). To conduct studies with plants Sunflower was initially performed a selection of more tolerant to acidity and salinity plants. The experiments were conducted on various substrates, soil and sand, simple and complete nutrient solution. The interaction between Trichoderma x nitrogen source for plants was conducted with Passion fruit and Sunflower. Were selected as moderately tolerant to aluminum to grow Sunflower Helium 360 , the other cultivars to toxicity occurred in contraction equal to or superior 160?M aluminum . Was selected as tolerant to salinity the H?lio 251 > 250 > 253, cultivars, with concentrations above 25 mM NaCl (1.90 dS.m?) plants were stop grown. After this step prior experiments cultivars tolerant or sensitive were used in accordance with the experimental needs. The experiments were divided into the following steps: In the first step, we evaluated the release of OH - / H + with application of nitrogen sources directly in the growth medium, and found that the nitrogen sources were unable to minimize the toxic effects of aluminum and salinity. In the second experiment, the effects of the release OH- /H+ with application of nitrogen sources in the association of the fungus Trichoderma sp. This fungus grown in petri dishes only at pH values above 5.0. The release of OH- / H+ did not influence the association of the fungus with the roots of plants of sunflower and Passion fruit. In the third step, we assessed whether foliar application of nitrogen sources could produce the same effects on efflux of loads in the rhizosphere. It was found that the nitrogen sources applied foliar increased the pH of the solution was applied when 10 % of nitrate and reduced the pH when applied 5 % and 10 % ammonium sulfate in plants of Coffee and 10 % of nitrate in Sunflower . The foliar application of nitrogen sources did not alter the toxicity of aluminum and not the salt effect on plants and Sunflower Coffee. / O presente trabalho foi realizado com o objetivo de estudar se varia??es do pH da rizosfera e do meio de crescimento, controladas pelo uso de fontes nitrogenadas, poderiam amenizar a toxidez de alum?nio ou os efeitos provocados pela saliniza??o. Na literatura cientifica ? bem documentado que se uma planta esta absorvendo e assimilando nitrato como uma fonte nitrogenada, ela libera 0H- para o substrato de crescimento. Se ela esta absorvendo e assimilando uma fonte amoniacal libera H+. Isto ocorre devido ?s c?lulas necessitarem equilibrar o seu balan?o eletroqu?mico de carga, devido ? assimila??o diferenciada de c?tions e anions. Apesar de ser uma regra geral, os trabalhos cient?ficos usam a fonte nitrogenada diretamente no meio de crescimento, poucos utilizaram outros m?todos de adicionar estas fontes, como por exemplo, a aplica??o foliar de nitrog?nio e suas implica??es no balan?o de carga. Neste trabalho foram estudadas diversas alternativas de aplica??o de nitrog?nio e as suas intera??es com a toxidez provocada por alum?nio, excesso de sais e com o fungo Trichoderma. Foram estudas diversas plantas: Girassol (Helianthus annuus L), Maracuj? (Passiflora edulis f. flavicarpa L.), Abacaxi (Ananas comosus Merril), Caf? (Coffea arabica L), Amendoeira (Terminalia catapa Linn) e Sombreiro (Clitoria fairchildiana Howard). Para realizar os estudos com plantas de Girassol foi realizada inicialmente uma sele??o de plantas mais tolerantes a acidez e a salinidade. Os experimentos foram realizados em diversos substratos, solo, areia, solu??o nutritiva simples e completa. A intera??o entre fungo Trichoderma x fonte nitrogenada foi realizado para plantas de Girassol e Maracuj?. Foram selecionadas como medianamente tolerantes ao alum?nio a cultivar de Girassol H?lio 360, as demais cultivares a toxidez ocorreu em contra??o igual ou superiora 160?M de alum?nio. Foi selecionada como tolerante a salinidade as cultivares H?lio 251>250>253, com concentra??es acima 25mM de NaCl (1,90 dS.m?) as plantas n?o cresceram.Ap?s esta etapa foram implantados experimentos com as cultivares previamente selecionas como sens?veis ou tolerantes e estas foram utilizadas de acordo com a necessidade experimental. Os experimentos foram divididos nas seguintes etapas: Na primeira etapa, avaliou-se a libera??o do OH-/H+ com aplica??o das fontes nitrogenadas diretamente no meio de crescimento, sendo verificado que as fontes nitrogenadas n?o conseguiram minimizar os efeitos t?xicos do alum?nio e da salinidade. Na segunda etapa, avaliou-se os efeitos libera??o do OH-/H+ com aplica??o das fontes nitrogenadas na associa??o do fungo Trichoderma. Este fungo cresceu em placas de petri somente em valores de pH acima de 5,0. A libera??o de OH-/H+ n?o influenciou a associa??o do fungo com as ra?zes de plantas de Girassol e Maracuj?. Na terceira etapa, foi avaliado se a aplica??o foliar das fontes nitrogenadas poderia produzir os mesmos os efeitos nos efluxos de cargas na rizosfera. Foi verificado que as fontes nitrogenadas aplicadas via foliar aumentaram o pH da solu??o quando foi aplicado 10% de nitrato e reduziram o pH quando foi aplicado 5% e 10% de sulfato de am?nia em plantas de Caf? e com 10% de nitrato em Girassol. A aplica??o foliar de fontes nitrogenadas n?o alteraram a toxidez de alum?nio e nem do efeito salino em plantas de Caf? e Girassol.

Orientador: Carlos Alexandre Costa Crusciol / Banca: Gabriela Ferraz de Siqueira / Banca: Rafaela Rossetto / Banca: Gustavo Pavan Mateus / Banca: Sergio Gustavo Quassi de Castro / Resumo: Inúmeros são os patógenos que reduzem a produção da cana-de-açúcar, em particular os fitonematoides apresentam grande importância. Em campo, os sintomas de ataque de nematoides são reboleiras de plantas raquíticas e cloróticas, murchas nas horas mais quentes do dia e menos produtivas. Na tentativa de diminuir as populações de nematoides abaixo do nível de dano econômico, vários métodos de controle, em integração, têm sido pesquisados, dentre eles está o controle químico, biológico e adição de matéria orgânica ao solo. Objetivou-se, por meio do presente estudo, avaliar os efeitos estimulantes de crescimento de plantas de cana-de-açúcar pela aplicação de Trichoderma asperellum, Bacillus subtilis e Bacillus methylotrophicus no controle biológico de nematoides, em área sem e com aplicação de torta de filtro. O experimento foi conduzido em cana planta, soca e soca de 4o corte, nos anos agrícola de 2015/16 e 2016/17, em áreas pertencente à Usina da Barra, Grupo Raízen Energia S/A. O delineamento experimental utilizado foi em blocos casualizados, com quatro repetições: sendo em esquema fatorial 2x5, para cana planta e soca, constituído do fator torta de filtro (1 - sem e 2 - com) combinado com o fator nematicida (1 - controle, 2 - carbofurano, 3 - Quality + Rizos, 4 - Quality + Onix, 5 - Quality + Onix + Rizos), e apenas do fator nematicida para cana soca de 4o corte. As avaliações realizadas foram: teores foliares de macronutrientes, avaliações biométricas (altura, diâmetro, número... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: There are many pathogens that reduce the sugarcane production, especially the phytonematodes are of great importance. In the field, the nematode attack symptoms are the formation of reeds and stunted and chlorotic plants, wilted in the hottest hours of the day and less productive. In order to reduce nematode populations to a minimum level of economic damage, several integration methods have been researched, including chemical, biological control and addition of organic matter to the soil. The objective of this study was to evaluate the growth stimulating effects of sugarcane plants by the application of Trichoderma asperellum, Bacillus subtilis and Bacilus methylotrophicus in the biological control of nematodes, in an area without and with application of filter cake. The experiment was carried out in sugarcane plant, sugarcane ratoon and 4th ratoon, in the agricultural years of 2015/16 and 2016/17, in areas belonging to the Usina da Barra, Grupo Raízen Energia S/A. The experimental design was a randomized complete block design, with four replications: a 2x5 factorial scheme for sugarcane plant and ratoon, consisting of filter cake factor (1 - without and 2 - with) combined with nematicidal factor (1 - control, 2 - carbofuran, 3 - Quality + Rizos, 4 - Quality + Onix, 5 - Quality + Onix + Rizos), and only the nematicidal factor for sugarcane 4th ratoon. The evaluations were: foliar macronutrient contents, biometric evaluations (height, diameter, number of stalks per meter, mean internode length, number of internodes and shoot yield) and technological (pol, purity, fiber, reducing sugar, total sugar recoverable and sugar production). The incorporation of filter cake into the soil contributed to increases in crop productivity through the addition ... / Doutor