Fungos da espécie Trichoderma harzianum são estudados como agentes de controle biológico de fitopatógenos que habitam o solo, sendo sua estratégia um processo complexo que pode ocorrer por diferentes mecanismos ou uma combinação deles, incluindo micoparasitismo. Neste trabalho, foram analisadas consequências da deleção do gene que codifica a proteína Epl-1, descrita como elicitora de resistência em plantas nos processos de: modulação da expressão de genes envolvidos no processo de micoparasitismo de T. harzianum contra o fungo fitopatogênico Sclerotinia sclerotiorum; estabelecimento do processo de micoparasitismo; interação entre T. harzianum e plantas de feijão comum. Os resultados mostram que a deleção do gene epl-1 alterou a modulação da expressão de todos os genes relacionados ao processo de micoparasitismo analisados. Além disso, Epl-1 apresentou um papel no processo de modulação de expressão desses genes em T. harzianum, no reconhecimento da própria parede celular e da parede de diferentes hospedeiros, na interação com fitopatógenos hospedeiros, no processo de formação de estruturas de micoparasitismo, bem como na indução de resistência local e sistêmica em plantas de feijão comum / Fungal species Trichoderma harzianum, are studied as soilborne plant pathogens biological control agent and its strategy is a complex process, which can occur by different mechanisms or a combination thereof, including mycoparasitism. In this work, the consequences of epl-1 gene deletion, which encoding for Epl-1 protein, described as plants resistance elicitor, were analyzed on: modulation of gene expression involved in T. harzianum mycoparasitism process against phytopathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum; mycoparasitism establishment process and T. harzianum interaction with bean plants. The results showed that epl-1 encoding gene deletion altered the expression modulation of all analyzed genes related to mycoparasitism process. Furthermore, Epl-1 presented a role in modulating expression of these genes in the process of self and host cell wall recognition; the interaction with host plant pathogens in formation of mycoparasitism structures as well as local and systemic resistance in beans plants

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cucumis melo is one of the most important horticultural species representing the family Cucurbitaceae, moreover, it is the leader fruit concerning value and volume of exportation in Brazil. As in other cultures, both physiological and health quality of seeds used in the crop establishment are critical to ensure an appropriate population of plants and with high quality and productivity. Treatment of seeds is employed in order to protect them against pathogens, as well as, to accelerate and uniform their germination. Thus, this study aims to evaluate the physiological and health quality of melon seeds, cv. Gaúcho Redondo‟, treated with chemical fungicides, biocontrol agents, micronutrients and polymer. Application rates followed recommendations described by manufacturers. Evaluation of physiological traits was undertaken by means of germination, seedlings length, cold storage, germination at low temperatures, greenhouse emergence and emergence speed index tests. Health quality tests, by the other hand, were determined by Blotter test , transmission and pathogenicity of Fusarium spp. isolated from melon seeds. Treatments with micronutrients, purely or combined with polymer coating, incremented in seed germination, as well as, the emergence and the emergence speed index. Trichoderma spp. also provided a significant increase in the first count and germination. The fungicide Captan® acted efficiently on Fusarium spp. present in the seeds, though it had not been totally eradicated. This pathogen associated with melon seeds did not affect the germination process of them. / Cucumis melo é uma das principais hortaliças representantes da família Cucurbitaceae, além disso, é a fruta líder em valor e volume de exportação no Brasil. Como em todas as culturas, a qualidade fisiológica e sanitária das sementes utilizadas na implantação da lavoura é fundamental para garantir uma população adequada de plantas e com elevada qualidade e produtividade. O tratamento de sementes é utilizado para promover a proteção das sementes contra patógenos causadores de doenças e proporcionar uma germinação mais rápida e uniforme. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a qualidade fisiológica e sanitária das sementes de melão, cultivar Gaúcho Redondo, após tratamento das mesmas com fungicidas químicos, agentes de biocontrole, micronutrientes e polímero. As doses de aplicação dos produtos seguiram as recomendações dos fabricantes e as avaliações da qualidade fisiológica das sementes foram realizadas através do teste de germinação, comprimento de plântulas, teste de frio, germinação a baixas temperaturas, emergência em casa de vegetação e índice de velocidade de emergência. Já a qualidade sanitária foi determinada pelo teste de sanidade, transmissão e patogenicidade de isolados de Fusarium spp. obtidos das sementes de melão. Os tratamentos com micronutrientes, isolados ou com recobrimento de polímero, promoveram incremento na germinação das sementes, assim como na emergência e no índice de velocidade de emergência. Trichoderma spp. também proporcionou aumento significativo na primeira contagem e na germinação. O fungicida Captan® atuou de forma eficiente no controle de Fusarium spp. presente nas sementes, embora não tenha erradicado totalmente. Este patógeno, associado às sementes de melão, não interferiu no processo germinativo das mesmas.

O presente trabalho tem como objetivo estudar alternativas de controle químico e biológico de isolados de Pythium para aplicação na formação de mudas de tabaco. Estudou-se por meio de bioensaios a compatibilidade de duas cepas de Trichoderma harzianum (ESALQ 1306 e 1316) com sete fungicidas. Os mesmos fungicidas foram avaliados quanto à capacidade de inibição de quatro isolados de Pythium spp. A atividade antagônica das cepas de T. harzianum foram testadas in vitro, em três momentos de inoculação a 23 e 28ºC para quatro isolados de Pythium spp. A eficiência de controle in vivo de Pythium sp., bem como germinação, massa seca e mudas aptas foram avaliadas em condições de casa de vegetação, com os fungicidas químicos Ridomil Gold MZ e Infinito, e biológicos Trichodermil 1306 e o produto experimental Trichodermil 1316. As cepas de T. harzianum apresentaram compatibilidade com todos os fungicidas testados. Todos os isolados de Pythium foram inibidos pelos fungicidas Censor, Amistar WG 500, Infinito e Ridomil Gold MZ em ensaios. A cepa ESALQ 1316 apresentou maior eficiência de inibição dos isolados de Pyhtium, em cultivo pareado, sendo 100% eficiente, independente do momento de inoculação, após 14 dias. Isoladamente o Trichodermil cepa ESALQ 1306 foi mais eficiente que o produto experimental Trichodermil cepa ESALQ 1316 no controle de Pythium sp. em mudas de tabaco. A combinação do Ridomil Gold MZ ou Infinito com o Trichodermil 1316 apresentou maior eficiência de controle de Pythium sp. quando comparada ao agente de biocontrole isoladamente em mudas de tabaco. / The present work aims to study alternatives for chemical and biological control of Pythium isolates for application in tobacco seedlings. It was studied by bioassays the compatibility of two strains of Trichoderma harzianum (ESALQ 1306 and 1316) with seven fungicides. The same fungicides were evaluated for their ability to inhibit four isolates of Pythium sp. The antagonistic activity of strains of T. harzianum were tested in vitro on three different occasions inoculation at 23 and 28 º C for four isolates of Pythium sp. The control efficiency in vivo of Pythium sp. and germination, seedling dry weight and suitable conditions were evaluated in a greenhouse with chemical fungicides Ridomil Gold MZ and Infinito, and biological products, Trichodermil 1306 and Trichodermil 1316. The strains of T. harzianum showed compatibility with all fungicides tested. All the isolates of Pythium were inhibited by fungicides Censor, Amistar WG 500, Infinito and Ridomil Gold MZ in trials. The strain ESALQ 1316 was more efficient inhibition of isolates Pyhtium in paired culture, being 100% effective, regardless of time of inoculation, after 14 days. On average Trichodermil 1306 was more efficient than the experimental product Trichodermil 1316 in the control of Pythium sp. in tobacco seedlings. The combination of Ridomil Gold MZ or Infinito with Trichodermil 1316 was more effective control of Pythium sp. compared with the biological control agent alone in tobacco seedlings.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4498.pdf: 2023528 bytes, checksum: b6d98480ef338423f24d2704afae90bd (MD5) Previous issue date: 2012-06-29 / Universidade Federal de Minas Gerais / The use of alternative and renewable fuels is vital to solve the problems derived from the dependence of fuels, and the vegetal biomass is the only renewable source available in large scale that can be converted in energy. The bioethanol production has demonstrated a huge potential to minimize the environmental changes resultant from fossil fuels consumption. Nevertheless, the production costs of cellulolytic complexes lays out one of the major obstacle of the economical viability of the second generation ethanol. Therefore, the bioprospection and the understanding of enzymes involved in the process can improve the complexes productivity. Xylanases are enzymes used in several biotechnological processes, primordially for biopulping and biobleaching in papel industries. However, current surveys have investigated these enzymes due to an accessory role for bioethanol production. In this study, an endoxylanase (xyn3) gene from Trichoderma harzianum was cloned into Pichia pastoris. The constitutive vector pGAPZαA was used, changing the α-factor by the native signal peptide of the enzyme, and with a 6xHisTag at C-terminus. The recombinant protein were expressed in two majority forms, one with a molecular mass of 35 kDa (non-glycosylated) and the other with 60 kDa (glycosylated). Both forms showed xylanolytic activity in zymogram and were biochemically analyzed. The enzymes present optimal temperature of 40°C and pH 6.5, and stable activity until 30°C. The glycosylation plays important role in the enzymatic kinects of the recombinant enzyme, showing a catalytic efficiency twice higher of glycosylated form, in comparison with the activity of the non-glycosylated form. Even in this study, the effects of cellulose and xylan on the regulation of expression of the xyn2, xyn3 and egl3 genes were investigated to T. harzianum. All studied genes were overexpressed under all induction conditions and the results indicate a higher and earlier expression of these genes in fungus induction using a mixture of cellulose and xylan. Furthermore, an advance in the period of induction was observed while the fungus was cultivated with steam explosed bagasse supplemented with endoxylanase 3, when compared with the pure bagasse utilization. These findings enhance the vii understanding of enzymatic mode of action involved in deconstruction of plant cellular wall, whick can be used in the second generation ethanol production. / A utilização de combustíveis alternativos e renováveis é vital para resolver os problemas derivados da dependência de combustíveis fosseis, e a biomassa vegetal é a única fonte renovável disponível em larga escala que pode ser convertida em energia. A produção de bioetanol tem demonstrado um enorme potencial para minimizar as alterações ambientais resultantes do consumo de combustíveis fósseis. No entanto, os custos de produção de complexos celulolíticos constituem um dos maiores obstáculos da viabilidade econômica do etanol de segunda geração. Portanto, a bioprospecção e a compreensão das enzimas envolvidas no processo podem melhorar a produtividade dos complexos. Xilanases são enzimas usadas em vários processos biotecnológicos, primordialmente para biopolpação e biobranqueamento nas indústrias de papel e celulose. No entanto, as pesquisas atuais têm buscado por estas enzimas devido a um papel acessório na produção de bioetanol. Neste estudo, uma endoxilanase (xyn3) de Trichoderma harzianum foi clonada em Pichia pastoris. O vetor de expressão constitutivo pGAPZαA foi usado, alterando-se o factor-α pelo peptídeo sinal nativo da enzima, e com uma sequência 6xHisTag no C-terminal. A proteína recombinante foi expressa em duas formas majoritárias, uma com uma massa molecular de 35 kDa (não-glicosilada) e a outra com 60 kDa (glicosilada). Ambas as formas mostraram atividade xilanolítica em zimograma e foram analisadas bioquimicamente. As enzimas mostraram temperatura ótima de 40°C e pH 6,5, e com atividade estável até aproximadamente 30°C. A glicosilação apresentou um papel importante na cinética enzimática da enzima recombinante, que mostrou uma eficiência catalítica duas vezes mais elevada em sua forma glicosilada, em comparação com a atividade da forma não-glicosilada. Ainda neste estudo, foram investigados os efeitos de celulose e xilana na regulação da expressão dos genes xyn2, xyn3 e egl3 no T. harzianum. Todos os genes estudados foram superexpressos sob todas as condições de indução e os resultados indicaram uma expressão mais elevada e precoce destes genes utilizando-se uma mistura de celulose e xilana. Além disso, um avanço no período de indução foi observado quando o fungo foi cultivado com bagaço explodido suplementado com endoxilanase 3, quando comparado com a utilização do bagaço v puro. Estes resultados contribuem para o entendimento do mecanismo de ação do sistema enzimático envolvido na desconstrução da parede celular vegetal, o qual pode ser utilizado na produção do etanol de segunda geração.

Considerando o potencial biotecnológico do fungo Trichoderma harzianum no processo de metabolização de compostos xenobióticos e sua resistência a metais pesados, o presente trabalho teve como finalidade estabelecer conhecimentos bioquímicos e ultraestruturais associados ao processo de remoção de cádmio. O microrganismo foi cultivado em meio contendo diferentes concentrações de cádmio: 1mM, 2mM e 3mM. O perfil de crescimento foi estabelecido em função da biomassa produzida, do consumo de glicose e fosfato, conteúdo intracelular de polifosfato, atividade das enzimas fosfatases ácida e alcalina, perfil de proteínas totais e remoção do metal. Os resultados obtidos sugerem efeitos do metal sobre o crescimento do organismo em diferentes meios de cultura. O crescimento em meio padrão revela a tolerância do organismo frente a altas concentrações de cádmio, e que tal cultivo induz variações no consumo de glicose e atividade das fosfatases. A utilização da microscopia óptica revelou variação na morfologia do organismo como resposta a variação do meio de cultivo e da presença e ausência do metal. Modificações relativas a processo de ramificação, textura e espessura das hifas foram visualizadas. Os aspectos ultraestruturais através de varredura demonstraram que T. harzianum cultivado na presença de cádmio apresentou variações associadas a eletrondensidade, densidade micelial, maior ramificação e menor número de clamidósporos. A análise do perfil de proteínas totais revelou que o cultivo em cádmio induziu a diminuição do conteúdo de proteínas dependendo da concentração. O isolado foi capaz de acumular polifosfato, e a presença do metal induziu a degradação do polímero em função da concentração. A remoção de cádmio do meio foi avaliada, revelando variação em função da concentração. Os resultados demonstram o efeito do cádmio sobre T. harzianum, pela primeira vez, e demonstram o potencial do microrganismo em acumular polifosfato e sua possível aplicação na remediação de metais pesados / Considering the biotechnological potential of Trichoderma harzianum in the xenobiotic metabolization and its resistance to heavy metals, the aim of this work was to evaluate the utrastructural and biochemical behavior related to cadmium tolerance and removal. The microorganism was grown in different media, containing 1mM, 2mM and 3mM of cadmium. Aspects of the growth profile was obtained by biomass production, glucose consumption, acid and alkaline phosphatase activities, morphology by optical microscopy, ultrastructure by scanning electron microscopy, total protein profile, polyphosphate acumulation and metal removal were evaluated. The results obtained revealed the inhibitory effects of the heavy metal on the microbial growth and the aspects of the tolerance to cadmium. The glucose consumption and the enzymes activities were also affected by cadmium and its different concentrations. The morphological analysis revealed variations related to hyphae thickness, branching pattern, texture and homogenity, electrondensity, and presence of granular structures. The ultrastructural aspects revealed alterations related to cell electrondensity, mycelia density, branching pattern and reduced chlamidospores number. The grown in presence of the metal induced a reduction in the total protein content related to cadmium concentration. The isolate was able to accumulate polyphosphate, and its grown in cadmium induced the polymer degradation. The cadmium removal was observed and revealed variations related to metal concentrations. The results for the first time revealed the effects of cadmium on T. harzianum polyphosphate accumulation and its potential application in the metal remediation

O presente trabalho tem como objetivo estudar alternativas de controle químico e biológico de isolados de Pythium para aplicação na formação de mudas de tabaco. Estudou-se por meio de bioensaios a compatibilidade de duas cepas de Trichoderma harzianum (ESALQ 1306 e 1316) com sete fungicidas. Os mesmos fungicidas foram avaliados quanto à capacidade de inibição de quatro isolados de Pythium spp. A atividade antagônica das cepas de T. harzianum foram testadas in vitro, em três momentos de inoculação a 23 e 28ºC para quatro isolados de Pythium spp. A eficiência de controle in vivo de Pythium sp., bem como germinação, massa seca e mudas aptas foram avaliadas em condições de casa de vegetação, com os fungicidas químicos Ridomil Gold MZ e Infinito, e biológicos Trichodermil 1306 e o produto experimental Trichodermil 1316. As cepas de T. harzianum apresentaram compatibilidade com todos os fungicidas testados. Todos os isolados de Pythium foram inibidos pelos fungicidas Censor, Amistar WG 500, Infinito e Ridomil Gold MZ em ensaios. A cepa ESALQ 1316 apresentou maior eficiência de inibição dos isolados de Pyhtium, em cultivo pareado, sendo 100% eficiente, independente do momento de inoculação, após 14 dias. Isoladamente o Trichodermil cepa ESALQ 1306 foi mais eficiente que o produto experimental Trichodermil cepa ESALQ 1316 no controle de Pythium sp. em mudas de tabaco. A combinação do Ridomil Gold MZ ou Infinito com o Trichodermil 1316 apresentou maior eficiência de controle de Pythium sp. quando comparada ao agente de biocontrole isoladamente em mudas de tabaco. / The present work aims to study alternatives for chemical and biological control of Pythium isolates for application in tobacco seedlings. It was studied by bioassays the compatibility of two strains of Trichoderma harzianum (ESALQ 1306 and 1316) with seven fungicides. The same fungicides were evaluated for their ability to inhibit four isolates of Pythium sp. The antagonistic activity of strains of T. harzianum were tested in vitro on three different occasions inoculation at 23 and 28 º C for four isolates of Pythium sp. The control efficiency in vivo of Pythium sp. and germination, seedling dry weight and suitable conditions were evaluated in a greenhouse with chemical fungicides Ridomil Gold MZ and Infinito, and biological products, Trichodermil 1306 and Trichodermil 1316. The strains of T. harzianum showed compatibility with all fungicides tested. All the isolates of Pythium were inhibited by fungicides Censor, Amistar WG 500, Infinito and Ridomil Gold MZ in trials. The strain ESALQ 1316 was more efficient inhibition of isolates Pyhtium in paired culture, being 100% effective, regardless of time of inoculation, after 14 days. On average Trichodermil 1306 was more efficient than the experimental product Trichodermil 1316 in the control of Pythium sp. in tobacco seedlings. The combination of Ridomil Gold MZ or Infinito with Trichodermil 1316 was more effective control of Pythium sp. compared with the biological control agent alone in tobacco seedlings.

La lutte biologique par utilisation de micro-organismes a indéniablement un potentiel de développement considérable. Dans un contexte multidisciplinaire et fondamental de physio-phytopathologie moléculaire et répondant à d’éminents enjeux appliqués et attendus par les acteurs de la profession oléicole et les consommateurs, nous nous sommes projetés dans l’étude des propriétés intrinsèques d’un agent de biocontrôle fongique, Trichoderma harzianum (souche Ths97) contre l’agent de la fusariose Fusarium solani (souche Fso14), qui sévit sévèrement sur une culture pérenne majeure pour la Tunisie, l’oléiculture. Deux axes de recherche ont été menés. Dans le premier axe, nous avons démontré que Ths97 est un agent de biocontrôle efficace contre la virulence de F. solani Fso14. Cette capacité s’accompagne d’une accumulation des défenses chez le partenaire végétal, des accumulations qui sont d’autant plus fortes quand l’agent bénéfique est en présence du pathogène (événements de priming). De même, des tests in vitro montrent que Ths97développe des activités mycoparasites envers F. solani Fso14, en émettant des structures d’infection classiques tels des enroulements et accolements d’hyphes, des appressoria et des papilles. Quant au second axe d’étude, nous avons étudié la superfamille des perméases Major Intrinsic Proteins (MIP) dans le genre Trichoderma. Cette famille multigénique n’a jamais été étudiée chez un agent fongique hyperparasite. Sept membres MIP sont présents chez T. harzianum, et se classent en 3 sous-groupes, les AQP, les AQGP et les XIP. La modélisation des structures tridimensionnelles et les fonctions putatives de transport pour l’eau et quelques polyols ont été étudiées. Enfin, leurs patrons transcriptionnels ont été suivis chez Ths97 in planta en situation d’antagonisme et in vitro en situation de parasitisme vis-à-vis de Fso14, et montrent que 4 MIP sont exprimées et régulées différentiellement selon que Ths97 est au contact de Fso14 ou pas. Nos travaux ont donc mis en lumière que Ths97 doit être considéré comme un agent biofongicide et biostimulateur de défenses végétales, puis que les MIP seraient impliqués dans les relations trophiques que met en place T. harzianum avec son environnement. Ces données devraient intégrer le développement de procédés plus efficaces et/ou plus durables pour la protection des cultures d’oliviers en Tunisie ainsi qu’à travers le monde. / Biological disease control through the use of microorganisms has a great potential for future use in integrated pest management. In a multidisciplinary and fundamental context of molecular physio-phytopathology and to provide solutions for the actors in the olive profession and the consumers, we have been studying the activity of a fungal biocontrol agent, Trichoderma harzianum (strain Ths97) against the olive tree pathogen Fusarium solani (strain Fso14), which causes major problems for olive production in Tunisia and elsewhere. The project consists of two parts. In the first part, we have demonstrated that Ths97 is a biocontrol agent effective against the F. solani Fso14 pathogen. Induction of plant defence responses by Ths97 was shown to be partly responsible for the biocontrol effect. In vitro tests further showed that Ths97 develops mycoparasitic activities towards F. solani Fso14, by forming infection structures such as hyphae windings and wedges, appressoria and papillae. In the second part of the study, we investigated the Major Intrinsic Proteins (MIP) superfamily in the Trichoderma genus. This multigenic family has never been investigated in a hyperparasitic fungal species. Seven MIP members are present in T. harzianum, and are classified into 3 subgroups: AQP, AQGP and XIP. Their three-dimensional structures and their putative involvement in transport of water and certain polyols have been examined. Finally, their transcription profiles were monitored in Ths97 in planta in antagonistic situations and in vitro in a parasitic situation with Fso14 and show that 4 MIP are expressed and regulated differentially during the interaction. Our work has shown that Ths97 must be considered as a biological control agent and biostimulator of plant defences, and that MIPs are involved in the trophic relationships between T. harzianum and the environment. These data contributes to the further development of T. harzianum as an efficient biocontrol agent for sustainable protection of olive trees in Tunisia and around the world.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6663.pdf: 3464569 bytes, checksum: 56765698cbf2bedabdd5b1e555a404ae (MD5) Previous issue date: 2015-03-20 / Financiadora de Estudos e Projetos / Currently the great challenge for the production of second generation ethanol is to reduce thecost of the enzymes. It is possible to reduce part of this cost by carrying out an optimization ofthe process fermentation using sources of cellulase-induction that allow further growth of fungalbiomass, and increased secretion of proteins. The use of a mutant strain with overexpression ofhemicelulolytics activators could increase expression of the enzymes of interest and therebycontribute to cost reduction. This work aimed to study the production of enzymes involved inthe degradation of biomass by the newly isolated strain of Trichoderma harzianum P49P11focusing on the improvement of the submerged fermentation processes and on the use molecularbiology tools to improve the fungal strain. Regarding the fermentation process, the effects ofdifferent inducing sources were evaluated in flasks and bioreactor using statistical experimentaldesign tools and strategies to enhance biomass in the pre-culture step. For fungal strainimprovement, it was used molecular biology tools for the overexpression of two activators ofcellulases (xyr1 and lae1). A proteomic analysis of the T. harzianum enzymatic extract obtainedusing sugarcane bagasse pretreated by steam explosion followed by delignification (BED) wasperformed. The results showed that the best source for inducing cellulase was BED + sucrose(3: 1), reaching values of 1.21 FPU/mL 80.0U/mL of xylanase and 17.30 U/mL of β-glucosidase. The proteomic analyis identificated 24 different glycoside hydrolases and fourCBM proteins, within 12 different CAZy families. From this study, the enzymatic cocktailproduced "on site" could be supplemented using two accessory enzymes, pectinase and α-Larabinofuranosidase,leading to an increase of 100% of the hydrolysis yield. Regarding thestudy of carbon sources in the pre-culture step, it was possible to increase cellulases productionin 2 times using glycerol as the initial carbon source, followed by inducing carbon source(BED). The xyr1 and lae1 overexpression influencied positively the FPase, CMCase, xylanaseand β-glucosidase production, representing a new approach to increase production of theseenzymes. / Atualmente o grande desafio para a produção de etanol de segunda geração consiste emdiminuir o custo das enzimas degradantes da fibra lignocelulósica. Uma alternativa quepode levar a redução de parte desse custo é a otimização do processo fermentativoutilizando fontes indutoras das enzimas (hemi)celulolíticas que permitam um maiorcrescimento da biomassa fúngica e maior secreção de proteínas. A utilização de umalinhagem mutante com a superexpressão dos ativadores dessas enzimas também podecontribuir nesse sentido. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar a produção deenzimas envolvidas na degradação da biomassa pelo fungo recém-isolado Trichodermaharzianum P49P11 com foco no melhoramento dos processos fermentativos submersose no uso de ferramentas de biologia molecular para o melhoramento da linhagemfúngica. Em relação ao processo fermentativo foi avaliado o efeito de diferentes fontesindutoras em frascos agitados e em biorreator utilizando ferramentas estatísticas deplanejamento de experimentos e estratégias de aumento de biomassa na fase de préinóculo.Em relação ao melhoramento da linhagem fungica foram utilizadas ferramentasde biologia molecular para a superexpressão de dois ativadores de celulases (xyr1 elae1). Para um melhor entendimento das proteínas produzidas em cultivo submerso foirealizado o proteôma do extrato enzimático secretado pelo fungo selvagem em bagaçode cana pré-tratado. Os resultados mostraram que a melhor fonte de carbono indutora decelulases foi o bagaço de cana explodido e deslignificado (BED) + sacarose naproporção 3:1, alcançando valores de 1,21 FPU/mL, 80.0U/mL de xilanse e 17,30 U/mL de β-glicosidase. O proteôma do extrato enzimático de T. harzianum resultou naidentificação de 24 hidrolases glicosídicas diferentes, 4 proteínas CBM dentro de 12diferentes famílias do CAZy. A partir deste estudo pode-se suplementar o coquetelenzimático on site com duas enzimas acessórias, pectinase e α-L-arabinofuranosidaseque aumentaram o rendimento de hidrólise em mais de 100%. Em relação ao estudo dasfontes de carbono na fase de pré-inóculo foi possível aumentar a produção de celulasesem 130% utilizando o glicerol como fonte de carbono inicial, seguida de fonte de18carbono indutora (BED). A aplicação de técnicas de biologia molecular para a mutaçãodo T. harzianum visando a superexpressão de xyr1 e lae teve influência positiva naprodução das enzimas FPase, CMCase, xilanase e β-glicosidase, representando umanova abordagem para aumentar a produção dessas enzimas.

Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado do Rio Grande do Sul / Trichoderma spp. is one of the most studied funguses as a biocontrol agent, being antagonistic to various plant pathogens in different cultures. This work aimed the production of liquid bio formulate of Trichoderma harzianum and Trichoderma viride based on biopolymer Xanthan Gum (GX) and carboxymethylcellulose (CMC) and the polymer polyvinylpyrrolidone (PVP).The bio formulates were composed of glycerol 10.0 gL -1, yeast extract 0.5 gL -1, MgSO 4 .7 H 2 0 0.2 gL -1, K 2 HPO 4 0.5 gL -1 and NaCl 0.1 gL -1. These amounts were determined by assessing the shortest period of time between the inoculation and sporulation of the fungus in Petri dishes containing PDA culture medium (potato dextrose agar) and bio formulates. The purpose of the use of these products were to make available a formulation that presents 180 days of shelf validity, as regarding the survival parameters (number of spores), evaluated using a Neubauer chamber and infectivity in vitro evaluated by testing direct confrontation with Fusarium oxysporum Schlecht . The evaluations were performed at intervals of 30, 60, 90, 120 and 180 days. The treatments used were G 1 P 1 C 2 (GX, 1.0 gL -1; PVP, 1.0 gL -1; CMC, 2.0 g L -1), G 0.5 P0.5 C1 (GX, 0.5 gL -1; PVP, 0.5 gL -1; CMC, 1.0 g L -1), G 2P 2C (GX, 2.0 gL -1; PVP, 2.0 gL-1) and GPC1 (CMC, 1.0 gL-1), stored in sterile plastic container at room temperature. T. harzianum showed the best result with G 0.5 P0.5C 1 in all periods of assessment. For T. viride none of the treatments was better than the control in the assessed periods. Polymers make possible to develop effective means of storage, extending the life of bio formulates. / Trichoderma spp. é um dos fungos mais pesquisados como agente de biocontrole, sendo antagonista a vários fitopatógenos em diferentes culturas. Este trabalho teve como objetivo a produção de bioformulado líquido de Trichoderma harzianum e Trichoderma viride a base de biopolímeros Goma Xantana (GX) e Carboximetilcelulose (CMC) e o polímero Polivinilpirrolidona (PVP). Os bioformulados foram compostos por glicerol 10,0 gL-1, extrato de levedura 0,5 gL-1, MgSO4.7H20 0,2 gL-1, K2HPO4 0,5 gL-1 e NaCl 0,1 gL-1. As quantidades foram determinadas através da avaliação do menor período de tempo entre a repicagem e a esporulação do fungo em placas de Petri, contendo meio de cultura BDA (batata dextrose ágar) e os bioformulados. A finalidade do uso destes produtos foi disponibilizar uma formulação que apresente 180 dias de validade em prateleira, quanto aos parâmetros sobrevivência (número de esporos), avaliado através de Câmara de Neubauer e infectividade in vitro avaliado através de teste de confrontação direta com Fusarium oxysporum Schlecht. Os intervalos de avaliações ocorreram aos 30, 60, 90, 120 e 180 dias. Os tratamentos utilizados foram G1P1C2 (1,0gL-1 GX, 1,0 gL-1 PVP, 2,0 gL-1 CMC), G0,5P0,5C1 (0,5 gL-1 GX, 0,5 gL-1 PVP, 1,0 gL-1 CMC), G2P2C (2,0 gL-1 GX, 2,0 gL-1 PVP) e GPC1 (1,0 gL-1 CMC), armazenados em embalagens plásticas e estéreis, em temperatura ambiente. T. harzianum apresentou melhor resultado com G0,5P0,5C1 em todos períodos de avaliação. Para T. viride nenhum dos tratamentos foi melhor do que o controle nos períodos avaliados. Os polímeros permitem desenvolver meios eficazes de armazenamento, prolongando a vida útil de bioformulados.

A grande diversidade de organismos que hoje encontramos em nosso planeta se deve à adaptação às diferentes condições ambientais de cada nicho ecológico existente e à resposta adaptativa originária das mudanças dessas condições. Pode-se considerar que a etapa inicial do processo de adaptação seja a reprogramação da expressão gênica dum organismo como resposta imediata a uma nova condição ambiental. De fato parte do genoma de todos os organismos é dedicada à codificação de proteínas relacionadas ao controle dos efeitos nocivos criados por diferentes tipos de estresse como choque térmico, ou osmótico, estresse oxidativo, ou aqueles resultantes de altas concentrações de íons de metais pesados. De forma semelhante, a ausência, ou exaustão, de fontes de macronutrientes, como carbono, nitrogênio, fósforo ou enxofre, exige uma reorganização do padrão de expressão gênica para adequação às novas condições nutricionais, também sendo considerada um estresse ambiental. Visto que a maioria dos estudos de análise da expressão gênica em resposta a estresses ambientais realizados em fungos se refere às leveduras unicelulares Saccharomyces cerevisiae e Schizossacharomyces pombe, nos propusemos a estudar tal resposta no fungo filamentoso multicelular Trichoderma reesei. Dessa forma analisamos por meio da técnica de \"microarrays\" de cDNAs a expressão gênica de aproximadamente 2.000 transcritos desse organismo em resposta a choque térmico, à alta concentração de íons de cádmio II e à ausência de fonte de carbono, ou nitrogênio, por período de 2 horas. Em geral, as respostas aos estresses se compuseram da regulação negativa da transcrição de genes envolvidos em processos com alta demanda de energia como a síntese protéica, evidenciada pela repressão da expressão de genes de proteínas ribossomais e do anabolismo. Em contrapartida, genes codificando proteínas relacionadas à defesa celular, como chaperonas, tiveram sua expressão induzida. As respostas ao choque térmico e ao tratamento com cádmio II se mostraram bastantes semelhantes, enquanto a ausência de fonte de nitrogênio também induziu a expressão de genes relacionados à degradação de proteínas e nucleotídeos. Genes relacionados à utilização de reservas lipídicas foram induzidos tanto na ausência de fonte de carbono quanto de nitrogênio. Foram identificados reguladores transcricionais e componentes de vias de sinalização celular com expressão diferenciada frente a esses diferentes estresses ambientais. A maior parte dos genes cuja expressão se alterou em função dos diversos estresses ambientais estudados ainda não tem função celular conhecida, sendo essa observação, portanto, uma contribuição importante para sua anotação funcional. Uma vez que o fungo filamentoso Trichoderma reesei vem se tornando um organismo de valor biotecnológico por sua característica de alto poder de síntese e secreção de proteínas, esperamos que os dados apresentados forneçam um maior entendimento dos processos celulares desse organismo e possam subsidiar futuros projetos visando uma melhor adaptação do mesmo a ambientes industriais. / The diversity of organisms found today in our planet is due to their adaptation to different environmental conditions present in each ecological niche, and to the adaptative response originated from changes in those conditions. The first step in the adaptation process is considered to be the reprogramming of gene expression as an immediate response to a new environmental condition. A fraction of the genome from all living organisms is dedicated to encoding proteins related to the control of deleterious effects created by different types of stresses like heat or osmotic shock, oxidative stress, or by the presence of high concentrations of heavy metal ions. Similarly, the absence or exhaustion of macronutrients as carbon, nitrogen, phosphorous or sulphur sources demand new patterns of gene expression in order to the organisms survive in a limited nutritional condition, which is also considered an environmental stress. Once the gene expression analyses in fungi as a response to environmental stresses have been widely studied in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizossacharomyces pombe, we proposed to study such response in the multicellular filamentous fungus Trichoderma reesei. To this purpose, we have utilized the cDNA microarray technique to analyze the gene expression of approximately 2,000 T. reesei transcripts in response to heat shock, to high concentration of cadmium II ions and to a 2-hour absence of carbon or nitrogen source. As a general response to the four studied stresses, we observed on one hand a negative transcriptional regulation of genes involved in processes that demand great amounts of energy, i.e. a negative regulation of protein synthesis, indicated by strong repression of ribosomal protein genes transcription, as well as a negative regulation of anabolism. On the other hand, genes that encode proteins associated with cellular defense, like chaperones, had their expression induced. The responses to heat shock and to cadmium poisoning were quite similar while nitrogen source absence also induced the expression of genes related to protein and nucleotide degradation. Genes implicated in the consumption of lipid reserves were induced in the absence of both carbon and nitrogen sources. We identified some transcription regulators as well as components of signal transduction pathways that have differential patterns of gene expression caused by these different environmental stresses. Most of the genes that had their expression altered in response to the studied environmental stresses has no known function yet. Their expression patterns towards such stresses are therefore an important contribution to their functional annotation. Since the filamentous fungus Trichoderma reesei has become a microorganism of biotechnological value for its high capacity of synthesis and secretion of proteins, we expect that the data presented on this work can provide a better understanding of its cellular processes and may support future projects for a better adaptation of this organism to industrial conditions.