A regulação da expressão gênica é essencial para os fungos se adaptarem às adversidades ambientais, como alterações no pH extracelular, escassez de nutrientes, força iônica e oscilações de temperatura. A resposta adaptativa ao pH ambiente é bem caracterizada em fungos modelo como Aspergillus nidulans, e envolve a via de transdução de sinal constituída pelos produtos dos genes pal e pacC. No dermatófito Trichophyton rubrum, o gene pacC foi inativado, e a linhagem mutante apresentou uma diminuição na atividade das queratinases, indicando que, de alguma forma, este gene está envolvido na regulação da atividade queratinolítica deste dermatófito, e consequentemente na sua virulência e patogenicidade. Além disto, a glicosilação protéica é uma importante forma de regulação pós traducional, estruturando e estabilizando glicoproteínas que podem ser da via secretória, da parede ou da membrana celular. O processo de glicosilação protéica sofre influência do pH extracelular e da fonte nutricional. Foi ainda relatado que este tipo de regulação pós traducional também sofre influência dos genes palB e pacC, indicando que estes genes tenham um papel na glicosilação de enzimas secretadas. O objetivo deste trabalho foi analisar a influência do pH e da fonte nutricional na expressão de genes que codificam enzimas de N- e O-manosilação, e sua possível modulação pela proteína PacC no dermatófito T. rubrum. Para tanto, foi analisado, por PCR em tempo real, o perfil transcricional destes genes nas linhagens H6 (controle) e pacC-1, utilizando-se como fonte de carbono glicose, glicose e glicina ou queratina em vários tempos de cultivo, em pH 5,0 ou 8,0. A análise da expressão gênica revelou que quando a linhagem controle é cultivada em queratina em pH 5,0 ocorre um aumento da expressão da O-manosiltransferase, comparado com o cultivo em glicina com glicose e glicose. Porém, nestas mesmas condições o gene da N-manosiltransferase da linhagem mutante apresenta maiores níveis de expressão que os da linhagem controle. Em pH 8,0 pode-se notar grande semelhança entre os perfis de expressão apresentados por estes dois genes. Os resultados obtidos indicam que o gene pacC tem um papel importante no sensoriamento de nutrientes em meio ácido, modulando a expressão destas transferases, nas condições avaliadas. Estas enzimas podem ativar proteínas que atuam na hidrólise da queratina, ou mesmo formar glicoproteínas de parede celular que são essenciais na adesão do fungo à célula do hospedeiro, sugerindo um papel das manosiltransferases no processo infeccioso. / Gene expression regulation is essential for fungi to adapt to environmental adversities, such as changes in the extracellular pH, nutrient starvation, ionic strength, and temperature. The adaptive response to ambient pH is well characterized in model fungi such as Aspergillus nidulans, and involves the signal transduction pathway consisting of the products of the pal and pacC genes. In the dermatophyte Trichophyton rubrum, the pacC gene was inactivated and the mutant strain showed a decreased activity of keratinases, indicating that, somehow, this gene is involved in the regulation of the keratonolytic activity of this dermatophyte, and consequently in its virulence and pathogenicity. Moreover, protein glycosylation is an important form of post-translational regulation, playing a role in protein folding and stability of glycoproteins of the secretory pathway, cell wall or membrane. The process of protein glycosylation is influenced by extracellular pH and nutritional source. It has also been reported that this type of post-translational regulation is also influenced by the palB and pacC genes, indicating that these genes have a role in glycosylation of secreted enzymes. The objective of this study was to analyze the influence of the pH and nutritional source in the expression of the genes coding for the N-and O-manosylation enzymes, and their possible modulation by PacC in the dermatophyte T. rubrum. To this end, the transcriptional profile of these genes was analyzed, by Real Time PCR, in the H6 (control) and pacC-1 strains, using glucose, glucose with glycine, or keratin as the carbon source, in several culture times, at pH 5.0 or 8.0. Gene expression analysis showed that when the control strain is grown in keratin at pH 5.0 there is an increased expression of the O-manosyltransferase encoding gene, compared to the cultivation in glucose and glucose with glycine. However, at the same conditions the gene coding for the N-manosyltransferase presented higher levels of expression in the mutant strain in relation to the control strain. At pH 8.0 there is a great similarity between the expression profile of these two genes. The obtained results indicate that pacC gene plays an important role in nutrient sensing at acidic pH by modulating the expression of these transferases in the conditions evaluated. These enzymes can activate proteins that play roles in the hydrolysis of keratin, or even forming cell wall glycoproteins that are essential for the adhesion of the fungus to the host cell, suggesting a role of the manosyltransferases in the infectious process.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:32:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8110_1.pdf: 1205143 bytes, checksum: 3c6fb699084662156122c7857341f9dd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Introdução: As dermatofitoses são infecções fúngicas freqüentes entre os homens. A constante mudança do perfil epidemiológico tornam necessários estudos regulares. O objetivo deste trabalho é determinar as dermatofitoses mais comuns em Pernambuco e seus agentes. Material e Métodos: Estudo transversal utilizando os registros de pacientes atendidos no Laboratório de Micologia Médica da Universidade Federal de Pernambuco durante o período de janeiro de 1995 a julho de 2005. Resultados: Foram analisados 1238 casos de dermatofitoses de 1105 pacientes. Os homens somaram 51,76% dos pacientes e os menores de 21 anos 51%. Trichophyton tonsurans e T. rubrum foram as espécies mais isoladas na primeira e segunda metades do estudo, respectivamente. Conclusão: Não houve diferença significativa entre os sexos nas tinhas em geral, as quais foram mais prevalentes em menores de 21 anos. A tinha de pele glabra e T. rubrum são, atualmente, a forma clínica e dermatófito mais freqüentes em Pernambuco

Trichophyton rubrum, importante agente de dermatofitoses, é um fungo queratinofílico, capaz de parasitar tecidos como pele e unha. É o principal responsável pelas dermatofitoses crônicas e refratárias ao tratamento e como é uma espécie antropofílica encontra-se muito bem adaptado ao parasitismo humano. Por tratar-se de uma micose cutânea, torna-se necessário o estudo dos fenômenos que ocorrem durante o encontro deste fungo com uma das principais células do sistema imunológico que primeiramente reconhecem o antígeno. Assim sendo, o objetivo deste trabalho é estudar a interação de T.rubrum com macrófagos, para aumentar o conhecimento dos mecanismos envolvidos na resposta imunológica nesta importante patologia. Para isso, foram realizados ensaios de fagocitose de conídios de T.rubrum, seguidos da análise da expressão de moléculas de superfície celular, dosagem de citocinas e viabilidade de macrófagos. Verificamos que o exoantígeno de T.rubrum provocou diminuição da fagocitose de conídios e partículas de zymosan pelos macrófagos. Entretanto, o exoantígeno não interferiu na expressão de moléculas de superfície celular e não foi capaz de estimular os macrófagos a secretar TNF-α, IL-12, IL-10 e óxido nítrico. Já os conídios fagocitados por macrófagos, provocaram diminuição significativa na expressão de suas moléculas de superfície, tais como MHC classe II, CD80 e CD54. Após fagocitose de conídios, os macrófagos foram capazes de secretar uma grande quantidade de TNF-α e IL-10 e após 8 horas de cultivo, os conídios internalizados iniciaram processo de formação de hifa, provocando lise e a conseqüente morte destas células. Por estes achados e pelos estudos prévios já realizados com o T.rubrum, pensamos que a persistência desta infecção fúngica possa estar relacionada com a ação inibitória do fungo sobre os macrófagos, levando à cronicidade observada nestas lesões. / Trichophyton rubrum is the most common pathogen causing dermatophytosis, accounting for approximately 80% of the reported cases of onychomycosis. Since 90% of the chronic dermatophyte infections are caused by T. rubrum, it is likely that this pathogen must have evolved mechanisms that evade or suppress cell-mediated immunity. Several reports have highlighted the participation of phagocytes in the immune defense against fungi; however, few studies have addressed the role of these cells in dermatophytosis. In this study, we investigated the interactions of resident and peritoneal macrophages with T. rubrum. We show here that the interaction of T. rubrum conidia with resident macrophages results in the production of TNF-α and IL-10 but not IL-12 and nitric oxide. Infected macrophages down-regulated the expression of co-stimulatory molecules (CD80 and CD54). We also show that phagocytosis of T. rubrum conidia is inhibited by the addition of fungal exoantigens or mannan. Cytotoxicity assays indicated that after 8 h of conidia ingestion macrophage viability decreased drastically. Electron microscopy revealed that the ingested conidia grow and differentiate into hyphae inside macrophages leading to rupture of the macrophage membrane.

Submitted by Aline Chiodi Borges null (aline.borges@ict.unesp.br) on 2017-02-01T12:59:00Z No. of bitstreams: 1 TESE Aline Chiodi Borges.pdf: 2538445 bytes, checksum: b94b3366c29227ee5a2e026711c63088 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-02-03T19:27:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 borges_ac_dr_sjc.pdf: 2538445 bytes, checksum: b94b3366c29227ee5a2e026711c63088 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-03T19:27:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 borges_ac_dr_sjc.pdf: 2538445 bytes, checksum: b94b3366c29227ee5a2e026711c63088 (MD5) Previous issue date: 2016-12-15 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As doenças fúngicas representam grande desafio para a área médica e odontológica devido à crescente prevalência e aumento da resistência aos antifúngicos. O plasma frio sob pressão atmosférica (PFPA) é uma mistura gasosa contendo partículas carregadas, radicais livres e radiação. Sua potencial aplicação em doenças infecciosas foi relatada, contudo a literatura carece de estudo sistemático sobre o efeito antifúngico, mecanismos de ação e potencial citotóxico. Neste trabalho foi avaliado o efeito antifúngico do PFPA sobre Candida albicans através de ensaios em células planctônicas e biofilmes, efeitos sobre a integridade de parede celular e membrana plasmática, morfogênese, produção de exoenzimas, aderência às células epiteliais e efeito no tratamento in vivo de lesões de candidose oral induzida em modelo murino. Ainda, avaliou-se o efeito do PFPA sobre culturas de Trichophyton rubrum, além de efeitos sobre capacidade de adesão de conídios. Ainda, o potencial citotóxico foi investigado usando células epiteliais. PFPA em modo de tensão contínuo (MC) foi capaz de reduzir a aderência de C. albicans às células epiteliais, modular a transição levedura-hifa na cepa SC 5314 e comprometer a viabilidade de biofilmes. PFPA-MC se mostrou citotóxico em parâmetros efetivos frente a biofilmes de C. albicans. Porém, não foi observado efeito citotóxico quando o PFPA foi utilizado em modo de tensão pulsada (MP). A exposição ao PFPA-MP reduziu a invasão de C. albicans no epitélio in vivo. O PFPA-MP foi capaz de afetar o crescimento de T. rubrum a partir de 10 minutos e de afetar a sua capacidade de aderência. Assim, conclui-se que PFPA apresenta efeito antifúngico contra C. albicans e T. rubrum e é capaz de interferir em fatores de virulência de ambos os micro-organismos. / Fungal diseases represent a great challenge to the medical and dental areas, due to the increasing prevalence and antifungal resistance. Atmospheric pressure plasma jet (APPJ) is a gaseous mixture containing charged particles, free radicals and radiation. Its potential application in infectious disease has been reported, however there is still a lack of a systematic study on the antifungal effect, mechanism of action and citotoxicc potential. The general aim of this project was to evaluate the antifungal effect of APPJ on Candida albicans in planktonic and biofilm cultures, effects on cell wall and cell membrane integrity, morphogenesis, exoenzymes production, adherence to epithelial cells and in vivo effect in the treatment of oral candidosis in murine model will be performed. The effect of APPJ on Trichophyton rubrum cultures and on adherence capability were also evaluated. The cytotoxic potential was evaluated in vitro. APPJ in continuous tension mode (CM) was able to reduce the adherence and yeast-hyphae transition in C. albicans SC 5314 and to decrease biofilm viability. APPJ-CM showed cytotoxic effect in the parameters effective to C. albicans biofilm. Conversely, no cytotoxic effect on epithelial cells were observed when pulsed (PM) plasma jet was used. In vivo tests showed that APPJ-PM was able to prevent C. albicans invasion to the epithelium. T. rubrum cultures were affectd by APPJ-PM after 15 minutes of exposure and conidia adherence was impaired by 10 minutes exposure. In conclusion, APPJ showed antifungal effect against C. albicans and T. rubrum and can also impair virulence factors in both microorganisms. / FAPESP: 2014/02354-7

Trichophyton rubrum, importante agente de dermatofitoses, é um fungo queratinofílico, capaz de parasitar tecidos como pele e unha. É o principal responsável pelas dermatofitoses crônicas e refratárias ao tratamento e como é uma espécie antropofílica encontra-se muito bem adaptado ao parasitismo humano. Por tratar-se de uma micose cutânea, torna-se necessário o estudo dos fenômenos que ocorrem durante o encontro deste fungo com uma das principais células do sistema imunológico que primeiramente reconhecem o antígeno. Assim sendo, o objetivo deste trabalho é estudar a interação de T.rubrum com macrófagos, para aumentar o conhecimento dos mecanismos envolvidos na resposta imunológica nesta importante patologia. Para isso, foram realizados ensaios de fagocitose de conídios de T.rubrum, seguidos da análise da expressão de moléculas de superfície celular, dosagem de citocinas e viabilidade de macrófagos. Verificamos que o exoantígeno de T.rubrum provocou diminuição da fagocitose de conídios e partículas de zymosan pelos macrófagos. Entretanto, o exoantígeno não interferiu na expressão de moléculas de superfície celular e não foi capaz de estimular os macrófagos a secretar TNF-α, IL-12, IL-10 e óxido nítrico. Já os conídios fagocitados por macrófagos, provocaram diminuição significativa na expressão de suas moléculas de superfície, tais como MHC classe II, CD80 e CD54. Após fagocitose de conídios, os macrófagos foram capazes de secretar uma grande quantidade de TNF-α e IL-10 e após 8 horas de cultivo, os conídios internalizados iniciaram processo de formação de hifa, provocando lise e a conseqüente morte destas células. Por estes achados e pelos estudos prévios já realizados com o T.rubrum, pensamos que a persistência desta infecção fúngica possa estar relacionada com a ação inibitória do fungo sobre os macrófagos, levando à cronicidade observada nestas lesões. / Trichophyton rubrum is the most common pathogen causing dermatophytosis, accounting for approximately 80% of the reported cases of onychomycosis. Since 90% of the chronic dermatophyte infections are caused by T. rubrum, it is likely that this pathogen must have evolved mechanisms that evade or suppress cell-mediated immunity. Several reports have highlighted the participation of phagocytes in the immune defense against fungi; however, few studies have addressed the role of these cells in dermatophytosis. In this study, we investigated the interactions of resident and peritoneal macrophages with T. rubrum. We show here that the interaction of T. rubrum conidia with resident macrophages results in the production of TNF-α and IL-10 but not IL-12 and nitric oxide. Infected macrophages down-regulated the expression of co-stimulatory molecules (CD80 and CD54). We also show that phagocytosis of T. rubrum conidia is inhibited by the addition of fungal exoantigens or mannan. Cytotoxicity assays indicated that after 8 h of conidia ingestion macrophage viability decreased drastically. Electron microscopy revealed that the ingested conidia grow and differentiate into hyphae inside macrophages leading to rupture of the macrophage membrane.

Human fungal superficial infections are mainly caused by dermatophytes. These infections are distributed worldwide, common for people of all ages, in both sexes. The current treatments include taking oral antifungal drugs and topical therapy. However, treatments of superficial infections can be challenging in children and elderly mainly due to compliance issues and associated potential health risks and side-effects. Photo dynamic therapy (PDT) is a novel approach to treat fungal superficial infections. In this approach, light is used to excite a photosensitizer to turn readily available oxygen into reactive oxygen species (ROS) to kill the pathogen. In this research, we have used the pathogenic dermatophyte Trichophyton rubrum as a model to screen for photosensitizers and identify the best combinations of photosensitizer X carrier X light exposure time against T. rubrum. I obtained the In vitro photosensitizers’ Minimum Inhibitory Concentration (MIC), Minimum Fungicidal Concentration (MFC), carrier inhibitory and fungicidal combinations experimental results. In addition, ex vivo experimental results for photosensitizer and carrier systematic treatments are presented with both nail pieces and nail well apparatus. The in vitro results confirm the fungicidal ability of photosensitizer Methylene Blue and natural extracts Inula, Propolis and St. John’s Wort to T. rubrum. For ex vivo experiments, among the three natural extracts, only Inula showed promising fungicidal effect on nail pieces. Methylene Blue and carrier, Methylene Blue plus Inula and carrier combinations at certain concentrations all showed strong nail penetration ability and fungicidal effect against T. rubrum infection. These results suggest promising avenues for further clinical research and application of PDT. / Thesis / Master of Applied Science (MASc)

O dermatófito Trichophyton rubrum é um fungo filamentoso, antropofílico que infecta preferencialmente tecidos queratinizados, e é o agente etiológico mais frequentemente isolado em casos de dermatofitoses humanas. Recentemente, este fungo tornou-se a causa de infecções profundas e generalizadas em pacientes imunocomprometidos. As estratégias terapêuticas para controlar esse tipo de infecção apresentam várias limitações, como o aparecimento de linhagens resistentes e o número restrito de alvos celulares disponíveis. Novas estratégias terapêuticas são necessárias, sendo o foco de muitas investigações. Acriflavina é uma droga citotóxica com atividade antifúngica envolvida na inibição da topoisomerase. Embora seja um composto intercalante de DNA, já foi relatada a super expressão de genes que codificam enzimas envolvidas no transporte de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial e no transporte de ferro em resposta a esta droga, sugerindo um amplo espectro de efeitos celulares. A fim de melhor compreender seus efeitos moleculares, o objetivo deste trabalho foi avaliar o transcriptoma de T. rubrum em resposta a acriflavina. Os perfis transcricionais em resposta a esta droga foram analisados utilizando a metodologia de RNA-seq empregando o sequenciamento em larga escala SOLiD System. Foram comparadas quatro bibliotecas sendo uma o cultivo de T. rubrum em meio Sabouraud e três períodos de exposição à droga: 3 horas, 12 horas e 24 horas. Foram geradas aproximadamente 200 milhões de reads, as quais foram filtradas e alinhadas no genoma de T. rubrum disponível no Dermatophyte Comparative Database Broad Institute utilizando os algoritmos Bowtie e Tophat. As reads alinhadas foram processadas utilizando os algoritmos Cufflinks e Cuffdiff para estimar a abundancia dos transcritos e testar os genes diferencialmente expressos entre o controle e as condições de exposição à droga. Foram identificados 3.153 genes diferencialmente expressos. Após o estabelecimento de critérios mais estringentes, foram selecionados 490 genes diferencialmente expressos em resposta à droga. Estes genes estão relacionados a vários processos celulares como reações de oxidação e redução, transporte transmembrana, transporte de íons e metais e a patogenicidade. Os genes envolvidos com patogenicidade foram reprimidos, sugerindo que a droga interfira com processos importantes para instalação e manutenção da infecção no hospedeiro. Outros fatores de virulência como genes envolvidos no ciclo do glioxilato, também foram reprimidos pela droga. Além disso, genes da via de biossíntese do ergosterol foram reprimidos pela droga, o que constitui um provável novo mecanismo de ação de acriflavina. Os resultados obtidos nesta análise em larga escala contribuem com a elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos na adaptação ao estresse em dermatófitos e podem auxiliar o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas. Além disso, estes resultados contribuem com a anotação do genoma e transcritoma de T. rubrum e outros dermatófitos. / The dermatophyte Trichophyton rubrum is an anthropophilic filamentous fungus that infects keratinized tissues and is the most common etiologic agent isolated in cases of human dermatophytoses. Recently, it has become the cause of deep and widespread infections in immunocompromised patients. Therapeutic strategies to control these infections have several limitations, such as the appearence of resistant strains and the limited number of antifungal cellular targets. New therapeutic strategies are necessary, being the focus of many investigations. Acriflavine is a cytotoxic drug with antifungal activity involved in topoisomerase inhibition. Although it presents DNA intercalating properties, it has already been reported the over-expression of genes coding for enzymes involved in mitochondrial respiratory-electron transport and in iron transport in response to this drug, suggesting a broad spectra of cellular effects. In order to better understand its molecular effects we evaluated T. rubrum transcriptome in response to acriflavine in a time-course assay using the next generation sequencing technology SOLiD System. RNA-seq was performed comparing T. rubrum growth in Sabouraud medium as the control and the three periods of drug exposure, 3h, 12h, and 24h. RNA-seq generated approximately 200 million short reads that were mapped to the Broad Institutes Dermatophyte Comparative Database using Bowtie and TopHat algoritms. Differential gene expression analysis was performed using Cufflinks and Cuffdiff. It was identified 3,153 differentially expressed genes. A more stringent cut-off threshold was established and this analysis revealed a subset of 490 genes modulated in response to the stress caused by exposure of T. rubrum to acriflavine. These genes are involved in various cellular processes such as oxidation-reduction reactions, transmembrane transport, metal ion binding, and pathogenicity. The genes involved in pathogenicity were down-regulated, suggesting that this drug interferes with virulence factors that allow the development of infection and persistence of the dermatophyte in the host. Other virulence factors such as genes involved in the glyoxylate cycle were also repressed by the drug. Moreover, genes involved in ergosterol biosynthesis pathway were down-regulated by the drug and may constitute a new mechanism of action of acriflavine. The results obtained in this large scale analysis provide insights into the molecular mechanisms underlying the responses of T. rubrum to stress conditions and may aid the development of new antifungal drugs. Furthermore, these results contribute to improve gene annotation and open reading frame prediction for T. rubrum and other dermatophyte genomes and transcriptomes.

As dermatofitoses apresentam alta prevalência na população em geral, sendo Trichophyton interdigitale (Trichophyton mentagrophytes) a segunda espécie mais frequentemente relatada como causadora de infecção em humanos. O objetivo do trabalho foi determinar a identidade genética, o perfil enzimático e de assimilação de açúcares e a suscetibilidade a antifúngicos de isolados clínicos do gênero Trichopyton. Os isolados foram avaliados por de ensaios enzimáticos, assimilação de fontes de carbono e da atividade antifúngica in vitro. A caracterização genotípica foi realizada através da amplificação e do sequenciamento da região do gene que codifica a região interna do gene DNA ribossomal dos isolados testados. No estudo, todos os isolados secretaram DNase, mas nenhum deles foi capaz de secretar fosfolipase e proteinase. Por outro lado, urease e lipase foram produzidas pela maioria dos isolados testados. Entre os antifúngicos avaliados, a terbinafina e o itraconazol demonstraram melhores resultados de sensibilidade, enquanto o fluconazol apresentou baixa atividade para as amostras. A anfotericina B, apesar de menos eficaz que a terbinafina e o itraconazol, também demonstrou resultados satisfatórios. A combinação entre os antifúngicos tioconazol e terbinafina demonstrou ter atividade antagônica em todos os isolados. Todos os dermatófitos testados assimilaram inulina, sorbitol, manose, glicose e trealose. Os demais carboidratos tiveram assimilação variável entre os isolados. Genotipicamente, todos os isolados do estudo foram identificados como pertencentes à espécie T. interdigitale. Os ensaios enzimáticos e de assimilação de carboidratos apresentaram resultados variáveis entre os isolados testados, inferindo variação intraespecífica entre as amostras de T. interdigitale. O perfil de sensibilidade aos antimicóticos testados seguiu o padrão de resultados observado em estudos anteriores. A identificação genotípica através da amplificação e do sequenciamento da região ITS permitiu garantir a identidade entre os isolados testados. / The prevalence of dermatophytosis among population is high, and Trichophyton interdigitale (Trichophyton mentagrophytes) is the second most frequently reported species to cause infection in humans. This study objective was to evaluate the genetic identity, the enzymatic profile and the assimilation of carbon sources, as well as the antifungal susceptibility of clinical isolates of Trichophyton sp. The isolates were analyzed phenotypically by enzymatic assays, assimilation of carbon sources and antifungal activity in vitro. The genotypic characterization was performed by amplification and sequencing the gene region encoding the internal region of the DNA ribosomal gene of the isolates tested. In our study, all isolates secreted DNase, while none of them was capable of secreting phospholipase, keratinase and proteinase. On the other hand, lipase and urease were secreted by most of the isolates. Of the antifungal agents tested, the best results in terms of sensitivity were found with terbinafine and itraconazole, while the antifungal activity of fluconazole was found to be weak. Amphotericin B, although less effective than terbinafine and itraconazole, also yielded satisfactory results. Evaluation of the drug combination of tioconazole and terbinafine revealed an antagonistic effect for all tested isolates. All isolates assimilated inulin, sorbitol, glucose, trehalose and mannose. Arabinose, dulcitol, galactose and xylose were assimilated by some of the isolates, whereas the most isolates assimilated cellobiose, dulcitol, erytritol and mannitol. Genotypically, all isolates in the study were identified as belonging to Trichophyton interdigitale species. In general, enzyme assays and assimilation of carbohydrates showed variable results among the isolates tested, inferring intraspecific variation between Trichophyton interdigitale samples. The sensitivity profile of the antifungal agents tested in this study was similar to results obtained in previous studies. The genotypic identification, by amplification and sequencing of the ITS region, has ensured the identity of the isolates tested.

Os dermatófitos são fungos que apresentam a capacidade de invadir o estrato córneo da pele e de outros tecidos queratinizados como os cabelos e as unhas. Esses fungos podem provocar infecções em qualquer local da pele, no entanto os pés, região inguinal, axilas, couro cabeludo e unhas são mais freqüentemente afetados. O Trichophyton rubrum é um fungo antropofílico responsável por aproximadamente 80% das micoses superficiais em humanos. Indivíduos saudáveis podem apresentar dermatofitoses, embora nesses indivíduos a doença ocorra de forma localizada. Por outro lado, indivíduos que apresentam comprometimento da imunidade celular tendem a apresentar formas mais disseminadas. Tendo o objetivo de avaliar a resposta imunológica celular de pacientes portadores de dermatofitoses extensas causadas pelo Trichophyton rubrum, utilizamos um método bastante sensível de avaliação da imunidade celular que mede a resposta linfoproliferativa a mitógenos como: a fitohemaglutinina (PHA); o anti-CD3 (OKT3); e o Pokeweed (PWM). Foram avaliadas também as respostas linfoproliferativas para antígenos como: o antígeno metabólico de Candida sp (CMA); o extrato antigênico do Trichophyton rubrum, e o peptídeo sintético (YIIDTGIDID) que corresponde ao principal epítopo do fungo. Avaliamos também a dosagem das citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e IFN- sob estímulo inespecífico pela PHA e CMA, e sob estímulo específico pelo peptídeo imunodominante do fungo. Os resultados da imunofenotipagem celular para CD3, CD4, CD8, CD19, CD56 e CD206 nos mostraram que não houve diferença entre os grupos de controles e pacientes. Os resultados dos ensaios de linfoproliferação demonstraram diferenças significativas entre os grupos controles e pacientes sob o estímulo inespecífico do PWM e ao antígeno não relacionado CMA. Houve semelhança dos resultados para os grupos controles e pacientes frente ao estímulo pelo extrato antigênico, e diferenças significativas entre os grupos controles e pacientes frente ao peptídeo imunodominante, onde o índice de estimulação foi nitidamente superior para o grupo controle. A quantificação de citocinas demonstrou diferença significativa apenas para IFN- entre os grupos de controles e pacientes sob os estímulos de PHA e do peptídeo sintético. Podemos concluir que o extrato fúngico obtido é antigênico e induz linfoproliferação. No entanto, a resposta ao peptídeo YIIDTGIDID (Tri r2) foi mais específica. Nosso trabalho demonstrou que nem todos os pacientes com Dermatofitoses extensas apresentam uma resposta celular deficiente, pois esses pacientes demonstram respostas tanto para o extrato quanto para o peptídeo antigênico de Trichophyton rubrum / Dermatophytes are fungi that have the ability to invade the stratum corneum of the skin and other keratinized tissues such as hair and nails. These fungi can cause infections anywhere on the skin, however the feet, inguinal region, axillae, scalp and nails are most often affected. Trichophyton rubrum is an anthropophilic fungus responsible for approximately 80% of superficial mycoses in humans. Healthy individuals can present dermatophytoses, although in these individuals the involvement occurs on localized areas. On the other hand, individuals with impaired cellular immunity tend to have disseminated forms. With the aim of evaluating the cellular immune response of patients with extensive dermatophytosis caused by Trichophyton rubrum, we used a very sensitive method for assessing cellular immunity, measuring the lymphoproliferative response to mitogens such as: phytohemagglutinin (PHA); anti-CD3 (OKT3); and pokeweed (PWM). We also evaluated the lymphoproliferative response to antigens as: the metabolic antigen of Candida sp (CMA), the antigenic extract of Trichophyton rubrum; and the synthetic peptide (YIIDTGIDID) that corresponds to the main fungal epitope . We also evaluated the levels of IL-4, IL-10, IL-12 and IFN- after stimulation by PHA, CMA, and the immunodominant peptide of the fungus. The immunophenotyping results showed no differences between the groups of patients and controls. The lymphoproliferation test results showed significant differences between the groups of patients and controls under the PWM and CMA stimuli. There were similar results for the groups of controls and patients after the antigenic stimulation by the extract, and significant differences between the groups of controls and patients against the immunodominant peptide, being the stimulation index significantly higher for the control group. The cytokines quantification showed a significant difference between the groups of controls and patients only for IFN- under PHA and the synthetic peptide stimulation. We can conclude that the obtained fungal extract is antigenic and can stimulate lymphoproliferation. However the response to the peptide YIIDTGIDID (Tri r2) was more specific. We showed that not all patients with extensive dermatophytosis have an impaired cellular response, demonstrating responses to both the extract and the antigenic peptide of T. rubrum

Os dermatófitos são fungos que apresentam a capacidade de invadir o estrato córneo da pele e de outros tecidos queratinizados como os cabelos e as unhas. Esses fungos podem provocar infecções em qualquer local da pele, no entanto os pés, região inguinal, axilas, couro cabeludo e unhas são mais freqüentemente afetados. O Trichophyton rubrum é um fungo antropofílico responsável por aproximadamente 80% das micoses superficiais em humanos. Indivíduos saudáveis podem apresentar dermatofitoses, embora nesses indivíduos a doença ocorra de forma localizada. Por outro lado, indivíduos que apresentam comprometimento da imunidade celular tendem a apresentar formas mais disseminadas. Tendo o objetivo de avaliar a resposta imunológica celular de pacientes portadores de dermatofitoses extensas causadas pelo Trichophyton rubrum, utilizamos um método bastante sensível de avaliação da imunidade celular que mede a resposta linfoproliferativa a mitógenos como: a fitohemaglutinina (PHA); o anti-CD3 (OKT3); e o Pokeweed (PWM). Foram avaliadas também as respostas linfoproliferativas para antígenos como: o antígeno metabólico de Candida sp (CMA); o extrato antigênico do Trichophyton rubrum, e o peptídeo sintético (YIIDTGIDID) que corresponde ao principal epítopo do fungo. Avaliamos também a dosagem das citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e IFN- sob estímulo inespecífico pela PHA e CMA, e sob estímulo específico pelo peptídeo imunodominante do fungo. Os resultados da imunofenotipagem celular para CD3, CD4, CD8, CD19, CD56 e CD206 nos mostraram que não houve diferença entre os grupos de controles e pacientes. Os resultados dos ensaios de linfoproliferação demonstraram diferenças significativas entre os grupos controles e pacientes sob o estímulo inespecífico do PWM e ao antígeno não relacionado CMA. Houve semelhança dos resultados para os grupos controles e pacientes frente ao estímulo pelo extrato antigênico, e diferenças significativas entre os grupos controles e pacientes frente ao peptídeo imunodominante, onde o índice de estimulação foi nitidamente superior para o grupo controle. A quantificação de citocinas demonstrou diferença significativa apenas para IFN- entre os grupos de controles e pacientes sob os estímulos de PHA e do peptídeo sintético. Podemos concluir que o extrato fúngico obtido é antigênico e induz linfoproliferação. No entanto, a resposta ao peptídeo YIIDTGIDID (Tri r2) foi mais específica. Nosso trabalho demonstrou que nem todos os pacientes com Dermatofitoses extensas apresentam uma resposta celular deficiente, pois esses pacientes demonstram respostas tanto para o extrato quanto para o peptídeo antigênico de Trichophyton rubrum / Dermatophytes are fungi that have the ability to invade the stratum corneum of the skin and other keratinized tissues such as hair and nails. These fungi can cause infections anywhere on the skin, however the feet, inguinal region, axillae, scalp and nails are most often affected. Trichophyton rubrum is an anthropophilic fungus responsible for approximately 80% of superficial mycoses in humans. Healthy individuals can present dermatophytoses, although in these individuals the involvement occurs on localized areas. On the other hand, individuals with impaired cellular immunity tend to have disseminated forms. With the aim of evaluating the cellular immune response of patients with extensive dermatophytosis caused by Trichophyton rubrum, we used a very sensitive method for assessing cellular immunity, measuring the lymphoproliferative response to mitogens such as: phytohemagglutinin (PHA); anti-CD3 (OKT3); and pokeweed (PWM). We also evaluated the lymphoproliferative response to antigens as: the metabolic antigen of Candida sp (CMA), the antigenic extract of Trichophyton rubrum; and the synthetic peptide (YIIDTGIDID) that corresponds to the main fungal epitope . We also evaluated the levels of IL-4, IL-10, IL-12 and IFN- after stimulation by PHA, CMA, and the immunodominant peptide of the fungus. The immunophenotyping results showed no differences between the groups of patients and controls. The lymphoproliferation test results showed significant differences between the groups of patients and controls under the PWM and CMA stimuli. There were similar results for the groups of controls and patients after the antigenic stimulation by the extract, and significant differences between the groups of controls and patients against the immunodominant peptide, being the stimulation index significantly higher for the control group. The cytokines quantification showed a significant difference between the groups of controls and patients only for IFN- under PHA and the synthetic peptide stimulation. We can conclude that the obtained fungal extract is antigenic and can stimulate lymphoproliferation. However the response to the peptide YIIDTGIDID (Tri r2) was more specific. We showed that not all patients with extensive dermatophytosis have an impaired cellular response, demonstrating responses to both the extract and the antigenic peptide of T. rubrum