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Thèse--Méd.--Reims, 1973. N°: N° 21. / Bibliogr. ff. I-X.

Th.--Méd.--Reims, 1977. N°: 65.

Th.--Méd.--Reims, 1981. N°: 8.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000448460-Texto+Completo-0.pdf: 1711084 bytes, checksum: 65dd3daa12164398aab7aa839028c683 (MD5) Previous issue date: 2013 / Tuberculosis remains as one of the main cause of mortality worldwide due to a single infectious agent, Mycobacterium tuberculosis. The aroK-encoded Mycobacterium tuberculosis Shikimate Kinase (MtSK), shown to be essential for survival of bacilli, catalyzes the phosphoryl transfer from ATP to the carbon-3 hydroxyl group of shikimate (SKH), yielding shikimate-3-phosphate and ADP. Here we present purification to homogeneity, and oligomeric state determination of recombinant MtSK. Biochemical and biophysical data suggest that the chemical reaction catalyzed by monomeric MtSK follows a rapid-equilibrium random order of substrate binding, and ordered product release. Isothermal titration calorimetry (ITC) for binding of ligands to MtSK provided thermodynamic signatures of non-covalent interactions to each process. A comparison of steady-state kinetics parameters and equilibrium dissociation constant value determined by ITC showed that ATP binding does not increase the affinity of MtSK for SKH. In addition, there appears to be a positive free energy coupling of 3. 2 kJ mol-1 for SKH binding to MtSK:Mg2+ATP binary complex, which suggest that ATP displays negative cooperativity for SKH binding. We suggest that MtSK would more appropriately be described as an aroL-encoded type II shikimate kinase. Our manuscript also gives thermodynamic description of SKH binding to MtSK and data for the number of protons exchanged during this bimolecular interaction. The negative value for the change in constant pressure heat capacity (ΔCp) and molecular homology model building suggest a pronounced contribution of desolvation of non-polar groups upon binary complex formation. Thermodynamic parameters were deconvoluted into hydrophobic and vibrational contributions upon MtSK:SKH binary complex formation. Data for the number of protons exchanged during this bimolecular interaction are interpreted in light of astructural model to try to propose the likely amino acid side chains that are the proton donors to bulk solvent following MtSK:SKH complex formation. / A tuberculose se mantém como uma das principais causas de mortalidade ao redor do mundo devido a um único agente infeccioso, o Mycobacterium tuberculosis. O gene aroK que codifica a enzima Chiquimato quinase de Mycobacterium tuberculosis (MtSK), que se mostrou essencial para a sobrevivência do bacilo, catalisa a transferência de um grupo fosforil do ATP para o chiquimato (SKH), resultando em chiquimato-3-fosfato e ADP. O presente trabalho apresenta a purificação da proteína MtSK até a homogeneidade e a determinação de seu estado oligomérico em solução. Estudos bioquímicos e biofísicos apresentados nesta tese sugerem que a reação catalisada pela MtSK monomérica segue um mecanismo de equilíbrio rápido ordenado aleatório na adição dos substratos e uma liberação ordenada sequencial dos produtos. A análise por calorimetria de titulação isotérmica (ITC) das interações não covalentes da enzima MtSK com diferentes ligantes resultou na determinação de assinaturas termodinâmicas para cada um desses eventos de ligação.A comparação entre as constantes de afinidade obtidas por espectrofotometria e ITC demostraram que o ATP não aumenta a afinidade da proteína MtSK pelo SKH. Além disso, foi determinada em + 3,2 kJ mol-1 a energia livre de acoplamento do SKH ao complexo binário MTSK:Mg2+ATP, sugerindo que o ATP possui uma cooperatividade negativa em relação ao SKH. Esse trabalho sugere que a MtSK deveria ser mais apropriadamente descrita como uma chiquimato quinase do tipo II codificada pelo gene aroL. Adicionalmente, estre trabalho demonstra a descrição termodinâmica do SKH se ligando a MtSK aonde os resultados sugerem o número de prótons que estão sendo trocados durante a interação bimolecular.O valor negativo encontrado para a capacidade calorífica em pressão constante (ΔCp) e o modelo molecular por homologia criado sugerem uma pronunciada contribuição na dessolvatação de grupos apolares relacionados à formação do complexo. As constantes termodinâmicas foram separadas na contribuição hidrofóbica e vibracional relacionadas à formação do complexo binário MtSK:SKH. Os resultados obtidos relacionados à transferência de prótons durante a formação do complexo binário foram analisados tendo como referência o modelo estrutural da enzima MtSK construído neste trabalho. De acordo com as cadeias laterais que fazem contato com o SKH no modelo proposto, se pode indicar que os aminoácidos Arg58 e Arg136 atuam como fonte de prótons durante a formação do complexo binário.

Uma vez que poucas drogas são ativas frente ao Mycobacterium tuberculosis, torna-se muito importante se conhecer os mecanismos que levam a resistência e, embora, tenha-se aprendido muito sobre a resistência, ainda existem alguns antimicrobianos onde esse mecanismo não está completamente elucidado. A aquisição da resistência aos antimicrobianos em bactérias, por sua vez, é frequentemente associada com a perda de fitness e é muito importante a determinação do fitness na população, já que, ele pode influenciar a o futuro da epidemia de isolados resistentes a múltiplas drogas. As mutações associadas com a resistência a estreptomicina nos genes rpsL e rrs são bem conhecidas e podem explicar em torno de 70% da resistência fenotípica. Mutações no gene gidB foram descritas recentemente em isolados clínicos de M. tuberculosis como associadas com a resistência a baixas concentrações de estreptomicina. Nesse estudo, mutações em gidB ocorreram em 27% das cepas resistentes a estreptomicina sem mutações nos genes rpsL e rrs. Duas mutações foram consideradas polimorfismos, gidB16 (alelo 16G) foi identificado exclusivamente no genótipo Latin American Mediterranean, enquanto que gidB92 (alelo 92C) foi associado com a linhagem Beijing. O fitness de 21 cepas multidroga resistentes de M. tuberculosis foi estudado através do método de quantificação da redução da resazurina, enquanto o fitness de 78 cepas foi estudado através de curvas de crescimento utilizando o mycobacterial growth indicator tube e estudos de competição com alguns isolados selecionados. Em geral, analisando-se as curvas de crescimento, em ambos os estudos as cepas com mutações K43R em rpsL e S531L em rpoB ou cresceram melhor ou sem diferença do isolado sensível, já os isolados com mutações em rpoB- não em S531L e com mutações em mais de um gene cresceram em média mais lentamente que os isolados sensíveis. Quanto às diferentes linhagens, no primeiro estudo, os isolados classificados como Latin American Mediterranean cresceram mais rápido no parâmetro tamanho da fase lag, mas sem nenhuma diferença na fase logarítmica, já no segundo estudo, o resultado foi diferente, as cepas não-Latin American Mediterranean cresceram em média mais rapidamente, mas sem diferença estatística das cepas Latin American Mediterranean, e também cresceram melhor nos ensaios de competição. O fitness dos isolados clínicos estudados é muito heterogêneo, possivelmente devido ao fato desses isolados apresentarem diferentes graus de resistência às drogas, diferentes mutações nos genes e ainda diferentes genótipos. Em ambos os estudos foi possível afirmar que as mutações mais encontradas em isolados clínicos são as mutações não relacionadas com a perda do fitness ou que geram pouco custo biológico ao isolado. / Since few drugs are active against the Mycobacterium tuberculosis, it is very important to know the mechanisms that lead to resistance and, although much has been learned about the resistance, there are still some antimicrobials where it is not fully understood. The acquisition of antimicrobial resistance in bacteria is often associated with a loss in fitness and it is very important to have the fitness determined in the population, since it can influence the future of the multidrug isolates epidemic. Mutations related to streptomycin-resistance in the rpsL and rrs genes are well known and can explain about 70% of the phenotypic resistance. Mutations in the gidB gene were described recently as being associated with resistance to low concentrations of streptomycin in strains of M. tuberculosis. In this study, mutations in gidB occurred in 27% of streptomycin-resistant strains without mutations in the rrs and rpsL genes. Two mutations were considered polymorphisms, gidB16 (16G allele) was found exclusively in Latin American Mediterranean genotype, while gidB92 (92C allele) was associated with Beijing lineage in another population. The fitness of 21 multidrug resistant strains of M. tuberculosis was studied by the method of quantitative resazurin reduction assay and fitness of 78 strains was studied by growth curves in mycobacterial growth indicator tube and competition assays using some selected strains. In general, analyzing the growth curves in both studies the strains with the mutations rpsL K43R and rpoB S531L grew better or with no difference from the susceptible strain, on the other hand, strains with mutations in rpoB-but not S531L and with mutations in more than one gene grew, on average, more slowly than susceptible ones. Regarding the different lineages from the first study, strains classified as Latin American Mediterranean grew faster in the parameter of the lag phase, but with no difference in the logarithmic phase. In the second study, the outcome was different, non- Latin American Mediterranean strains grew faster on average, but with no statistical difference from Latin American Mediterranean strains, and also grew well in the competition assays. The fitness of the clinical isolates studied is very heterogeneous, possibly because these isolates present varying degrees of drug resistance, different mutations in the genes analyzed and even different genotypes. In both studies we can say that the frequently mutations found in clinical isolates are the mutations related with no fitness cost or that generate little fitness cost.

Um grande número de pacientes em tratamento para tuberculose desenvolve algum tipo de reação adversa. A mais grave destas, hepatotoxicidade, é, muitas vezes, atribuída aos metabólitos tóxicos gerados durante a metabolização da isoniazida (INH), principal fármaco do tratamento. A INH é metabolizada pelas enzimas N-acetiltransferase 2 (NAT2), citocromo P450 2E1 (CYP2E1) e glutationa S-transferase (GSTM1 e GSTT1). Polimorfismos nos genes que codificam estas enzimas parecem influenciar na sua atividade e toxicidade, além de estarem distribuídos de forma variável entre as populações. Este estudo foi elaborado com o objetivo de estimar a frequência dos polimorfismos nos genes CYP2E1, GSTM1 e GSTT1, e avaliar a relação destes genes e de fatores de risco com o desenvolvimento de hepatotoxicidade. Foram incluídos no estudo 245 pacientes que fizeram tratamento para tuberculose no ambulatório do Hospital Sanatório Partenon (Porto Alegre, RS) com rifampicina, isoniazida e pirazinamida (esquema RHZ). Esses pacientes forneceram termo de consentimento livre e esclarecido, entrevista para coleta de dados clínicos e epidemiológicos e amostra de sangue para exames de provas de função hepática e perfil genético. A identificação dos genótipos foi realizada através das técnicas de PCR para os genes GSTM1 e GSTT (presença ou ausência) e PCR-RFLP para CYP2E1 (SNPs nas posições -1053C>T,-1293G>C e 7632T>A). Através da montagem de um banco de dados com as informações epidemiológicas e genéticas foram testadas possíveis relações entre as características. As frequências dos alelos variantes no gene CYP2E1 foram 8% (-1053), 8,5% (-1293) e 12% (7632). Os genes GSTM1 e GSTT1 estavam ausentes em 42.9% e 12.4% da população, respectivamente. Quinze (6,1%) pacientes desenvolveram hepatotoxicidade. Pacientes com genótipo selvagem em CYP2E1, sendo acetiladores lentos para NAT2, estão sob maior risco de desenvolver hepatotoxicidade. O genótipo nulo para GSTM1 e GSTT1 não teve influência na resposta ao tratamento para essa população. Os fatores de risco associados à hepatite induzida por tuberculostáticos foram: HIV positivo, tuberculose extrapumonar e níveis elevados de transaminases basais. / Patients under treatment for tuberculosis (TB) frequently suffer adverse drug reactions. The most severe, hepatotoxicity is often related to toxic metabolites produced during the main drug metabolism, isoniazid (INH). INH is metabolized by N-acetyltransferase 2 (NAT2), cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) and glutathione S-transferase (GSTM1 and GSTT1) enzymes. Polymorphisms in coding genes can modulate enzyme activity and toxicity, and are distributed in a variable way among populations. This study was designed to determine the frequency of CYP2E1, GSTM1 e GSTT polymorphisms, and to evaluate whether clinical risk factors and polymorphism are related to drug-induced hepatotoxicity. A total of 245 TB outpatients from Hospital Sanatorio Partenon (Porto Alegre, RS) using INH, RMP and PZA were included in the study. Patients provided a written informed consent, clinical records through an interview and blood sample for liver enzymes tests and genotyping. Individuals were genotyped using polymerase chain reaction (GSTM1 and GSTT) and restriction fragment length polymorphism (CYP2E1) methods. Using a database containing genetic and clinical information, possible relations were tested. The frequencies for the CYP2E1 polymorphic alelles RsaI, PstI and DraI are 8%, 8,5% and 12%, respectively. GSTM1 and GSTT1 genes are deleted in 42.9% and 12.4% of the population. Fifteen patients (6.1%) developed hepatotoxicity. Patients without polymorphisms in CYP2E1, having NAT2 slow acetylator profile, are at higher risk for drug-induced hepatotoxicity. Null genotype for GSTM1 and GSTT1 showed no influence in drug response. HIV, extrapulmonary TB and high baseline levels of transaminases are independent risk factors for hepatotoxicity in this population.

Resumo não disponível.

Foram estudados 656 casos de tuberculose, referentes ao ano de 1984, envolvendo população residente no Município de São Paulo, na faixa etária de menores de 15 anos, cujo diagnóstico foi notificado ao Centro de Informaçôes da Saúde da Secretaria de Estado da SaGde (SP). São descritas algumas características gerais, referentes, à região de residência, faixa etária, sexo, formas de tuberculose e localização em diferentes órgãos e/ou sistemas, positividade ao exame bacteriológico, instituição que fêz a notificação e mês do ano em que o diagnôstico de tuberculose foi feito. Em cada caso, além de se levar em consideração algumas características próprias do médico que efetuou a notificação, o diagnóstico foi estudado tendo em vista: o local de sua realização, os elementos disponíveis e o critério utilizado. Os resultados mostram que predominou, na população de estudo, a tuberculose pulmonar, tanto a isolada quanto a associada a tuberculose extrapulmonar. A tuberculose miliar ocorreu em 3,7% dos casos, independente de ser considerada isolada ou associada a outras localizações. A meningite tuberculosa e a tuberculose pleural aparecem entre as localizações extrapulmonares mais frequentes. Em relação ao grupo etário, a maior incidência de casos ocorreu em menores de 5 anos. Em 75% da população de estudo a probabilidade de acerto no diagnóstico, avaliado por um sistema de escore, foi elevada. A notificação dos casos foi realizada por médicos de várias especialidades, predominando a que foi feita por pneumologistas, quando consideradas as especialidades principais (isoladas ou as saciadas). Na população de estudo, 30% dos casos foram notificados por médicos que julgaram ser seus conhecimentos insuficientes para trabalhar com a tuberculose na criança. Entre os casos notificados, 70% o foram por médicos que referiram dificuldades para fazer o diagnóstico de tuberculose na faixa etária de menores de 15 anos. / The present study describes 656 cases of tuberculosis notified to the Center of Health lnformation of the Secretaria de Estado da Saúde of the State of São Paulo, Brazil, during 1984; all individuais in the population aged less than 15 years and lived in the city of São Paulo. The characterization of the population included: age, sex, place of living, the form of tuberculosis, its localization (in different organs and/or systems), positiveness of bacteriological examination, as well as the features of the reporting health services and the month when the diagnosis was done. For each notification, besides considering some aspects of the physician\'s background, it was taken into account for the diagnosis; the criterion utilized, the available elements and the institution from where it carne from. A predominance of pulmonary disease is demonstrated; it occurs either alone or associated to an extrapulmonary tuberculosis. In spite of being isolated or not to others tuberculosis\' localizations, the miliary tuberculosis is responsible for 3,7% of the cases. Among the extrapulmonary tuberculosis, the meningitis and pleural tuberculosis were found more frequent. Considering all cases studied, it is shown that tuberculosis predominantes among children in the age group of 0-4 years. A high degree of accuracy for the diagnosis was guaranteed for 75% of the studjed population, by utilizing a special scoring system. The cases studjed were notified by physicians of different specialties, however predominating the pneumologists when the major specialty is considered. For 30% of the cases, the own physician declared himself to have some lack of knowledge needed for dealing with child tuberculosis. On the other hand, 70% of the cases were notified by physicians declaring to have found difficulties to perform the right diagnosis for children aged less than 15 years.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. / Made available in DSpace on 2012-10-17T04:05:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2016-01-09T00:56:27Z : No. of bitstreams: 1 137752.pdf: 2827856 bytes, checksum: 85e1165a1f3345476c398ba581a073d5 (MD5)