Orientador: Sandra de Moraes Gimenes Bosco / Resumo: A pitiose, cujo agente etiológico é o oomiceto Pythium insidiosum, é umadoença que acomete diversas espécies animais, incluindo-se a humana, sendomais prevalente em equinos. A doença é de difícil diagnóstico e tratamento.Estudos sobre a caracterização proteica de P. insidiosum são escassos. Oobjetivo deste estudo foi determinar o perfil proteico de Pythium insidiosum pormeio da estratégia espectrometria de massas e bioinformática, a fim deidentificar fatores de virulência. Para isso, foi padronizada uma técnica deextração de proteínas totais de P. insidiosum, as quais foram quantificadas. Apartir do protocolo de extração de proteínas foi obtido o perfil das proteínasexpressas pelo oomiceto P. insidiosum por meio da análise por eletroforesebidimensional. Os géis analisados apresentaram 186 spots com massamolecular de 12 a 89 KDa, e ponto isoelétrico entre 4-7, destes 103 foramrecortados e sequenciados. Um total de 36 proteínas foram identificadas eagrupadas de acordo com suas funções, seis delas foram classificadas comoproteínas relacionadas à virulência - β 1,3 glucano sintetase, Hsp 70, enolase,peroxirredoxina 2, proteína G e proteassoma unidade β. Os resultados dopresente trabalho contribuirão para o melhor entendimento dos mecanismospatogênicos de P. insidiosum, bem como para novos estudos no campoterapêutico e diagnóstico. / Abstract: Pythiosis, whose etiologic agent is the oomycete Pythium insidiosum, is a disease that affects several animal species, including human, being more prevalent in horses. The disease has difficult diagnosis and treatment. Studies on protein characterization of P. insidiosum are scarce. The objective of this study was to determine the protein profile of Pythium insidiosum by mass spectrometry and bioinformatics strategies aiming to identify virulence factors. To this end, an extraction was standardized technique of total proteins of P. insidiosum, which were quantitated. From the protein extraction protocol it was obtained the profile of proteins expressed by the oomycete P. insidiosum through analysis by two-dimensional electrophoresis. The gels had 186 spots analyzed with molecular weight 12-89 kDa and an isoelectric point of 4-7, 103 of these were cut and sequenced. A total of 36 proteins were identified and grouped according to their functions, six of them were classified as proteins related to virulence - β 1,3 glucan synthase, Hsp 70, enolase, peroxiredoxin 2, G protein and the proteasome β unit. The results of this work will contribute to better understanding of the pathogenic mechanisms of P. insidiosum as well as for further studies in the therapeutic field and diagnosis. / Mestre

O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil proteico do plasma seminal equino utilizando eletroforese bidimensional de gel de acrilamida (2D-PAGE) e determinar se algumas das proteínas presentes estavam relacionadas com a congelabilidade do sêmen. O plasma seminal foi coletado de dez garanhões, de alta e baixa congelabilidade de sêmen, provenientes do Haras Estatal da Baixa Saxônia, na cidade de Celle, na Alemanha e rotineiramente utilizados em programas de inseminação artificial. Vinte e cinco bandas proteicas foram encontradas nos géis bidimensionais (12%) e sete delas foram identificadas por MALDI-MS. Das 25 proteínas encontradas nas amostras de plasma seminal dos garanhões, duas bandas proteicas apresentaram densidade óptica superior (P<0,05) nas amostras de garanhões de alta congelabilidade o sêmen: as bandas 5 (80-85 kDa, pI 7,54), que foi identificada como CRISP3 e a 45 (18,2 kDa, pI 5,0-5,2) identificada como HSP-2. Contrariamente a banda 7 (75,4 kDa, pI 6,9 – 7,4), identificada como lactoferrina, a 15 (26,7 kDa, pI 5,51) identificada como calicreína, a 25 (25 kDa, pI 7,54) como CRISP3 e a 35 (13,9 kDa, pI 3,8 – 4,2) que foi identificada como HSP-1, apresentaram valores de densidade óptica superior (P<0,05) nos reprodutores de baixa congelabilidade do sêmen. As proteínas foram identificadas através de espectometria de massa MALDI-MS. As evidências encontradas neste experimento mostram que existem diferenças no perfil proteico dos reprodutores de alta e baixa congelabilidade do sêmen, sugerindo as proteínas CRISP3 e a HSP-2 como possíveis marcadores da alta congelabilidade de sêmen de garanhões. / The objective of this study was to evaluate protein profile of equine seminal plasma using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) and to find if any of these proteins were related to semen freezability. Seminal plasma was collected from 10 stallions of high and low semen freezability routinely used in AI programs from the State Stud of Lower Saxony and Artificial Insemination Center. Twenty five protein spots were identified from the 2 D gel (12%), seven of which were present in all samples. Of the 25 proteins found in the research stallions, two spots showed superior relative content (P<0.05) in seminal plasma samples collected from stallions with high semen freezability: the spots 5 (80-85 kDa, pI 7.54) was identified as CRISP3 and 45 (18.2 kDa, pI 5.0-5.2) was identified as HSP-2. Conversely, the spot 7 (75.4 kDa, pI 6.9 – 7.4) was identified as lactoferrin, 15 (26.7 kDa, pI 5.51) was identified as kallikrein, 25 (25 kDa, pI 7.54) was identified as CRISP3 and 35 (13.9 kDa, pI 3.8 – 4.2) was identified as HSP-1, showed superior relative protein content (P<0.05) on seminal plasma samples from stallions with low semen freezability. The proteins were identified by MALDI-MS. There were differences in the seminal plasma protein profile between stallions with high and low semen freezability. It may be suggested that CRISP3 and HSP-2 may be considered possible seminal plasma markers of high semen freezability.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O pinhÃo manso (Jatropha curcas L.), pertencente à famÃlia Euphorbiaceae, à uma planta oleaginosa com grande potencial para a produÃÃo de biocombustÃvel devido à riqueza de lipÃdios em suas sementes. Ele tambÃm apresenta toxicidade devido à presenÃa de Ãsteres de forbol. Nesse contexto, o objetivo deste estudo à realizar o isolamento de plastÃdios, local de sÃntese de Ãcidos graxos e de Ãsteres de forbol, presentes no endosperma de sementes em desenvolvimento de J. curcas. Experimentos preliminares atravÃs de anÃlises morfolÃgica, histolÃgica e histoquÃmica foram realizados para determinaÃÃo do estÃgio do desenvolvimento da semente mais adequado para o isolamento de plastÃdios presentes no endosperma. Estas anÃlises revelaram que a deposiÃÃo de lipÃdios e proteÃnas no endosperma se inicia por volta do 30o DAA. O isolamento de plastÃdios, do endosperma de sementes nesse estÃgio foi realizado por centrifugaÃÃo em gradiente descontÃnuo de PBF-Percoll (10%, 22%, 35%). A fraÃÃo enriquecida de plastÃdios foi obtida a partir da banda formada na interface da camada de 22-35%. AnÃlises por microscopia eletrÃnica de varredura e de transmissÃo foram realizadas para confirmar a eficiÃncia do protocolo empregado na purificaÃÃo dos plastÃdios. Mapas bidimensionais foram estabelecidos, os âspotsâ detectados nos mesmos serÃo identificados por espectrometria de massa, o que possibilitarà a identificaÃÃo das proteÃnas plastidiais envolvidas na sÃntese dos Ãcidos graxos e dos Ãsteres de forbol no endosperma de sementes de J. curcas. / Jatropha (Jatropha curcas L.), belonging to the Euphorbiaceae family, is an oilseed plant with great potential for biofuel production because of the richness of lipids in their seeds. It also presents toxicity due to the presence of phorbol esters. In this context, the objective of this study is the isolation of plastids, the site of synthesis of fatty acids and phorbol esters, present in the endosperm of developing seeds of J. curcas. Preliminary experiments by testing morphology, histology and histochemistry was performed to determine the stage of seed development most suitable for the isolation of plastids present in the endosperm. These analyzes revealed that the deposition of lipids and proteins in the endosperm starts around the 30th DAA. The isolation of plastids, the endosperm of the seeds in this stage was performed by gradient centrifugation PBF-Percoll discontinuous (10%, 22%, 35%). The enriched fractions of plastids has been obtained from the band formed in the interface layer of 22-35%. Analysis by scanning electron microscopy and transmission were performed to confirm the efficiency of the protocol employed in the purification of the plastids. Two-dimensional maps have been laid, the "spots" detected in the same will be identified by mass spectrometry, which will allow the identification of the plastid proteins involved in the synthesis of fatty acids and phorbol esters in the endosperm of seeds J. curcas.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Embora o potencial das sementes de pinhÃo manso como fonte de matÃria prima para a produÃÃo de biodiesel seja amplamente reconhecido, pouco se sabe sobre os padrÃes de deposiÃÃo de Ãleo e proteÃna durante o desenvolvimento da semente. A disponibilidade deste conhecimento serà de fundamental importÃncia para a criaÃÃo de novos genÃtipos que atendam a demanda das indÃstrias do biodiesel. Neste trabalho, foi realizada uma anÃlise proteÃmica inicial do endosperma em desenvolvimento e maduro, objetivando identificar proteÃnas envolvidas no metabolismo de Ãcidos graxos assim como proteÃnas com propriedades alergÃnicas/tÃxicas/antinutricionais que sÃo responsÃveis por tornar o resÃduo da extraÃÃo do Ãleo inadequado para o consumo animal. AtravÃs de eletroforese bidimensional (2DE) foram estabelecidos mapas de referÃncia das fraÃÃes protÃicas do endosperma de sementes em desenvolvimento (ESD) e maduras (ESM), que foram obtidas explorando as propriedades de solubilidade diferencial das proteÃnas do endosperma. Desses mapas de referÃncia, um total 1480 spots foram selecionados (712 âESDâ e 768 âESMâ), retirados dos gÃis 2DE e digeridos com tripsina para posterior anÃlise por espectrometria de massa. Foram utilizados para as buscas, os bancos de dados do NCBInr e um banco de dados local de ESTs de sementes em desenvolvimento e durante a germinaÃÃo de sementes de pinhÃo manso. Um total de 525 spots foram identificados e classificados funcionalmente. Embora a maioria das proteÃnas identificadas fosse relacionadas com funÃÃo de reserva, proteÃnas envolvidas em vias biossintÃticas dos Ãcidos graxos e dos diterpenos foram identificadas, assim como vÃrias proteÃnas relacionadas com metabolismo, inibidores de protease e a proteÃna tÃxica curcina. A taxa de identificaÃÃo relativamente baixa obtida neste estudo pode em parte ser atribuÃda ao fato de nÃo existir bancos de dados extensos para esta espÃcie. Os resultados aqui apresentados representam a primeira anÃlise em profundidade do padrÃo de deposiÃÃo e identificaÃÃo das proteÃnas de sementes de pinhÃo manso e fixam as bases sobre as quais o proteoma completo de sementes de pinhÃo manso poderà ser estabelecido. / Although the potential of the seed Jatropha as a source of raw material for the production of biodiesel is widely recognized, little is known about the deposition patterns of oil and protein during seed development. The availability of this knowledge will be crucial for the creation of new genotypes to meet the demand from the biodiesel industry. In this study, we performed an initial proteomic analysis of the endosperm in developing and mature in order to identify proteins involved in fatty acid metabolism as well as proteins with allergenic properties / toxic / antinutritional that are responsible for marking the residue of oil extraction unsuitable for consumption animal. Through two-dimensional electrophoresis (2DE) were established reference maps of protein fractions from the endosperm of the seed development (ESD) and mature (ESM), which were obtained by exploring the properties of differential solubility of proteins in the endosperm. These reference maps, 1480 spots in total were selected (712 "ESD" and 768 "ESM"), removed from the 2DE gel and digested with trypsin for subsequent analysis by mass spectrometry. Were used for searching the databases NCBInr and a local database of ESTs from developing seeds and during germination of Jatropha. A total of 525 spots were identified and classified functionally. Although most of the proteins identified were related reservation function, proteins involved in biosynthetic pathways of fatty acids were identified and diterpenes, as well as various metabolic-related proteins, protease inhibitors and curcina toxic protein. The relatively low rate of identification obtained in this study may in part be attributed to the fact that there is extensive databases for this species. The results presented here represent the first in-depth analysis of the deposition pattern and identification of proteins from seeds of Jatropha and lay the foundations on which the complete proteome of seeds of Jatropha can be established.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / A realizaÃÃo desta pesquisa teve por objetivos a descriÃÃo do mapa eletroforÃtico bidimensional do plasma seminal de touros adultos Bos indicus, raÃa Brahman, bem como a determinaÃÃo das associaÃÃes estatÃsticas entre proteÃnas do plasma seminal e parÃmetros seminais destes touros. Amostras de sÃmen de 56 touros foram coletadas e o plasma seminal foi obtido atravÃs de centrifugaÃÃo e submetido à eletroforese bidimensional. Os gÃis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados por meio do aplicativo PDQuest. Os touros foram divididos em grupos de alta e baixa motilidade espermÃtica e alto e baixo percentual de cÃlulas espermÃticas morfologicamente normais. As proteÃnas mais abundantes no plasma seminal dos touros Bos indicus e detectadas em todos os 56 gÃis apresentaram semelhanÃa com espermadesinas e BSPs. A expressÃo de spots com valores de kDa e pI equivalentes aos das proteÃnas aSFP, BSPs, clusterina , albumina e osteopontina foram estatisticamente diferentes entre os grupos de animais com parÃmetros contrastantes de motilidade e morfologia espermÃticas. As associaÃÃes encontradas entre tais spots protÃicos e os parÃmetros seminais sugerem a possibilidade do uso destes como marcadores moleculares da fertilidade potencial dos animais. / This research aimed to describe the two-dimensional electrophoresis map of bull seminal plasma of adult Bos indicus, Brahman, and the determination of statistical associations between proteins of seminal plasma and semen parameters of these bulls. Semen samples from 56 bulls were collected and seminal plasma was obtained by centrifugation and subjected to two-dimensional electrophoresis. The gels were stained with colloidal Coomassie, scanned and analyzed using PDQuest application. The bulls were divided into groups of high and low sperm motility and high and low percentage of morphologically normal sperm cells. The most abundant proteins in seminal plasma of bulls Bos indicus and detected in all 56 gels showed similarity to espermadesinas and BSPs. The expression of spots with pI values &#8203;&#8203;kDa protein equivalent to aSFP, BSPs, clusterin, albumin and osteopontin were significantly different between groups of animals with contrasting parameters of sperm motility and morphology. The associations found between such protein spots and semen parameters suggest the possibility of their use as molecular markers of potential fertility of animals.

Em bovinos, o sucesso no estabelecimento da gestação depende de interações entre o concepto e o útero. Tais interações ocorrem através de moléculas presentes no ambiente uterino. Falhas nesse processo causam 30-40% de perdas de gestação. As proteínas são constituintes desse ambiente e possuem um importante papel nesse processo. Objetivou-se na presente dissertação caracterizar o perfil protéico do ambiente uterino de fêmeas bovinas, ciclando ou prenhes, durante o período crítico, utilizando eletroforese bidimensional. O objetivo específico foi comparar a composição protéica de lavados uterinos obtidos in vivo, por sonda de folley ou post-mortem no dia 18 após o estro de vacas não inseminadas ou gestantes. Para a obtenção das amostras, 48 fêmeas bovinos tiveram seu ciclo estral sincronizado e foram alocadas aleatoriamente para receberem lavagens in vivo por sonda de folley (12 inseminadas e sete não inseminadas) ou para receberem lavagens post-mortem (12 inseminadas e cinco não inseminadas) no dia 18 após o estro. Após a coleta, os lavados foram processados e submetidos à eletroforese bidimensional. Os géis foram analisados utilizando o programa Image Master-2D ELITE V. 4.01 (GE Healthcare) para determinação do ponto isoelétrico (PI) e peso molecular relativo (PMR) das proteínas nos diferentes grupos e análise da densidade óptica. Foram selecionadas 178 proteínas presentes nos lavados. Em relação à distribuição das proteínas de acordo com o ponto isoelétrico, 74% (132/178) apresentaram PI entre 5,5 e 8, em relação ao peso molecular, 44% (79/178) das proteínas possuíam PMR menor que 50KDa enquanto 54% (95/178) entre 50 e 100KDa. Nos lavados realizados por sonda de folley (FC ou FP) foram selecionadas 151 proteínas, sendo 96 nos lavados de animais cíclicos e 86 nos prenhes. Os lavados realizados post-mortem (PMC ou PMP) apresentaram apenas 54 proteínas, das quais 24 estiveram presentes nos lavados PMC e 36 nos lavados PMP. Em relação ao estado reprodutivo 115 proteínas foram encontradas nos lavados dos animais cíclicos (FC ou PMC), enquanto 104 proteínas foram selecionadas nos lavados de animais prenhes (FP e PMP). Entre os lavados realizados por sonda de folley (FC e FP) 31 proteínas foram comuns entre os estados, enquanto entre os lavados realizados post-mortem (PMC e PMP) apenas seis proteínas estiveram presentes em ambos os lavados. Nos lavados realizados em animais ciclando (FC e PMC) cinco proteínas estiveram presentes em ambos os tipos de lavados, enquanto nos lavados realizados em animais prenhes (FP e PMP) 18 proteínas foram comuns em ambos os tipos de lavado. Entre os lavados FC e PMP ou FP e PMC, 15 e 6 proteínas, respectivamente, foram comuns. As proteínas presentes exclusivamente nos lavados de vacas prenhes, possivelmente estão envolvidas no diálogo materno-embrionário durante o processo de estabelecimento da gestação. Proteínas detectadas exclusivamente nos lavados obtidos via sonda de folley podem ser devidas ao influxo de proteínas do soro sanguíneo em resposta à manipulação do trato reprodutivo durante a obtenção dos lavados. Esperava-se uma maior efetividade dos lavados realizados post-mortem em relação aos realizados por sonda de folley. Entretanto os lavados obtidos por sonda de folley foram melhores por identificar um maior numero de proteínas, permitindo identificar diferenças maiores entre os lavados de animais ciclando e prenhes. Concluiu-se que a eletroforese bidimendional constitui um método adequado para avaliar quantitativamente o perfil protéico do ambiente uterino bovino e que tanto o estado reprodutivo quanto o método de obtenção de lavados uterinos modificam sua composição protéica. Novos estudos são necessários para se obter a seqüência de aminoácidos das proteínas localizadas para que se conheça sua identidade e função na gestação inicial de bovinos. / In the cattle, the outcome for the establishment of pregnancy depends on interactions between conceptus and uterus. These interactions occur through molecules presents in the uterine environment. Failure in this process causes 30-40% of loss in gestation. The proteins are component of this environment and have a important role in this process. The aim of this dissertation was to characterize the protein profile of the uterine environment in cows, cyclic or pregnant, during the critical period, using two-dimensional electrophoresis. The specific aim was to compare the protein composition of uterine washings recovered in vivo, through a folley catheter, with washings recovered post-mortem at day 18 after estrus of not inseminated or pregnant cows. To obtain the samples 48 cows had their estrous synchronized and here aleatoric put in the group to receive washings in vivo through the folley catheter (12 inseminated and seven not inseminated) or to be washed post-mortem (12 inseminated and five not inseminated) at day 18 after estrus. After the recover, the washings were proceeded and submitted to two-dimensional electrophoresis. The gels were analyzed using the software Image Master-2D ELITE V. 4.01 (GE Heathcare) to determine the isoelectric point (PI) and relative molecular weight (PMR) of the proteins presents in the different groups and analysis of the optical density. One hundred and seventy eight proteins were presents in the washings. The distribution of the proteins according to the PI, 74% (132/178) had PI between 5,5 and 8 and according to the PMR 44% (79/178) of the proteins showed PMR lower than 50KDa, while 54% (95/178) had PMR between 50 and 100KDa. In the washings recovered through the folley catheter (FC and FP) 151 proteins were selected, being 96 from the cyclic cows and 86 from the pregnant cows. The washings recovered post-mortem (PMC and PMP) showed only 54 proteins, from those 24 were present in the cyclic animals and 36 in the pregnant animals. According to the reproductive status 115 proteins were found in the washings from the cyclic animals (FC and PMC), while 104 proteins were selected from the washings of the pregnant animals (FP and PMP). Among the washings recovered through the folley catheter (FC and FP) 31 proteins were the same between the reproductive status. While in the washings recovered post-mortem (PMC and PMP) only six proteins were present in both washings. In washings done in the cyclic animals (FC and PMC) five proteins were presents in both kind of washings, while in washings done in the pregnant animals (FP and PMP) 18 proteins were the same in both kind of washings. Among the washings FC and PMP or FP and PMC, 15 and six proteins, respectively were the same. The proteins presents exclusively in the washings of the pregnant animals are probably involved with the embryo-maternal interplay during the process of pregnancy establishment. Proteins detected exclusively in the washings recovered through the folley catheter may be inflow of proteins from the serum, in response to the uterine manipulation during the process of washing. It was expected a better effect from the washings post-mortem than the ones through the folley catheter. However the washings from the folley catheter had a better result, because they identified a greater number of proteins which allowed identify greater differences between the washings from cyclic and pregnant animals. In conclusion, the two-dimensional electrophoresis is a adequate method to analyze the quantitatively proteins profile of the uterine environment in the cow and that both the reproductive status and the method to obtain the uterine washings modify the proteins composition. New studies are necessary to obtain the amino acids sequence of the proteins found so that we know their identity and function in the beginning of pregnancy in the cow.

Estudou-se o perfil de proteínas de plasma seminal de touros das raças Nelore (Bos taurus primigerus indicus) e Simental (Bos taurus primigerus taurus), criados a campo, em regime de acasalamento múltiplo e manejo extensivo, na região de Dourados/MS, a fim de analisar a relação entre estas proteínas e características ligadas ao desempenho reprodutivo de touros. Coletaram-se amostras de sêmen no período de inverno (Julho/2001) e verão (Fevereiro/2002), realizando-se inicialmente o exame andrológico nos animais, e em seguida a análise padrão do sêmen. O plasma seminal foi, então, submetido à dosagem de proteínas totais, à dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), para avaliação da ocorrência de lipoperoxidação, e à eletroforese bidimensional de proteínas. Para análise do perfil proteico de plasma seminal da cada raça, foram utilizados os seguintes parâmetros: comparação entre os períodos de inverno e verão; comparação de grupos de amostras separados de acordo com a quantificação de características ligadas ao desempenho reprodutivo (morfologia espermática, dosagem de proteína total e dosagem de TBARS); e comparação de grupos de amostras separados de acordo com classificações para avaliação da capacidade reprodutiva, previamente descritas na literatura (Breeding Soundness Evaluations – BSEs). Os touros da raça Simental demonstraram menor adaptação às condições ambientais tropicais, com valores mais altos de defeitos espermáticos maiores, proteína total e dosagem de TBARS no período de verão. Observou-se grande variabilidade no perfil proteico entre as raças Nelore e Simental e, dentro de cada raça, encontrou-se expressiva variação individual. O perfil de proteínas de plasma seminal de touros Nelore apresentou 155 spots, entre os quais 04 se destacaram como possíveis marcadores de características ligadas ao desempenho reprodutivo. Já na raça Simental foram identificados 248 spots, com destaque para 04 spots, que demonstraram maior potencial como marcadores de características de interesse para a reprodução. Os resultados mostram que o perfil de proteínas de plasma seminal está relacionado ao desempenho reprodutivo de touros, fazendo-se necessários maiores estudos sobre as proteínas que se destacaram como marcadores, a fim de identificar as funções que elas exercem no trato reprodutivo e nos eventos ligados à fertilização. / Seminal plasma proteins profiles from Nelore (Bos taurus primigerus indicus) and Simmental (Bos taurus primigerus taurus) bulls, used for multiple-sire breeding under range conditions, at Dourados/MS region, were studied aiming to analyze the relation between these proteins and traits linked to bulls’ reproductive performance. Semen samples were collected in the winter (July/2001) and summer (February/2002). Initially, an andrological examination was performed, followed by standard semen analysis. Seminal plasma was subjected to total protein quantification, thiobarbituric acid reactive substances quantification (TBARS, to evaluate lipid peroxidation), and two-dimensional protein electrophoresis. To analyze seminal plasma protein profile of each breed, the following parameters were used: comparison between winter and summer, comparison among groups of samples divided by quantification of traits linked to reproductive performance (sperm morphology, total protein quantification, TBARS quantification) and comparison among groups of samples divided by breeding soundness evaluations (BSEs), previously reported in literature. Simmental bulls showed lower adaptability to tropical environment conditions, with higher values of major sperm defects, total protein and TBARS in the summer. A great variability was observed in the protein profile between Nelore and Simmental breeds, and, for each breed it was found great individual variability too. Nelore seminal plasma protein profile presented 155 spots, 04 of which were considered potential markers for traits linked to reproductive performance. For Simmental breed, 248 spots were identified, with special interest for 04 spots, which showed higher potential as markers to reproductive characteristics. Results show that seminal plasma protein profile is related to bulls’ reproductive performance. Further studies about those proteins which are potential markers are needed, to determine their function at bulls’ reproductive system and in the events related to fertilization.

Apesar da importância econômica e ambiental que a madeira representa como fonte natural e renovável de energia e fibras, pouco é conhecido sobre os processos celulares, moleculares e bioquímicos envolvidos com a sua formação. Usando metodologias proteômicas como 2D-PAGE e espectrometria de massas foi iniciada a análise do proteoma do caule de Eucalyptus grandis em diferentes estádios de desenvolvimento (5 meses, 3 anos e 6 anos). O presente trabalho baseou-se especificamente na idade de cinco meses. As plantas tiveram suas folhas, raízes e cascas removidas e seus caules foram macerados em almofariz com nitrogênio líquido e as proteínas extraídas pelo método de extração fenólica. As proteínas foram separadas por eletroforese bidimensional em fitas IPG com gradiente de pH imobilizado linear de 4-7 na primeira dimensão e gel de poliacrilamida (12,5%) na segunda dimensão. A coloração dos géis foi realizada com coomassie G250. Foram detectados 438 spots e um total de 168 spots foram retirados do gel, digeridos com tripsina e submetidos ao sequenciamento por espectrometria de massas através do sistema LCMS/ MS. O sequenciamento por MS apresentou uma eficiência de 72,02% possibilitando a identificação de 121 spots, enquanto que 35 (20,83%) não apresentaram homologia com nenhuma base de dados. Entre as proteínas identificadas 22 foram representadas por mais de um spot, podendo indicar a ocorrência e eventos provenientes do splicing alternativo, modificações pós-traducional, variações alélicas de uma mesma proteína ou degradação da amostra. Entre os spots analisados, 22,02% estão relacionados com a produção de energia, (17,86%) metabolismo, (13,69%) processes celulares, (0,60%) transporte, (8,33%) componentes estruturais, (5,36%) metabolismo macromolecular, (4,17%) proteínas putativas, (20,83%) não apresentaram homologia com nenhuma base de dados e (7,14%) não demonstraram resultado. A comparação realizada entre o volume de 59 proteínas e os seus respectivos transcritos demonstrou que não existe correlação entre mRNA e as proteínas do caule. O método possibilitou uma rápida e precisa separação e identificação das proteínas do caule de Eucalyptus grandis que são diferencialmente expressas durante a fase de crescimento de cinco meses. / The process of wood formation is an important economical factor for the forestry industry and it is also of ecological importance, although little is known about the proteins involved in wood formation. The sequencing, identification and analysis of proteins provides such information of wood formation. Using proteomics techniques such as two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry we have started a proteomic analysis of wood formation in Eucalyptus grandis at different stages of development (5 months, 3 and 6 years old). This work presents data related to the stage of 5 months. Using high resolution 2DE with linear pH gradient ranging from 4 to 7, a total of 438 spots were detected. However, only 168 spots were analyzed by LC ESIMS/ MS and 121 were identified (72.02%) while 35 (20.83%) presented no homology in the database used. Overall, 22 proteins appeared as multiple spots and accounted for most of the proteins found in the group. This observation may reflect post-translation modification, alternative splicing events, isozyme variation, allelic variation of the same protein, but also protein degradation. Over the 168 spots analysed, (22.02%) play a role in energy, (17.86%) metabolism, (13.69%) cellular processes, (0.60%) transport, (8.33%) structural components, (5.36%) macromolecular metabolism, (4.17%) putative protein, (20.83%) no homology and (7.14%) no result. For 59 proteins, the spot volume was compared with their respective transcript with mRNAs extracted from wood forming tissue. The method provided a faster and accurate tool for separation and identify of protein which are differentially expressed under different stages of development in Eucalyptus grandis.

Keywords: Arabidopsis thaliana, phytoremediation, abiotic stress, ibuprofene, doxorubicin, two-dimensional electrophoresis Nowadays, develop of the pharmaceutical industry is very fast. Reason of this trend is ever-increasing number of diseases, lifestyle and still increasing demand for the drugs. With this trend growing interest in the analysis of the residues of pharmaceuticals in the environment which is result of incomplete wastewater treatment. This diploma thesis is studying effect of cytostatic drugs, specifically doxorubicin and one of the most widely used analgesics - ibuprofen, at the proteome level of the model plant Arabidopsis thaliana. Proteins isolated from plants exposed to the drugs were separated by two-dimensional electrophoresis. Comparing of protein maps by PDQest program (Bio-Rad, USA) was found several proteins whose expression was affected by the presence of drugs in the culture medium. Selected proteins were identified by LC - MS / MS.

Metodologia proteômica baseada em eletroforese bi-dimensional (2D-PAGE) foi usada para auxiliar no entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na injúria renal induzida pelo flúor (F) e definir biomarcadores potenciais para fluorose. Três grupos de ratos Wistar machos recém-desmamados (21 dias de vida) foram tratados com água de beber contendo 0 (controle), 5 ou 50 ppm F, por 60 dias (n=6/grupo). Durante o período experimental, os animais foram mantidos individualmente me gaiolas metabólicas, a fim de que o consumo de água e ração fosse avaliado, bem como as excreções urinária e fecal de F. Os animais foram mortos e o rim esquerdo e o soro foram coletados para análises histopatológica e de F, respectivamente. Para análise proteômica foram coletados o rim direito e a urina (no dia anterior ao sacrifício, num coquetel contendo inibidores de protease em gelo). Após o isolamento das proteínas, os perfis proteômicos renal e urinário foram examinados usando 2D-PAGE e coloração com azul de Coomassie brilhante. Foi possível detectar uma doseresposta em relação à ingestão e excreção de F, bem como em relação aos níveis de F presentes no soro e nos rins dos animais. As análises histológicas não revelaram danos aos rins induzidos pelo F, com exceção de uma congestão vascular no grupo de 50 ppm F. Para os rins, a análise quantitativa de intensidade (software Image Máster Platinum, alterações de 2 vezes) revelou 30 e 17 proteínas diferencialmente expressas, respectivamente, entre os grupos controle X 50 ppm F e controle X 5 ppm F. Para a urina, 9, 10 e 13 proteínas aumentaram ou diminuíram nos grupos controle X 5 ppm F, 5 ppm F X 50 ppm F e controle X 50 ppm F, respectivamente. Nove proteínas foram identificadas satisfatoriamente por MALDI-TOF TOF MS. As proteínas identificadas estão relacionadas principalmente ao metabolismo, desintoxicação e housekeeping. Esses dados indicam que a análise proteômica de rim e urina de animais tratados com F é capaz de identificar proteínas diferencialmente expressas, mesmo em casos de baixas doses de F. Assim, essa ferramenta pode contribuir para o entendimento dos mecanismos envolvidos na fluorose, apontando proteínas-chave que deveriam ser melhor investigadas, bem como potenciais biomarcadores de toxicidade. / Two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) based proteomics approach was used to better understand the molecular mechanisms of renal injury induced by fluoride (F) and define potentials biomarkers of fluorosis. Three groups of weanling male Wistar rats (21 days old) were treated with drinking water containing 0 (control), 5, or 50 ppm F for 60 days (n=6/group). During the experimental period, the animals were kept individually in metabolic cages, in order to analyze the water and food consumption, as well as fecal and urinary F excretion. Animals were killed and left kidney and serum were collected for histopathological examination and F analysis, respectively. For proteomic analysis, right kidney and urine (one day before sacrifice, in protease-inhibitors cocktail for 8 hours in ice box) were collected. After protein isolation, renal and urinary proteome profiles were examined using 2D-PAGE and coomassie brilliant blue staining. It was possible to detect a dose-response regarding F intake and F excretion, as well as F levels in serum and kidneys. The histological analysis revealed no damage in kidneys induced by F, except for a vascular congestion in the 50 ppm F group. For kidney, quantitative intensity analysis (Image Master Platinum software, 2-fold changes) revealed 30 and 17 differentially expressed proteins between control X 50 ppm F, and control X 5 ppm F groups, respectively. As for urine, 9, 10 and 13 proteins increased or decreased in control X 5 ppm F, 5 ppm F X 50 ppm F and control X 50 ppm F groups, respectively. Nine proteins were successfully identified by MALDI-TOF TOF MS. The identified proteins are mainly related with metabolism, detoxification and housekeeping. These data indicate that proteomic analysis in kidney and urine of F-treated animals is able to identify differentially expressed proteins, even in cases of low F doses. Thus, this approach can contribute for the understanding of the mechanisms underlying fluorosis, by indicating key-proteins that should be better addressed, as well as potential toxicity biomarkers.