Les Inhibiteurs de l'activité Tyrosine Kinase (ITK) de BCR-ABL (Imatinib (IMA), Nilotinib (NIL) et Dasatinib (DAS)) ont révolutionné le traitement de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC), mais la cinétique et l'intensité des réponses thérapeutiques restent variables. Par ailleurs, plusieurs travaux démontrent qu'il persiste chez la majorité des patients des cellules souches leucémiques (CSL) CD34+ résistantes aux ITK et capables de reconstituer la maladie. Partant du principe que la thérapie ciblée (les ITK) devait atteindre le compartiment cellulaire et du constat qu'aucune méthode ne permettait d'évaluer la quantité d'ITK dans les cellules malignes vivantes, nous avons développé un procédé en cytométrie en flux pour quantifier ces molécules dans les cellules de la LMC. Nous avons ainsi démontré que la mort cellulaire des lignées K562 et KCL22 à 24h est étroitement corrélée à la quantité d'IMA accumulée dès la 1ère heure. L'application du procédé aux cellules primaires a montré un taux intracellulaire d'ITK dépendant des caractéristiques des cellules et variable d'un sujet à l'autre (Article 1). Pour l'instant, en raison de l'hétérogénéité de notre cohorte, nous n'avons pas pu mettre en évidence de corrélation entre l'accumulation des ITK et la réponse thérapeutique de la LMC. Notre procédé nous a permis de suivre l'accumulation in vivo du DAS dans les blastes circulants d'un patient LMC en phase d'acutisation, en parallèle de la réactivation de pSyk348 - que nous avons identifié comme marqueur de progression - au moment de l'échappement au DAS (Article 2). Un avantage majeur du procédé est la possibilité d'analyser les différentes sous-populations, dont les cellules CD34+ de LMC. Ces dernières ont un taux d'ITK intracellulaire plus faible que les cellules matures, voire absent chez certains patients. Pour l'instant une corrélation significative avec les tests clonogéniques effectués en parallèle est retrouvée seulement avec le DAS. Enfin, nos résultats préliminaires suggèrent des différences entre les cellules CD34+ du sang et de la moelle. En conclusion, ce procédé permet d'évaluer la quantité d'ITK dans des sous-populations cellulaires précises et viables. Nous envisageons de poursuivre ce projet par l'évaluation de l'intérêt d'un dosage précoce du taux d'ITC intracellulaire in vivo (après la 4ème prise) d'une part et d'autre part par l'étude de l'influence du microenvironnement sur la résistance des CSL de LMC aux ITK et sur certaines dérégulations propres à ce compartiment cellulaire. / The Tyrosine Kinase Inhibitors (TKI) of BCR-ABL (Imatinib (IMA), Nilotinib (NIL) and dasatinib (DAS)) have revolutionized the treatment of Chronic Myeloid Leukemia (CML). However therapeutic responses remain variable. Moreover, several studies showed that most patients have persistent CD34+ leukemic stem cells (LSCs) resistant to TKI and the origin of disease relapse. Given that the targeted therapy (TKI) should reach malignant cells and that no method was able to assess the amount of TKI in viable target cells, we have developed a process by flow cytometry for TKI quantification in target cells. By using K562 and KCL22 cell lines we showed that cell death at 24hrs was closely related to IMA uptake after one hour of incubation. We then applied our method to primary cells and showed an intracellular level of IMA, NIL and DAS dependent on cell characteristics and heterogeneous from one subject to another (Article 1). Probably because of the heterogeneity of our series, we did not find any correlation between the accumulation of TKI and therapeutic response of CML. Moreover, we used our process to observe a decrease in DAS accumulation in vivo in circulating blasts of a CML patient with acute transformation, in spite of significant DAS uptake, we observed a recurrence of Syk phosphorylation in Y348 that we identified as a potential marker of acutisation, at the same time of disease resistance (Article 2). A major advantage of our process is the possibility to analyze the different cell subsets, including CD34+ CML cells. These cells had a lower (even absent in cells from some patients) level of intracellular TKI compared to mature cells. The clonogenic assays performed in parallel showed a significant correlation with DAS only. Finally, our preliminary results suggest differences between CD34+ cells from blood and those from bone marrow. In conclusion, our process allows evaluating the amount of TKI in viable cell subpopulations. This project will be continued with i) the study of the potential interest of the early evaluation of in vivo intracellular level of TKI (after the fourth dose) and ii) the influence of the microenvironment on CSL resistance to TKI and epigenetics deregulations.

Signaling pathways are complex and function to transmit signals from the extracellular environment into the cell. Analysis of results obtained from a high throughput siRNA screen led to the identification of Membrane protein palmitoylated 3 (MPP3) and Leukocyte Tyrosine Kinase (LTK) as novel negative regulators of the Wnt pathway. MPP3 is a MAGUK family protein and domain mapping studies indicated that the Guk domain plays a role in the negative regulation of the pathway. LTK, a receptor tyrosine kinase, has several transcript variants one of which lacks the entire kinase domain (LTK∆KD). While LTK∆KD interacted with the Wnt receptor Frizzled7, the full length LTK did not, suggesting distinct modes of pathway regulation. Analysis of neuronal cells, NIE115 and Neuro2a, demonstrated LTK is expressed and that cells are Wnt3a responsive, thereby providing a neuronal model system appropriate for further studies on the mechanism and biological role of LTK as a negative regulator of the Wnt pathway

Signaling pathways are complex and function to transmit signals from the extracellular environment into the cell. Analysis of results obtained from a high throughput siRNA screen led to the identification of Membrane protein palmitoylated 3 (MPP3) and Leukocyte Tyrosine Kinase (LTK) as novel negative regulators of the Wnt pathway. MPP3 is a MAGUK family protein and domain mapping studies indicated that the Guk domain plays a role in the negative regulation of the pathway. LTK, a receptor tyrosine kinase, has several transcript variants one of which lacks the entire kinase domain (LTK∆KD). While LTK∆KD interacted with the Wnt receptor Frizzled7, the full length LTK did not, suggesting distinct modes of pathway regulation. Analysis of neuronal cells, NIE115 and Neuro2a, demonstrated LTK is expressed and that cells are Wnt3a responsive, thereby providing a neuronal model system appropriate for further studies on the mechanism and biological role of LTK as a negative regulator of the Wnt pathway

Introduction : Le traitement des cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) EGFR mutés repose sur les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) du récepteur de l’Epidermal Growth Factor (EGFR). Cependant tous les patients traités par ITK EGFR finissent par présenter une progression tumorale, du fait de mécanismes de résistance comme l’amplification du gène codant pour le récepteur tyrosine kinase MET. Il n’existe actuellement aucune donnée sur les modifications phénotypiques induites par l’activation de MET dans ce contexte. L’objectif de cette thèse est de déterminer si l’amplification de MET, lors de la résistance aux ITK EGFR dans les CBNPC EGFR mutés, confère aux cellules tumorales un phénotype plus agressif et modifie l’histoire naturelle de la maladie.Méthodes : Les capacités de prolifération, de croissance sans ancrage, de formation de sphéroïdes, de résistance à l’anoïkis et de migration ont été étudiées in vitro dans la lignée HCC827, dérivée d’un CBNPC EGFR muté, et dans sa lignée fille HCC827-GR6 (GR6) devenue résistante aux ITK EGFR via une amplification du gène MET. L’expression de la vimentine, de ZEB1, et de la E-cadherine a également été étudiée dans les deux lignées cellulaires afin d’évaluer l’impact de l’amplification de MET sur la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). In vivo la croissance tumorale et le potentiel métastatique ont respectivement été analysés dans des modèles murins de xénogreffe ectopique et d’injection intracardiaque. Enfin les données cliniques de patients issus de 15 centres avec un CBNPC EGFR muté métastatique, présentant une forte surexpression de MET en immunohistochimie (score 3+) ou une amplification de MET en FISH sur une re-biopsie réalisée après la progression sous ITK EGFR ont été analysées rétrospectivement. Résultats : In vitro, l’amplification de MET induisait une augmentation significative de la prolifération, de la croissance sans ancrage, de la formation de sphéroïdes, de la résistance à l’anoïkis et de la migration. En présence d’un inhibiteur de MET, le PHA-665752, ces différentes propriétés biologiques étaient réduites de façon significative dans les cellules GR6 porteuses de l’amplification de MET. Il était également mis en évidence dans les cellules GR6 une augmentation de l’expression de la vimentine et de ZEB1. In vivo, l’amplification de MET augmentait significativement la croissance tumorale et le potentiel métastatique. Un traitement par crizotinib, ITK ciblant MET, diminuait de façon significative le potentiel métastatique des cellules porteuses de l’amplification de MET. Enfin les patients atteints d’un CBNPC EGFR muté, porteur d’une amplification de MET à la résistance à l’ITK EGFR, présentaient une durée jusqu’à apparition de nouvelles métastases plus courte après progression sous ITK EGFR que les patients avec une forte surexpression de MET sans amplification génique. Conclusion L’amplification de MET dans un contexte de résistance aux ITK EGFR est associée à un phénotype tumoral plus agressif. Ces résultats plaident en faveur d’une utilisation précoce d’inhibiteurs de MET en association avec les ITK EGFR afin d’éviter l’émergence d’un clone tumoral résistant plus agressif. / Introduction: Treatment of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) mutated non-small cell lung cancers (NSCLC) relies on EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKI). However, all patients treated with EGFR TKI eventually present tumor progression, due to mechanisms of resistance such as the MET amplification. There is currently no data on phenotypic changes induced by MET activation in this context. The objective of this thesis is to determine whether the MET amplification during EGFR TKI resistance in the EGFR mutated NSCLC induces a more aggressive phenotype in tumor cells and alters the natural history of the disease.Methods: Proliferation, anchorage independent growth, spheroid formation, anoïkis resistance and migration were studied in vitro in the HCC827 cell line, derived from an EGFR mutated NSCLC, and in its daughter cell line HCC827-GR6 (GR6) which became resistant to EGFR TKI through MET amplification. The expression of vimentin, ZEB1, and E-cadherin was evaluated in these cellular models in order to investigate an epithelial to mesenchymal transition (EMT) process induced by the MET amplification. In vivo, the tumor growth and the metastatic potential were analyzed by subcutaneous xenograft and intracardiac injection in mouse models. Finally, the clinical data of patients from 15 centers with a metastatic EGFR mutated NSCLC, exhibiting high MET overexpression in immunohistochemistry (score 3+) or MET amplification assessed by FISH on a re-biopsy performed after TKI EGFR progression were analyzed retrospectively.Results: In vitro, the MET amplification induced a significant increase in proliferation, anchorage independent growth, spheroid formation, anoïkis resistance and migration. Treatment with PHA-665752, a MET TKI, significantly reduced these biological properties in the GR6 cells harboring the MET amplification. An increase in the expression of vimentin and ZEB1 was also observed in the GR6 cells. In vivo, the MET amplification significantly increased the tumor growth and the metastatic potential. Treatment with crizotinib, another MET TKI, significantly decreased the metastatic potential of cells carrying MET amplification. Finally, patients with an EGFR mutated NSCLC, displayed a time to new metastases after TKI EGFR progression shorter than patients with high MET overexpression without MET amplification.Conclusion: The MET amplification during EGFR TKI resistance is associated in EGFR muted NSCLC with a more aggressive tumor phenotype. These results argue for the early use of MET inhibitors in combination with EGFR TKIs to avoid the emergence of a more aggressive resistant tumor clone.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia do mesilato de imatinibe, em comparação com a quimioterapia usual com vimblastina e prednisona, no tratamento do mastocitoma canino e descrever os efeitos colaterais apresentados pelas medicações. Bem como analisar a expressão do VEGF (fator de crescimento endotelial), a relação da expressão do gene c-kit por RT-PCR e marcação imunoistoquímica do KIT com a presença de mutações na justamembrana e a relação desta mutação com a resposta à terapia. Para tanto foram incluídos 29 animais com diagnóstico citológico de mastocitoma, estes animais foram submetidos a tomografia computadorizada para determinação das medidas das formações cutâneas e em seguida divididos em 2 grupos. O grupo 1 foi tratado com o protocolo quimioterápico de vimblastina e prednisona por 12 semanas e o grupo 2 com o mesilato de imatinibe na dose de 10 mg/Kg a cada 24 horas por 8 semanas. A avaliação da resposta ao tratamento foi realizada com mensurações periódicas das formações com paquímetro e nova tomografia ao final do tratamento para mensuração do maior diâmetro e volume tumoral. Um fragmento das formações cutâneas foi coletado antes do início do tratamento para graduação histológica da neoplasia, determinação do índice mitótico e imunomarcação para KIT, VEGF e Ki- 67. Parte do material coletado teve o DNA e RNA extraídos e posterior sequenciamento dos exons 11 do gene c-kit e determinação da expressão deste e do seu ligante por RT-PCR. A toxicidade a medicação foi avaliada segundo as normas do VCOG 1.1.A taxa de resposta do grupo VP foi de 7,7 % e no grupo MI de 28,6%, embora os pacientes tratados com mesilato de imatinibe tenham apresentado maior chance de resposta a terapia, não foi observado diferença entre os dois grupos. Os dois protocolos foram bem tolerados, os pacientes do grupo MI d menor número de efeitos colaterais. O grau histológico, Indice mitótico, padrão imunohistoquimico do KIT, além da quantificação do ki-67 foram homogêneos nos dois grupos e não influenciaram na resposta ao tratamento. A quantificação do VEGF foi mais intensa nos pacientes com remissão parcial e total. Não foi observado relação entre a quantificação do KIT e a expressão do gene c-kit, que foi maior nos pacientes que responderam ao tratamento, porém a associação desta com a resposta a terapia não pode ser determinada. Mutações ativantes no exon11 do gene c-kit não foram identificadas. O tratamento com o mesilato de imatinibe é bem tolerado pelos animais, no entanto este não se mostrou superior ao protocolo padrão de quimioterapia para o tratamento do mastocitoma; este resultado pode ter sido influenciado pelo número de animais incluídos no estudo. Mutações em outros domínios do receptor KIT e a ação do ITK em receptores como do PDGF e o VEGF podem estar relacionados a resposta a esta classe de fármacos observada neste estudo, a despeito da ausência de mutações ativantes no exon 11 do gene c-kit. / The objective of this study was to evaluate the efficacy of imatinib mesylate, compared with the usual chemotherapy with vinblastine and prednisone in the treatment of canine mast cell tumor and describe the side effects submitted by medications. Well as analyzing the expression of VEGF (vascular endothelial growth factor), the relationship between the expression of c-kit gene by RT-PCR and immunohistochemical staining of KIT with the presence of mutations in the juxtamembrane and the relationship of this mutation with response to therapy. For both 29 animals with cytological diagnosis of mast cell tumor were included, these animals underwent computed tomography to determine the measured skin formations and then divided into 2 groups. Group 1 was treated with the chemotherapeutic protocol vinblastine and prednisone for 12 weeks and the second group with the imatinib mesylate in a dose of 10 mg / kg every 24 hours for 8 weeks. The assessment of response to treatment was performed with periodic measurements of the formations Caliper and a new computed tomography in the end of treatment to measure the largest tumor diameter and volume. A fragment of skin formations was collected before the initiation of treatment for histological grading, determination of mitotic index, KIT and VEGF staining patterns and the proliferation marker Ki67. Part of the collected material was extracted RNA and DNA and subsequent sequencing of 11 exons of the c-kit gene and determination and expression of its ligand by RT-PCR. The medication toxicity was evaluated according to the standards of VCOG 1.1.A response rate of the VP group was 7.7% and 28.6% MI group, although patients treated with imatinib had a higher chance of response therapy, no difference in response between the two groups was observed. The two protocols were well tolerated, patients in the MI group had a smaller number of side effects. The histological grade, mitotic index, staining patterns KIT, beyond the quantification of Ki-67 were homogeneous in both groups and did not influence the response to treatment. Quantification of VEGF was intensely in patients with partial and total remission. It was no relationship between KIT and quantification of the expression of c-kit gene, which was higher in patients who responded to treatment, but its association with response to therapy cant be determined. Exon11 activating mutations in the c-kit gene were not identified. Treatment with imatinib mesylate is well tolerated by the animals, however this was not superior to standard chemotherapy protocol for the treatment of mast cell tumors; this result may have been influenced by the number of animals included in the study. Mutations in other domains of the KIT receptor and action in ITK receptors as PDGF and VEGF may be related to response to this class of drugs in this study, despite the absence of activating mutations in exon 11 of c-kit gene.

La résistance à la chimiothérapie constitue un frein majeur à son efficacité. Notre équipe a récemment pu montrer que le masitinib, un nouvel inhibiteur de protéines tyrosine kinases, possède une activité de resensibilisation des cellules tumorales résistantes à la chimiothérapie lorsqu'il est combiné à certaines chimio-drogues. L'objectif des travaux de cette thèse est de déterminer les voies de signalisation, modulées par l'action du masitinib, qui sont impliquées dans la resensibilisation aux chimiothérapies et amélioration de l'activité anti-tumorale.Dans la première partie de la thèse, nous avons pu identifier la nucléoside kinase dCK (désoxycytidine kinase), protéine activatrice d'un grand nombre de chimiothérapies, comme nouvelle cible du masitinib. Cette première étude nous a permis de mettre en évidence un nouveau concept thérapeutique: le masitinib, un composé chimique de type inhibiteur de protéines tyrosine kinases, peut jouer en même temps le rôle d'activateur de nucléoside kinase.Nous avons pu mettre en évidence dans la deuxième partie de la thèse que le traitement combiné entre l'épi-drogue décitabine et le masitinib peut être plus efficace pour la réexpression de certains gènes non ou peu induits par la décitabine seule.En conclusion, ces travaux nous ont permis de mettre en évidence l'interaction entre un inhibiteur de protéine tyrosine kinases et une nucléoside kinase, dans un concept d'activation enzymatique qui pourra certainement servir de base pour l'élaboration de nouvelles petites molécules chimiques spécifiques de l'activation de dCK ou d'autres nucléosides kinases nécessaires à l'activation des drogues de chimiothérapie. / Resistance to chemotherapy is considered as one of the major blockers of its efficacy. Recently, our team demonstrated that masitinib, a new tyrosine kinases inhibitor, possesse a resensitization activity of cell lines resistant to chemotherapy when associated with chemodrugs.The aim of this work is to determine signaling pathways, modulated by masitinib action, that could explain the resensitization to chemotherapy and improvement of anti-tumoral activity.In the first part of this work, we identified the nucleoside kinase dCK (deoxycytidine kinase), a chemotherapy activating protein, as a new target of masitinib. In summary, this first part of the work allowed us to describe a new and never described concept: masitinib, a small molecule belonging to tyrosine kinases group, can also play a role as nucleoside kinase activator.We were able to demonstrate through the second part of the work that the combined treatment of the epidrug decitabine and masitinib can be more effective than decitabine treatment for the re-expression of some genes non or weakly induced by decitabine when used alone.In conclusion, These data allowed us to introduce an interaction between a tyrosine kinases inhibitor and a nucleoside kinase, as an enzymatic activation new concept. This could be used as a base for the design of new small chemical molecules specific for dCK or other nucleoside kinases essential for the activation of chemodrugs. This concept will obviously help to imagine and evaluate more potential therapeutic combinations of chemodrugs and small chemical molecules to overcome the resistance to chemotherapy dependent on nucleoside kinases.

FGFR3 est un récepteur cellulaire impliqué dans de nombreux processus biologiques chez l’homme. La dérégulation de l’activité tyrosine kinase de FGFR3 est à l’origine d’anomalies de croissance osseuse et de certains cancers (myélome multiple, vessie). Le blocage de ce récepteur par des inhibiteurs compétitifs de l’ATP constitue une approche thérapeutique intéressante. La première partie de la thèse a concerné la préparation d’analogues du PD173074, inhibiteur nanomolaire de FGFR3, issu de l’industrie. Basée sur un squelette pyrido[2,3-d]pyrimidine, une chimiothèque de triazoles a été obtenue via une réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire catalysée au cuivre (I). Parmi les 27 analogues synthétisés, le meilleur inhibiteur restaure ex vivo la croissance osseuse de fémurs de souris naines. Dans une seconde partie, nous avons développé deux nouvelles séries d’inhibiteurs de type pyrazolooxadiazole et pyrazolo[4,3-d]pyrimidine, à partir d’un précurseur pyrazole commun. Des procédures micro-ondes rapides et efficaces ont été utilisées pour conduire aux composés cibles. L’étude des relations structure-activité, réalisée sur une soixantaine de composés, a été validée par modélisation moléculaire. Le composé le plus actif présente une CI50 submicromolaire / FGFR3 is a cellular receptor involved in many human biological processes. Deregulated tyrosine kinase activity of the FGFR3 is at the origin of abnormal bone growth and some cancers (multiple myeloma, bladder). Blocking this receptor by ATP competitive inhibitors may constitute an interestingtherapeutic approach. The first part of this thesis concerned the preparation of analogues of PD173074, a nanomolar inhibitor of FGFR3, stemming from the industry. Based on pyrido [2,3-d] pyrimidine skeleton, a library of triazoles was obtained via copper (I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloaddition. Among the 27 analogues synthesized, the best inhibitor restores bone growth of dwarf mice femurs ex vivo. In a second part, we have developed two new series of inhibitors based on pyrazolooxadiazole and pyrazolo [4,3-d] pyrimidine skeletons, derived from a common pyrazole precursor. Rapid and efficient microwave procedures were used to yield the target compounds. The study of structure-activity relationships, performed on sixty compounds, was confirmed by molecular modeling. The most active compound has a submicromolar IC50 value.

Au sein d'un organisme les cellules se divisent et assurent la croissance, la différentiation et l'homéostasie des tissus. Des travaux récents proposent qu'elles communiquent activement entre voisines au sein des organes solides pour coordonner leur propre division et la préservation de l'intégrité tissulaire. Nous proposons que la signalisation Eph-éphrine, acteur de la communication cellulaire locale, participe à cette coordination entre division cellulaire et cohésion du tissu. Au cours de ma thèse, j'ai démontré dans plusieurs modèles cellulaires que la signalisation Eph-éphrine contrôle la division cellulaire et peut induire des retards dans l'abscission et de la polyploïdie. J'ai prouvé par vidéomicrosocpie que ces défauts d'abscission dépendent du domaine catalytique du récepteur EphB2 et de l'activation de la protéine tyrosine kinase relais c-Src. En cascade, c-Src phosphoryle un régulateur clé de la stabilité du pont intercellulaire, la protéine citron kinase (CitK). J'ai également observé que CitK était anormalement localisé durant la cytocinése en aval de la voie Eph. Par des essais kinase in vitro, j'ai exclu une phosphorylation directe de CitK par le récepteur Eph et identifié c-Src comme capable de phosphoryler directement CitK. J'ai identifié les résidus tyrosines de CitK phosphorylés par c-Src, mutés deux d'entre eux et à l'aide d'analyses de sauvetage phénotypique, démontré que ces résidus étaient nécessaires et suffisants pour induire des défauts d'abscission. J'ai ensuite validé in vivo ce rôle original de la voie Eph-éphrine, dans le contexte du développement neuronal chez la souris. Plusieurs membres de la famille des Eph-éphrines sont exprimés dans les progéniteurs neuraux à l'origine des neurones corticaux et des auteurs ont montrés que CitK contrôle la cytocinèse de ces cellules. En utilisant un système Cre-lox, j'ai spécifiquement éteint la signalisation Eph dans ces progéniteurs et observé une modification de la ploïdie neuronale dans ces animaux. J'ai également observé dans les progéniteurs neuraux une co-localisation physiologique de résidus tyrosines phosphorylés et de la protéine CitK, qui adopte un enrichissement apical caractéristique. Ces résultats suggèrent notamment que la signalisation Eph-éphrine pourrait contrôler l'abscission des progéniteurs neuraux via la phosphorylation de CitK. La cytocinèse est aujourd'hui décrite comme un processus cellulaire autonome orchestré par la machinerie intracellulaire. Les résultats obtenus durant mon doctorat suggèrent que la cytocinèse est également régulée par l'environnement local de la cellule comme j'en ai fait la démonstration avec la signalisation Eph-éphrine. D'autre part, mes travaux suggèrent que la phosphorylation de CitK sert d'interrupteur moléculaire durant la progression à travers la division cellulaire et le contrôle de la ploïdie des neurones. / Cells within an organism successfully divide to ensure growth, differentiation and homeostasie. Recent work suggests that dividing cells actively communicate with neighbours thus spatially and temporally coordinating cell division while maintaining tissue cohesiveness. We hypothesized that Eph-ephrin signalling, a local cell-cell signalling pathway, could participate in coordinating cell division within a tissue. Using vertebrate and invertebrate cell culture models I showed that Eph-signalling controls cell division and induces delay in the abscission of nascent daughter cells as well as polyploidy. Using time-lapse imaging I proved that the Eph-mediated abscission failure depends on the catalytic activity of the receptor via the non receptor tyrosine kinase relay molecule c-Src. Downstream of Eph signalling c-Src phosphorylates the protein citron kinase (CitK) a well known regulator of intercellular bridge stability. I also observed that CitK was abnormally localized during cytokinesis when Eph signalling was active. Further, using in vitro kinase assays, I demonstrated that Eph does not directly phosphorylate CitK but that c-Src could do so. In addition, using Mass Spectrometry I mapped all tyrosine residues directly phosphorylated by c-Src. I mutated two of them located in the Rho binding domain of CitK and demonstrated that phosphorylation of those residues are necessary and sufficient to induce cytokinesis failure. I validated in vivo this novel role of Eph-ephrin signalling in a physiological context in the developing mouse neocortex. Members of the Eph/ephrin family are expressed in neural progenitors that give rise to neurons of the cortex upon neurogenic division. Importantly, CitK has been shown by others to control cytokinesis of these progenitor cells. Using the Cre-lox system, I specifically turned off Eph forward signalling in neural progenitor cells and observed an alteration of neuronal ploidy in these mutant animals. Further, I also observed that CitK which adopts a particular apical localisation in neural progenitors physiologically co-localized with phosphorylated tyrosine residues. Altogether, these results suggest that Eph-ephrin signalling controls abscission of neural progenitors by promoting phosphorylation of CitK. The textbook view of cytokinesis is that it is a cell autonomous event orchestrated by the intracellular machinery. Data obtained during my PhD suggest that cytokinesis is also regulated by local environment, here Eph/ephrin signalling, and that phosphorylation of CitK may represent a molecular switch in the normal progression of cell division and in the control of neuronal ploidy.

Les dernières avancées dans les traitements des hémopathies aboutissent à un meilleurs taux de rémission complète ainsi qu' à de meilleurs taux de survie après traitement. Cependant les risques de rechutes restent élevés. Notre projet s'inscrit dans la compréhension du rôle des cellules NK dans l'évolution de ce type de pathologies. Dans une première partie nous nous sommes intéressés à la polyglobulie de Vaquez. Cette pathologie présente une évolution lente et progressive, et elle est caractérisée par une mutation de JAK2 présente dans la lignée myéloïde chez plus de 95% des patients. Nous avons cherché à détecter la mutation dans les cellules NK de patients, puis, pour savoir si la mutation avait un effet sur les NK, nous avons exploré leurs fonctions in vitro. Nos résultats ont montré que, bien que la mutation soit présente dans les cellules NK, elle ne semble pas avoir d'impact sur les fonctions des cellules NK que nous avons pu tester. Nous en avons conclu que l'évolution de la polyglobulie de Vaquez en leucémie n'était peut-être pas due à une perte de fonction des NK mais plutôt à leur inhibition par l'environnement cellulaire.Dans une deuxième partie nous avons étudié la régulation des natural cytotoxicity receptors dans la leucémie aiguë myéloïde. D'apres des travaux antérieurs nous avons émis l'hypothèse que l'expression des trois NCR aurait une régulation commune s'effectuant au niveau de transcription de leurs gènes. Nos recherches bio-informatiques ainsi que notre expérimentation d'immunoprécipitation de la chromatine (Chip) montrent que le facteur de transcription ETS-1 semble être impliqué dans la régulation commune aux trois NCR. / The latest advances in blood disorders treatments lead to a better complete remission rate and a better survival rate after treatment. However, the risk of relapse remains high. Our project is included in the understanding of NK cells role in the development of these diseases.In a first part, we focused on polycythemia Vera for several reasons: the pathology has a slowly progressive disease, and it is characterized by the presence of JAK2 mutation for > 95% patients. We wanted to know if this mutation was found in NK cells from PV patients and what effects the mutation had on NK cells functions. Our results have shown that although the mutation was found in NK cells, it appears to have no impact on NK cells functions. We conclude that the evolution of PV to leukemia is not due to a loss of NK cell functions but to their inhibition by cellular environment.In a second part, we investigated the regulation of natural cytotoxicity receptors in acute myeloid leukemia because previous works have shown that NCR are weakly expressed in AML patients, that this down-regulation is acquired during evolution of AML and reversible after complete remission, ant that NCR weak expression is related to poor prognosis. We supposed that the expression of the three NCR has a common regulation at genes transcription level. Our bioinformatic researches and our experiment of chromatin immunoprecipitation show that ETS-1 transcription factor is a good candidate involved in the common regulation of the three NCR.

CSF-1R (colony-stimulating factor 1 receptor) est un récepteur transmembranaire à activité tyrosine kinase exprimé à la surface des monocytes, des macrophages et de leurs progéniteurs. Son ligand, CSF-1, oriente les cellules souches hématopoïétiques vers le lignage myéloïde et permet la différenciation des monocytes en macrophages. Une localisation nucléaire de CSF-1R a été décrite dans certaines lignées tumorales, dans des tumeurs mammaires primitives et dans les macrophages murins. Dans le noyau de ces cellules, CSF-1R régulerait la phosphorylation de protéines nucléaires et l'expression de gènes de la prolifération. Nous avons identifié une localisation nucléaire de CSF-1R dans les monocytes primaires humains par différentes approches et différents anticorps. La forme nucléaire de CSF-1R correspond à la protéine entière monomérique qui est transportée depuis la membrane plasmique vers le noyau, de manière rétrograde, après activation par son ligand et avec celui-ci. L'utilisation d'inhibiteurs de l'activité kinase de CSF-1R diminue la quantité de récepteur dans le noyau. En revanche le blocage des mécanismes d'export nucléaire dépendant de CRM1 par la leptomycine B conduit à l'accumulation de la protéine dans ce compartiment. Dans les monocytes, CSF-1R est localisé sur la chromatine, dans les régions intergéniques et introniques et colocalise avec la marque H3K4me1 présente au niveau des enhancers activés. CSF-1R est situé à proximité de gènes régulant la morphogénèse, le développement du système nerveux, l'ossification et la différenciation cellulaire. Le récepteur est présent sur le promoteur du gène PU.1, facteur de transcription clé dans la différenciation myéloïde et la génération des monocytes, ainsi que sur des gènes impliqués dans la différenciation, la polarisation, la survie et les fonctions des macrophages. Au niveau de la chromatine, CSF-1R interagit avec des facteurs de transcription comme EGR1 sur lequel il exerce un effet co-répresseur. Cette localisation nucléaire de CSF-1R est conservée lorsque les monocytes se différencient en macrophages en réponse à CSF-1. CSF-1R nucléaire est alors relocalisé vers les régions promotrices et exoniques où il colocalise avec la marque H3K4me3. Il est présent à proximité de gènes régulant la vascularisation, la phagocytose, le métabolisme, la réponse au stress et à l'hypoxie. Il interagit avec les facteurs de transcription ELK1 et YY1, et joue un rôle de co-activateur. Lorsque les monocytes sont différenciés en macrophages par une autre cytokine, le GM-CSF, CSF-1R reste dans le noyau des cellules mais sa localisation sur la chromatine et ses interacteurs diffèrent de ceux des monocytes et des macrophages générés par CSF-1, démontrant un régulation différentielle de CSF-1R nucléaire selon le stade de différenciation et les signaux environnementaux. Dans des monocytes de patients atteints de leucémie myélomonocytaire chronique, l’expression, la localisation sur l’ADN et les interacteurs de CSF-1R sont modifiés, indiquant une dérégulation des fonctions nucléaires du récepteur en condition pathologique. CSF-1R est donc localisé dans le noyau des monocytes et des macrophages où il exerce un rôle de régulation de l'expression des gènes dont PU.1. Des résultats préliminaires suggèrent une localisation nucléaire du récepteur dans certaines populations de progéniteurs myéloïdes où il pourrait participer à la regulation de la différenciation. De nombreux inhibiteurs de CSF-1R sont en développement afin de cibler les macrophages infiltrant les tumeurs. Nos résultats démontrent que certains inhibiteurs ont la capacité de cibler la forme membranaire et la forme nucléaire du récepteur et donc d'inhiber l'ensemble des activités de CSF-1R dans les cellules, renforçant l'activité potentielle de ces traitements. / CSF-1R (colony-stimulating factor 1 receptor) is a transmembrane receptor with a tyrosine kinase activity. It is expressed at the cell surface of monocytes, macrophages and their progenitors. Its ligand, CSF-1, has an instructive role on hematopoietic stem cells to direct their differentiation into the myeloid lineage. CSF-1R is also able to differentiate monocytes into macrophages. A nuclear location was described for CSF-1R in cancer cell lines, primary breast tumors and murine macrophages. In the cell nucleus, CSF-1R was suggested to regulate nuclear protein phosphorylation and gene expression. We demonstrate that a small part of CSF-1R is in the nucleus of primary human monocytes, using different antibodies and technical approaches. Nuclear CSF-1R corresponds to full length monomeric receptor. After activation by its ligand, CSF-1R is translocated form cell surface to the nucleus through a retrograde transport, together with CSF-1. Kinase activity inhibitors impaired this process while inhibitors of CRM1-dependant nuclear export (leptomycin B) can revert this effect. In monocytes, CSF-1R is localized on chromatin, mainly on intergenic and intronic regions. It colocalizes with H3K4me1 mark which signs active enhancers. The receptor is present around genes involved in morphogenesis, nervous system development, ossification and cell differentiation. CSF-1R is also located on PU.1 promoter, which is a master transcription factor involved in myeloid and monocyte differentiation. CSF- 1R is also present on genes implicated in macrophage functions, differentiation, polarization and survival. At the chromatin level, CSF-1R interacts with different transcription factors like EGR1 and exerts a co-repressive role to decrease or limit gene expression. CSF-1R nuclear localization persists in macrophages generated by exposure of monocytes to CSF-1. It entails CSF-1R relocalization on promoter-TSS and exonic regions where it colocalizes with H3K4me3 mark. The receptor is close to genes regulating vascularization, phagocytosis, metabolism, stress and hypoxia responses. CSF-1R interacts with ELK1 and YY1 to promote macrophage functions. When monocytes are differentiated into macrophages with GM-CSF, CSF-1R also remains in the nucleus. However, its chromatin localization and interactions change compared to monocytes and CSF-1 differentiated macrophages. This indicates that nuclear CSF-1R is differentially regulated, depending on the cytokine that triggers cell differentiation. In monocytes from chronic myelomonocytic leukemia, CSF-1R expression, chromatin localization and interactors are modified, indicating a deregulated CSF-1R nuclear function under pathological state. Altogether, we showed that CSF-1R is localized in the nucleus of human monocytes and macrophages where it regulates gene expression including PU.1. Preliminary results suggest CSF-1R nuclear location in myeloid progenitor subsets where the receptor could directly regulate the expression of myeloid differentiation genes. Targeting CSF-1R is currently tested as a therapeutic strategy to impair tumor infiltrating macrophages. Our results show that CSF-1R inhibitors are able to target both membrane and nuclear forms and thus to inhibit all CSF-1R activities in the cells, enhancing the potential therapeutic effects of these molecules.