Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-01-20T21:18:47Z No. of bitstreams: 1 KeilaMarthaAmorimBarroso_TESE.pdf: 21818921 bytes, checksum: 6e052052d865c5daec54b63d43d919f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-01-22T20:15:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 KeilaMarthaAmorimBarroso_TESE.pdf: 21818921 bytes, checksum: 6e052052d865c5daec54b63d43d919f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-22T20:15:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KeilaMarthaAmorimBarroso_TESE.pdf: 21818921 bytes, checksum: 6e052052d865c5daec54b63d43d919f5 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / As neoplasias de gl?ndulas salivares exibem uma grande diversidade morfol?gica e comportamentos biol?gicos variados o que suscita o interesse na pesquisa destas les?es. A dissemina??o das c?lulas tumorais ? um passo inicial para a progress?o de neoplasias malignas e, dentro deste contexto, os vasos linf?ticos neoformados s?o considerados essenciais para que ocorra essa dissemina??o. O papel do VEGF (fator de crescimento endotelial vascular) na forma??o dos vasos ? fato conhecido mas, pouco se sabe a respeito de sua participa??o em tumores de gl?ndula salivar. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a express?o do VEGF-C e VEGF-D, a densidade linf?tica tumoral (D2-40) e a prolifera??o endotelial linf?tica (dupla marca??o D2-40/Ki-67) em uma s?rie de neoplasias de gl?ndulas salivares. A amostra foi composta por 20 adenomas pleom?rficos, 20 carcinomas aden?ides c?sticos, 20 carcinomas mucoepiderm?ides e 10 casos de tecido glandular salivar com caracter?sticas de normalidade para efeito comparativo. Todos os casos estudados exibiram express?o positiva para VEGF-C em regi?o peritumoral e intratumoral, n?o sendo encontrada diferen?as de imunoexpress?o entre os grupos. No entanto, o grupo dos carcinomas aden?ides c?sticos demonstrou diferen?a significativa da imunoexpress?o do VEGF-C segundo o padr?o cribriforme e s?lido (p = 0,004). A maioria dos casos constantes do presente estudo, apresentou fraca marca??o para VEGF-D em regi?o peritumoral e intratumoral. Na avalia??o da densidade endotelial linf?tica peritumoral, intratumoral e total, os grupos estudados revelaram um gradiente crescente, com valores menores para o grupo dos adenomas pleom?rficos, seguido dos carcinomas mucoepiderm?ides e carcinomas aden?ides c?sticos. A densidade endotelial linf?tica foi maior entre os tumores malignos do que nos tumores benignos. N?o foi observada correla??o entre a imunoexpress?o de VEGF-C e VEGF-D em rela??o a densidade linf?tica tumoral e a prolifera??o endotelial linf?tica / Salivary gland neoplasms exhibit a great morphological diversity and varied biological behavior which raises the interest in the study of these lesions. The spread of tumor cells is an early step in the progression of malignancies and the neoformed lymphatic vessels are considered essential in tumor dissemination. Vascular endotelial growth fator (VEGF) is a family of proteins involved in angiogenesis e lymphangiogenesis. However, in salivar tumors we have limited information on the expression. The aim of this study was to assess the expression of VEGF-C and VEGF-D, lymphatic vessel density (single-staining D2-40) and lymphatic endothelial proliferation (double labeling D2-40/Ki-67) in a series of salivary glands neoplasms. We selected 20 cases of pleomorphic adenoma, 20 of mucoepidermoide carcinoma, 20 of adenoid cystic carcinoma and 10 tissue sample of normal salivary gland. All cases studied showed positive expression of VEGF-C in intratumoral and peritumoral region, no differences in immunoreactivity was found between the groups. However, the group of adenoid cystic carcinoma showed a significant difference in immunoreactivity of VEGF-C by the cribriform and solid pattern (p = 0.004). Most of the cases included in this study showed weak immunoreactivity for VEGF-D in intratumoral and peritumoral region. In the assessment of lymphatic endotelial density peritumoral, intratumoral and total, the groups showed an increasing gradient, with lower values for the group of pleomorphic adenomas followed by mucoepidermoid carcinoma and adenoid cystic carcinoma. Lymphatic endothelial cell density was higher in malignant than benign tumors. No correlation was observed between the immunoreactivity of VEGF-C and VEGF-D in relation to tumor lymphatic density and lymphatic endothelial proliferation

Hintergrund Die Strahlentherapie ist neben der radikalen Prostatektomie eine Standardtherapie zur Behandlung von Prostatatumoren und führt zu sehr guten Ergebnissen für die lokale Tumorkontrolle und für das Überleben. Allerdings ist, wie bei der Operation auch, dabei das Risiko eines Rezidivs für fortgeschrittene Tumoren im Gegensatz zu Tumoren in früheren Stadien relativ hoch. Daher besteht eine hohe Dringlichkeit zur Verbesserung der Strahlentherapie vor allem bei fortgeschrittenen Tumoren. Ein Ansatz hierfür ist die Kombination der Bestrahlung mit molekularen Therapien. Ziel dabei ist es, bestimmte Zielproteine zu blockieren, um die Strahlensensibilität der Prostatakarzinomzellen zu erhöhen. Ein potentielles Target könnte hierbei die Blockade des VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalwegs (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C; NRP-2 – Neuropilin 2; Akt – Proteinkinase B) sein. Im Prostatakarzinom sind die Konzentrationen von VEGF-C und NRP-2 im Vergleich zu normalen Prostatazellen erhöht. Aus Untersuchungen ist bekannt, dass beide Proteine eine progressive Wirkung auf die Tumorgenese haben. In Vorarbeiten zeigen Muders et al. (2009) zudem eine Aktivierung von Akt über die VEGF-C/NRP-2-Achse und eine darüber vermittelte Resistenz gegenüber oxidativem Stress durch H2O2. Akt wirkt in verschiedenen Tumorentitäten außerdem protektiv gegenüber Bestrahlung. Es besteht die Annahme, dass dies auch für Prostatakarzinomzellen gilt. Zielstellung Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob und über welchen Mechanismus VEGF-C, NRP-2 und Akt die Strahlenresistenz in Prostatakarzinomzelllinien beeinflussen. Methoden Es wurden in vitro- und in vivo-Experimente in den humanen Prostatakarzinomzelllinen PC-3, DU145, LNCaP sowie in PC-3-Xenografts durchgeführt. Der Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz wurde in vitro nach Herunterregulierung der entsprechenden Gene mittels siRNA beziehungsweise nach Supplementierung mit humanem rekombinanten VEGF-C in Koloniebildungsassays untersucht. Zur Ermittlung des Einflusses von VEGF-C und von NRP-2 auf mögliche Zellüberlebensmechanismen wurden der autophagische Flux nach Blockade der Autophagie mit Bafilomycin A1 mittels Western Blot, die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur mittels Quantifizierung der γH2AX Foci sowie die Zellzyklusverteilung mittels Durchflusszytometrie untersucht. Die Signalweiterleitung von VEGF-C über Akt sowie, als weitere Möglichkeit, die Signalweiterleitung über ERK1/2 wurden nach siRNA-Transfektion mit und ohne Bestrahlung mittels Western Blot geprüft. Weitere Versuche zu Akt erfolgten in vitro und in vivo mit dem PI3K/Akt-Inhibitor Nelfinavir in PC-3-Zellen. Der in vitro Effekt von Nelfinavir auf die Strahlenresistenz wurde dabei mithilfe eines Koloniebildungsassays nach Behandlung der Zellen mit 10 µM Nelfinavir getestet. In vivo wurde die Wirkung von Nelfinavir ohne sowie in Kombination mit Bestrahlung in PC-3-Xenografts in Nacktmäusen untersucht. Für die Bestimmung der Tumorwachstumszeit wurden die Mäuse mit 80 mg Nelfinavir/kg Körpergewicht 30 mal innerhalb von 6 Wochen behandelt. In einem weiteren Versuch wurde die lokale Tumorkontrolle bei gleichzeitiger fraktionierter Bestrahlung mit Gesamtdosen von 30 bis 120 Gy und einer Nachbeobachtungszeit von 180 Tagen bestimmt. Ergebnisse Die Untersuchungen zur Strahlenresistenz über den VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalweg haben ergeben, dass in den drei Prostatakarzinomzelllinien PC-3, DU145 und LNCaP VEGF-C signifikant Strahlenresistenz vermittelt. Für NRP-2 hingegen wurde festgestellt, dass es in Abhängigkeit von der Zelllinie entweder zur Strahlenresistenz (DU145) oder zur Strahlensensibilisierung (PC-3) führt. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass durch VEGF-C in PC-3 und DU145 weder über Akt noch über ERK1/2 Strahlenresistenz vermittelt wird. Die Versuche zu Strahlenresistenz vermittelnden Mechanismen ergaben, dass VEGF-C in unbestrahlten PC-3-Zellen die Autophagie fördert, NRP-2 jedoch nicht. Unter Bestrahlung war ein Effekt von VEGF-C und NRP-2 auf die Autophagie nicht reproduzierbar nachweisbar. Ein weiterer Versuch hat gezeigt, dass in PC-3 Autophagie keinen Einfluss auf das klonogene Überleben nach Bestrahlung hat. Außerdem wurde festgestellt, dass VEGF-C in PC-3 die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur nicht beeinflusst. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass eine Verminderung des VEGF-C-Gehalts in PC-3 zum G2/M-Arrest führt. In DU145 konnte jedoch kein Effekt beobachtet werden. In den Untersuchungen zum Einfluss von Akt auf die Strahlenresistenz unabhängig von VEGF-C und NRP-2 wirkte Nelfinavir inhibierend auf die Akt-Phosphorylierung am Ser473 und beeinflusste das klonogene Überleben von PC-3-Zellen minimal. In PC-3-Xenografts führte Nelfinavir zu keiner Tumorwachstumsverzögerung und wirkte in vitro und in vivo nicht strahlensensibilisierend. Schlussfolgerung In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass VEGF-C in Prostatakarzinomzellen Strahlenresistenz vermittelt. Diese Erkenntnis könnte als ein Forschungsansatz zur Entwicklung einer kombinierten Therapie aus VEGF-C-Blockade und Bestrahlung dienen. Ein potentieller Mechanismus, über den VEGF-C die Strahlenresistenz vermittelt, ist, in Abhängigkeit von der Zelllinie, die Aufhebung des G2/M-Arrests. NRP-2 wirkt in der Vermittlung von Strahlenresistenz beziehungsweise sensibilität je nach Zelllinie unterschiedlich. Hierzu sollten weitere Untersuchungen bezüglich möglicher Interaktionen innerhalb anderer Signalwege mit strahlensensibilisierendem Einfluss erfolgen. Innerhalb des untersuchten Signalwegs konnte weiterhin festgestellt werden, dass VEGF-C Strahlenresistenz nicht über Akt vermittelt. Die vorliegende Arbeit enthält die erste Studie sowohl zur Untersuchung des Einflusses von Nelfinavir in Kombination mit Bestrahlung auf das Überleben von Prostatakarzinomzellen in vitro als auch auf die Tumorwachstumszeit und die lokale Tumorkontrolle in vivo. Hierin konnte keine strahlensensibilisierende Wirkung von Nelfinavir nachgewiesen werden. Da Nelfinavir in Zellen anderer Tumorentitäten strahlensensibilisierend wirkt und außerdem bekannt ist, dass es in eine Reihe von Signalwegen eingreift, die das Zellüberleben fördern oder hemmen, sollte weiter geklärt werden, ob Tumorzellen mit einem bestimmten genetischen Profil besser auf die Behandlung mit Nelfinavir ansprechen. / Background In addition to radical prostatectomy, radiotherapy is a standard therapy for the treatment of prostate tumours and leads to good results for local tumour control and survival. However, as with the resection, the risk of recurrence for advanced tumours is relatively high compared to tumours in earlier stages. Therefore, there is a high urgency to improve radiotherapy especially for advanced stages. One approach is the combination of irradiation with molecular therapies. The aim is to block certain target proteins to increase the radiosensitivity of the prostate carcinoma cells. A potential target could be the blockade of the VEGF-C/NRP-2/Akt signalling pathway (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C; NRP-2 – neuropilin 2; Akt – protein kinase B). In prostate cancer the concentrations of VEGF-C and NRP-2 are increased compared to normal prostate cells. Studies have shown that both proteins have a progressive effect on tumourigenesis. In preliminary work Muders et al. (2009) also showed the activation of Akt via the VEGF-C/NRP-2 axis and a resistance to H2O2 induced oxidative stress. Akt also has a protective effect against irradiation in various tumour entities. It is assumed that this also applies to prostate carcinoma cells. Aim of the study Within the framework of this thesis, it was investigated whether and via which mechanism VEGF-C, NRP-2, and Akt affect the radioresistance in prostate carcinoma cell lines. Methods In vitro and in vivo experiments were performed in the human prostate carcinoma cell lines PC-3, DU145, LNCaP, as well as in PC-3 xenografts. The influence of VEGF-C and NRP-2 on the radioresistance was examined in vitro after knock down of the corresponding genes using siRNA or after supplementation with human recombinant VEGF-C in colony formation assays. In order to determine the influence of VEGF-C and NRP-2 on possible cell survival mechanisms, the autophagic flux was examined after the blockade of autophagy with bafilomycin A1 using western blot, the DNA double strand break repair by quantification of the γH2AX foci, and the cell cycle distribution by flow cytometry. The signal transduction of VEGF-C via Akt as well as, as a further possibility, the signal transduction via ERK1/2 were tested after siRNA transfection with and without irradiation using western blot. Further experiments on Akt were performed in vitro and in vivo with the PI3K/Akt inhibitor nelfinavir in PC-3 cells. The in vitro effect of nelfinavir on radioresistance was tested using a colony formation assay after treatment of the cells with 10 μM nelfinavir. In vivo, the effect of nelfinavir without and in combination with irradiation in PC-3 xenografts was investigated in nude mice. For the determination of the tumour growth time, the mice were treated with 80 mg nelfinavir/kg body weight 30 times within 6 weeks. In a further experiment, the local tumour control was determined with simultaneous fractionated irradiation with total doses of 30 to 120 Gy and a follow-up time of 180 days. Results The investigations on radioresistance via the VEGF-C/NRP-2/Akt signalling pathway showed that in the three prostate carcinoma cell lines PC-3, DU145, and LNCaP VEGF-C significantly mediates radioresistance. For NRP-2 however, it was found that, depending on the cell line, it either leads to radioresistance (DU145) or radiosensitization (PC-3). Further, it was shown that in PC-3 and DU145 VEGF-C does not mediate radioresistance via Akt or ERK1/2. The experiments on radioresistance mediating mechanisms revealed that VEGF-C promotes autophagy in untreated PC-3 cells, but NRP-2 does not. Under irradiation, an effect of VEGF-C and NRP-2 on autophagy could not be detected reproducibly. A further experiment has shown that in PC-3 autophagy has no influence on the clonogenic survival after irradiation. In addition, it was found that VEGF-C does not affect the DNA double strand break repair in PC-3. Furthermore, it was shown that a reduction in the VEGF-C content leads to a G2/M arrest in PC-3. However, no effect could be observed in DU145. In studies regarding the influence of Akt on radioresistance independent of VEGF-C and NRP-2, nelfinavir inhibited Akt phosphorylation at Ser473 and minimally affected the clonogenic survival of PC-3 cells. In PC-3 xenografts, nelfinavir did not lead to any tumour growth delay and did not have a radiosensitizing effect in vitro or in vivo. Conclusion In the experiments, it was shown that VEGF-C mediates radioresistance in prostate cancer cells. This finding could serve as a research approach for the development of a combined therapy of a VEGF-C blockade and irradiation. A potential mechanism by which VEGF-C mediates radioresistance is the reverse of the G2/M arrest, depending on the cell line. NRP-2 acts differently in the mediation of radioresistance or radiosensitivity, depending on the cell line. On this, further investigations should be carried out with regard to possible interactions within other signalling pathways with a radiosensitizing influence. Within the investigated signalling pathway, it was further shown that VEGF-C does not mediate radioresistance via Akt. The present work contains the first study examining the effect of nelfinavir in combination with irradiation on prostate cancer cell survival in vitro as well as on growth time and local tumour control in vivo. Herein no radiosensitizing effects of nelfinavir could be detected. Since nelfinavir radiosensitizes cells of other tumour entities and is also known to interfere with a series of signalling pathways that promote or inhibit cell survival, it should be clarified whether tumour cells with a particular genetic profile are more responsive to treatment with nelfinavir.

Hintergrund Die Strahlentherapie ist neben der radikalen Prostatektomie eine Standardtherapie zur Behandlung von Prostatatumoren und führt zu sehr guten Ergebnissen für die lokale Tumorkontrolle und für das Überleben. Allerdings ist, wie bei der Operation auch, dabei das Risiko eines Rezidivs für fortgeschrittene Tumoren im Gegensatz zu Tumoren in früheren Stadien relativ hoch. Daher besteht eine hohe Dringlichkeit zur Verbesserung der Strahlentherapie vor allem bei fortgeschrittenen Tumoren. Ein Ansatz hierfür ist die Kombination der Bestrahlung mit molekularen Therapien. Ziel dabei ist es, bestimmte Zielproteine zu blockieren, um die Strahlensensibilität der Prostatakarzinomzellen zu erhöhen. Ein potentielles Target könnte hierbei die Blockade des VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalwegs (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C; NRP-2 – Neuropilin 2; Akt – Proteinkinase B) sein. Im Prostatakarzinom sind die Konzentrationen von VEGF-C und NRP-2 im Vergleich zu normalen Prostatazellen erhöht. Aus Untersuchungen ist bekannt, dass beide Proteine eine progressive Wirkung auf die Tumorgenese haben. In Vorarbeiten zeigen Muders et al. (2009) zudem eine Aktivierung von Akt über die VEGF-C/NRP-2-Achse und eine darüber vermittelte Resistenz gegenüber oxidativem Stress durch H2O2. Akt wirkt in verschiedenen Tumorentitäten außerdem protektiv gegenüber Bestrahlung. Es besteht die Annahme, dass dies auch für Prostatakarzinomzellen gilt. Zielstellung Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob und über welchen Mechanismus VEGF-C, NRP-2 und Akt die Strahlenresistenz in Prostatakarzinomzelllinien beeinflussen. Methoden Es wurden in vitro- und in vivo-Experimente in den humanen Prostatakarzinomzelllinen PC-3, DU145, LNCaP sowie in PC-3-Xenografts durchgeführt. Der Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz wurde in vitro nach Herunterregulierung der entsprechenden Gene mittels siRNA beziehungsweise nach Supplementierung mit humanem rekombinanten VEGF-C in Koloniebildungsassays untersucht. Zur Ermittlung des Einflusses von VEGF-C und von NRP-2 auf mögliche Zellüberlebensmechanismen wurden der autophagische Flux nach Blockade der Autophagie mit Bafilomycin A1 mittels Western Blot, die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur mittels Quantifizierung der γH2AX Foci sowie die Zellzyklusverteilung mittels Durchflusszytometrie untersucht. Die Signalweiterleitung von VEGF-C über Akt sowie, als weitere Möglichkeit, die Signalweiterleitung über ERK1/2 wurden nach siRNA-Transfektion mit und ohne Bestrahlung mittels Western Blot geprüft. Weitere Versuche zu Akt erfolgten in vitro und in vivo mit dem PI3K/Akt-Inhibitor Nelfinavir in PC-3-Zellen. Der in vitro Effekt von Nelfinavir auf die Strahlenresistenz wurde dabei mithilfe eines Koloniebildungsassays nach Behandlung der Zellen mit 10 µM Nelfinavir getestet. In vivo wurde die Wirkung von Nelfinavir ohne sowie in Kombination mit Bestrahlung in PC-3-Xenografts in Nacktmäusen untersucht. Für die Bestimmung der Tumorwachstumszeit wurden die Mäuse mit 80 mg Nelfinavir/kg Körpergewicht 30 mal innerhalb von 6 Wochen behandelt. In einem weiteren Versuch wurde die lokale Tumorkontrolle bei gleichzeitiger fraktionierter Bestrahlung mit Gesamtdosen von 30 bis 120 Gy und einer Nachbeobachtungszeit von 180 Tagen bestimmt. Ergebnisse Die Untersuchungen zur Strahlenresistenz über den VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalweg haben ergeben, dass in den drei Prostatakarzinomzelllinien PC-3, DU145 und LNCaP VEGF-C signifikant Strahlenresistenz vermittelt. Für NRP-2 hingegen wurde festgestellt, dass es in Abhängigkeit von der Zelllinie entweder zur Strahlenresistenz (DU145) oder zur Strahlensensibilisierung (PC-3) führt. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass durch VEGF-C in PC-3 und DU145 weder über Akt noch über ERK1/2 Strahlenresistenz vermittelt wird. Die Versuche zu Strahlenresistenz vermittelnden Mechanismen ergaben, dass VEGF-C in unbestrahlten PC-3-Zellen die Autophagie fördert, NRP-2 jedoch nicht. Unter Bestrahlung war ein Effekt von VEGF-C und NRP-2 auf die Autophagie nicht reproduzierbar nachweisbar. Ein weiterer Versuch hat gezeigt, dass in PC-3 Autophagie keinen Einfluss auf das klonogene Überleben nach Bestrahlung hat. Außerdem wurde festgestellt, dass VEGF-C in PC-3 die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur nicht beeinflusst. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass eine Verminderung des VEGF-C-Gehalts in PC-3 zum G2/M-Arrest führt. In DU145 konnte jedoch kein Effekt beobachtet werden. In den Untersuchungen zum Einfluss von Akt auf die Strahlenresistenz unabhängig von VEGF-C und NRP-2 wirkte Nelfinavir inhibierend auf die Akt-Phosphorylierung am Ser473 und beeinflusste das klonogene Überleben von PC-3-Zellen minimal. In PC-3-Xenografts führte Nelfinavir zu keiner Tumorwachstumsverzögerung und wirkte in vitro und in vivo nicht strahlensensibilisierend. Schlussfolgerung In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass VEGF-C in Prostatakarzinomzellen Strahlenresistenz vermittelt. Diese Erkenntnis könnte als ein Forschungsansatz zur Entwicklung einer kombinierten Therapie aus VEGF-C-Blockade und Bestrahlung dienen. Ein potentieller Mechanismus, über den VEGF-C die Strahlenresistenz vermittelt, ist, in Abhängigkeit von der Zelllinie, die Aufhebung des G2/M-Arrests. NRP-2 wirkt in der Vermittlung von Strahlenresistenz beziehungsweise sensibilität je nach Zelllinie unterschiedlich. Hierzu sollten weitere Untersuchungen bezüglich möglicher Interaktionen innerhalb anderer Signalwege mit strahlensensibilisierendem Einfluss erfolgen. Innerhalb des untersuchten Signalwegs konnte weiterhin festgestellt werden, dass VEGF-C Strahlenresistenz nicht über Akt vermittelt. Die vorliegende Arbeit enthält die erste Studie sowohl zur Untersuchung des Einflusses von Nelfinavir in Kombination mit Bestrahlung auf das Überleben von Prostatakarzinomzellen in vitro als auch auf die Tumorwachstumszeit und die lokale Tumorkontrolle in vivo. Hierin konnte keine strahlensensibilisierende Wirkung von Nelfinavir nachgewiesen werden. Da Nelfinavir in Zellen anderer Tumorentitäten strahlensensibilisierend wirkt und außerdem bekannt ist, dass es in eine Reihe von Signalwegen eingreift, die das Zellüberleben fördern oder hemmen, sollte weiter geklärt werden, ob Tumorzellen mit einem bestimmten genetischen Profil besser auf die Behandlung mit Nelfinavir ansprechen.:Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung und Zielstellung 1 2 Grundlagen 3 2.1 Zelluläre Auswirkungen der Bestrahlung 3 2.2 Überlebensfördernde Signalwege 6 2.3 Zellüberlebensstrategien 9 2.3.1 Autophagie 10 2.3.2 DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur 12 2.3.3 Zellzyklusarrest 13 2.4 Reaktionen von Tumoren auf Bestrahlung 14 2.5 Nelfinavir als Akt-Inhibitor 15 3 Material und Methoden 17 3.1 Material 17 3.1.1 Zelllinien 17 3.1.2 Reagenzien und Substanzen 17 3.1.3 Kits 19 3.1.4 Primäre Antikörper 19 3.1.5 Sekundäre Antikörper 20 3.1.6 siRNA 20 3.1.7 Primer 20 3.1.8 Materialien und Hilfsmittel 20 3.1.9 Geräte 21 3.1.10 Software 22 3.2 Methoden 22 3.2.1 Zellkultur 22 3.2.2 siRNA-Transfektion 23 3.2.3 Bestrahlung 24 3.2.4 Koloniebildungsassay 24 3.2.5 Autophagischer Flux 26 3.2.6 Semiquantitative Proteinbestimmung 27 3.2.7 mRNA-Quantifizierung 29 3.2.8 γH2AX Foci-Assay 31 3.2.9 Zellzyklusanalyse 33 3.2.10 Tierversuch 34 3.2.11 Statistische Auswertung 37 4 Ergebnisse 39 4.1 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Strahlenresistenz 39 4.1.1 Betrachtung der VEGF C- und NRP 2-Gehalte in den Zelllinien PC 3, DU145 und LNCaP 39 4.1.2 Etablierung der VEGF C- und NRP 2-siRNA-Transfektionen 39 4.1.3 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Klonogenität bestrahlter Zellen 40 4.2 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf überlebensfördernde Signalwege unter Bestrahlung 42 4.2.1 Aktivierung des Akt-Signalwegs 43 4.2.2 Aktivierung des ERK1/2-Signalwegs 45 4.3 Untersuchungen zum Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Strahlenresistenz beeinflussende zelluläre und molekulare Prozesse 46 4.3.1 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Autophagie und deren Bedeutung für die Strahlenresistenz 46 4.3.2 Einfluss von VEGF C auf die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen 48 4.3.3 Der Einfluss von VEGF C auf den Zellzyklus 50 4.4 Inhibierung der Aktivierung von Akt durch Nelfinavir 52 4.4.1 Einfluss von Nelfinavir auf die Klonogenität in vitro 53 4.4.2 Tumorwachstumsverzögerung 54 4.4.3 Lokale Tumorkontrolle 56 5 Diskussion 59 5.1 VEGF C- und NRP 2-Expression und -Herunterregulierung 59 5.2 Der Einfluss von VEGF-C auf die Strahlenresistenz 59 5.3 Die Funktion von NRP-2 als Co-Rezeptor für VEGF-C bei der Vermittlung von Strahlenresistenz 60 5.4 VEGF C-abhängige Akt- und ERK1/2-Regulierung unter Bestrahlung 62 5.5 Der Einfluss der Autophagie auf die Strahlenresistenz 62 5.6 Der Einfluss von VEGF C auf die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur 63 5.7 Der Einfluss von VEGF C auf den Zellzyklus 64 5.8 Der Einfluss von Nelfinavir auf das Wachstum und auf die Strahlenresistenz von PC 3-Zellen in vitro und in vivo 65 5.9 Schlussfolgerung und Ausblick 67 6 Zusammenfassung 69 7 Abstract 72 8 Literaturverzeichnis 75 9 Abbildungsverzeichnis 89 10 Tabellenverzeichnis 90 Danksagung 92 Anhang 93 Anlage 1 94 Anlage 2 96 / Background In addition to radical prostatectomy, radiotherapy is a standard therapy for the treatment of prostate tumours and leads to good results for local tumour control and survival. However, as with the resection, the risk of recurrence for advanced tumours is relatively high compared to tumours in earlier stages. Therefore, there is a high urgency to improve radiotherapy especially for advanced stages. One approach is the combination of irradiation with molecular therapies. The aim is to block certain target proteins to increase the radiosensitivity of the prostate carcinoma cells. A potential target could be the blockade of the VEGF-C/NRP-2/Akt signalling pathway (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C; NRP-2 – neuropilin 2; Akt – protein kinase B). In prostate cancer the concentrations of VEGF-C and NRP-2 are increased compared to normal prostate cells. Studies have shown that both proteins have a progressive effect on tumourigenesis. In preliminary work Muders et al. (2009) also showed the activation of Akt via the VEGF-C/NRP-2 axis and a resistance to H2O2 induced oxidative stress. Akt also has a protective effect against irradiation in various tumour entities. It is assumed that this also applies to prostate carcinoma cells. Aim of the study Within the framework of this thesis, it was investigated whether and via which mechanism VEGF-C, NRP-2, and Akt affect the radioresistance in prostate carcinoma cell lines. Methods In vitro and in vivo experiments were performed in the human prostate carcinoma cell lines PC-3, DU145, LNCaP, as well as in PC-3 xenografts. The influence of VEGF-C and NRP-2 on the radioresistance was examined in vitro after knock down of the corresponding genes using siRNA or after supplementation with human recombinant VEGF-C in colony formation assays. In order to determine the influence of VEGF-C and NRP-2 on possible cell survival mechanisms, the autophagic flux was examined after the blockade of autophagy with bafilomycin A1 using western blot, the DNA double strand break repair by quantification of the γH2AX foci, and the cell cycle distribution by flow cytometry. The signal transduction of VEGF-C via Akt as well as, as a further possibility, the signal transduction via ERK1/2 were tested after siRNA transfection with and without irradiation using western blot. Further experiments on Akt were performed in vitro and in vivo with the PI3K/Akt inhibitor nelfinavir in PC-3 cells. The in vitro effect of nelfinavir on radioresistance was tested using a colony formation assay after treatment of the cells with 10 μM nelfinavir. In vivo, the effect of nelfinavir without and in combination with irradiation in PC-3 xenografts was investigated in nude mice. For the determination of the tumour growth time, the mice were treated with 80 mg nelfinavir/kg body weight 30 times within 6 weeks. In a further experiment, the local tumour control was determined with simultaneous fractionated irradiation with total doses of 30 to 120 Gy and a follow-up time of 180 days. Results The investigations on radioresistance via the VEGF-C/NRP-2/Akt signalling pathway showed that in the three prostate carcinoma cell lines PC-3, DU145, and LNCaP VEGF-C significantly mediates radioresistance. For NRP-2 however, it was found that, depending on the cell line, it either leads to radioresistance (DU145) or radiosensitization (PC-3). Further, it was shown that in PC-3 and DU145 VEGF-C does not mediate radioresistance via Akt or ERK1/2. The experiments on radioresistance mediating mechanisms revealed that VEGF-C promotes autophagy in untreated PC-3 cells, but NRP-2 does not. Under irradiation, an effect of VEGF-C and NRP-2 on autophagy could not be detected reproducibly. A further experiment has shown that in PC-3 autophagy has no influence on the clonogenic survival after irradiation. In addition, it was found that VEGF-C does not affect the DNA double strand break repair in PC-3. Furthermore, it was shown that a reduction in the VEGF-C content leads to a G2/M arrest in PC-3. However, no effect could be observed in DU145. In studies regarding the influence of Akt on radioresistance independent of VEGF-C and NRP-2, nelfinavir inhibited Akt phosphorylation at Ser473 and minimally affected the clonogenic survival of PC-3 cells. In PC-3 xenografts, nelfinavir did not lead to any tumour growth delay and did not have a radiosensitizing effect in vitro or in vivo. Conclusion In the experiments, it was shown that VEGF-C mediates radioresistance in prostate cancer cells. This finding could serve as a research approach for the development of a combined therapy of a VEGF-C blockade and irradiation. A potential mechanism by which VEGF-C mediates radioresistance is the reverse of the G2/M arrest, depending on the cell line. NRP-2 acts differently in the mediation of radioresistance or radiosensitivity, depending on the cell line. On this, further investigations should be carried out with regard to possible interactions within other signalling pathways with a radiosensitizing influence. Within the investigated signalling pathway, it was further shown that VEGF-C does not mediate radioresistance via Akt. The present work contains the first study examining the effect of nelfinavir in combination with irradiation on prostate cancer cell survival in vitro as well as on growth time and local tumour control in vivo. Herein no radiosensitizing effects of nelfinavir could be detected. Since nelfinavir radiosensitizes cells of other tumour entities and is also known to interfere with a series of signalling pathways that promote or inhibit cell survival, it should be clarified whether tumour cells with a particular genetic profile are more responsive to treatment with nelfinavir.:Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung und Zielstellung 1 2 Grundlagen 3 2.1 Zelluläre Auswirkungen der Bestrahlung 3 2.2 Überlebensfördernde Signalwege 6 2.3 Zellüberlebensstrategien 9 2.3.1 Autophagie 10 2.3.2 DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur 12 2.3.3 Zellzyklusarrest 13 2.4 Reaktionen von Tumoren auf Bestrahlung 14 2.5 Nelfinavir als Akt-Inhibitor 15 3 Material und Methoden 17 3.1 Material 17 3.1.1 Zelllinien 17 3.1.2 Reagenzien und Substanzen 17 3.1.3 Kits 19 3.1.4 Primäre Antikörper 19 3.1.5 Sekundäre Antikörper 20 3.1.6 siRNA 20 3.1.7 Primer 20 3.1.8 Materialien und Hilfsmittel 20 3.1.9 Geräte 21 3.1.10 Software 22 3.2 Methoden 22 3.2.1 Zellkultur 22 3.2.2 siRNA-Transfektion 23 3.2.3 Bestrahlung 24 3.2.4 Koloniebildungsassay 24 3.2.5 Autophagischer Flux 26 3.2.6 Semiquantitative Proteinbestimmung 27 3.2.7 mRNA-Quantifizierung 29 3.2.8 γH2AX Foci-Assay 31 3.2.9 Zellzyklusanalyse 33 3.2.10 Tierversuch 34 3.2.11 Statistische Auswertung 37 4 Ergebnisse 39 4.1 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Strahlenresistenz 39 4.1.1 Betrachtung der VEGF C- und NRP 2-Gehalte in den Zelllinien PC 3, DU145 und LNCaP 39 4.1.2 Etablierung der VEGF C- und NRP 2-siRNA-Transfektionen 39 4.1.3 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Klonogenität bestrahlter Zellen 40 4.2 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf überlebensfördernde Signalwege unter Bestrahlung 42 4.2.1 Aktivierung des Akt-Signalwegs 43 4.2.2 Aktivierung des ERK1/2-Signalwegs 45 4.3 Untersuchungen zum Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Strahlenresistenz beeinflussende zelluläre und molekulare Prozesse 46 4.3.1 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Autophagie und deren Bedeutung für die Strahlenresistenz 46 4.3.2 Einfluss von VEGF C auf die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen 48 4.3.3 Der Einfluss von VEGF C auf den Zellzyklus 50 4.4 Inhibierung der Aktivierung von Akt durch Nelfinavir 52 4.4.1 Einfluss von Nelfinavir auf die Klonogenität in vitro 53 4.4.2 Tumorwachstumsverzögerung 54 4.4.3 Lokale Tumorkontrolle 56 5 Diskussion 59 5.1 VEGF C- und NRP 2-Expression und -Herunterregulierung 59 5.2 Der Einfluss von VEGF-C auf die Strahlenresistenz 59 5.3 Die Funktion von NRP-2 als Co-Rezeptor für VEGF-C bei der Vermittlung von Strahlenresistenz 60 5.4 VEGF C-abhängige Akt- und ERK1/2-Regulierung unter Bestrahlung 62 5.5 Der Einfluss der Autophagie auf die Strahlenresistenz 62 5.6 Der Einfluss von VEGF C auf die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur 63 5.7 Der Einfluss von VEGF C auf den Zellzyklus 64 5.8 Der Einfluss von Nelfinavir auf das Wachstum und auf die Strahlenresistenz von PC 3-Zellen in vitro und in vivo 65 5.9 Schlussfolgerung und Ausblick 67 6 Zusammenfassung 69 7 Abstract 72 8 Literaturverzeichnis 75 9 Abbildungsverzeichnis 89 10 Tabellenverzeichnis 90 Danksagung 92 Anhang 93 Anlage 1 94 Anlage 2 96

Το λεμφαγγειακό σύστημα διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης των ιστών, στην ανοσολογική απόκριση του οργανισμού, στην απορρόφηση των λιπών από τον πεπτικό σωλήνα, και στη διασπορά των καρκινικών κυττάρων. Η πρόσφατη ανακάλυψη ειδικών για τα λεμφαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα δεικτών και αναπτυξιακών παραγόντων, όπως επίσης και η δημιουργία γενετικών μοντέλων ποντικιών με διαταραγμένη τη λειτουργία του λεμφαγγειακού συστήματος, παρείχαν σημαντικότατες πληροφορίες για τη μοριακή ρύθμιση της εμβρυικής ανάπτυξης του λεμφαγγειακού συστήματος και της φυσιολογίας του. Τα σχετικά πρόσφατα αναγνωρισμένα μοριακά σηματοδοτικά μονοπάτια από τα οποία ρυθμίζεται η λεμφαγγειογένεση επέτρεψαν τη μελέτη της σχετιζόμενης με όγκους λεμφαγγειογένεσης. Οι μελέτες αυτές κατέδειξαν ότι η σχετιζόμενη με τους όγκους λεμφαγγειογένεση αποτελεί σημαντικό στοιχείο της μεταστατικής διαδικασίας, ενώ παράλληλα αναδεικνύουν συνεχώς καινούρια μόρια/σηματοδοτικά μονοπάτια-ρυθμιστές της εν λόγω διαδικασίας. / The lymphatic vascular system plays an important role in the maintenance of fluid homeostasis, in the afferent immune response, in the intestinal lipid uptake and in the metastatic spread of malignant cells. The recent discovery of specific markers and growth factors for lymphatic endothelium and the establishment of genetic mouse models with impairment of lymphatic function have provided novel insights into the molecular control of the lymphatic system in physiology and in embryonic development. Recently, molecular pathways that signal for lymphangiogenesis have been described allowing analyses of tumor lymphangiogenesis to be performed. These studies demonstrate that tumor lymphangiogenesis is a major component of the metastatic process, while at the same time new molecules and transduction pathways are discovered to regulate tumor lymphatics growth.