Resumo: Foi realizado um inquérito sorológico, em 816 soros de eqüinos de diversas regiões do Estado do Paraná, em 1991, para detectar anticorpos inibidores de hemaglutinação para os vírus das encefalomielites eqüinas leste, oeste e venezuelana. Os resultados obtidos foram de uma prevalência de 30,4% para o vírus da encefalomielite eqüina oeste (WEE), 19,2% para o vírus da encefalomielite eqüina venezuelana (VEE) e 15,3% para o vírus da encefalomielite eqüina leste (EEE). Dos 816 soros analisados pelo teste de inibição da hemaglutinação (Hl), 300 reagiram positivamente, resultando em uma incidência de 36,76% de encefalomielite eqüina no Estado do Paraná. A região de Umuarama apresentou 19% do total de soros positivos, seguida das regiões de Curitiba (14%), Ponta Grossa (12%), Jacarezinho (9%), Irati (7%), Campo Mourão (7%), Guarapuava (7%), Ivaiporã (6%), Francisco Beltrão (4%), Maringá (4%), Paranavaí (4%), União da Vitória (3%), Toledo (3%), Cascavel (1%) e Pato Branco (0%).

Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Bruno Moreira Carneiro / Banca: João Bosco Guerreiro da Silva / Banca: Márcia Maria Costa Nunes Soares / Banca: Rejane Maira Góes / Banca: Ricardo Barros Mariutti / Resumo: O vírus da hepatite C (HCV) causa a doença da Hepatite C e estima-se que cerca de 3% da população mundial esteja infectada com o vírus. A infecção por HCV promove a alteração na expressão de várias proteínas celulares. Estudos têm demonstrado que muitas proteínas de choque térmico (HSPs) possuem um perfil de expressão alterado na presença do vírus e algumas HSPs interagem diretamente com proteínas do HCV. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar in vitro os níveis de expressão de proteínas de choque térmico na presença e ausência de HCV. Com este propósito, células de hepatoma humano Huh7.5 e células Huh7.5 infectadas com o vírus (HCV JFH-1) foram submetidas à extração de RNA e síntese de cDNA. A expressão diferencial de 84 HSPs e chaperonas foi avaliada por qPCR Array. Os resultados demonstram que cinco genes apresentaram expressão aumentada (em Log2 2), enquanto outros cinco apresentaram expressão reduzida. Para validar estes resultados os 10 genes diferencialmente expressos foram testados por qPCR em três modelos celulares para o HCV: células contendo replicon subgenômico do HCV (SGR-JFH-1), células infectadas com JFH-1 (ambos do genótipo 2a) e células contendo o replicon subgenômico S52 (genótipo 3). O gene HSPB8 mostrou expressão aumentada nos três modelos testados, condizente com os resultados obtidos por qPCR Array. Em seguida, promovemos o silenciamento de HSPB8 e foi observado um aumento na replicação viral. Em contraste, quando aumentamos a expressão de... / Abstract: Hepatitis C virus (HCV) causes Hepatitis C disease and it is estimated that about 3% of world population are infected with the virus. HCV infection promotes alteration in the expression of several cellular proteins. Studies have shown that many heat shock proteins (HSPs) have an altered expression profile in the presence of the virus and some HSPs interact directly with HCV proteins. Thus, the present study aimed to evaluate in vitro the expression levels of heat shock proteins in the presence and absence of HCV. With this purpose, human hepatoma Huh7.5 cells and Huh7.5 cells infected with the virus (HCV JFH-1) were subjected to RNA extraction and cDNA synthesis. The differential expression of 84 HSPs and chaperones was assessed by qPCR Array. The results demonstrate that five genes showed increased expression (over Log2 2), while five other presented reduced expression. To validate these results, the 10 differentially expressed genes were tested by real-time PCR in three different HCV cell culture models: subgenomic HCV replicon cells (SGR-JFH-1), JFH-1 infected cells (both genotype 2a) and subgenomic S52 cells (genotype 3). The HSPB8 gene showed increased expression in all of three tested models, consistent with qPCR Array results. Then we promoted the silencing of HSPB8 and observed an increase in viral replication. In contrast, when we increased an expression of HSPB8, HCV had a decrease in replication rate. The same procedure was adopted for the DNAJC5B, validated in the ... / Doutor

Orientador: Paula Rahal / Coorientadora: Paola Jocelan Scarin Provazzi Trabulsi / Banca: Tatiana Rabachini / Banca: Cristiane Damas Gil / Banca: Patricia Simone Leite Vilamaior / Banca: Rejane Maira Góes / Resumo: Introdução. A infecção por Papilomavírus humano (HPV) está relacionada a doenças benignas e malignas, sendo o grau de patologia dependente do tipo viral, da resposta imune do hospedeiro e de fatores ambientais. O condiloma acuminado são lesões hiperproliferativas benignas encontradas principalmente em epitélios não queratinizados. O objetivo deste estudo foi identificar genes e vias celulares associadas às alterações imunes em indivíduos que não eliminaram espontaneamente o vírus e, assim, desenvolveram verrugas genitais. Material e Métodos. Vinte e sete biópsias de condiloma foram genotipadas por sequenciamento direto e seus cDNAs foram organizados em três pools - HPV 6, HPV 11 e pool HPV negativo (margem). Noventa e dois genes relacionados à resposta imune foram analisados por meio da metodologia de TaqMan Array. Seis genes com expressão diferencial obtidos a partir do ensaio de expressão foram validados por qPCR. Além disso, cinquenta e seis amostras parafinadas de condiloma foram submetidas a imuno-histoquímica com anticorpos primários para CD1a, FOXP3, CD3, CD4, CD8 e interferon gama (IFNG). Resultados. Todas as vinte e sete amostras foram HPV positivas e apresentaram HPV 6 (70,4%) ou HPV 11 (29,6%). A análise de expressão gênica resultou em 31 genes diferencialmente expressos em lesões de condiloma acuminado. Seis desses genes tiveram a expressão validada por qPCR. O gene GZMB foi regulado positivamente em 63% das amostras, enquanto o IFNG, IL12B e IL8 foram superexpre... / Abstract: Human papillomavirus (HPV) infection is related to several benign and malignant diseases, the pathology degree is dependent of viral type, host immune response and local environmental factors. Condyloma acuminate are benign proliferative disease, a category of anogenital warts, found mainly on non-keratinized epithelia. The aim of this study was highlight candidate genes and pathways associated with the immune changes in individuals that not eliminated spontaneously the virus and thus developed genital warts. Methods. Twenty-seven condyloma biopsies were genotyped by sequencing and their cDNAs were arranged in three pools - HPV 6, HPV 11 and HPV negative pool (margin). Ninety-two ... / Doutor

O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é um vírus pequeno, sem envelope e com genoma DNA circular de fita simples pertencente ao gênero Circovirus da família Circoviridae. O PCV2 está associado a uma síndrome multissistémica, atualmente denominada de porcine circovirus–associated disease (PCVAD) que acomete suínos e causa sérios prejuízos econômicos. Esta doença caracteriza-se por apresentar uma variedade de manifestações clínicas, como diminuição do ganho de peso, distúrbios respiratórios e entéricos, desordens reprodutivas e alta mortalidade. Além disso, PCVAD está fortemente associada a manifestações de dermatite, comprometimento renal e depleção linfóide. Apesar das grandes perdas econômicas e das inúmeras manifestações clínicas, a patogenia e o mecanismo de infectividade do PCV2 ainda não estão totalmente esclarecidos. O objetivo deste trabalho é avaliar a patogenia do PCV2 em suínos naturalmente infectados e em cultivo celular através da caracterização dos efeitos da infecção no sistema vascular. Primeiramente, foi realizada uma investigação para determinar os parâmetros hemostáticos de suínos naturalmente infectados por PCV2. Além disso, avaliou-se, in vitro, as alterações nas propriedades hemostáticas em células endoteliais infectadas pelo PCV2. Nossos resultados, mostram que suínos naturalmente infectados pelo PCV2 apresentam um estado protrombótico, demonstrado pela diminuição do tempo de coagulação e dos níveis de fibrinogênio, ativação e consumo plaquetário, aumento na atividade de trombina no plasma, e presença de vasculite nos capilares sanguíneos. In vitro, foi demonstrado que as células endoteliais infectadas pelo PCV2 apresentam um fenótipo ativado, caracterizado pelo aumento na atividade procoagulante na superfície celular. Além disso, foi observado que o tratamento com trombina exógena nos cultivos celulares infectados por PCV2 induz um aumento na carga viral. A partir disso, evidencia-se a participação do endotélio na infecção pelo PCV2, e a capacidade do vírus em modular a hemostasia. O conjunto destes dados permite um melhor entendimento dos fenômenos que ocorrem no hospedeiro durante a infecção pelo PCV2, especialmente no sistema vascular, permitindo uma maior compreensão dos mecanismos patogênicos da PCVAD e fornecendo novos conhecimentos dos processos envolvendo a interação PCV2-suíno. / Porcine circovirus type 2 (PCV2) is a small non-enveloped virus with a single-strand DNA genome, which belongs to the Circovirus genus of the Circoviridae family. PCV2 is related to a multisystemic syndrome nowadays called porcine circovirus-associated disease (PCVAD), which affects pigs and causes considerable economic losses. The disease is characterized by a variety of clinical manifestations, such as decrease in weight gain, respiratory and enteric disturbance, reproductive disorders and high mortality rates. Apart from this, PCVAD is also associated to dermatitis, renal failure and lymphoid depletion. In spite of the large economic losses and of the numerous clinical manifestations, the pathogenesis and infection mechanism of PCV2 have not been fully clarified. The aim of this study is to evaluate the PCV2 pathogenesis in naturally infected pigs and in cell culture, by characterizing the effects of the infection in the vascular system. Firstly, an investigation aimed at determining the hemostatic parameters in naturally infected pigs was conducted. Also, an in vitro evaluation of the hemostatic properties of PCV2-infected endothelial cells was performed. Our results show that pigs naturally infected with PCV2 presented a prothrombotic state manifested as decreased coagulation time and fibrinogen levels, reduced platelet activation and consumption, increased thrombin plasma activity, and as the occurrence of vasculitis in capillary vessels. In vitro, it was demonstrated that endothelial cells infected with PCV2 presented an activated phenotype characterized by a higher procoagulant activity on the cell surface. Apart from this, the treatment with exogenous thrombin in PCV2 infected cell cultures induces an increase in viral load. These findings reveal the role played by the endothelium in the PCV2 infection and the capacity of the virus to modulate hemostasis. Taken together, these results afford to better understand the phenomena taking place in the host during PCV2 infection, namely in the vascular system, shedding new light on the pathogenic mechanisms of PCVAD and on the processes involved in the swine-PCV2 interaction.

Os morcegos (Ordem Chiroptera) estão entre as espécies de mamíferos mais diversificadas e distribuídas no mundo. É reconhecido o papel fundamental que eles exercem na natureza. Por outro lado, são conhecidos como importantes reservatórios de agentes de doenças infecciosas, dentre os quais vírus, até pouco tempo desconhecidos, que nas últimas décadas se tornaram emergentes em humanos e outras espécies. Dentre os vírus RNA emergentes, destacam-se o SARS-CoV, MERS-CoV, vírus Hendra e Nipah e o último a causar importante surto na África, vírus Ebola.Mais de 100 espécies de vírus já foram detectadas em morcegos em todo o mundo, tanto vírus RNA, quanto vírus DNA, embora importância desses últimos como agentes de zoonoses ainda não tenha sido confirmada. Estudos no Brasil com relação à detecção de vírus em morcegos são praticamente inexistentes, e são focados apenas na vigilância e epidemiologia do vírus rábico. Portanto, este trabalho objetivou a detecção de vírus, tanto RNA, quanto DNA, em amostras de morcegos no estado do Rio Grande do Sul, através de técnicas moleculares e sequenciamento dos fragmentos obtidos. Identificamos a presença de vírus da família Coronaviridae, Circoviridae e Adenoviridae em amostras de fezes e tecidos de morcegos insetívoros e hematófagos. A detecção de novas espécies de vírus da família Circoviridae confirma a diversidade viral que estes vírus podem apresentar. Os resultados obtidos por investigação não podem afirmar se tais vírus apresentam potencial zoonótico, mas por serem dados inéditos no país, reforçam a importância da vigilância e de estudos adicionais para melhor compreender o papel que diferentes espécies de morcegos tem como reservatórios de vírus que possam ter impacto na saúde animal e humana. / Bats (Order Chiroptera) are among the most diverse and worldwide distributed mammal species. It is recognized the important role they play in nature, but, on the other hand, they are known as important reservoirs of infectious diseases, including viruses, until then unknown, that have become emerging in recent decades. Among RNA viruses of great importance are the SARS-CoV, MERS-CoV, Hendra and Nipah viruses and the one responsible to cause major outbreaks in Africa recently, the Ebola virus. More than 100 species of virus have been detected in bats in the world, both RNA and DNA viruses DNA, although the latter still hasn't confirmed its importance on zoonosis or the impact it would cause to the host itself.Studies in Brazil are practically nonexistent, because they are focused only on surveillance and epidemiology of rabies virus. Therefore, this work aimed to virus detection, both RNA and DNA in samples from bats in the State of Rio Grande do Sul, through molecular techniques and sequencing of the fragments obtained.We identify the presence of viruses of the family Coronaviridae, Circoviridae and Adenoviridae in stool samples and tissues. In addition, the discovery of new species of viruses of the family Circoviridae confirms viral diversity that these bats can carry. The results obtained in this investigation cannot confirm if such viruses have zoonotic potential, but as they are the first data published in the country, it underscores the importance of vigilance and additional studies to better understand the role that different species of bats have as reservoirs of viruses that may have an impact on animal and human health.

O vírus da anemia das galinhas (CAV) pode causar imunodepressão em galinhas de todas as idades e doença nos frangos jovens, a qual é caracterizada por severa anemia, atrofia da medula óssea e hemorragias. A doença clínica é rara hoje, porém a forma subclínica é freqüentemente encontrada em criações comerciais e resulta num considerável decréscimo do desempenho. O CAV apresenta variabilidade genética, entretanto, em relação às amostras brasileiras do CAV, pouco ou quase nada desta variabilidade é conhecida. O presente trabalho descreve um protocolo de Nested-PCR para a detecção do CAV diretamente de amostras clínicas e analisa filogeneticamente as seqüências nucleotídicas das amostras positivas buscando verificar se a patologia apresentada por estas está relacionada com a variabilidade genética. Para a extração de DNA, o método baseado em tiocianato de guanidina mostrou-se mais eficiente e prático de executar que os demais testados. Foi selecionado um par de primers que amplifica uma região de 664 pb do gene vp1 e outro par que amplifica uma região interna de 539 pb para a realização da Nested-PCR. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV e 30 diferentes isolados de vírus e bactérias causadoras de doenças em galinhas, as quais não geraram produto de amplificação. A sensibilidade foi determinada a partir de diluições seriadas da vacina comercial para o CAV. A Nested-PCR mostrou ser mais sensível do que a PCR e foi capaz de detectar 0,16 DICC50% da cepa vacinal. Além disso, a Nested-PCR detectou DNA viral em tecidos, soro e cama aviária de lotes com e sem sintomas clínicos.O produto de amplificação de 539 pb do gene vp1 de 44 amostras, provenientes de diferentes Estados produtores de frangos do Brasil, foi seqüenciado e foram encontradas 10 novas seqüências nucleotídicas do CAV. Estas 10 seqüências nucleotídicas foram analisadas filogeneticamente pelo método de distância neighbour joining com 1000 replicações o qual, mostrou que não houve correlação entre a patogenia apresentada nos animais e os grupos genéticos. Estas seqüências nucleotídicas também foram comparadas com 30 cepas de CAV isoladas em outros países e não foi observada correlação entre a distribuição geográfica e a variabilidade genética. Substituições de amino ácidos foram observadas em 9 posições sendo que, 65R substituindo o resíduo Q e 98F substituindo o resíduo Y ainda não haviam sido observadas. Conclui-se que, como técnica de detecção do CAV, o protocolo de Nested-PCR aqui descrito é mais sensível e menos trabalhoso do que o isolamento viral. As amostras Brasileiras de CAV possuem características filogenéticas similares às isoladas em outros países.

Orientador: Paula Rahal / Coorientador: / Banca: / Resumo: O ZIKV é um vírus de RNA, não segmentado, de fita simples e sentido positivo membro da família Flaviviridae. O genoma viral possui uma arquitetura típica de flavivírus, com cerca de 11kb de comprimento, que codifica três proteínas estruturais (Capsídeo, precursor-Membrana, Envelope) e sete proteínas não-estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). Nas Américas, emergiu rapidamente após surto na ilha da Páscoa, Chile. No Brasil, o surto iniciou em 2015, aumentando consideravelmente casos de microcefalia em recém-nascidos. Aliada a esses casos, também foi observada a ocorrência de síndrome neurológica de Guillain-Barré. Essas associações transformaram o impacto da transmissão e infecções por ZIKV em uma preocupação de saúde pública global. O vírus é transmitido principalmente pelos mosquitos do gênero Aedes, que possuem ampla distribuição e apresentam grandes adaptações a ambientes urbanos. Além de transmissão vetorial, pode ser transmitido via sexual e materno-fetal. O objetivo deste trabalho foi comparar as infecções por uma cepa contemporânea de ZIKV com DENV2 em modelo de explantes de placenta humana a termo, bem como quantificar expressão de citocinas, interferons do tipo I, II e III e marcadores de apoptose induzida via infecção viral. Os resultados demonstram que os explantes da placenta a termo são permissivos e apoiam a infecção por ZIKV. A quantificação da carga viral entre infecções ZIKV e DENV2 foram similares. No entanto, DENV2 apresentou decréscimo na... / Abstract: ZIKV is a non-segmented, single-stranded, positive-sense RNA virus and a member of the Flaviviridae family. Its genome has a typical 11 kB-long flavivirus architecture that encodes three structural proteins (Capsid, PrecursorMembrane, Envelop) and seven non-structural proteins (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B and NS5). In the Americas, the viruses emerged rapidly after outbreak on Pascoa Island, Chile. The outbreak reached Brazil in 2015, substantially increasing cases of microcephaly in newborns. In addition to microcephaly, cases associated with neurological diseases such as GuillainBarré syndrome have made ZIKV a global public health concern. The virus is mainly transmitted by mosquitoes of the genus Aedes, which are widely distributed and which have adapted well great to urban environments. In addition to vector transmission, ZIKV can be transmitted via sexual and maternal-fetal routes, the virus has been isolated is from sperm, amniotic fluid and central nervous systems of stillborn fetuses. The goal of this report was compare ZIKV-infected to DENV2 in full-term human placenta explant model. Quantify expression of cytokines, type I, II and III interferons and markers of induced-apoptosis by viral infection. The results demonstrated that full-term placenta explants are permissive and support ZIKV infection. Viral loads in ZIKV and DENV2 infections were similar. However, DENV2 presented a decrease in viral load release at 24 hours post infection (h.p.i). The kinetics of viral replication coincided with the expression of proinflammatory cytokines and the increase of apoptosis in the infected tissue. Apoptosis was partially dependent on TNF-α. Anti-TNF-α treatment significantly decreased the activated-caspase 3 mediated viral infection. Cumulatively, this model demonstrates that human placental tissues are targets of ZIKV-infection and that the infection is pathogenic to ... / Doutor

Os herpesvírus bovinos tipos 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2), 4 (BoHV-4), 5 (BoHV-5) e o herpesvírus ovino tipo 2 (OvHV-2) apresentam como característica comum a indução de infecções latentes em seus hospedeiros. Estes agentes estão associados a diferentes enfermidades em bovinos, embora na maioria dos animais infectados a infecção primária ocorra com poucos ou sem sinais clínicos evidentes. Eventualmente, hospedeiros suscetíveis podem apresentar quedas na produtividade, perdas reprodutivas ou mesmo sofrer doença fatal. Esta tese compreende dois estudos independentes, que visam contribuir para um maior conhecimento sobre infecções por herpesvírus em bovinos. O primeiro capítulo reporta os achados de uma pesquisa sobre a presença do DNA de BoHV-2, BoHV-4 e OvHV-2 em gânglios trigêmeos (GT) de bovinos. Fragmentos de 200 GT (de 100 animais) foram coletados e submetidos à extração de DNA. Um conjunto de PCRs, duas das quais “semi-nested”, foi padronizado para amplificar parte do gene que codifica a glicoproteína B de BoHV-2 e BoHV-4. Outra PCR foi desenhada tendo como alvo o gene que codifica a proteína FGAM-sintase de OvHV-2. Controles internos foram construídos e utilizados para determinar a sensibilidade dos testes. Genomas de BoHV-2 foram encontrados em 2% (2/100) das amostras analisadas; genomas de BoHV-4 e OvHV-2 não foram detectados. No segundo capítulo desta tese, na busca de um imunógeno capaz de minimizar as perdas decorrentes de encefalites causadas por BoHV-5, o potencial imunogênico de uma amostra recombinante de BoHV-5, da qual os genes que codificam as glicoproteínas I, E e a proteína US9 foram deletados (BoHV5 gI/gE/US9-), em uma formulação vacinal inativada. Para a avaliação da vacina, oito terneiros (grupo vacinado; GV) foram vacinados com 3 ml da preparação por via subcutânea nos dias 0 e 28. Outros quatro terneiros foram vacinados com a preparação vacinal sem antígeno (grupo controle; GC). Após o desafio com o vírus parental selvagem (EVI 88/95), os animais do GV apresentaram sinais leves de infecção respiratória, enquanto que os animais do GC desenvolveram doença respiratória e encefalite grave, o que levou à eutanásia de dois dos quatro animais controle. A vacina conferiu proteção contra encefalite nos animais do GV após o desafio, porém não impediu a reativação do vírus selvagem. Os estudos aqui realizados permitiram demonstrar pela primeira vez a ocorrência de co-infecções com BoHV-1, BoHV-2 e BoHV-5, mas não com BoHV-4 e OvHV-2, em gânglios trigêmeos de bovinos. No segundo capítulo, foi demonstrada a eficácia do recombinante BoHV5 gI/gE/US9-, na proteção de bovinos contra encefalites causadas por BoHV-5 selvagem. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2), 4 (BoHV-4), 5 (BoHV-5) and ovine herpesvirus type 2 (OvHV-2) are known to induce latent infections in their natural hosts. These agents are associated with different diseases in cattle, although in the majority of infected animals, primary infections occur with few or no evident clinical signs. Eventually, susceptible hosts may display decreased productivity, reproductive losses or undergo fatal disease. This thesis comprises two studies intended to increase the knowledge on herpesvirus infections in cattle. The first chapter reports the findings of a search for DNA of BoHV-2, BoHV-4 and OvHV-2 in trigeminal ganglia (TG) of cattle. Fragments of 200 TG (from 100 animals) were collected and submitted to DNA extraction. A set of PCRs, two of which "semi-nested" was standardized to amplify a portion of the gene encoding the BoHV-2 and BoHV-4 glycoprotein B. Another PCR was designed targeting the gene coding for the FGAM-synthase of OvHV-2. Internal controls were constructed and used to determine the sensitivity of the tests. BoHV-2 genomes were found in 2% (2/100) of the examined samples. Genomes of BoHV-4 and OvHV-2 were not detected. In the second chapter of this thesis, a recombinant BoHV-5 in which the genes encoding glycoproteins I, E and protein US9 were deleted (BoHV5 gI/gE/US9-) was evaluated in its potential to protect cattle against BoHV-5 encephalitis in an inactivated vaccine. Eight calves were subcutaneously vaccinated with 3 ml of the vaccine on days 0 and 28 (vaccinated group; VG). Another four calves were mock vaccinated with the vaccine diluent (control group, CG). After challenge with wild type virus (EVI 88/95), the VG animals showed mild clinical signs of respiratory infection, whereas animals CG developed severe respiratory disease and encephalitis, which led to euthanasia of two of the four CG animals. The inactivated vaccine conferred protection against encephalitis in animals after challenge, but did not prevent viral reactivation. The studies conducted here demonstrate for the first time the occurrence of co-infections with BoHV-1, BoHV-2 and BoHV-5, but not with BoHV-4 and OvHV-2 in TG of cattle. In the second chapter, demonstrated the efficacy of an inactivated vaccine prepared with the recombinant BoHV5 gI/gE/US9- in the protection of cattle against encephalitis caused by wild-type BoHV-5.

Membros da família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) tem sido associados a diferentes condições clínicas em bovinos. Assim, diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5 é uma valiosa informação objetivando um melhor entendimento da patogenia e epidemiologia destes vírus no rebanho bovino. Contudo, métodos para diferenciação são escassos devido às reações cruzadas originadas da alta homologia genômica e antigênica entre estes vírus. O presente estudo concentrou-se na análise da região carboxi-terminal da glicoproteína C (nucleotídeos 16763 - 17337 em BoVH-1 e 17671 - 18242 em BoHV-5), uma vez que tal região apresentou características potenciais que permitissem a diferenciação entre estes vírus. Assim, no primeiro capítulo do presente trabalho a região carboxi-terminal da gC foi utilizada como alvo para o desenvolvimento de uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) seguida da Análise da Restrição Enzimática (REA) do fragmento amplificado, capaz de diferenciar entre isolados de BoHV-1 ou BoHV-5, gerando fragmentos com tamanhos de 575 pares de base (pb) frente a BoHV-1 e 572 pb frente a BoHV-5. A diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5 foi obtida após a digestão dos amplicons com a enzima de restrição Bgl I. No segundo capítulo, a região carboxi-terminal de 23 amostras Sul-Americanas de BoHV-1 ou BoHV-5 foram amplificadas e sequenciadas. A análise filogenética realizada com as sequências de nucleotídeos revelou identidade variando entre 98,7 a 99,8% (BoHV-1/ BoHV-1), 88,3 a 92% (BoHV-1/ BoHV-5) e 96 to 99,7% (BoHV-5/ BoHV-5). Alinhamentos realizados com sequências de aminoácidos revelaram identidade variando entre 97,5 a 99,5% (BoHV-1/ BoHV-1), 77,5 a 84,4% (BoHV-1/ BoHV-5) e 92,1 a 99,5% (BoHV-5/ BoHV-5). Análises filogenéticas revelaram, ainda, que: i) alguns isolados de BoHV-5 apresentaram um padrão diferente daqueles até o presente reconhecidos; ii) uma amostra isolada no Uruguai (BoHV-1.2) apresentou um padrão de agrupamento distinto quando comparado com as outra amostras de BoHV-1.2. O terceiro capítulo apresenta o primeiro relato de detecção de BoHV-5 de sêmen bovino através da análise antigênica, amplificação diferencial da região amino-terminal do gene da gC de BoHV-1 e 5, seguida da caracterização por REA do isolado em estudo. Em síntese, através da utilização da gC foi possível avaliar a homologia entre as amostras Sul- Americanas estudadas; desenvolver uma PCR/REA diferencial entre estes vírus e relatar a detecção de uma amostra de BoHV-5 isolada à partir de sêmen contaminado. / Members of the Herpesviridae family, Alphaherpesvirinae subfamily bovine herpesvirus types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) have been associated to different clinical conditions of cattle. Thus, differentiation has become an important tool for a better understanding of the pathogenesis and epidemiology of BoHV infections in cattle. However, currently available methods for such differentiation are hampered by cross-reactions from high genomic and antigenic homology between these viruses. The present work focused on the analysis of the carboxy-terminal portion of glycoprotein C (gC), corresponding to nucleotides 16763 - 17337 on BoHV-1 and 17671 - 18242 on BoHV-5 once such region showed characteristics that would allow a clear distinction between BoHV-1 and 5. In view of that, in the first chapter, the carboxy-terminal region of gC was the target for the development of a Polymerase Chain Reaction followed by a Restriction Enzyme Analysis (PCR/REA) for differentiation between BoHV-1 and 5. The PCR/REA was designed to amplify a segment on the carboxy-terminal portion of the glycoprotein C (gC) gene, giving rise to amplicons of 575 base pairs (bp) for BoHV- 1, and 572 bp for BoHV-5. The amplicons were digested with the Bgl I for differentiation between BoHV-1 and 5. In the second chapter the region previously described of 23 South American isolates of BoHV-1 and BoHV-5 were amplified and sequenced. Nucleotide sequence alignments revealed identity ranged from 98,7 to 99,8% (BoHV-1/ BoHV-1), 88,3 to 92% (BoHV-1/ BoHV-5) and 96 to 99,7% (BoHV-5/ BoHV-5). The identity deduced from amino acid sequences ranged from 97,5 to 99,5% (BoHV-1/ BoHV-1), 77,5 to 84,4% (BoHV-1/ BoHV-5) and 92,1 to 99,5% (BoHV-5/ BoHV- 5) . Phylogenetic analyses and deduced amino acid sequences revealed that: i) some BoHV-5 isolates seem to be “non a non b” subtype and ii) there is a Uruguayan BoHV-1.2 strain that has a distinct nucleotide and amino acid sequence when compared to others BoHV-1.2 strains. The third chapter of the present work contains the first report of a BoHV-5 strain isolated from the bovine semen by antigenic characterization, differential amplification of the N-terminal region of gC gene from BoHV-1 and 5 followed by genomic characterization by REA and antigenic characterization of the isolate analyzed.

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:04:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 154.pdf: 1288159 bytes, checksum: 2cc2211b7c112d6211913cb143210291 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Em Cabo Verde, arquipélago situado na Costa Ocidental Africana, os primeiros casos de dengue ocorreram em 2009, com a notificação de mais de 21.000 casos, a maioria desses registrados na Ilha de Santiago. O mosquito Aedes aegypti foi identificado como vetor, e ações para seu controle, usando os inseticidas temephos (larvicida) e a deltametrina (adulticida), têm sido implementadas. Objetiva-se com esse trabalho avaliar o atual status de suscetibilidade a inseticidas e caracterizar os mecanismos de resistência nessa população. Amostras de A. aegypti da ilha de Santiago foram coletadas através de armadilhas de oviposição, para o estabelecimento de uma população a ser analisada. Foram realizados bioensaios do tipo dose diagnóstica, usando garrafas impregnadas com doses únicas dos adulticidas malathion (organofosforado), deltametrina (piretróide) e cipermetrina (piretróide), e bioensaios do tipo dose resposta, usando múltiplas concentrações dos inseticidas temephos (organofosforado), Bacillus thuringiensis sorovariedade israelensis (bactéria entomopatogênica) e diflubenzuron (inibidor de síntese de quitina). Para a investigação dos mecanismos de resistências, foram realizados testes bioquímicos com substratos específicos para quantificar a atividade das enzimas glutationa S-transferases, esterases (alfa, beta e PNPA) e oxidases de função mista, ligadas a detoxificação de xenobióticos, e a taxa de inibição da acetilcolinesterase ligada a insensibilidade do sítio alvo. / Pesquisou-se também a presença de mutaçõeso do tipo kdr (knock-down resistance) associadas à resistência a piretróides, pela análise da sequência dos exons 20 e 21 no gene do canal de sódio. Nos resultados dos bioensaios constatou-se que a população de A. aegypti investigada apresenta resistência aos piretróides deltametrina e cipermetrina (mortalidade 80 por cento) e ao organofosforado temephos (RR90=4), mas é suscetível ao malathion (mortalidade maior ou igual a 98 por cento), Bacillus thuringiensis sorovariedade israelensis (RR90=0.8) e ao diflubenzuron (RR90=2,2). Em relação a atividade das enzimas ligadas ao processo de detoxificação, foram detectadas alterações nas glutationa S-transferases (25 por cento), oxidases de função mista (18 por cento), esterase-alfa (19 por cento) e esterase-beta (17 por cento). A taxa de inibição da acetilcolinesterase (6 por cento) e a atividade da esterase-PNPA (7 por cento) mostraram que estas estão inalteradas. Nenhuma das mutações do tipo kdr pesquisadas foi detectada. Estes resultados permitem concluir que a população de A. aegypti da ilha de Santiago, Cabo Verde, é suscetível aos inseticidas, excetuando os piretróides testados e o temephos, usados no seu controle; e que ela apresenta alterações em enzimas detoxificadoras que poderão estar implicadas na resistência a esses compostos