O diagnóstico da infecção pelo papilomavírus humano (HPV) em homens tem ganhado importância já que o mesmo é freqüentemente assintomático, o que pode tornar o indivíduo contaminado num reservatório do vírus, com importante papel na transmissão e perpetuação da doença. Este trabalho teve como objetivo o estudo do HPV no espermatozóide, a fim de avaliar sua influência na qualidade seminal e no estresse oxidativo. Foram analisados 68 homens, dos quais 30 foram positivos para HPV/DNA e 38 foram negativos. Dos casos positivos, 8/30 apresentaram infecção pelo HPV dos tipos 16 ou 18, os quais são considerados os tipos de alto risco oncogênico com maior prevalência. A infecção e classificação dos tipos virais foram determinadas por nested-PCR, enquanto a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) foram determinadas por espectrofotometria. Os dados não apresentaram relação significativa entre as variáveis epidemiológicas estudadas e a presença do vírus. Os parâmetros de concentração e motilidade espermática foram avaliados manualmente, segundo o critério da Organização Mundial da Saúde (OMS) e, a morfologia avaliada, conforme os critérios da OMS e estrito de Tygerberg. Os dados mostram um aumento da incidência de espermatozóides com morfologia alterada nos pacientes com infecção por HPV. Os parâmetros seminais de concentração e motilidade não apresentaram diferenças significativas entre os grupos (com e sem HPV). Nos pacientes portadores do vírus, as medidas de catalase mostraram-se significativamente aumentadas em relação aos pacientes não infectados. O estresse oxidativo pode estar relacionado com a fisiopatologia da infertilidade em pacientes com infecção por HPV no sêmen. Esta infecção sinaliza uma piora na qualidade do sêmen, baseada na alteração da morfologia do espermatozóide. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-22T16:46:36Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Leticia Lucchese.pdf: 4254447 bytes, checksum: 410f0fa2c8bc9751e9a9d21ab3033a19 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-22T16:46:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Leticia Lucchese.pdf: 4254447 bytes, checksum: 410f0fa2c8bc9751e9a9d21ab3033a19 (MD5) / The diagnosis of human papillomavirus infection (HPV) in men has gained importance due to the fact they are frequently asymptomatic, who may be a virus reservoir, with an important role in the transmission and perpetuation of the disease. The goal of this study was to identify the presence of HPV in the semen in order to evaluate its influence in semen quality as well as in seminal oxidative stress. Sixty-eight men were analyzed, from which 30 were positive for DNA/HPV and 38 negative. Of the positive cases, 8/30 had HPV infection with the subtypes 16 or 18, which are considered with high prevalence for oncogenic risks. The viral infection and the classification of the virus subtypes were determined with the nested-PCR technique, and the enzymatic activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) were determined by spectrophotometry technique. There was no significant correlation among the studied epidemiological variables and the presence of the virus. The semen parameters sperm concentration and motility were evaluated manually according to the World Health Organization (WHO) criteria and the sperm morphology evaluated according to the WHO and Tygerberg´s strict criteria. The results show a higher incidence of sperm with abnormal morphology in patients with HPV infection compared to patients without the infection. Sperm concentration and motility did not show a difference between patients with or without HPV infection. In patients with the HPV, CAT levels were higher than patients without the HPV infection. Seminal oxidative stress may be related to the pathophysiology of infertility in patients with seminal HPV infection. This infection signalize for diminishing semen quality based on the damage of the sperm morphology seen in our study.

Os papilomavírus constituem uma extensa família de vírus associados a lesões epiteliotrópicas, assim como acometem o tecido mucoso onde podem causar tumores benignos que podem evoluir para a malignização. A papilomatose bovina é uma doença economicamente relevante, já que há a desvalorização dos animais a serem comercializados devido à aparência e depreciação do couro. Em humanos, a identificação dos tipos de papilomavírus (HPV) envolvidos bem como o relato de co-infecções são bem estabelecidos. Já foram descritos na literatura mais de 200 tipos de HPVs, o que ainda é pouco explorado na área da Medicina Veterinária, em que somente 21 tipos de papilomavírus bovino (BPV) foram caracterizados até o momento. A presente dissertação visou investigar a diversidade de BPV presentes em um papiloma de um bovino oriundo do Estado de Rondônia. A partir do DNA extraído da lesão, foi realizada a rooling circle amplification (RCA) seguida do sequenciamento de última geração (Ilumina MiSeq). O emprego dessas metodologias culminou na identificação do BPV13, que atualmente é bem caracterizado, e de três prováveis novos tipos de BPVs que haviam sido descritos em um único estudo recente. Estes resultados confirmam a presença de co-infecção em lesões de papilomatose bovina e demonstram que estas técnicas possibilitaram a detecção de espécies que não são identificadas pelos métodos convencionais. Este conhecimento sobre a diversidade de BPV servirá de base para o melhor entendimento da biologia do vírus e para a geração de vacinas profiláticas ou terapêuticas eficazes. / Papillomaviruses are an extensive family of viruses associated with epitheliotropic lesions, as well as affecting mucosal tissue where they can cause benign tumors that may progress to malignancy. Bovine papillomatosis is an economically relevant disease, since there is a devaluation of the animals to be marketed due to the appearance and depreciation of the leather. In humans, the identification of the types of papillomavirus (HPV) involved as well as the reporting of co-infections is well established. More than 200 types of HPV have been described in the literature, which is still little explored in the area of Veterinary Medicine, in which only 21 types of bovine papillomavirus (BPV) have been characterized. This study aimed to investigate the diversity of BPV present in a papilloma of a bovine animal from the State of Rondônia. From the DNA extracted from the lesion, the rooling circle amplification (RCA) was performed followed by the last generation sequencing (Ilumina MiSeq). The use of these methodologies culminated in the identification of BPV13, which is currently well characterized, and of three putative new BPVs types that had been described in a single recent study. These results confirm the presence of co-infection in bovine papillomatosis lesions and demonstrate that these techniques enabled the detection of species that are not identified by conventional methods. This knowledge on BPV diversity will serve as a basis for a better understanding of the biology of the virus and for the generation of effective prophylactic or therapeutic vaccines.

Com os avanços recentes nos métodos de detecção de patógenos, a importância das doenças polimicrobianas tornou-se mais evidente e a identificação de interações de patógenos e seus mecanismos de potenciação de enfermidades se tornou um tema de grande interesse. O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) está associado a várias síndromes, tais como a síndrome multissistêmica do definhamento dos suínos (SMDS), a síndrome da dermatite e nefropatia dos suínos (SDNS), o complexo das doenças respiratórias dos suínos (CDRS), falhas reprodutivas e tremores congênitos, coletivamente chamadas “doenças associadas ao circovírus suíno tipo 2” (PCVAD), e que, além do PCV2, podem apresentar diferentes graus de envolvimento de outros agentes. Dentre estas, a SMDS é a que apresenta maior impacto na cadeia produtiva de suínos. Sendo a SMDS uma doença multifatorial e polimicrobiana, estudos buscando identificar associações do PCV2 com outros patógenos são importantes. No presente trabalho foram desenvolvidos ensaios moleculares para a detecção de alguns agentes cuja potencial participação nas PCVAD não havia ainda sido estudada com maior profundidade. Dessa forma, o citomegalovírus suíno (PCMV) e os recém-identificados bocavírus suínos do tipo 1, 2, 3 e 4 (PBoV1-4) foram pesquisados em amostras de animais afetados ou não pela SMDS, em diferentes faixas etárias. O PCMV foi detectado em altas taxas em ambos os grupos de animais, afetados ou não pela SMDS, sendo que nenhum tipo de associação com a SMDS pode ser inferida quanto à detecção de genomas de PCMV e o desenvolvimento da síndrome. A detecção de genomas de PBoV2 e 3 foi associada com animais afetados pela SMDS, enquanto nenhum tipo de associação foi inferida com a detecção de genomas de PBoV1 e do PBoV4. Animais afetados pela síndrome apresentam frequência de detecção e carga viral de PBoV2 significantemente superior à frequência encontrada em animais saudáveis com idade equivalente, revelando uma associação positiva entre PBoV2 e a SMDS. Por outro lado, animais adultos possuem uma carga viral significativamente superior a dos animais jovens sem sinais clínicos de SMDS. Os resultados obtidos possibilitaram detectar, pela primeira vez, os quatro tipos PBoV em amostras de suínos no Brasil. Paralelamente, esse estudo mostrou, pela primeira vez, a presença de genomas circulantes de PBoV1, PBoV2 e PBoV4 em animais adultos clinicamente saudáveis. Além disso, permitiu sugerir uma possível associação entre SMDS e PBoV2 e PBoV3, mostrando que mais estudos devem ser realizados para elucidar tal associação. / With recent advances in pathogen detection methods, the importance of polymicrobial diseases has become more evident, and identification of pathogen interactions and their disease potentiation mechanisms has become a topic of great interest. The porcine circovirus type 2 (PCV2) is associated with several syndromes, such as Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), Porcine dermatitis and nephropathy syndrome (PDNS), Porcine respiratory disease complex (PRDC), reproductive failures and congenital tremors, collectively called "Porcine circovirus type 2 associated diseases" (PCVAD), that beyond PCV2, may have different degrees of involvement of other agents. Among these, PMWS have the main impact on pig production chain. As PMWS is a multifactorial and polymicrobial disease, studies attempting to identify associations of PCV2 with other pathogens are important. In the present work, we developed molecular assays for detection of some agents whose potential role in PCVAD had not yet been studied in greater depth. Thus, porcine cytomegalovirus (PCMV) and newly identified porcine bocavirus type 1, 2, 3 and 4 (PBoV1-4) were investigated in samples of animals with or without PMWS, in different age groups. PCMV was detected at high rates in both groups of animals, and any type of association with PMWS could be inferred regarding detection of PCMV genomes and syndrome development. The PBoV2 and PBoV3 genomes detection was associated with animals affected by PMWS, while no association could be inferred from detection of genomes PBoV1 and PBoV4. Animals affected by the syndrome had significantly higher PBoV2 frequency of detection and viral load than the healthy animals with equivalent age, showing a positive association between PBoV2 and PMWS. Moreover, adult animals had significantly higher viral load than young animals without clinical signs of PMWS. Obtained results showed, for the first time, the four types of PBoV in Brazilian pig samples and the presence of circulating genomes of PBoV1, PBoV2 and PBoV4 in clinically healthy adult animals. It also allowed suggesting a possible association between PBoV2 and PBoV3 with PMWS, showing that more studies are needed to elucidate this association.

Com os avanços recentes nos métodos de detecção de patógenos, a importância das doenças polimicrobianas tornou-se mais evidente e a identificação de interações de patógenos e seus mecanismos de potenciação de enfermidades se tornou um tema de grande interesse. O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) está associado a várias síndromes, tais como a síndrome multissistêmica do definhamento dos suínos (SMDS), a síndrome da dermatite e nefropatia dos suínos (SDNS), o complexo das doenças respiratórias dos suínos (CDRS), falhas reprodutivas e tremores congênitos, coletivamente chamadas “doenças associadas ao circovírus suíno tipo 2” (PCVAD), e que, além do PCV2, podem apresentar diferentes graus de envolvimento de outros agentes. Dentre estas, a SMDS é a que apresenta maior impacto na cadeia produtiva de suínos. Sendo a SMDS uma doença multifatorial e polimicrobiana, estudos buscando identificar associações do PCV2 com outros patógenos são importantes. No presente trabalho foram desenvolvidos ensaios moleculares para a detecção de alguns agentes cuja potencial participação nas PCVAD não havia ainda sido estudada com maior profundidade. Dessa forma, o citomegalovírus suíno (PCMV) e os recém-identificados bocavírus suínos do tipo 1, 2, 3 e 4 (PBoV1-4) foram pesquisados em amostras de animais afetados ou não pela SMDS, em diferentes faixas etárias. O PCMV foi detectado em altas taxas em ambos os grupos de animais, afetados ou não pela SMDS, sendo que nenhum tipo de associação com a SMDS pode ser inferida quanto à detecção de genomas de PCMV e o desenvolvimento da síndrome. A detecção de genomas de PBoV2 e 3 foi associada com animais afetados pela SMDS, enquanto nenhum tipo de associação foi inferida com a detecção de genomas de PBoV1 e do PBoV4. Animais afetados pela síndrome apresentam frequência de detecção e carga viral de PBoV2 significantemente superior à frequência encontrada em animais saudáveis com idade equivalente, revelando uma associação positiva entre PBoV2 e a SMDS. Por outro lado, animais adultos possuem uma carga viral significativamente superior a dos animais jovens sem sinais clínicos de SMDS. Os resultados obtidos possibilitaram detectar, pela primeira vez, os quatro tipos PBoV em amostras de suínos no Brasil. Paralelamente, esse estudo mostrou, pela primeira vez, a presença de genomas circulantes de PBoV1, PBoV2 e PBoV4 em animais adultos clinicamente saudáveis. Além disso, permitiu sugerir uma possível associação entre SMDS e PBoV2 e PBoV3, mostrando que mais estudos devem ser realizados para elucidar tal associação. / With recent advances in pathogen detection methods, the importance of polymicrobial diseases has become more evident, and identification of pathogen interactions and their disease potentiation mechanisms has become a topic of great interest. The porcine circovirus type 2 (PCV2) is associated with several syndromes, such as Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), Porcine dermatitis and nephropathy syndrome (PDNS), Porcine respiratory disease complex (PRDC), reproductive failures and congenital tremors, collectively called "Porcine circovirus type 2 associated diseases" (PCVAD), that beyond PCV2, may have different degrees of involvement of other agents. Among these, PMWS have the main impact on pig production chain. As PMWS is a multifactorial and polymicrobial disease, studies attempting to identify associations of PCV2 with other pathogens are important. In the present work, we developed molecular assays for detection of some agents whose potential role in PCVAD had not yet been studied in greater depth. Thus, porcine cytomegalovirus (PCMV) and newly identified porcine bocavirus type 1, 2, 3 and 4 (PBoV1-4) were investigated in samples of animals with or without PMWS, in different age groups. PCMV was detected at high rates in both groups of animals, and any type of association with PMWS could be inferred regarding detection of PCMV genomes and syndrome development. The PBoV2 and PBoV3 genomes detection was associated with animals affected by PMWS, while no association could be inferred from detection of genomes PBoV1 and PBoV4. Animals affected by the syndrome had significantly higher PBoV2 frequency of detection and viral load than the healthy animals with equivalent age, showing a positive association between PBoV2 and PMWS. Moreover, adult animals had significantly higher viral load than young animals without clinical signs of PMWS. Obtained results showed, for the first time, the four types of PBoV in Brazilian pig samples and the presence of circulating genomes of PBoV1, PBoV2 and PBoV4 in clinically healthy adult animals. It also allowed suggesting a possible association between PBoV2 and PBoV3 with PMWS, showing that more studies are needed to elucidate this association.

O diagnóstico da infecção pelo papilomavírus humano (HPV) em homens tem ganhado importância já que o mesmo é freqüentemente assintomático, o que pode tornar o indivíduo contaminado num reservatório do vírus, com importante papel na transmissão e perpetuação da doença. Este trabalho teve como objetivo o estudo do HPV no espermatozóide, a fim de avaliar sua influência na qualidade seminal e no estresse oxidativo. Foram analisados 68 homens, dos quais 30 foram positivos para HPV/DNA e 38 foram negativos. Dos casos positivos, 8/30 apresentaram infecção pelo HPV dos tipos 16 ou 18, os quais são considerados os tipos de alto risco oncogênico com maior prevalência. A infecção e classificação dos tipos virais foram determinadas por nested-PCR, enquanto a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) foram determinadas por espectrofotometria. Os dados não apresentaram relação significativa entre as variáveis epidemiológicas estudadas e a presença do vírus. Os parâmetros de concentração e motilidade espermática foram avaliados manualmente, segundo o critério da Organização Mundial da Saúde (OMS) e, a morfologia avaliada, conforme os critérios da OMS e estrito de Tygerberg. Os dados mostram um aumento da incidência de espermatozóides com morfologia alterada nos pacientes com infecção por HPV. Os parâmetros seminais de concentração e motilidade não apresentaram diferenças significativas entre os grupos (com e sem HPV). Nos pacientes portadores do vírus, as medidas de catalase mostraram-se significativamente aumentadas em relação aos pacientes não infectados. O estresse oxidativo pode estar relacionado com a fisiopatologia da infertilidade em pacientes com infecção por HPV no sêmen. Esta infecção sinaliza uma piora na qualidade do sêmen, baseada na alteração da morfologia do espermatozóide. / The diagnosis of human papillomavirus infection (HPV) in men has gained importance due to the fact they are frequently asymptomatic, who may be a virus reservoir, with an important role in the transmission and perpetuation of the disease. The goal of this study was to identify the presence of HPV in the semen in order to evaluate its influence in semen quality as well as in seminal oxidative stress. Sixty-eight men were analyzed, from which 30 were positive for DNA/HPV and 38 negative. Of the positive cases, 8/30 had HPV infection with the subtypes 16 or 18, which are considered with high prevalence for oncogenic risks. The viral infection and the classification of the virus subtypes were determined with the nested-PCR technique, and the enzymatic activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) were determined by spectrophotometry technique. There was no significant correlation among the studied epidemiological variables and the presence of the virus. The semen parameters sperm concentration and motility were evaluated manually according to the World Health Organization (WHO) criteria and the sperm morphology evaluated according to the WHO and Tygerberg´s strict criteria. The results show a higher incidence of sperm with abnormal morphology in patients with HPV infection compared to patients without the infection. Sperm concentration and motility did not show a difference between patients with or without HPV infection. In patients with the HPV, CAT levels were higher than patients without the HPV infection. Seminal oxidative stress may be related to the pathophysiology of infertility in patients with seminal HPV infection. This infection signalize for diminishing semen quality based on the damage of the sperm morphology seen in our study.

O Vírus da influenza, apesar de todas as epidemias e pandemias referirem-se a infecções em seres humanos, não está restrita a espécie humana e é capaz de causar debilidade ou mortalidade em várias outras espécies, incluindo cavalos, suínos, mamíferos marinhos e aves, entre outros. Estudos ecológicos das viroses de influenza conduziram a hipótese que todas as que acometem mamíferos derivam de reservatórios destes vírus em aves. Mesmo com programas de monitoramento contínuo de aves silvestres em alguns países do mundo que possuem casos originados pelos vírus aviário H5N1, pouco foi feito na Antártica e por isso, o presente trabalho foi realizado nas estações de verão antártico de 2006, 2007 e 2008 em duas localidades no território Antártico, a Península Keller, localizada na Ilha Rei George e na ilha Elefante 61°08S, 55°07W, a primeira onde está situada a Estação Antártica Comandante Ferraz-EACF e a segunda onde está localizada uma base de apoio a estudos avançados. Para este estudo foi realizada a coleta de 283 amostras de quatro diferentes espécies de pinguins: Pygoscelis adeliae; P. papua; P. antarctica; Aptenodytes patagonicus. Para o diagnóstico das amostras colhidas, foi aplicada a detecção direta dos produtos amplificados pelo método de RT-PCR em gel de agarose confirmados pelo método de Real-Time PCR (Applied Biosystems) e pelo RT-PCR-GeneScan no laboratório de Virologia Clínica e Molecular, do Departamento de Microbiologia, da Universidade de São Paulo. Os resultados obtidos em nosso estudo foram 8 amostras positivas em pinguins para o vírus Influenza A. As amostras positivas por RT-PCR foram encaminhadas para o laboratório de Influenza do Department of Infectious Diseases, St. Jude Children\'s Research Hospital, Memphis, TN, USA, para isolamento em ovos embrionados, não havendo crescimento de vírus da influenza A. Quatro destas amostras positivas puderam ser sequenciadas e comparadas com sequências de Influenza A depositadas no Genbank apresentando uma identidade de 96,8 % a 100 % entre elas e o controle tendo este último uma identidade de 100% com as do banco de dados, confirmando a presença do vírus nestas aves. / Epidemics and pandemics of influenza usually refer to infections in human beings. The influenza virus is not, however, restricted to humans and can cause infirmity and death in other species including horses, swine, marine mammals, birds, and others. Ecological studies of viral infections have led to the hypothesis that the influenza viruses that attack mammals have their origin in the accumulation of these viruses in birds (avian flu). In some countries with influenza cases caused by the avian H5N1 virus, there was monitoring of wild birds but little had been done in Antarctica. The present work was therefore carried out during the Antarctic summer seasons of 2006, 2007, and 2008 in two Antarctic locations: The Commander Ferraz Antarctic Station, on the Keller Peninsula of King George Island, and at the Base of Advanced Studies located on Elephant Island (61°08S, 55°07W). Two hundred eighty-three (283) samples from four different penguin species Pygoscelis adeliae, Pygoscelis papua, Pygoscelis antarctica; and Aptenodytes patagonicus were collected for this study. Diagnoses of the samples were performed not only by application of direct detection and amplification according to the RT-PCR method in agar-gel, but also by Real-Time PCR (Applied Biosystems), and by RT-PCR gene scan at the Laboratory of Clinical and Molecular Virology of the Department of Microbiology of the University of Sao Paulo. Eight of the penguin samples tested positive for the Influenza-A virus. The positive samples, as determined by RT-PCR, were sent to the Influenza Laboratory of the Department of Infectious Diseases of the St. Jude Research Hospital in Memphis, Tennessee, USA, to be isolated in egg embryos where no further growth of the Influenza-A virus took place. Four of these positive samples could be sequenced and compared with those of Influenza-A on deposit at the Gene Bank and ranged from 96.85 to 100% when compared with the control samples (100% positive), thus confirming the presence of the virus in the tested birds.

O Vírus da influenza, apesar de todas as epidemias e pandemias referirem-se a infecções em seres humanos, não está restrita a espécie humana e é capaz de causar debilidade ou mortalidade em várias outras espécies, incluindo cavalos, suínos, mamíferos marinhos e aves, entre outros. Estudos ecológicos das viroses de influenza conduziram a hipótese que todas as que acometem mamíferos derivam de reservatórios destes vírus em aves. Mesmo com programas de monitoramento contínuo de aves silvestres em alguns países do mundo que possuem casos originados pelos vírus aviário H5N1, pouco foi feito na Antártica e por isso, o presente trabalho foi realizado nas estações de verão antártico de 2006, 2007 e 2008 em duas localidades no território Antártico, a Península Keller, localizada na Ilha Rei George e na ilha Elefante 61°08S, 55°07W, a primeira onde está situada a Estação Antártica Comandante Ferraz-EACF e a segunda onde está localizada uma base de apoio a estudos avançados. Para este estudo foi realizada a coleta de 283 amostras de quatro diferentes espécies de pinguins: Pygoscelis adeliae; P. papua; P. antarctica; Aptenodytes patagonicus. Para o diagnóstico das amostras colhidas, foi aplicada a detecção direta dos produtos amplificados pelo método de RT-PCR em gel de agarose confirmados pelo método de Real-Time PCR (Applied Biosystems) e pelo RT-PCR-GeneScan no laboratório de Virologia Clínica e Molecular, do Departamento de Microbiologia, da Universidade de São Paulo. Os resultados obtidos em nosso estudo foram 8 amostras positivas em pinguins para o vírus Influenza A. As amostras positivas por RT-PCR foram encaminhadas para o laboratório de Influenza do Department of Infectious Diseases, St. Jude Children\'s Research Hospital, Memphis, TN, USA, para isolamento em ovos embrionados, não havendo crescimento de vírus da influenza A. Quatro destas amostras positivas puderam ser sequenciadas e comparadas com sequências de Influenza A depositadas no Genbank apresentando uma identidade de 96,8 % a 100 % entre elas e o controle tendo este último uma identidade de 100% com as do banco de dados, confirmando a presença do vírus nestas aves. / Epidemics and pandemics of influenza usually refer to infections in human beings. The influenza virus is not, however, restricted to humans and can cause infirmity and death in other species including horses, swine, marine mammals, birds, and others. Ecological studies of viral infections have led to the hypothesis that the influenza viruses that attack mammals have their origin in the accumulation of these viruses in birds (avian flu). In some countries with influenza cases caused by the avian H5N1 virus, there was monitoring of wild birds but little had been done in Antarctica. The present work was therefore carried out during the Antarctic summer seasons of 2006, 2007, and 2008 in two Antarctic locations: The Commander Ferraz Antarctic Station, on the Keller Peninsula of King George Island, and at the Base of Advanced Studies located on Elephant Island (61°08S, 55°07W). Two hundred eighty-three (283) samples from four different penguin species Pygoscelis adeliae, Pygoscelis papua, Pygoscelis antarctica; and Aptenodytes patagonicus were collected for this study. Diagnoses of the samples were performed not only by application of direct detection and amplification according to the RT-PCR method in agar-gel, but also by Real-Time PCR (Applied Biosystems), and by RT-PCR gene scan at the Laboratory of Clinical and Molecular Virology of the Department of Microbiology of the University of Sao Paulo. Eight of the penguin samples tested positive for the Influenza-A virus. The positive samples, as determined by RT-PCR, were sent to the Influenza Laboratory of the Department of Infectious Diseases of the St. Jude Research Hospital in Memphis, Tennessee, USA, to be isolated in egg embryos where no further growth of the Influenza-A virus took place. Four of these positive samples could be sequenced and compared with those of Influenza-A on deposit at the Gene Bank and ranged from 96.85 to 100% when compared with the control samples (100% positive), thus confirming the presence of the virus in the tested birds.

En aquest treball es descriu la determinació estructural mitjançant cristal·lografia de raigs X de la proteïna p4 del bacteriòfag phi29 en la seva forma lliure i en complex amb DNA.La proteïna p4 és essencial en el procés infectiu del bacteriòfag, ja que regula la transcripció dels seus gens, establint-se dues fases transcripcionals clarament diferenciades. Això permet separar en el temps la síntesi de proteïnes implicades en la replicació del DNA fàgic i la de les proteïnes estructurals que formen la partícula del bacteriòfag. Existeixen 3 llocs funcionals de unió de p4 en el genoma del bacteriòfag phi29, que es localitzen en una regió intergènica de 219 pb on es troben els 3 promotors més importants: el A2b, el A2c i el A3.En absència de la proteïna p4, els promotors A2b i A2c són transcripcionalment actius, mentre que el promotor A3, degut a l'absència de una caixa -35 en la seva seqüència és incapaç d'unir l'RNA polimerasa i es manté inactiu.En el moment en que la proteïna p4 és sintetitzada, aquesta s'uneix als seus llocs d'unió i produeix diferents efectes depenent del promotor que considerem. En el promotor A2b, el lloc d'unió de la proteïna p4 solapa amb la seva caixa -35 i impedeix la unió de l'RNA polimerasa inhibint-se la transcripció. En el promotor A2c, la proteïna p4 afavoreix la unió de l'RNA polimerasa però aquesta no pot realitzar la seva funció perque es produeix una sobreestabilització del complex i l'RNA polimerasa és incapaç d'alliberar-se del promotor. En el promotor A3, la proteïna p4 recluta l'RNA polimerasa permetent l'inici de la transcripció.La proteïna p4 va cristal·litzar en dos grups espacials, C2221 i P212121 en presència i absència d'un compost de platí, respectivament. L'obtenció de fases es va realitzar pel mètode MAD, recollint 3 conjunts de dades a diferent longitud d'ona de manera que les intensitats fossin diferents en les reflexions simètriques per l'efecte del platí com a dispersor anòmal. El model de la proteïna es va afinar fins a 3 Å en el grup espacial C2221 i aquest va servir per poder fer una cerca de reemplaçament molecular en el cristall P212121. En aquest grup espacial es va poder afinar el model fins a 2 Å.El complex format per la proteïna p4 i el DNA va cristal·litzar en el grup espacial P2, apareixent un complex per unitat asimètrica. El fasejat es va realitzar pel mètode del reemplaçament molecular utilitzant com a model de cerca un dímer de la proteïna p4 i un fragment ideal de DNA en conformació B.La proteïna p4 és una proteïna de 125 aminoàcids que s'uneix al DNA en forma de dímer. La unió de la proteïna al DNA provoca una corvatura de 70º. La unió es realitza de manera específica en la regió N-terminal de la proteïna i de manera inespecífica en la regió de dimerització. Els contactes realitzats amb l'esquelet de fosfat del DNA tenen com a objectiu fixar el solc menor de la molècula de DNA en una conformació comprimida. / This work describes the structural determination by X-ray crystallography of the phi29 bacteriophage protein p4, both bound and unbound to DNA.Protein p4 is essential for the bateriophage infective step, as it regulates its genes transcription, thus establishing two clearly differentiated transcriptional phases. This allows temporal separation of the phage protein synthesis: the proteins involved in phage DNA replication are synthesized first and the structural proteins that form the bacteriophage particle later. There are three p4 functional binding sites in phi29 genome, which are located in a 219bp long intergenic region where the three most important promoters (A2b, A2c and A3) are located.In p4 absence, A2b and A2c promoters are active, while A3 promoter, due to not having a -35 box in its sequence, is unable of binding RNA polymerase and remains inactive.When p4 protein is synthesized, it binds to its binding sites, thus producing different effects depending on the promoter. In A2b promoter, protein p4 binding site encloses the promoter -35 box, thus preventing RNA polymerase binding and transcription consequently. In A2c promoter, although protein p4 enhances RNA polymerase binding, the enzyme is unable to perform its function because the complex is overstabilized and so RNA polymerase cannot escape from the promoter. In A3 promotor, protein p4 recruits RNA polymerase, thus allowing transcription initiation.Protein p4 was crystallized in two different space groups, C2221 in presence of a platinum compost and P212121 in its absence. Phases were obtained by MAD, collecting 3 data sets at different wavelengths to have differences in the symmetric reflections intensities due to the effect as an anomal dispersor of the platinium. The protein model was refined up to 3 Å in the C2221 space group, and this model was used to perform a molecular replacement in the P212121 crystal. In this former space group, the model could be refined up to 2 Å .The complex formed by protein p4 and DNA was crystallized in P2 space group, with one complex per asymmetric unit. Molecular replacement was used for phase determination, taking a protein p4 dimer and an ideal DNA fragment in B conformation as a searching model.P4 is a 125 aminoacid long protein that binds DNA as a dimer. P4 binding to the DNA induces a 70º curvature on it. This binding is specific at the n-terminal region and unspecific at the dimerization area. The contacts with the phosphate backbone of the DNA fix the minor groove of the DNA molecule in a narrowed conformation.

Metapneumovírus Aviário (aMPV), família Pneumoviridae, gênero Metapneumovírus, é o agente etiológico responsável pela rinotraqueíte dos perus e também está associada à síndrome da cabeça Inchada em galinhas, duas importantes doenças respiratórias que acometem aves comerciais e levam a grandes perdas econômicas. O objetivo deste estudo foi detectar a presença de aMPV em amostras de aves silvestres e realizar a caracterização molecular dos isolados encontrados, com o intuito maior de contribuir para o entendimento da epidemiologia desse vírus. Para isso foram coletados no total, 448 suabes orofaringeanos (OP) e cloacais (C) oriundos de 234 aves silvestres em quatro locais do estado de São Paulo. Três tipos de amostras foram processadas e testadas: 1) 266 suabes agrupados de um ou até cinco animais que estavam no mesmo recinto e respeitando o mesmo tipo de suabe (OP ou C); 2)188 suabes foram agrupados na forma de pools de até dois animais, contendo os suabes OP e C de cada animal, formando então 48 pools; 3) amostras de tecido traqueal e pulmonar de três Egretta thula também foram coletados e testados. A purificação de RNA viral foi realizada utilizando o QIAmp RNA Mini Kit Kit (Qiagen). Para o teste de RT-PCR foi utilizado o kit OneStep RT-PCR (Qiagen) com primers baseados no gene N, previamente descritos, com fragmento esperado de 115 bp. As amostras foram também testadas por RT-PCR em tempo real (RRT-PCR) com primers específicos previamente descritos, para os subtipos A e B, com base no gene G com fragmentos de 116 e 135 bp, respectivamente. Os fragmentos das amostras positivas foram purificados e sequenciados pelo sequenciamento tipo Sanger para caracterização por análises filogenéticas. Das 126 amostras testadas pelo teste de RT-PCR baseado no gene N, quatorze foram positivas: oito amostras de Anseriformes (Aix sponsa, Aix galericulata, Dendrocygna viduata), três de Columbiformes (Columba livia), um de Falconiformes (Falco sparverius), um de Psittaciformes (Psittacara leucophthalma) e um de Pelecaniformes (Egretta thula). Das quatorze amostras positivas, treze eram provenientes de suabes, e a décima quarta era oriunda de tecido traqueal de Egretta thula. Pelo teste de RRT-PCR baseado no gene G nenhuma das 184 amostras testadas foi positiva. As análises filogenéticas realizadas com fragmentos de 44 e 54 bp do gene N de duas amostras positivas, que se agruparam com isolados pertencentes ao aMPV de subtipo A. Estes vírus apresentaram alta identidade com as estirpes derivadas de vacina e com estirpes vacinais, o que mostra uma possível ocorrência de escapes vacinais de aves de produção para as aves silvestres. / Avian metapneumovirus (aMPV), family Pneumoviridae, genus Metapneumovirus, it is the etiologic agent responsible for turkey rhinotracheitis and is also associated with swollen head syndrome in chickens, two important respiratory diseases in poultry which leads to large economic losses. The aim of this study was detect the presence of aMPV in wild birds samples, to perform the phylogenetic analysis of the isolates found with the major objective of contributing to the understanding of the epidemiology of this virus in poultry farms. In total, 448 oropharyngeal (OP) and cloacal (C) swabs from 234 wild birds collected in four different locations within the state of São Paulo. The samples were processed and tested in three different ways: 1) 266 swabs were in the form of pools of one up to five animals that were in the same enclosure and respecting the same type of swab (OP or C); 2) 188 remaining swabs were grouped into pools of up to two animals, containing the oropharyngeal and cloacal swabs of each animal; 3) tracheal and pulmonary tissue samples were also collected and tested. Purification was performed using the QIAmp RNA Mini Kit Kit (Qiagen). Viral detection was performed by conventional RT-PCR technique using the OneStep RT-PCR kit (Qiagen) with primers based on the N gene, previously described with expected fragment of 115 bp. The samples were also tested by a real time RT-PCR (RRT-PCR) with specific primers previously described, for subtypes A and B, based on the G gene with fragments of 116 and 135 bp, respectively. Of the 126 samples tested by the RT-PCR N gene based, fourteen were positive: eight samples of Anseriformes (Aix sponsa, Aix galericulata, Dendrocygna viduata), three Columbiformes (Columba livia), one Falconiformes (Falco sparverius), one Psittaciformes (Psittacara leucophtalma) and one Pelecaniformes (Egretta thula). Of the swab samples, five were derived from oropharyngeal swabs and four from cloacal swabs, the other four samples were detected in the samples processed in pools of up to two animals, which contained the oropharyngeal and cloacal swabs of each bird. The positive Egretta thula sample was from a tracheal tissue sample. Based on the RRT-PCR G gene based, none of the 184 samples tested were detected. Phylogenetic analyzes were performed on two positive samples that proved to belong to aMPV subtype A, showing high similarity with the strains derived from the vaccine and with vaccine strains.

As formulações vacinais contra o Vírus Respiratório Sincicial Humano, HRSV, estão associadas à indução de eosinofilia pulmonar mediada por uma resposta de células TCD4+ Th2, após exposição ao HRSV selvagem. Foi identificado um peptídeo da proteína viral G, que modificado perde a capacidade de predispor à eosinofilia, tornando-o um imunógeno atraente. Células T CD8+ específicas para HRSV reduzem a resposta Th2, mediam resistência a desafio com o vírus, e estão relacionadas à redução dos sintomas. Assim, neste trabalho buscamos e identificamos epítopos de células TCD8+ na polimerase viral, utilizando programas de predição, imunização com peptídeos e avaliação da resposta celular. Também construímos vacinas de DNA contendo a seqüência nucleotídica do peptídeo da proteína G modificado. A caracterização da resposta imune estimulada por essas vacinas e por peptídeos purificados revelou que o plasmídio pTGMCTB, bem como os peptídeos GM e GMCTB, foram capazes de induzir anticorpos que, porém, não se mostraram neutralizantes de HRSV e protetores frente a desafio. / Vaccines against human respiratory syncytial virus (HRSV) are associated with pulmonary eosinophilia induction mediated by a TCD4+ Th2 response, after exposition to wild HRSV. A peptide from the viral protein G was identified to predispose to eosinophilia and loses this ability when mutated, making it an interesting immunogen. CD8+ T cells specific to HRSV reduce the Th2 response, mediate resistance to virus challenge, and are related to symptom-reduction. Thus, in the present work, we searched for and identified CD8+ T cell epitopes in the viral polymerase; using prediction programs, peptide immunization and evaluation of the cellular response. We also constructed DNA vaccines containing the nucleotide sequence of the mutated peptide from G protein mentioned above. The characterization of the immune response elicited by these vaccines and purified peptides showed that the pTGMCTB plasmid, as well as GM and GMCTB peptides were able to induce antibody response; however they are not neutralizing and protective against HRSV challenge.