Made available in DSpace on 2014-06-12T15:05:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1817_1.pdf: 544861 bytes, checksum: 273b8fd85ce7e992f4b4753d8bac0934 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / A espécie Bothrops erythromelas, conhecida em Pernambuco como jararaca malha-de-cascavel, está amplamente distribuída na Região Nordeste do Brasil. A hemorragia é um dos sintomas mais característicos do envenenamento botrópico, especialmente em Pernambuco. A ação hemorrágica ocorre devido a um grupo de metaloproteínas zinco-dependentes, denominadas hemorraginas, que agem diretamente na parede dos vasos sanguíneos, sendo divididas em 4 classes de acordo com a massa molecular. O objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar duas hemorraginas de alta massa molecular da peçonha de Bothrops erythromelas (pBe). Para tanto, 865 mg de pBe foram aplicados em coluna de gel filtração Sephacryl S-200 equilibrada com tampão acetato de amônio 50mM contendo 0,3 M de NaCl, pH 5,0, sendo as frações analisadas quanto a intensidade de atividade hemorrágica em camundongos. A fração com maior atividade foi aplicada em coluna Mono Q 5/50 equilibrada com tampão Tris-HCl 100mM, pH 8,0 e eluída em gradiente não linear de NaCl 2M. Os tubos 9 e 18 provenientes da troca iônica foram recromatografados, separadamente, em coluna de gel filtração TSK G-2000 SW equilibrada com tampão acetato de amônio 150 mM, pH 5,0. As toxinas purificadas tiveram sua massa molecular estimada em 55 KDa segundo EGPA-SDS em condições redutoras e foram completamente inibidas por EDTA. Em conclusão, duas novas metaloproteinases hemorrágicas da classe P-III, denominadas berythrogina 1 e berythrogina 2, foram purificadas da peçonha de Bothrops erythromelas

As peçonhas de serpentes contêm uma mistura complexa de substâncias farmacologicamente ativas, como metaloproteases, fosfolipases A2, serino-proteases, L-aminoácido oxidase (LAAO), além de outros importantes compostos sem ação enzimática. LAAOs são flavoproteínas que catalisam a desaminação oxidativa de L-aminoácidos e produzem o -cetoácido correspondente, com a concomitante liberação de amônia e peróxido de hidrogênio. A peçonha de Lachesis muta (L. muta) contém L-aminoácido oxidase, a qual pode contribuir com o envenenamento. Portanto, o objetivo deste trabalho é a purificação da L-amino acido oxidase de peçonha de Lachesis muta (LmLAAO) e a sua caracterização bioquímica, estrutural e funcional. Para isso, foram desenvolvidos dois protocolos distintos de purificação, os quais forneceram LmLAAO com grande pureza. No primeiro protocolo, 20 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a uma gel filtração em Sephacryl S100®. Das dez frações obtidas, a primeira fração apresentou atividade L-aminoácido oxidase e foi submetida a mais um passo cromatográfico em Mono Q®. A homogeneidade da fração com atividade L-aminoácido oxidase após a troca iônica foi comprovada por presença de banda única com 60,2 kDa em SDS-PAGE. O segundo protocolo de purificação foi uma sequência de três passos cromatográficos, na qual 200 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a gel filtração em Sephacryl S200®, seguido por interação hidrofóbica em Phenyl Sepharose® e Affi- gel Blue Gel®. Da mesma forma, a pureza da enzima obtida depois desses passos cromatográficos foi comprovada por presença de banda única com 64 kDa em SDS-PAGE. Em ambos os protocolos de purificação, LmLAAO manteve sua atividade enzimática. A massa molar de LmLAAO foi determinada por espectrometria de massas (MALDI-TOF) e apresentou valor de 60,85 kDa. Além disso, foi determinado o valor do ponto isoelétrico da LmLAAO como 5,1. A LmLAAO mostrou preferência catalítica por aminoácidos hidrofóbicos (L-Metionina L-Leucina e L-Fenilalanina) e apresentou perda de atividade catalítica quando submetida à altos valores de pH ou de temperatura. Os parâmetros cinéticos foram determinados e a constante de Michaelis-Menten para o substrato L-Leucina foi de 0,9737 mmol/L e a velocidade máxima de reação foi de 0,06345 mol peróxido de hidrogênio/min. A sequência N-terminal dos 40 primeiros resíduos da LmLAAO purificada foi determinada por degração de Edman e a sua estrutura primária completa foi deduzida da sequência do cDNA obtido da glândula de peçonha. Verificou-se uma grande identidade entre as sequências em aminoácidos da LAAO de L. muta e as de outros viperídeos. A estrutura da LmLAAO foi resolvida por substituição molecular usando as coordenadas atômicas da LAAO de Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). As atividades farmacológicas da LmLAAO foram determinadas in vivo e in vitro. A injeção da enzima (10 µg) não induziu edema de pata em camundongos, nem hemorragia (50 µg) e nem toxicidade sistêmica (100 µg). No entanto, provocou uma leve mionecrose (100 µg) e edema em músculo quadríceps de camundongo, aumentando a creatina quinase plasmática. In vitro, foram testadas as atividades citotóxicas da LmLAAO em células de carcinoma. Os dados obtidos mostram IC50 de 22,70 µg/mL, para linhagem AGS (carcinoma de estômago), e IC50 de 1,41 µg/mL linhagem MCF-7 (carcinoma de mama). Para a atividade antiparasitária, foi determinada uma IC50 de 2,22 µg/mL para a forma promastigota de Leishmania brasiliensis. No entanto, a LmLAAO (32 µg/mL) não apresentou toxicidade relevante para a forma tripomastigota de Tripanosoma cruzi. Concluindo, este trabalho descreve o isolamento e a caracterização estrutural e funtional de uma nova LAAO da peçonha de L. muta. A enzima mostrou efeitos antitumorais e leishmanicida, sem toxicidade sistêmica relevante, mas apresentou significativa ação edematogênica e miotóxica local. Este estudo é relevante não apenas por contribuir para uma melhor compreensão do papel da LAAO no envenenamento, mas também por demonstrar seu potencial biotecnológico como agente terapêutico. / Snake venoms comprise a complex mixture of pharmacologically active substances, such as metalloproteases, phospholipase A2, serine proteases and L-amino acid oxidases (LAAOs) other compounds showing no enzymatic activity. LAAOs are flavoproteins catalyzing the oxidative deamination of L-amino acids to produce the corresponding -keto acid with the concomitant release of ammonia and hydrogen peroxide. Lachesis muta (L. muta) venom contains L-amino acid oxidase which may contribute to the envenomation. The aim of this study is the purification of an L-amino acid oxidase from Lachesis muta venom (LmLAAO) and its structural and functional characterization. For that, two purification protocols were performed and both provided highly pure LmLAAO. In the first protocol, 20 mg of crude venom of L. muta were submitted to a gel filtration on Sephacryl S100® and yielded ten fractions, whose were tested for L-amino acid oxidase activity. The first fraction showed L-amino acid oxidase activity and it was submitted to a further chromatographic step on Mono Q®. The homogeneity of the fraction showing L-amino acid oxidase activity after ion exchange was confirmed by the presence of a single band corresponding to 60.2 kDa by SDS-PAGE. The second purification protocol was a sequence of three chromatographic steps, where 200 mg of crude L. muta venom were submitted to gel filtration on Sephacryl S200, followed by hydrophobic interaction on Phenyl Sepharose® and Affi-gel-Blue Gel. For the second protocol, the purity of LmLAAO was confirmed by the presence of a single band with 64 kDa as determined by SDS-PAGE. In both purification protocols LmLAAO kept its enzymatic activity. The molar mass of LmLAAO was determined by mass spectrometry (MALDI-TOF) and showed a value of 60.85 kDa. Moreover, the isoelectric point was 5.1. In addition, LmLAAO showed a catalytic preference for hydrophobic amino acids (L-methionine, L-leucina and L-phenylalanine) and lost its catalytic activity when subjected to high pH or temperature. The kinetic parameters for LAAO were determined and the Michaelis-Menten constant for the substrate L-leucine was 0.9737 mmol/L, and the maximum reaction velocity was 0.06345µmol hydrogen peroxide/min. Furthermore, the sequence of the first forty residues was determined by Edman degradation and the complete sequence of LmLAAO was resolved by cloning cDNA obtained from the venom glands. The amino acid sequence of LmLAAO showed a great identity with sequences of LAAOs from other viper snakes. The LmLAAO structure was solved by molecular replacement using the the atomic coordinates of the LAAO from Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). In addiction, LmLAAO pharmacological activities were determined in vivo and in vitro. Thus, LmLAAO (10 µg) did not induce paw edema in mice, neither hemorrhage (50 µg) nor systemic toxicity (100 µg). However, it caused a mild myonecrosis (100 µg) and edema in the quadriceps muscles of mice, increasing plasma creatine kinase. In vitro activities of LmLAAO in carcinoma cells was assayed. The IC50 of LmLAAO on AGS cell line (stomach cancer) was 22.70 µg / mL, and the IC50 of LmLAAO on MCF-7 cell line (breast carcinoma) was 1.41 µg/mL. Moreover, antiparasitic activity of LmLAAO was determined on promastigote of Leishmania brasiliensis and an IC50 of 2.22 µg/mL was found, whereas on trypomastigote form Trypanosoma cruzi LmLAAO showed no toxicity at doses of 32 µg/mL. In conclusion, this work reports the isolation and the structural and funtional characterization of a new LAAO from L. muta snake venom. The enzyme showed antitumoral and leishmanicidal effects, without relevant systemic toxicity, but presented a significant local edema inducing and myotoxic action. This study is relevant not only for contributing to a better understanding of LAAO role in envenomation, but also for demonstrating its biotechnological potential as a therapeutic agent.

Esse trabalho teve como objetivo estudar aspectos importantes das estratégias reprodutivas de machos e fêmeas de Bothrops jararaca do clado norte (CN) e sul (CS) e das ilhas de Búzios (SP), Ilhabela (SP) e ilha dos Franceses (ES). Para isso, foram analisados exemplares de B. jararaca preservadas de diversas coleções zoológicas. Machos e fêmea de B. jararaca do CN foram significativamente maiores que os machos e fêmeas CS, no entanto tiveram cabeças relativamente menores e foram menos robustos. Fêmeas do CN têm em média maior fecundidade e filhotes maiores do que fêmeas do CS. O ciclo reprodutivo de machos e fêmeas de ambas as populações é sazonal e não variou entre as estações do ano. Fêmeas do CN e do CS tem cópula outonal. A vitelogênese tem início no final do verão e fêmeas grávidas são observadas a partir do final do inverno. Nascimentos de B. jararaca de ambos os clados podem ser observados principalmente no verão e podem se estender até o início do outono. A estocagem de espermatozoides no útero e no infundíbulo foi observada principalmente no outono e inverno. Ciclos reprodutivos de machos de ambos os clados são considerados do tipo pós-nupcial ou do tipo I. O início da produção de espermatozoides é na primavera e a fase ativa pode ser observada no verão. No outono e no inverno, os testículos estão inativos. Estocagem de espermatozoides nos ductos deferentes foi observada durante todos os meses do ano e o segmento sexual renal (SSR) apresentou a fase mais ativa (fase secretora) na primavera e verão (sincronizado com a espermatogênese nos testículos) e fase não secretora no outono e no inverno. Esse padrão dos ciclos dos machos foi observado em ambos os clados. Dessa forma, foram observadas variações geográficas nas características de histórias de vida entre as populações do CN e CS, porém, não foram observadas diferenças entre os padrões de ciclos reprodutivos. Assim, o ciclo reprodutivo de machos e fêmeas de B. jararaca do CN e do CS são conservativo na espécie. / This research aimed to study important aspects of reproductive strategies in male and female of Bothrops jararaca from north clade (CN), south clade (CS) including the islands of Búzios (SP), Ilhabela (SP), and Franceses (ES). We analyzed specimens of B. jararaca preserved on several zoological collections. Male and female of B. jararaca from CN were significantly longer than male and female from CS, however they had relatively smaller heads and were less robust. Male and female of B. jararaca from CN were significantly larger than individuals from CS, had relatively smaller heads and were less robust. Females from CN had on average higher fecundity and larger offspring than females of CS. The reproductive cycle of males and females from both populations was seasonal and the timing of events was also similar between clades. Females of CN and CS have autumn mating season. The vitellogenesis starts in the end of the summer and pregnant females are observed from late winter. Births of B. jararaca occurred from early summer to the beginning of autumn. Sperm storage in the uterus and infundibulum was mainly observed during autumn and winter. Reproductive cycles of male of both clades are type postnuptial or a type I. The beginning of the sperm production occurs in spring and the active phase was observed in the summer. During autumn and winter, the testicles are inactive. Sperm storage in the different ducts was observed throughout the year and the sexual segment of the kidney (SSK) shows a more active phase during spring and summer and non-secretory phase on autumn and winter. This pattern of cycles of male was observed in both clades. In conclusion, there is geographical variation in life-history characteristics between CN and CS populations. However, differences among the reproductive cycle pattern were not evident. Then, the reproductive cycles of male and female of CN and CS are conservative in the species.

Esse trabalho teve como objetivo estudar aspectos importantes das estratégias reprodutivas de machos e fêmeas de Bothrops jararaca do clado norte (CN) e sul (CS) e das ilhas de Búzios (SP), Ilhabela (SP) e ilha dos Franceses (ES). Para isso, foram analisados exemplares de B. jararaca preservadas de diversas coleções zoológicas. Machos e fêmea de B. jararaca do CN foram significativamente maiores que os machos e fêmeas CS, no entanto tiveram cabeças relativamente menores e foram menos robustos. Fêmeas do CN têm em média maior fecundidade e filhotes maiores do que fêmeas do CS. O ciclo reprodutivo de machos e fêmeas de ambas as populações é sazonal e não variou entre as estações do ano. Fêmeas do CN e do CS tem cópula outonal. A vitelogênese tem início no final do verão e fêmeas grávidas são observadas a partir do final do inverno. Nascimentos de B. jararaca de ambos os clados podem ser observados principalmente no verão e podem se estender até o início do outono. A estocagem de espermatozoides no útero e no infundíbulo foi observada principalmente no outono e inverno. Ciclos reprodutivos de machos de ambos os clados são considerados do tipo pós-nupcial ou do tipo I. O início da produção de espermatozoides é na primavera e a fase ativa pode ser observada no verão. No outono e no inverno, os testículos estão inativos. Estocagem de espermatozoides nos ductos deferentes foi observada durante todos os meses do ano e o segmento sexual renal (SSR) apresentou a fase mais ativa (fase secretora) na primavera e verão (sincronizado com a espermatogênese nos testículos) e fase não secretora no outono e no inverno. Esse padrão dos ciclos dos machos foi observado em ambos os clados. Dessa forma, foram observadas variações geográficas nas características de histórias de vida entre as populações do CN e CS, porém, não foram observadas diferenças entre os padrões de ciclos reprodutivos. Assim, o ciclo reprodutivo de machos e fêmeas de B. jararaca do CN e do CS são conservativo na espécie. / This research aimed to study important aspects of reproductive strategies in male and female of Bothrops jararaca from north clade (CN), south clade (CS) including the islands of Búzios (SP), Ilhabela (SP), and Franceses (ES). We analyzed specimens of B. jararaca preserved on several zoological collections. Male and female of B. jararaca from CN were significantly longer than male and female from CS, however they had relatively smaller heads and were less robust. Male and female of B. jararaca from CN were significantly larger than individuals from CS, had relatively smaller heads and were less robust. Females from CN had on average higher fecundity and larger offspring than females of CS. The reproductive cycle of males and females from both populations was seasonal and the timing of events was also similar between clades. Females of CN and CS have autumn mating season. The vitellogenesis starts in the end of the summer and pregnant females are observed from late winter. Births of B. jararaca occurred from early summer to the beginning of autumn. Sperm storage in the uterus and infundibulum was mainly observed during autumn and winter. Reproductive cycles of male of both clades are type postnuptial or a type I. The beginning of the sperm production occurs in spring and the active phase was observed in the summer. During autumn and winter, the testicles are inactive. Sperm storage in the different ducts was observed throughout the year and the sexual segment of the kidney (SSK) shows a more active phase during spring and summer and non-secretory phase on autumn and winter. This pattern of cycles of male was observed in both clades. In conclusion, there is geographical variation in life-history characteristics between CN and CS populations. However, differences among the reproductive cycle pattern were not evident. Then, the reproductive cycles of male and female of CN and CS are conservative in the species.