Der Sekretionsweg ist essenziell für die Funktion von Zellen und beginnt, wenn mRNAs, die für Membran- und Sekretionsproteine codieren, an das endoplasmatische Retikulum (ER) gebracht werden. Allerdings ist wenig darüber bekannt, inwiefern RNA-bindende Proteine zur Erkennung und Translation von ER lokalisierten mRNAs beitragen. In dieser Arbeit haben wir das humane RNA-bindende Protein HDLBP charakterisiert. Wir haben durch PAR-CLIP-, Zellfraktionierungs- und RNA-Seqeuenzierexperimente festgestellt, dass HDLBP an mehr als 80% aller ER lokalisierten mRNAs bindet. Analysen zu HDLBPs Bindungsmotiv haben gezeigt, dass HDLBP vorwiegend an ein CU-haltiges Motiv in der codierenden Sequenz (CDS) hauptsächlich von ER lokalisierten mRNAs bindet. Im Gegensatz dazu enthalten zytosolische HDLBP gebundene mRNAs weniger Bindungsstellen und diese treten sowohl in der CDS als auch in 3‘ untranslatierten Regionen auf. Dies zeigt, dass sich ER lokalisierte mRNAs von Zytosol lokalisierten mRNAs in ihrer Sequenzzusammensetzung hinsichtlich der HDLBP Bindungsstellen unterscheiden. Weitere Analysen des PAR-CLIP-Experiments ergaben, dass HDLBP mit RNA-Komponenten des Signalerkennungspartikels (SRP) und der 40S ribosomalen Untereinheit interagiert. Durch BioID-Experimente haben wir Proteine in unmittelbarer Nähe zu HDLBP bestimmt und konnten damit die Assoziation von HDLBP mit Komponenten des Translationsapparates und des SRPs bestätigen. Funktionelle Studien, bei denen wir CRISPR-Cas9 erzeugte HDLBP Knockout (KO) Zelllinien in Kombination mit Ribosomen-Profiling verwendet haben, haben gezeigt, dass HDLBP die Translation von mRNAs fördert, die an HDLBP gebunden und am ER lokalisiert sind. Letztlich haben in vivo Experimente mit Nacktmäusen ergeben, dass HDLBP KO eine Abnahme der Lungentumorbildung verursacht, was die Relevanz von HDLBP für die Tumorprogression hervorhebt. Insgesamt zeigt unsere Arbeit eine generelle Funktion von HDLBP bei der Translation von ER lokalisierten mRNAs. / The secretory pathway is essential for proper cell functioning and starts when mRNAs encoding membrane and secretory proteins are targeted to the endoplasmic reticulum (ER). However, little is known about the contribution of RNA-binding proteins to the recognition, localization and translation of ER-localized mRNAs. In this work, we characterized the human RNA-binding protein HDLBP. We identified that HDLBP binds to more than 80% of all ER-localized mRNAs by PAR-CLIP, cell fractionation and RNA-sequencing experiments. Analysis of the HDLBP binding motif showed that it predominantly binds to a CU-containing motif and forms high affinity multivalent interactions primarily in the coding sequence (CDS) of ER-localized mRNAs. In contrast, we identified that cytosolic HDLBP mRNA targets show less HDLBP binding sites randomly distributed between the CDS or 3’ untranslated regions. This indicates that ER-localized mRNAs per se differ from cytosol-localized mRNAs in their sequence composition with regard to HDLBP binding sites. Further PAR-CLIP analysis revealed that HDLBP interacts with RNA components of the signal recognition particle (SRP) and the 40S ribosomal subunit. We identified by BioID experiments proteins in close proximity to HDLBP and confirmed the association of HDLBP with components of the translational apparatus and the SRP. Functional studies using CRISPR-Cas9 HDLBP knockout (KO) cell lines in combination with ribosome profiling demonstrated that HDLBP promotes the translation of its ER-localized target mRNAs. We validated this finding by pSILAC experiments and detected the corresponding decrease in protein synthesis of proteins encoded by mRNAs that are bound by HDLBP and ER-localized. Lastly, in vivo experiments with nude mice showed that HDLBP KO resulted in a decrease of lung tumor formation highlighting the relevance of HDLBP for tumor progression. Overall, these results demonstrate a general function for HDLBP in the translation of ER-localized mRNAs.

Die chloroplastidäre und mitochondriale Genexpression ist abhängig von einer großen Anzahl an RNA-Bindeproteinen (RBPs). Eine besonders abundante Familie sind die chloroplastidären Ribonukleoproteine (cpRNPs). Während Ziel-RNAs mehrerer cpRNPs und die Phänotypen entsprechender Mutanten beschrieben wurden, bleibt ihre molekulare Funktion weitgehend ungeklärt. In dieser Arbeit wurden Studien der cp29a Mutante durch genomweite Analysen erweitert. Diese legen nahe, dass die eigentliche Rolle von CP29A in phänotypisch erkennbarem Mutanten-Gewebe durch sekundäre Defekte maskiert wird. Um primäre Defekte zu identifizieren, wurden in vivo Bindestellen von CP29A mit einer neuen Chloroplasten-adaptierten Methode, die UV-Licht zur Quervernetzungen nutzt, bestimmt. Transkripte, die für Untereinheiten des Photosystem II und des Cytochrom-b6f-Komplexes kodieren, waren unter den Zielen von CP29A überrepräsentiert. Weiterhin wurden mehrere Bindestellen in Nachbarschaft zu Bindestellen von PPR-Proteinen identifiziert. Mit einer alternativen Methode, die chemische Quervernetzung nutzt, wurden Ziel-RNAs eines weiteren cpRNP, CP31A, identifiziert. Transkripte, die für Untereinheiten des NADH-Dehydrogenase Komplexes kodieren, waren überrepräsentiert. Diese Daten führten zu einer neuen Hypothese, die die Funktion von cpRNPs im Zusammenspiel mit PPR-Proteinen in der Prozessierung funktionell verwandter RNAs postuliert. Ein weiterer für die Genexpression relevanter Mechanismus ist die Bildung membranloser Kompartimente durch flüssig-flüssig Phasentrennung. Es wurde eine in silico Analyse durchgeführt, um organelläre Proteine mit Domänen, die auf flüssig-flüssig Phasentrennung hindeuten, zu identifizieren. Funktionen mit Bezug zu Genexpression, insbesondere RNA-Edierung, waren bei diesen Proteinen mit Prionen-ähnlichen Domänen (PLDs) überrepräsentiert. Zwei Kandidaten wurden auf ihre Neigung zur flüssig-flüssig Phasentrennung durch in vitro Experimente und in vivo Mikroskopie untersucht. / Gene expression in chloroplasts and mitochondria relies on a large number of RNA-binding proteins (RBPs), which are involved in the processing of polycistronic precursor transcripts. A particular abundant family are the chloroplast ribonucleoproteins (cpRNPs). While target RNAs and mutant phenotypes of several cpRNPs were described, insights on their molecular function remained sparse. In this thesis, analyses of cp29a mutants were extended by genome-wide transcriptome data, which suggest that in phenotypically noticeable mutant tissue the actual role of CP29A might be masked by secondary effects. To identify primary defects, in vivo binding sites of CP29A on its target transcripts were determined using a novel chloroplast-adapted approach using crosslinking by UV-light. Identified targets of CP29A are functionally enriched in mRNAs encoding subunits of the photosystem II and the cytochrome b6f complex. Moreover, several binding sites were identified in close proximity to characterized binding sites of PPR proteins. Using an alternative approach, employing chemical crosslinking, targets of another cpRNP, CP31A, were identified. Targets are enriched in genes encoding subunits of the NADH-like dehydrogenase complex. In combination, these data led to a novel hypothesis on the molecular function of cpRNPs working together with PPR proteins in the processing of functionally related RNAs. Another increasingly recognized mechanism in gene expression is the formation of membraneless organelles by liquid-liquid phase separation. An in silico screen for organellar proteins containing domains indicative of phase separation was performed. The identified set of proteins with prion-like domains (PLDs) is enriched in functions related to gene expression, particularly RNA-editing. Two selected candidate proteins were characterized for their propensity to undergo phase separation by in vitro phase separation assays and in vivo microscopy.

Die hoch abundante sRNA 6S RNA reguliert in Prokaryoten durch Bildung eines stabilen Riboproteinkomplexes mit der RNA Polymerase maßgeblich die globale Genexpression zur Anpassung an wechselnde Umweltbedingungen. In der vorliegenden Arbeit wurde die regulative Funktion von 6S RNA in Cyanobakterien am Beispiel des Modellorganismus Synechocystis sp. PCC 6803 beleuchtet. Die Analysen zeigten, dass die 6S RNA-Transkriptmenge sowohl unter phototrophen als auch unter photoheterotrophen Bedingungen in der stationären Wachstumsphase abnahm. Zudem wurden physiologische Untersuchungen einer 6S RNA-Deletionsmutante (delta_ssaA) und einer Überexpressionsmutante unter diversen Stressbedingungen durchgeführt. Während für delta_ssaA eine erhöhte Sensitivität gegenüber oxidativem Stress gemessen wurde, war die Thermotoleranz in den Mutanten nicht beeinträchtigt. Ferner wurde für delta_ssaA eine verlangsamte Regeneration nach Stickstoffmangel ermittelt, die sich phänotypisch durch eine verzögerte Reassemblierung der Phycobilisomen und des Glykogenabbaus sowie durch eine verminderte photosynthetische Aktivität äußerte. Vergleichende Microarray-Analysen zeigten, dass sich die Genexpression in delta_ssaA unter Stickstoffmangel kaum vom Wildtyp unterschied. Hingegen waren während der Regeneration Gene kodierend für die ATP-Synthase, ribosomale Proteine, Photosynthese-Komplexe und Phycobilisomen in delta_ssaA signifikant negativ exprimiert. Zudem wurde eine charakteristische Expressionskinetik für die sRNA SyR11 ermittelt. In vivo-pulldown-Analysen der RNA Polymerase zeigten, dass 6S RNA während der Regeneration die Rekrutierung des Hauptsigmafaktors SigA begünstigt und die Dissoziation von Sigmafaktoren der Gruppe 2 beschleunigt. Derweil blieb das 6S RNA-Transkriptlevel unter Stickstoffstress nahezu konstant. Ein Nachweis von in vivo-synthetisierten pRNA-Transkripten blieb negativ. Die Ergebnisse werden in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich der funktionellen Bedeutung von 6S RNA für die Adaptation an Stressbedingungen in Cyanobakterien diskutiert. / The highly abundant sRNA 6S RNA extensively regulates the global gene expression for adaptation to changing environmental conditions in many prokaryotes by forming stable complexes with the RNA polymerase. In this work, Synechocystis sp. PCC 6803 was used as a model organism to study the regulative function of 6S RNA in cyanobacteria. A decline in 6S RNA transcript levels during stationary phase was measured under phototrophic and photoheterotrophic conditions. Physiological studies were carried out under various stress conditions using a 6S RNA deletion mutant (delta_ssaA) and an overexpression mutant. Delta_ssaA exhibited increased sensitivity toward oxidative stress, whereas the thermo-tolerance of the cells was not affected in the mutant strains. The recovery from nitrogen depletion was considerably delayed in delta_ssaA compared to the wild type. This phenotype was physiologically characterized by a decelerated phycobilisome reassembly and glycogen degradation as well as reduced photosynthetic activity in delta_ssaA. Comparative transcriptome analysis verified these observations. While under nitrogen depletion similar gene expression patterns were measured in delta_ssaA and wild type, genes encoding ATP synthase, ribosomal proteins, photosystem components and phycobilisomes were significantly negatively affected in the mutant strain during recovery. Furthermore, a distinctive accumulation kinetics was found for the sRNA SyR11. In vivo pulldown analyses of the RNA polymerase revealed a promoting effect of 6S RNA on the recruitment of the housekeeping sigma factor SigA as well as on the complex dissociation of group 2 sigma factors. Meanwhile, the 6S RNA transcript level remained nearly constant during nitrogen deficiency and the detection of in vivo synthesized pRNA transcripts was negative. The results are discussed regarding the functional role of 6S RNA for the adaptation to stress conditions in cyanobacteria.

Der Ribonukleinsäure (RNS) Stoffwechsel umfasst verschiedene Schritte, beginnend mit der Transkription der RNS über die Translation bis zum RNA Abbau. Poly(A) Schwänze befinden sich am Ende der meisten der Boten-RNS, schützen die RNA vor Abbau und stimulieren Translation. Die Deadenylierung von Poly(A) Schwänzen limitiert den Abbau von RNS. Bisher wurde RNS Abbau meist im Kontext von cytoplasmatischen Prozessen untersucht, ob und wie RNS Deadenylierung und Abbau in Nukleus erfolgen ist bisher unklar. Es wurde daher eine neue Methode zur genomweiten Bestimmung von Poly(A) Schwanzlänge entwickelt, welche FLAM-Seq genannt wurde. FLAM-Seq wurde verwendet um Zelllinien, Organoide und C. elegans RNS zu analysieren und es wurde eine signifikante Korrelation zwischen 3’-UTR und Poly(A) Länge gefunden, sowie für viele Gene ein Zusammenhang von alternativen 3‘-UTR Isoformen und Poly(A) Länge. Die Untersuchung von Poly(A) Schwänzen von nicht-gespleißten RNS Molekülen zeige, dass deren Poly(A) Schwänze eine Länge von mehr als 200 nt hatten. Die Analyse wurde durch eine Inhibition des Spleiß-Prozesses validiert. Die Verwendung von Methoden zur Markierung von RNS, welche die zeitliche Auflösung der RNS Prozessierung ermöglicht, deutete auf eine Deadenylierung der Poly(A) Schwänze schon wenige Minuten nach deren Synthesis hin. Die Analyse von subzellulären Fraktionen zeigte, dass diese initiale Deadenylierung ein Prozess im Nukleus ist. Dieser Prozess ist gen-spezifisch und Poly(A) Schwänze von bestimmten Typen von Transkripten, wie nuklearen langen nicht-kodierende RNS Molekülen waren nicht deadenyliert. Um Enzyme zu identifizieren, welche die Deadenylierung im Zellkern katalysieren, wurden verschiedene Methoden wie RNS-abbauende Cas Systeme, siRNAs oder shRNA Zelllinien verwendet. Trotz einer effizienten Reduktion der RNS Expression entsprechender Enzymkomplexe konnten keine molekularen Phänotypen identifiziert werden welche die Poly(A) Länge im Zellkern beeinflussen. / The RNA metabolism involves different steps from transcription to translation and decay of messenger RNAs (mRNAs). Most mRNAs have a poly(A) tail attached to their 3’-end, which protects them from degradation and stimulates translation. Removal of the poly(A) tail is the rate-limiting step in RNA decay controlling stability and translation. It is yet unclear if and to what extent RNA deadenylation occurs in the mammalian nucleus. A novel method for genome-wide determination of poly(A) tail length, termed FLAM-Seq, was developed to overcome current challenges in sequencing mRNAs, enabling genome-wide analysis of complete RNAs, including their poly(A) tail sequence. FLAM-Seq analysis of different model systems uncovered a strong correlation between poly(A) tail and 3’-UTR length or alternative polyadenylation. Cytosine nucleotides were further significantly enriched in poly(A) tails. Analyzing poly(A) tails of unspliced RNAs from FLAM-Seq data revealed the genome-wide synthesis of poly(A) tails with a length of more than 200 nt. This could be validated by splicing inhibition experiments which uncovered potential links between the completion of splicing and poly(A) tail shortening. Measuring RNA deadenylation kinetics using metabolic labeling experiments hinted at a rapid shortening of tails within minutes. The analysis of subcellular fractions obtained from HeLa cells and a mouse brain showed that initial deadenylation is a nuclear process. Nuclear deadenylation is gene specific and poly(A) tails of lncRNAs retained in the nucleus were not shortened. To identify enzymes responsible for nuclear deadenylation, RNA targeting Cas-systems, siRNAs and shRNA cell lines were used to different deadenylase complexes. Despite efficient mRNA knockdown, subcellular analysis of poly(A) tail length by did not yield molecular phenotypes of changing nuclear poly(A) tail length.

Vorhersagen von miRNA-Bindestellen enthalten oft einen hohen Prozentsatz an falsch positiven Ergebnissen (24-70%). Gleichzeitig ist es schwierig die biologischen Interaktionen von miRNAs und ihren Zieltranskripten auf experimentellem Wege und Genom weit zu messen. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Frage beantwortet, ob ChIP-Sequenzierungsdaten, von denen es immer mehr gibt, verwendet werden können, um Vorhersagen von miRNA-Bindestellen zu filtern. Dabei wurde von einem Netzwerk aus miRNAs und Transkriptionsfaktoren gebraucht gemacht, die Zieltranskripte gemeinsam regulieren. Zunächst wurden verschiedene Methoden getestet, mit denen „Peaks“ aus der ChIP-Sequenzierung Zielgenen zugeordnet werden können. Zielgenlisten des transkriptionalen Repressors RE1-silencing transcription factor (REST/NRSF) wurden mithilfe von ChIP-Sequenzierungsdaten erzeugt. Ein Algorithmus zur Suche nach überrepräsentierten miRNA-Zielgenen in REST-Genlisten basierend auf Vorhersagen von TargetScanHuman wurde entwickelt und angewandt. Die detektierten „enrichment“-miRNAs waren Teil eines vielfältig regulierten REST-miRNA-Netzwerks. Mögliche Funktionen von miRNAs wurden vorgeschlagen und ihre Rolle im gemeinsamen Netzwerk mit REST und im damit gebildeten Netzwerkmotiv (Inkoherente Schleife zur Vorwärtskopplung Typ 2) wurde analysiert. Es stellte sich heraus, dass ein Filtern der Vorhersagen tatsächlich möglich ist, da Gene, die sowohl von REST als auch von einer oder mehreren „enrichment“-miRNAs reguliert werden, einen höheren Anteil an wahren miRNA-Transkript-Interaktionen haben. / Predictions of miRNA binding sites suffer from high false positive rates (24-70%) and measuring biological interactions of miRNAs and target transcripts on a genome wide scale remains challenging. In the thesis at hand the question was answered if the ever growing body of ChIP-sequencing data can be applied to filter miRNA target predictions by making use of the underlying regulatory network of miRNAs and transcription factors. First different methods for association of ChIP-sequencing peaks to target genes were tested. Target gene lists of the transcriptional repressor RE1-silencing transcription factor (REST/NRSF) were generated by means of ChIP-sequencing data. An enrichment analysis tool based on predictions from TargetScanHuman was developed and applied to find ‘enrichment’-miRNAs with over-represented targets in the REST gene lists. The detected miRNAs were shown to be part of a highly regulated REST-miRNA network. Possible functions could be assigned to them and their role in the regulatory network and special network motifs (incoherent feedforward loop of type 2) was analyzed. It turned out that miRNA target predictions of genes shared by enrichment-miRNAs and REST had a higher proportion of true positive associations than the TargetScanHuman background, thus the procedure made a filtering possible.

Evolutionär konservierte, kleine offene Leserahmen (upstream open reading frames, uORFs) sind translational aktive Kontrollelemente, die bevorzugt in Boten-Ribonukleinsäuren von Schlüsselgenen zur Regulation von Zellwachstum, Proliferation und Differenzierung vorkommen. In dieser Arbeit wurden Mäuse analysiert, die defizient für das uORF Initiationscodon des Transkriptionsfaktors CCAAT/enhancer binding protein beta (C/EBPbeta-Delta-uORF) sind. Proteinanalysen verschiedener Gewebe zeigten, dass C/EBPbeta-Delta-uORF Mäuse im Gegensatz zu Wildtyptieren nicht in der Lage sind, die kurze, auto-antagonistische C/EBPbeta LIP Isoform zu induzieren. Die verminderte LIP Expression verursachte eine gestörte Differenzierung knochenabbauender Osteoklasten und ging mit einer Zunahme von mineralisiertem Knochengewebe in C/EBPbeta-Delta-uORF Mäusen einher. Nach partieller Hepatektomie führte der Verlust der uORF-vermittelten Induktion von LIP in regenerierenden C/EBPbeta-Delta-uORF Lebern zu einer Überaktivierung C/EBPbeta-regulierter Akute Phase Gene. Im Vergleich zum Wildtyp wiesen Hepatozyten von C/EBPbeta-Delta-uORF Tieren einen verzögerten und abgeschwächten Wiedereintritt in die S-Phase des Zellzyklus auf. Genomweite Genexpressionsanalysen zeigten, dass die verminderte S-Phase Aktivität in regenerierenden C/EBPbeta-Delta-uORF Lebern mit einer persistierenden Repression von Zellzyklusgenen korrelierte, wobei insbesondere die verminderte Expression zahlreicher E2F-regulierter Gene auffällig wurde. Chromatinimmunpräzipitations- und Reportergenexperimente führten zur Entwicklung eines mechanistischen Modells, das eine isoformspezifische C/EBPbeta-Koregulation E2F-kontrollierter Zellzyklusgene vorschlägt. Die Analyse der C/EBPbeta-Delta-uORF Mäuse belegt erstmals die Funktionalität der uORF-gesteuerten translationalen Kontrolle im Säugetier und weist auf eine entscheidende Bedeutung dieses Kontrollmechanismus bei zahlreichen physiologischen und pathopysiologischen Prozessen hin. / Evolutionary conserved small upstream open reading frames (uORFs) are translational control elements predominantly prevalent in the 5'' mRNA regions of key regulatory genes of growth, proliferation, and differentiation. This thesis comprises the evaluation of mice deficient for the uORF initiation codon of the transcription factor CCAAT/enhancer binding protein beta (C/EBPbeta-Delta-uORF). Protein analysis of various tissues demonstrated that C/EBPbeta-Delta-uORF mice, in contrast to wildtype control animals (C/EBPbeta-WT), fail to induce translation of the truncated, auto-antagonistic C/EBPbeta LIP isoform. The reduced expression of LIP was associated with impaired differentiation of bone resorbing osteclasts and resulted in an increased bone volume of C/EBPbeta-Delta-uORF mice. After partial hepatectomy the loss of uORF-mediated LIP induction resulted in super activation of acute phase response genes in regenerating livers. Furthermore, C/EBPbeta-Delta-uORF hepatocytes showed a delayed and blunted re-entry into the cell cycle after partial hepatectomy as compared to C/EBPbeta-WT animals. Genome-wide transcript expression analyses revealed that the reduced S-phase activity in regenerating C/EBPbeta-Delta-uORF livers correlated with a persistent repression of cell cycle regulatory genes and showed a remarkable underrepresentation of genes regulated by the E2F family of transcription factors. Chromatinimmunoprecipitations and luciferase reporter gene assays allowed the development of a mechanistic model that suggests C/EBPbeta isoform-specific co-regulation of E2F-controled cell cycle genes. The analysis of C/EBPbeta-Delta-uORF mice validates the functionality of uORF-mediated translational control in vertebrates and suggests a comprehensive role of uORF regulation in physiology and the etiology of disease.

Genomweite Bemühungen haben eine große Anzahl langer nichtkodierender RNAs (lncRNAs) identifiziert, obwohl ihre möglichen Funktionen weitgehend rätselhaft bleiben. Hier verwendeten wir ein System zur synchronisierten Blüteninduktion in Arabidopsis, um 4106 blütenbezogene lange intergene RNAs (lincRNAs) zu identifizieren. Blütenbezogene lincRNAs sind typischerweise mit funktionellen Enhancern assoziiert, die bidirektional transkribiert werden und mit verschiedenen funktionellen Genmodulen assoziiert sind, die mit der Entwicklung von Blütenorganen zusammenhängen, die durch Koexpressionsnetzwerkanalyse aufgedeckt wurden. Die Master-regulatorischen Transkriptionsfaktoren (TFs) APETALA1 (AP1) und SEPALLATA3 (SEP3) binden an lincRNA-assoziierte Enhancer. Die Bindung dieser TFs korreliert mit der Zunahme der lincRNA-Transkription und fördert möglicherweise die Zugänglichkeit von Chromatin an Enhancern, gefolgt von der Aktivierung einer Untergruppe von Zielgenen. Darüber hinaus ist die Evolutionsdynamik von lincRNAs in Pflanzen, einschließlich nicht blühender Pflanzen, noch nicht bekannt, und das Expressionsmuster in verschiedenen Pflanzenarten war ziemlich unbekannt. Hier identifizierten wir Tausende von lincRNAs in 26 Pflanzenarten, einschließlich nicht blühender Pflanzen. Ein direkter Vergleich von lincRNAs zeigt, dass die meisten lincRNAs speziesspezifisch sind und das Expressionsmuster von lincRNAs einen hohen Transkriptionsumsatz nahe legt. Darüber hinaus zeigen konservierte lincRNAs eine aktive Regulation durch Transkriptionsfaktoren wie AP1 und SEP3. Konservierte lincRNAs zeigen eine konservierte blütenbezogene Funktionalität sowohl in der Brassicaceae- als auch in der Grasfamilie. Die Evolutionslandschaft von lincRNAs in Pflanzen liefert wichtige Einblicke in die Erhaltung und Funktionalität von lincRNAs. / Genome-wide efforts have identified a large number of long non-coding RNAs (lncRNAs), although their potential functions remain largely enigmatic. Here, we used a system for synchronized floral induction in Arabidopsis to identify 4106 flower-related long intergenic RNAs (lincRNAs). Flower-related lincRNAs are typically associated with functional enhancers which are bi-directionally transcribed and are associated with diverse functional gene modules related to floral organ development revealed by co-expression network analysis. The master regulatory transcription factors (TFs) APETALA1 (AP1) and SEPALLATA3 (SEP3) bind to lincRNA-associated enhancers. The binding of these TFs is correlated with the increase in lincRNA transcription and potentially promotes chromatin accessibility at enhancers, followed by activation of a subset of target genes. Furthermore, the evolutionary dynamics of lincRNAs in plants including non-flowering plants still remain to be elusive and the expression pattern in different plant species was quite unknown. Here, we identified thousands of lincRNAs in 26 plant species including non-flowering plants, and allow us to infer sequence conserved and synteny based homolog lincRNAs, and explore conserved characteristics of lincRNAs during plants evolution. Direct comparison of lincRNAs reveals most lincRNAs are species-specific and the expression pattern of lincRNAs suggests their high evolutionary gain and loss. Moreover, conserved lincRNAs show active regulation by transcriptional factors such as AP1 and SEP3. Conserved lincRNAs demonstrate conserved flower related functionality in both the Brassicaceae and grass family. The evolutionary landscape of lincRNAs in plants provide important insights into the conservation and functionality of lincRNAs.

Der Gen-Knockdown mittels RNAi hat sich als essentiell erwiesen, um Inhibitoren der induzierten Transdifferenzierung in C. elegans zu identifizieren (Tursun et al., 2011). Bakterienstämme, die dsRNA exprimieren, das die Expression spezifischer Gene mindert, können dem Wurm direkt zugefüttert werden, um einen genomweiten RNAi-screen der insgesamt 20.000 Gene in C. elegans durchzuführen. Allerdings werden die meisten biologischen Prozese durch mehr als ein Gen reguliert, was den Bedarf nach einer Methode generiert, die es erlaubt, zwei oder mehr Gene gleichzeitig herunter zu regulieren, um die Steuerung biologischer Prozesse studieren zu können. Die derzeitig vorhandenen Methoden liefern entweder nicht reproduzierbare Ergebnisse oder sind nicht skalierbar. Wir nutzen baktierelle Konjugation, die es durch ein konjugatives Plasmid ermöglicht Bakterienzellen zu generieren, die zwei verschiedene RNAi-Plasmide enthalten. Das Ziel war es, modifizierte RNAi-Donor-Plasmide mittels bakterieller Konjugation an eine Vielzahl anderer Bakterienzellen zu übertragen, die bereits ein anderes RNAi-Plasmid enthalten und dies dann im Hochdurchsatzverfahren durchführen zu können. Um Enhancer induzierter Expression von unc-25::gfp in der Keimbahn, ermöglicht durch den Knockdown des Histonchaperons LIN-53 (RbAp46/48 in Menschen), zu finden, wurden RNAi-Klone generiert, die gleichzeitig lin-53 als auch eines von insgesamt 800 verschiedenen Chromatin-bezogenen Gene herunter regulieren. Dabei identifizierten wir RBBP-5, Mitglied des Set1/ MLL-Methyltransferase-Komplexes, als neuen Barrierefaktor der induzierten Transdifferenzierung. RBBP-5 agiert dabei mutmaßlich parallel zu LIN-53. Doppelte RNAi, ermöglicht durch bakterielle Konjugation, erlaubt den simultanen Knockdown zweier oder mehr Gene, um genetische Interaktionen studieren zu können und erweitert damit die Einsatzmöglichkeiten von RNAi-Screens, um untereinander verbundene biologische Prozesse zu studieren. / The knock down of genes by RNAi has been fundamental to identify inhibitors of induced cell transdifferentiation in C. elegans (Tursun et al., 2011). Bacteria strains expressing dsRNA that target specific genes can be fed to the worm allowing straightforward whole-genome RNAi screens of the 20,000 genes in theC. elegans genome. However, many biological processes are regulated by more than one gene raising the need for simultaneous knock down of two or more genes to more fully interrogate the regulation of complex biological processes. Two approaches are currently available for double RNAi knockdown, − two bacteria strains expressing specific dsRNA can be mixed and grown together and fed simultaneously, which gives highly variable results. Alternatively, a new bacterial clone can be generated carrying a plasmid on which two RNAi targets of interest are 'stitched' together, which is not scalable. To address this challenge, we have developed a protocol using bacterial conjugation mediated by the 'Fertility Factor' (F) Episome in order to combine two different RNAi plasmids in a single bacterium. The objective was to be able to transfer a single RNAi plasmid to a large number of bacterial cells carrying different RNAi clones in one step in a high-throughput manner for large scale 'double' or even 'triple' RNAi screens. To find enhancers of induced unc-25::gfp expression in the germ line enabled by the depletion of histone chaperone LIN-53 (RbAp46/48 in humans), double RNAi clones targeting lin-53 and a total of 800 chromatin-related genes were generated and screened. We identified the Set1/MLL methyltransferase complex member RBBP-5 as a novel reprogramming barrier that putatively acts in a parallel pathway to LIN-53. Double RNAi by conjugation permits to reliably knock down two genes simultaneously in order to study genetic interactions at a genome-wide level, thus further increasing the versatility of RNAi screens to investigate interconnected biological processes.

Der eukaryotische Zellzyklus ist auf allen Ebenen der Genexpres- sion reguliert. Sowohl breit angelegte genetische Screens als auch funktionale Studien zu den beteiligten Proteinen haben unser Ver- ständnis dieses fundamentalen Prozesses geprägt. In dieser Arbeit behandle ich räumliche Aspekte der post-transkriptionalen Regulation des Zellzyklus, die mit lichtmikroskopischen Einzelzell- und Einzel- molekülmethoden experimentell zugänglich werden. Insbesondere untersuchte ich die subzelluläre Lokalisierung der messenger RNA von CLB2, einem zentralen Regulator der Mitose im eukaryotischen Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae (Bierhefe). Frühere Studien zeigten, dass diese RNA sich im Laufe des vegetativen Zellwachstums in der entstehenden Tochterzelle, der Knospe, anreichert. Mithilfe modernster Fluoreszenzmikroskopie charakterisierte ich die Bewe- gung und Verteilung einzelner CLB2 messenger RNA-Moleküle auf Zeitskalen von Millisekunden bis hin zur Generationszeit dieser He- fen. Ich zeigte, dass sich mit Hilfe von Multifokusmikroskopie unter Verwendung optimierter Fluoreszenzmarker und der Entwicklung objektiver Analysemethoden die Bewegung einzelner RNA-Moleküle zwischen Mutterzelle und Knospe nachvollziehen lässt. Dazu präsen- tiere ich eine Methode um die beobachteten Trajektorien der messenger RNA mathematischen Analysen der Systembiologie zugänglich zu machen. Weiterhin gab die Beobachtung der Verteilung einzelner CLB2 messenger RNA Moleküle über den Zellzyklus hinweg mittels einer neuartigen Lichtblattmikroskopie (Lattice Light Sheet Microscopy) Hinweise auf eine bisher unbekannte Dynamik in der Lokalisierung dieser messenger RNA. Die hier entwickelten Methoden ermöglichen eine quantitative Untersuchung räumlicher Aspekte der posttranskrip- tionalen Zellzyklusregulation. / The eukaryotic cell cycle is regulated on all levels of gene expression. Genetic screens and functional studies of the involved proteins have shaped our understanding of this fundamental process. In this thesis I use single cell and single molecule light microscopy methods to investigate spatial aspects of post-transcriptional cell cycle regulation. I investigated the subcellular localization of CLB2 mRNA, a central regulator of mitosis in the eukaryotic model organism Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast). Previous studies have shown that that this messenger RNA is enriched in the emerging daughter cell, the bud, during vegetative growth. Using pre-commercial fluorescence micro- scopes I characterized the dynamics and partitioning of single CLB2 mRNA on time scales from milliseconds to the generation time of this yeast. I demonstrate that using aberration corrected multifocus mi- croscopy, optimized fluorescent markers, and here developed objective analysis methods, the translocation of single mRNA molecules be- tween mother and bud can be observed. In addition, I report a method to make these trajectories available for the mathematical approaches of Systems Biology. Further, the observation of single CLB2 mRNA partitioning throughout the cell cycle with the use of lattice light sheet microscopy suggested a previously unknown localization behavior of the transcript. The methods developed here enable a quantitative analysis of spatial aspects of post-transcriptional cell cycle regulation.

Phosphorylierung modulieren. Obwohl heute bereits Tausende von Phosphorylierungsstellen annotiert sind, sind entsprechende funktionelle Informationen begrenzt. Dies ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass es keine Hochdurchsatzmethoden zur Erforschung der Funktion einer Phosphorylierungsstelle gibt. Um dieser Herausforderung zu begegnen, habe ich eine auf Shotgun-Proteomik basierende Strategie zur Messung der RNA-Bindungsaktivität von RBPs und ihren phosphorylierten Proteoformen entwickelt, die 'quantitative RNA-Interactome Capture (qRIC)' genannt wird. QRIC quantifiziert die Pull-Down-Effizienz von RBPs, die mit Oligo(dT)-Magnetbeads isoliert werden. Diese Effizienz korreliert mit der Anzahl der RNA-Bindungsstellen und der Spezifität der Motivbindung, und spiegelt so die RNA-Bindung in vivo wieder. In einer Gegenüberstellung der Pull-Down-Effizienz verschiedener Proteoformen in unbehandelten Zellen, habe ich qRIC als unvoreingenommenes Screening von regulatorischen Phosphorylierungsstellen in RBPs eingesetzt. Für jede einzelne Phosphorylierungsstelle wurde ein Delta-Effizienzwert berechnet, der den Einfluss auf die RNA-Bindung in vivo reflektiert. Die Effizienzunterschiede spiegelten das erwartete Verhalten von RBPs während der Phasentrennung von membranlosen Organellen und die Ladungsabstoßung zwischen Phosphorylierungsstellen und Nukleotiden bei physiologischem pH-Wert wider. Mithilfe des Delta-Effizienzwertes identifizierte ich mehrere bereits bekannte regulatorische Phosphorylierungsstellen in SF3B1, UPF1 und ELAVL1, sowie neue, bisher unbekannte und möglicherweise regulatorische Phosphorylierungsstellen in SERBP1, LARP1 und RBM20. Phosphomimetische Mutationsvarianten dieser Phosphorylierungsstellen wurden analysiert, um den molekularen Einfluss auf die Regulation der RBP-Funktion zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung bestimmter Stellen im Spleißregulator RBM20 dessen nukleo-zytoplasmatische Lokalisierung, die Assoziation mit zytosolischen RNA-Granula und die Spleißfunktion beeinflusst. Diese Erkenntnisse könnten sich beispielsweise auf die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden für Patienten mit dysfunktionalen RBM20-Mutationen auswirken, die zu dilatativer Kardiomyopathie führen. QRIC kann als Hochdurchsatzverfahren dazu beitragen, unser Wissen über die Regulierung von Protein-RNA-Interaktionen durch Phosphorylierung zu erweitern. / Post-transcriptional regulation of gene expression is fundamental in health and disease. RNA-binding proteins (RBPs) directly bind and govern the fate of RNAs in cells. At the same time, cell signaling cascades control RBP functions by modulating their physicochemical properties through post-translational modifications, like phosphorylation. Although thousands of phosphorylation sites have been annotated, functional information is limited. This, in part, is due to the lack of high-throughput methods that measure function. To tackle this challenge I developed a shotgun proteomics-based strategy for measuring the RNA-binding activity of RBPs and their phosphorylated proteoforms, named quantitative RNA-interactome capture (qRIC). In qRIC, pull-down efficiency of RBPs isolation with oligo(dT) magnetic beads is quantified in cells at steady state and correlates with the number of RNA-binding sites and motif binding specificity, reflecting a link to RNA-binding in vivo. By contrasting pull-down efficiency of different proteoforms in the cells, I applied qRIC as an unbiased screening of regulatory phosphorylation sites in RBPs affecting pull-down efficiency. A delta efficiency score was calculated for each individual phosphorylation site to denote its influence on RNA-binding in vivo. Efficiency differences globally reflected the expected behavior of RBPs during phase separation of membraneless organelles and charge repulsion between phosphorylation sites and nucleotides in physiological pH. Using the delta efficiency score, I identified several previously known regulatory phosphorylation sites in SF3B1, UPF1 and ELAVL1, plus novel candidate regulatory sites in SERBP1, LARP1 and RBM20. Phosphomimetic mutant variants of these sites were analysed to investigate the molecular mechanism of regulation. Importantly, I show that phosphorylation of candidate sites in the splicing regulator RBM20 affects its nucleo-cytoplasmic localization, association with cytosolic RNA granules, and splicing function. These findings could have implications for the development of novel treatments based on kinase activity for patients with dysfunctional RBM20 mutations leading to congenital dilated cardiomyopathy. I anticipate that qRIC, as a high throughput approach, will help to expand our knowledge about the regulation of protein-RNA interactions and their regulation by phosphorylation.