Die Genexpression wurde bisher hauptsächlich auf Transkriptions- und Proteinebene untersucht, wobei der Einfluss der Translation, die die Proteinhäufigkeit direkt beeinflusst, weitgehend außer Acht gelassen wurde. Um diese Rolle besser zu verstehen, habe ich Ribosomen-Profiling-Daten (Ribo-seq) verwendet, um die Translationsregulation zu untersuchen und neue Translationsvorgänge in 65 linksventrikulären Proben von DCM-Patienten im Endstadium und 15 Nicht-DCM-Kontrollen zu identifizieren. Dieser Datensatz half dabei, die Transkriptions- und Translationsregulation zwischen erkrankten und nicht betroffenen menschlichen Herzen zu sezieren und enthüllte Gene und Prozesse, die rein unter Translationskontrolle stehen. Darüber hinaus habe ich neue kardiale Proteine vorhergesagt, die von langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) und zirkulären RNAs (circRNAs) translatiert werden. Computergestützte Analysen dieser evolutionär jungen Proteine legten eine Beteiligung an verschiedenen molekularen Prozessen nahe, mit einer besonderen Anreicherung für den mitochondrialen Energiestoffwechsel. Schließlich identifizierte ich RNA-bindende Proteine (RBPs), deren Expression die Menge der Ziel-mRNA oder die Frequenz der Translationseffizienz (TE) beeinflusst. Für eine Untergruppe von 21 RBPs habe ich die Regulation auf beiden quantitativen Merkmalen beobachtet, was zu einer unterschiedlichen mechanistischen Basis der Expressionskontrolle für unabhängige Gensätze führte. Obwohl die genaue Umschaltung der RBP-Funktion wahrscheinlich durch eine Kombination von mehreren Faktoren erreicht wird, haben wir für drei Kandidaten eine starke Abhängigkeit von der Zielgenlänge und der 5'-UTR-Struktur beobachtet. Diese Arbeit präsentiert einen Katalog von neu identifizierten Translationsereignissen und einen quantitativen Ansatz zur Untersuchung der Translationsregulation im gesunden und kranken menschlichen Herzen. / Gene expression has primarily been studied on transcriptional and protein levels, largely disregarding the extent of translational regulation that directly influences protein abundance. To elucidate its role, I used ribosome profiling (Ribo-seq) data, obtained through ribosome profiling, to study translational regulation and identify novel translation events in 65 left ventricular samples of end-stage DCM patients and 15 non-DCM controls. This dataset helped dissect transcriptional and translational regulation between diseased and unaffected human hearts, revealing genes and processes purely under translational control. These would have remained undetected by only looking at the transcriptional level. Furthermore, I predicted novel cardiac proteins translated from long non-coding RNAs (lncRNAs) and circRNAs. Computational analysis of these evolutionary young proteins suggested involvement in diverse molecular processes with a particular enrichment for mitochondrial processes. Finally, I identified RNA-binding proteins (RBPs) whose expression influences target mRNA abundance or translational efficiency (TE) rates. For a subset of 21 RBPs, I have observed regulation on both quantitative traits, which resulted in different mechanistic basis expression control for independent sets of genes. Though the precise switch in RBP function is likely achieved by a combination of multiple factors, for three candidates we have observed a strong dependency on target length and 5’ UTR structure. This work presents a catalogue of newly identified translation events and a quantitative approach to study translational regulation in the healthy and failing human heart.

Nukleinsäuretemplatkontrollierte Reaktionen, die häufig auf Ligations- oder Transferreaktionen basieren, unterliegen dem Effekt der Produktinhibierung. Dadurch können besonders niedrige Templatmengen nur schwer detektiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmalig eine grundlegend neue Kategorie templatkontrollierter Reaktionen etabliert werden: templatkontrollierte Spaltungsreaktionen. Dazu wurde ein spaltbarer Linker auf N-Alkylpicoliniumbasis (NAP) entwickelt, der mit einfachen, orthogonalen Konjugationsmethoden (SPAAC, Maleimid-Thiol-Konjugation oder via Amidbinungsknüpfung) sowohl in PNA- als auch in DNA-Strukturen inkludiert werden kann. Die Templat-vermittelte Photoreduktion induziert eine C-O-Bindungsspaltung des Linkers. Daraus resultieren Produkte, die eine geringere Templataffinität besitzen als das Edukt, sodass die Reaktion keiner Produktinhibierung unterliegt. Dies konnte zum Beispiel mittels Triplex-bildender, spaltbarer PNA-Sonden realisiert werden, die eine rasche Spaltungsgeschwindigkeit aufweisen. Hierzu bindet die spaltbare PNA-Sonde auf dem Templat benachbart zu einer mit einem Ruthenium(II)-Komplex modifizierten Assistenzsonde, die die Photoreduktion lichtkontrolliert induzieren kann. In einem alternativen Ansatz wurde die Fluorophor-induzierte Photolyse von NAP-Derivaten näher untersucht und führte letztlich zur Entwicklung eines selbst-spaltenden Molecular Beacons (iMB). Dieser verhält sich wie ein konventioneller iMB, wodurch eine neue Klasse an Molecular Beacons vorgestellt werden konnte. Die templatkontrollierte Photolyse konnte nicht nur in wässrigem Milieu, sondern auch in komplexen Umgebungen wie Zellkulturmedium, Zelllysat und RNA-Extrakt durchgeführt werden. / Nucleic acid templated reactions, which are often based on ligation or transfer reactions, are limited by the phenomenon of product inhibition. As a result, the usage of catalytical amounts of target are up to date only applicable to a limited extend. In this work, a fundamentally new category of nucleic acid templated reactions could be established: nucleic acid templated cleavage reactions. For this purpose, a cleavable linker based on N-alkylpicolinium (NAP) was developed, which can be included in both PNA and DNA structures using simple, orthogonal conjugation methods (SPAAC, maleimide-thiol conjugation or via amide bond formation). A template-mediated photoreduction induces the C-O bond cleavage of the linker. The target affinity of the cleavage products is lower than the parental oligonucleotide prior to cleavage, hence providing a thermodynamical driving force for amplified nucleic acid detection. This could be realized, for example, using triplex-forming, cleavable PNA probes which have a fast cleavage rate. In a first approach various triplex-forming PNA probes were developed that would undergo a photo-reductive C-O-bond cleavage upon irradiation when placed on a template adjacent to an assistant probe equipped with a sensitizer (Ruthenium(II)-complex). In an alternative approach, the fluorophore-induced photolysis of NAP derivatives was investigated and ultimately led to the development of a self-immolative Molecular Beacon (iMB). The iMB behaves like a conventional MB, therefore a new class of Molecular Beacons was introduced. The template-controlled photolysis can be performed not only in aqueous environments, but also in various complex environments such as cell culture medium, cell lysate or RNA extract.

MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse von ca. 22 nt langen, nicht-kodierenden RNAs, welche mittels Basenpaarung die Translationsrate und Stabilität von mRNAs herabsetzen. Die vorliegende Studie untersucht mittels Hochdurchsatz-Sequenzierung Expressionsveränderungen von miRNAs nach Infektion von kultivierten Wirtszellen mit dem mikrobiellen Modellpathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium. In Makrophagen, welche eine Schlüsselfunktion in der Orchestrierung der angeborenen Immunität spielen, wurde im Zuge der Infektion eine Induktion der miRNAs miR-21, miR-146 und miR-155 beobachtet. Darüberhinaus stellten sich alle Mitglieder der evolutionär konservierten let-7 miRNA Familie in infizierten Makrophagen als herab reguliert heraus. Es konnte gezeigt werden, dass let-7 miRNAs die zentralen Makrophagen-Zytokine IL6 und IL10 post-transkriptional reprimieren. Konsequenterweise bewirkt eine Reduktion der let-7 Expression in mikrobiell aktivierten Makrophagen eine Erhöhung der IL6 und IL10 Produktion. Weiterhin konnten den miRNAs miR-146 und miR-155 wichtige Funktionen in der Steuerung der Sensitivität und Aktivität von Makrophagen gegenüber mikrobiellen Stimuli nachgewiesen werden: während miR-146 primär die Aktivität des plasmamembranständigen Lipopolysaccharid-Rezeptors TLR4 herabsetzte und damit einer vorzeitigen inflammatorischen Makrophagenantwort vorbeugte, blieb miR-155 strikt an letztere gekoppelt, um die Aktivität diverser pro-inflammatorischer Signalwege zu begrenzen. Es konnte gezeigt werden, dass eine Stimulation des cytosolischen Immunrezeptors NOD2 eine inflammatorische Makrophagenantwort und die resultierende miR-155 Induktion begünstigt und der negativen Kontrolle durch miR-146 entzieht. Dies verhindert möglicherweise eine Hyposensitivität gegenüber zellinvasiven Pathogenen. Zusammenfassend legen diese Beobachtungen nahe, dass miRNAs zentrale Funktionen in der post-transkriptionalen Steuerung der Wirtszellantwort auf mikrobielle Pathogene ausüben. / MicroRNAs (miRNAs) are a class of approx. 22 nt long non-coding RNAs that interfere with mRNA translation and stability. Using high-throughput sequencing the present study investigated miRNA expression changes after infection of cultured host cells with the microbial model pathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium. In macrophages, which play a key role in the orchestration of innate immunity, infection caused the induction of miRNAs miR-21, miR-146 and miR-155. Moreover, all members of the evolutionarily conserved let-7 miRNA family were down-regulated in infected macrophages. This work reports let-7 miRNAs to function in the macrophage inflammatory response by repressing the major cytokines IL6 and IL10 post-transcriptionally. Consequently a reduction of let-7 expression in microbially activated macrophages results in a specific increase in IL6 and IL10 production. Furthermore, miR-146 and miR-155 could be assigned important functions in the control of the sensitivity and activity of macrophages to microbial stimuli: while miR-146 primarily reduced the activity of the plasma membrane associated lipopolysaccharide receptor TLR4, thereby preventing a premature macrophage inflammatory response, miR-155 stayed strictly coupled to inflammation in order to limit the activity of various pro-inflammatory signaling pathways. Interestingly, it could be shown that stimulation of the cytosolic immune receptor NOD2 favors the macrophage inflammatory response and the concomitant induction of miR-155, while bypassing the negative control by miR-146. This may prevent hyposensitivity to cell-invasive pathogens. In summary, these observations suggest that miRNAs exert key functions in the post-transcriptional control of the host cell response to microbial pathogens.

Die Genexpressionsmaschinerie in Chloroplasten und Mitochondrien und die ihrer prokaryotischen Vorläufer sind konserviert. Innerhalb eines bakteriellen Grundgerüsts entwickelte sich darüber hinaus ein komplexer RNA-Metabolismus. In der vorliegenden Arbeit wird eine neue Klasse kleiner RNAs (15-50nt) mit plastidärem und mitochondrialen Ursprung beschrieben. Diese kurzen RNAs überlappen mit Bindestellen von RNA-bindenden Proteinen, die mRNAs gegen exonukleolytischen Verdau beschützen. Diese stabilisierende Funktion wird vermutlich hauptsächlich von PPR (Pentatricopeptid repeat) Proteinen und verwandten Proteine bewerkstelligt. Die kleinen RNAs repräsentieren dabei minimale nuklease-resistente Bereiche, sogenannte RNA-Bindeprotein footprints. Solche footprints finden sich in fast jedem intergenischen Bereich, der Prozessierung aufweist. Durch transkriptomweite Untersuchungen von kleinen RNAs in Mutanten von RNA-Bindeproteinen konnte für diese eine Reihe von Bindestellen identifiziert werden. Nuklease-resistente kleine RNAs fehlen in entsprechenden Mutanten. Der Vergleich neu identifizierter Ziele einzelner RNA-Bindeproteine führte dabei zu neuen Erkenntnissen über den Mechanismus der RNA-Erkennung durch PPR Proteine. Im Gegensatz zu Plastiden befinden sich kleine RNAs in Mitochondrien überwiegend an den 3‘ Enden von Transkripten, deren Stabilität vermutlich maßgeblich von diesen RNA-Bindeproteinen beeinflusst wird. Für das chloroplastidäre Ribonukleoprotein CP31A konnte gezeigt werden, dass es an der Stabilisierung der ndhF mRNA beteiligt ist. Die Interaktion mit der ndhF mRNA, die eine zentrale Komponente des NDH-Komplexes kodiert, wird dabei über die 3‘ untranslatierte Region vermittelt. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass CP31A die Stabilität einiger antisense Transkripte beeinflusst. Weiterhin wurden zehn neue Cytidin Desaminierungungen durch die Analyse von RNA-Seq Datensätzen in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana identifiziert. / Chloroplasts and mitochondria are of endosymbiotic origin. Their basic gene expression machineries are retained from their free-living prokaryotic progenitors. On top of this bacterial scaffold, a number of organelle-specific RNA processing steps evolved. In this thesis, a novel class of organelle-specific short (15-50nt) RNAs is described on a transcriptome-wide scale. The small RNAs are found at binding sites of PPR (Pentatricopeptide repeat) and PPR-like proteins, which protect mRNAs against exonucleolytic decay. The small RNAs represent minimal nuclease resistant RNAs, so called PPR footprints. Small RNAs were identified in almost every intergenic region subjected to intergenic processing. This finding suggests that accumulation of processed transcripts in plastids is mostly due to protection by highly specific RNA-binding proteins. Small RNA sequencing identified a number of nuclease insensitive sites missing in mutants of RNA-binding proteins. Analysis of multiple small RNAs representing target sites of single PPR proteins expands the knowledge of target specificity. In mitochondria, accumulations of small RNAs predicts that at least two thirds of mitochondrial mRNAs are stabilized by RNA-binding proteins binding in their 3’UTR. In sum, small organellar RNAs turned out to be instrumental in elucidating the hitherto enigmatic intercistronic processing of organellar RNAs and allowed novel insights into the function of the dominant family of organellar RNA binding proteins, the PPR proteins. A chloroplast ribonucleoprotein CP31A is shown to be involved in stabilization of an mRNA for a central component of the NDH-complex by interaction with its 3’UTR. In addition, CP31A represents the first factor described that influences the accumulation of chloroplast antisense transcripts. Finally, ten novel plastid C to U RNA-editing sites were identified in the model plant Arabidopsis thaliana, using a novel RNA-Seq based approach.

Koordinierte Phosphorylierung der C-terminale Domäne von RNA Polymerase II (RNAPII) ist essentiell für eine effiziente Kupplung von naszierender RNA Synthese und co-transkriptionalem RNA Prozessierens. Zirkuläre RNAs (circRNAs) sind eine neue Klasse von RNA Molekülen mit hoher Prävalenz in neuronalen Zelltypen. Die Biogenese von circRNAs ist noch ungeklärt, insbesondere die Frage warum das Intron upstream der circRNA während der Transkription des circRNA Exons zurückbehalten wird um Rück-Spleißen zu ermöglichen. Verschiede Belege suggerieren, dass unzulängliche Rekrutierung des Spleiceosoms zur circRNA Formation führen kann. In dieser Arbeit untersuche ich die Mechanismen die zu Defekten in der Erkennung und des Spleißens des Introns upstream der circRNA führen. Mit diesem Ziel erfasste ich die genomweite Verteilung von chromatinassoziierter RNAPII mit verschiedenen Phosphorylierungen, sowie Spleißfaktoren und Transkriptionsreglern mittels ChIP-seq in neuronaler Differenzierung von murinen embryonalen Stammzellen zu dopaminergen und Motoneuronen. Während der gesamten Differenzierung, aber insbesondere in den differenzieren Neuronen, konnten circRNAs detektiert werden. In meiner Arbeit finde ich, dass circRNAs detektiert werden, wenn Gene hohe Levels an mRNA exprimieren und, dass die Produktion von circRNA mit einer Dysbalance zwischen dem Laden der RNA-Polymerase II auf die DNA und dem Rekruitieren der Splice-Maschinerie zusammen hängt. Um funktionell mit den Pausier-Mechanismen der RNA-Polymerase II zu interferieren, habe ich einen ''promotor-proximal-pausing'' Faktor depletiert. Dabei stellte ich fest, dass diese Depletion genügt, um die circRNA Levels in embryonalen Stamzellen zu erhöhen. Die Ergebnisse die in dieser Arbeit gezeigt werden, beschreiben die Beteiligung des Pausierens der RNA-Polymerase II and der Formierung von circRNAs. / Coordinated phosphorylation of RNA polymerase II (RNAPII) C-terminal domain is essential for efficient coupling of nascent RNA synthesis with co-transcriptional RNA processing events. Circular RNAs (circRNAs) are a novel class of RNAs whose biogenesis remains ill understood, namely why the upstream intron is not spliced before the circRNA-exon is fully transcribed. Indirect evidence suggests that altered spliceosome recruitment can lead to circRNA formation. To investigate the mechanisms that may be involved in deficient recognition and splicing of introns upstream of exons included in circRNAs, I mapped the chromatin occupancy of RNAPII phosphorylated forms, splicing factors, and transcription regulators by ChIP-seq during mouse ESC differentiation to dopaminergic and spinal motor neurons. CircRNAs are detected throughout differentiation, peaking in differentiated neurons, as expected. I found that circRNAs are detected when genes express high levels of mRNA, and that circRNA production is associated with an imbalance between RNAPII loading and recruitment of the splicing machinery. To mechanistically interfere with pausing mechanisms, I depleted an RNAPII promoter-proximal pausing factor, and found that it was sufficient to increase the formation of circRNAs in stem cells. Results shown in this work implicate RNAPII regulation mechanisms in the formation of circRNAs.

MicroRNAs (miRNAs) sind kurze nicht-kodierende RNAs, die auf posttranskriptionaler Ebene die Genexpression hemmen. Dafür bilden miRNAs Ribonukleoprotein-Komplexe, deren Kernbestandteile aller Bilateria Argonaute (AGO) und GW182 /TNRC6 Proteine sind. GW182 / TNRC6-Proteine rekrutieren CCR4-NOT-Deadenylasen über kurze Tryptophan-reiche Motive (W-Motive), welche additiv wirken und fördern so die translationale Repression und den Abbau von Ziel-mRNAs. Um mehr über die Mechanismen der miRNA-abhängigen Genrepression zu erfahren, habe ich W-Motiv-abhängige Interaktionspartner humaner TNRC6C Proteine bestimmt. Hierzu habe ich, mithilfe von quantitativer Massenspektrometrie, das Interaktom von wildtyp TNRC6C Proteinen mit dem von TNRC6C Proteinen, deren W-Motive mutiert wurden, verglichen. Neben bekannten Interaktionspartnern, wie Untereinheiten des CCR4-NOT Komplexes, habe ich Komponenten von Clathrin-Vesikeln (CCVs), Stoffwechsel assoziierte Enzyme, mitochondriale Proteine, RNA Helikasen, Kinasen und Phosphatasen mit potentiellen Funktionen in der miRNA-assoziierten Repression identifiziert. Die im ersten Teil dieser Studie vorgestellten Ergebnisse legen nahe, dass CCVs die Speicherung oder das Recycling von TNRC6 und AGO Proteinen vermitteln können und somit das miRNA-Silencing modulieren. Der zweite Teil dieser Studie befasst sich mit der Konservierung von miRNA vermitteltem Gen-Silencing in Cnidaria (Nematostella vectensis), welche sich vor 600 Millionen Jahren von der Ahnenreihe der Metazoa abspalteten. Hier zeige ich anhand humaner Zellen, dass Nematostella GW182, ähnlich wie in Bilateria, von AGO rekrutiert wird und nachfolgend in der Repression der mRNA fungiert, was darauf hinweist, dass dieser Mechanismus der miRNA-vermittelten Geninhibition bereits in den letzten gemeinsamen Vorfahren von Cnidaria und Bilateria aktiv war. / MicroRNAs (miRNAs) are short non-coding RNAs that act as post-transcriptional repressors of gene expression. To function miRNAs are assembled in ribonucleoprotein complexes, whose core components in bilaterian animals are Argonaute (AGO) and GW182/TNRC6 proteins. GW182/TNRC6 proteins additively recruit CCR4-NOT deadenylases via short tryptophan-containing motifs (W-motifs), thereby promoting translational repression and the decay of target mRNAs. To gain deeper insights into the mechanisms of miRNA silencing I determined the W-motif-specific interactome of human TNRC6C proteins. Using Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell Culture (SILAC) coupled to affinity purification and Mass Spectrometry (MS) I identified proteins enriched with wild type TNRC6C as compared to two mutants with disrupted W-motifs. Besides known functional interactors, such as subunits of the CCR4-NOT complex, I identified several components of clathrin-coated vesicles (CCVs), metabolic enzymes, mitochondrial proteins, RNA helicases, kinases, and phosphatases with potential functional roles in miRNA-mediated repression. The results presented in the first part of this thesis indicate that CCVs may mediate the storage or recycling of TNRC6 and AGO proteins, thus modulating miRNA silencing. The second part of the thesis addressed the conservation of the mechanisms of miRNA silencing via W-motifs in the cnidarian Nematostella vectensis, separated by 600 million years from other Metazoa. Using cultured human cells, I showed that similarly to bilaterians, GW182 in Nematostella is recruited to the miRNA repression complex via interaction with AGO proteins, and functions downstream to repress mRNA, indicating that this mechanism of miRNA-mediated silencing was already active in the last common ancestor of Cnidaria and Bilateria.

Initiation der Translation ist ein komplexer und stark regulierter Prozess, bei dem Ribosomen die mRNA binden. Die überwiegende Mehrheit eukaryotischer mRNAs wird durch einen 5‘-Cap-abhängigen Mechanismus translatiert. Dazu bindet der eIF4F-Proteinkomplex die mRNA an der 5'-Cap-Struktur, um weitere eIFs und die kleine ribosomale Untereinheit zu rekrutieren, welche dann die 5'UTR von 5'- in 3'-Richtung bis zu einem Startcodon scannt. Anschließend trifft die große ribosomale Untereinheit dazu und die Proteinsynthese beginnt. Darüber hinaus kann die Translation durch IRES, interne ribosomale Eintrittsstellen, vermittelt werden, welche das Ribosom unabhängig von Cap und 5‘-Ende zum Startcodon rekrutieren. Die zelluläre IRES-vermittelte Translation gilt als ineffizient unter physiologischen Bedingungen, wird aber durch Stress aktiviert. Da die Regulation dieses Mechanismus weitaus unbekannt ist, haben wir die zelluläre, Cap-unabhängige Translationsinitiation untersucht. Dafür haben wir eine embryonale Stammzelllinie generiert, welche eine dominant-negative Mutante von 4E-BP1 exprimiert. 4E-BP1 bindet das 5‘-Cap-bindende Protein, sodass eIF4F nicht am 5'-Cap andocken kann. Wir haben das Proteom während der Überexpression von 4E-BP1 und der neuronalen Differenzierung bestimmt, um Translationsdynamiken systemisch zu erfassen. Gene mit verminderter Sensitivität für die Cap-abhängige Translation wurden so identifiziert und in bicistronischen Reporter-Assays getestet. Nach strenger Validierung wurde eine Cap-unabhängig translatierte mRNA, Pqbp1, entdeckt. Der zweite Teil dieser Studie untersuchte die Cap-unabhängige Translation einer circRNA, welche keine freien Enden hat und daher per IRES translatiert werden muss. Wir konnten bestätigen, dass circMbl in vitro translatiert wird und konnten so innerhalb eines Kooperationsprojekts zu der Erkenntnis beitragen, dass circRNAs im Fliegengehirn translatiert werden. / Translation initiation is a complex and highly regulated process which involves the assembly of an elongation competent ribosome on the mRNA. The vast majority of eukaryotic mRNAs is translated by a canonical cap-dependent mechanism. This requires the eIF4F protein complex to bind the mRNA at the 5’-cap to recruit further eIFs and the small ribosomal subunit which then scans the 5’UTR in 5’ to 3’ direction until a start codon is encountered. Afterwards the large ribosomal subunit joins and protein synthesis begins. Besides that, translation of mRNAs can be mediated by IRESs, internal ribosome entry sites, which recruit the ribosome in a cap and 5’-end-independent manner to the start codon. Such cellular IRES-mediated translation is thought to be inefficient under physiological conditions but activated during stress. As the regulation of this mechanism is not well understood, we aimed to elucidate cellular cap-independent translation events. Therefore, we generated a mouse embryonic stem cell line with inducible overexpression of a dominant negative mutant of 4E-BP1. 4E-BP1 sequesters the cap-binding protein eIF4E so that the eIF4F protein complex fails to assemble at the 5’-cap. We performed shotgun proteomics during 4E‑BP1 overexpression and neuronal differentiation to globally monitor translation dynamics. Genes with reduced sensitivity for cap-dependent translation were identified and tested for internal translation initiation in bicistronic reporter assays. After stringent validation one cap-independently translated mRNA, Pqbp1, was discovered. The second part of this study investigated cap-independent translation initiation on a circRNA, which by nature lacks free ends and thus requires IRES-mediated translation. We could show that circMbl is translated in vitro and thus contributed to the scientific evidence for the translation of circRNAs in fly brain, which was studied in a collaboration project.

Die Lokalisierung von mRNA ist ein wichtiger regulativer Mechanismus in polarisierten Zellen und in frühen Embryonalstadien. Dort sind räumliche Muster maternaler mRNA für die korrekte Entwicklung der Körperachsen und die Spezifizierung der Keimzellen verantwortlich. Systematische Analysen dieser Prozesse wurden jedoch bisher limitiert durch einen Mangel an räumlicher und zeitlicher Auflösung von Einzelzell- Sequenzierungsdaten. Wir analysierten die Dynamik des räumlichen und zeitlichen Transkriptoms während frühen Embryonalstadien von Zebrafischen. Wir verbesserten Empfindlichkeit und Auflösung von tomo-seq und erfassten damit systematisch räumlich aufgelöste Transkriptome entlang der animal-vegetalen-Achse Embryonen im Einzell-Stadium und fanden 97 vegetal lokalisierte Gene. Außerdem etablierten wir eine Hochdurchsatz kompatible Variante der RNA-Markierungsmethode scSLAM-seq. Wir wendeten diese in Embryonen während der Gastrulation. Von den vegetal lokalisierten Genen waren 22 angereichert in Keimzellen, was eine funktionelle Rolle bei der Spezifizierung von Keimzellen nahelegt. Mit tomo-seq untersuchten wir die evolutionäre Konservierung der RNA-Lokalisierung zwischen Zebrafischen und gereiften Oozyten zweier Xenopus-Arten. Wir verglichen die lokalisierten Gene, suchten nach konservierten 3'UTR-Motiven, und fanden zum Teil überlappende Motive, was auf eine mögliche mechanistische Konservierung der Lokalisierungsmechanismen hinweist. Wir untersuchten auch RNA-Editierung von Adenin zu Inosin während der Embryonalentwicklung und in den Organen erwachsener Fische. In im Gehirn exprimierten Transkripten fanden wir 117 Editierstellen, die hauptsächlich für Ionentransporter kodieren und zum Teil zum Menschen konserviert sind. Die höchsten Editierraten konnten wir in Eierstöcken, Hoden und frühen Embryonen nachweisen, was auf eine mögliche Rolle bei der Regulierung der RNA-Stabilität hindeutet. / Subcellular localization of mRNA is an important regulatory mechanism in polarized cells. In early embryos of many species, spatial patterns of maternal mRNA are essential for the proper development of body axes and the specification of germ cells. These processes have been studied in zebrafish, but systematic analyses have been hindered by a lack of spatial and temporal information in single-cell RNA sequencing. We performed a spatial-temporal analysis of the zebrafish transcriptome during early embryonic development to systematically characterize localized mRNA and the fate of maternal transcripts until gastrulation stage. We enhanced sensitivity and resolution of the tomo-seq method and systematically acquired spatially-resolved transcriptomes along the animal-vegetal axis of one-cell stage zebrafish embryos, and found 97 genes to be localized vegetally. Furthermore, we established an in vivo and high-throughput compatible version of the single-cell RNA labeling method scSLAM-seq in gastrulation stage embryos. We followed localized transcripts until gastrulation and found transcripts of 22 of the vegetally localized genes enriched in primordial germ cells. We propose that these genes have a functional role in the early priming of the germ cell fate. To investigate the evolutionary conservation of vegetal RNA localization, we acquired tomo-seq datasets of mature oocytes of two xenopus species. We compared the pools of localized RNA and searched for conserved 3’UTR motifs. The resulting sets showed high similarity, possibly reflecting a mechanistic conservation of localization pathways. We also investigated RNA A-to-I editing during embryonic development and in organs of adult fish. Specifically, we identified 117 recoding editing sites in the brain that mainly encode for ion transporters and are partly conserved in humans. We detected the highest editing levels in ovary, testes and in early embryos, implicating a potential role in regulating RNA stability.

MicroRNAs (miRNAs) sind endogenene kurze RNA-Moleküle, die zentrale Aufgaben bei der Regulation der eukaryotischen Zellhomöostase erfüllen. MiRNAs wurden bereits als potente Immunregulatoren beschrieben. Trotz dieser Erkenntnisse blieb die Rolle dieser kurzen RNA Moleküle in Infektionen mit Mycobacterium tuberculosis weitgehend unerforscht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein miRNA-Expressionsprofil von Makrophagen generiert, die mit Mycobacterium tuberculosis infiziert waren. Dies ermöglichte die Identifizierung von miRNAs, welche bei der Infektion differenziell reguliert waren. Anhand eines ex-vivo-Modells von Todesrezeptor-induzierter Apoptose konnte gezeigt werden, dass miRNA-133b apoptoseresitente Zellen empfindlich gegen Tumornekrosefaktor-alpha (TNFalpha), TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) oder CD95 ligand (Fas/APO1 ligand) induzierte Zytotoxizität machte. Eine umfassende Studie führte zur Identifizierung der anti-apoptotischen Proteine Fas apoptosis inhibitory molecule (FAIM) und glutathione-S-transferase pi (GSTP1) als direkte Zielgene für miRNA-133b. Desweiteren zeigte sich die Expression von Osteoprotegerin (OPG) und Fettsäuresynthase (FASN), als miRNA-133b abhängig. Dies unterstrich die pleiotrope Art der pro-apoptotischen Aktivität dieser miRNA. Die Expression von miRNA-133b wurde durch Mitglieder der Toll-like Rezeptor (TLR)-Familie aktiviert. MiRNA-133b Transfektion führte zu einer verstärkten Aktivierung des Transkriptionsfaktors nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-kappaB). Diese resultierte in erhöhten Mengen an Interleukinen 6 und 8 (IL6/8). Diese Ergebnisse stellen die erste detaillierte Charakterisierung von miRNA-133b im Zusammenhang der Todesrezeptor-vermittelten Apoptose und der angeborenen Immunität dar. Die erforschten molekularen Wechselwirkungen ergänzen und bereichern das Verständnis über die regulatorischen molekularen Mechanismen, die mit der Tumorentstehung und Entzündung verbunden sind. / MicroRNAs (miRNAs) are endogenous short RNA molecules which perform essential tasks in the regulation of eukaryotic cell homeostasis. During the past few years miRNAs have emerged as very potent immune regulators. Despite the consequences of this discovery for our understanding of immune response regulation hitherto virtually nothing is known about miRNA function during innate immunity to Mycobacterium tuberculosis. Herein, a miRNA expression profile of human macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis was generated. This led to the identification of miRNAs being differentially regulated during infection. By using an experimental ex-vivo model of death receptor (DR)-induced apoptosis it could be demonstrated that miRNA-133b rendered apoptosis-resistant cells sensitive to tumor necrosis factor-alpha (TNFalpha)-, TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)- or CD95 ligand (Fas/APO1 ligand)-activated cytotoxicity. Comprehensive analysis led to the discovery of the anti-apoptotic proteins Fas apoptosis inhibitory molecule (FAIM) and glutathione-S-transferase pi (GSTP1) as direct miRNA-133b targets. Moreover, underlining the pleiotropic and synergistic nature of miRNA activity, the expression of osteoprotegerin (OPG) and fatty acid synthase (FASN) could be further proven as miRNA-133b dependent. Expression of miRNA-133b increased following innate immune activation by members of the Toll-like receptor (TLR) family. MiRNA-133b enhanced the activity of the transcription factor nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-kappaB). This translated into increased levels of the pro-inflammatory interleukins 6 and 8 (IL6/8). The results presented in this work represent the first detailed characterization of miRNA-133b in the context of DR-mediated apoptosis and innate immunity. The molecular interactions dissected herein improve the understanding of the regulatory processes associated with tumorigenesis and the immune response.