Das Jahr 2000 wird oft als Meilenstein der Entwicklung der Humangenetik bezeichnet. Eine Relevanz für die praktische Medizin erlangt das Humangenom-Projekt jedoch erst, wenn die Funktion der einzelnen Gene in komplexen physiologischen Systemen und die genetische Variabilität aufgeklärt sind. Die hier vorgelegten Studien beruhen auf der Annahme, dass der Einfluss genetischer Variabilität nicht nur im Vergleich kranker und gesunder Menschen sichtbar wird, sondern auch in der Variabilität physiologischer Parameter in der Allgemeinbevölkerung nachweisbar ist. Grundlage aller Studien war eine medizinische Untersuchung von gesunden eineiigen und zweieiigen Zwillingspaaren. Es wurde für Kennwerte des Herz-Kreislauf-Systems die Stärke genetischer Einflüsse (Heritabilität) bestimmt. Weiterhin erfolgten Kopplungs- und Assoziationsanalysen mit ausgewählten Kandidatengenen. Der Einfluss spezifischer Gene auf die Blutdruckregulation, die Herzgröße, EKG-Parameter sowie Blutfette konnte nachgewiesen werden. Weiterhin wurde der prinzipielle Nachweis erbracht, dass die funktionelle Untersuchung einzelner Gene in unausgelesenen Stichproben realisierbar ist. / The year 2000 is often called a milestone in the history of human genetics. The knowledge of the sequence of the human genome will only become relevant for clinical medicine when the function of genes within complex physiological systems as well as the genetic variability will be revealed. The studies reported here are based on the assumption that the influence of genetic variability does not only become obvious by comparison of affected and unaffected subjects but is as well detectable in the variability of physiological parameters in the general population. All studies are based on testing healthy mono- and dizygotic twins. We determined the heritability of various cardiovascular parameters. Furthermore selected candidate genes were tested by linkage and association analyses. We could demonstrate the influence of specific genes on blood pressure regulation, heart size, ECG and lipids. These studies are a proof of principle for the functional analysis of single genes in unselected random samples.

Transaldolase-Mangel (TALDO) ist ein extrem seltener, angeborener Stoffwechseldefekt, von dem weltweit nur 34 Fälle bekannt sind. Der Defekt geht auf den Verlust des Enzyms Transaldolase 1 aus dem nicht-oxidativen Pentosephosphat-Weg (nicht-oxPPW) zurück und äußert sich in einem weiten Spektrum klinischer Symptome. Die schwerwiegendsten Folgen sind Leber- und Nierenmangelfunktionen, die zum sehr frühen Tod führen können. Desweiteren leiden 15 % der Patienten an wiederkehrenden Infektionen. Neutrophile Granulozyten (Neutrophile) sind die häufigsten weißen Blutkörperchen im Menschen und essentiell für die angeborene Immunantwort gegen Infektionserreger. Ich habe hier funktionale Aspekte von TALDO-Neutrophilen untersucht. Der oxidative Pentosephosphat-Weg (oxPPW) stellt das Reduktionsäquivalent NADPH bereit, welches indirekt für die Entstehung von reactive oxygen species (ROS)-abhängigen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) verantwortlich ist. Der Beitrag des nicht-oxPPW zur ROS-abhängigen NET-Bildung ist bislang nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte ich für Neutrophile aus drei TALDO-Patienten eine jeweils komplett abwesende Entstehung ROS-abhängiger NETs und einen deutlich verringerten oxidativen Burst nach PMA-Stimulation zeigen. Um diese Beobachtungen in einem unabhängigen Modelsystem zu bestätigen, habe ich mit Hilfe des CRISPR-Cas9-Systems, ‚knock-out‘ Mutanten von Transaldolase 1 und dessen Partnerenzym Transketolase in der Neutrophil-ähnlichen Zelllinie PLB-985 hergestellt. Die dergestalt genetisch manipulierten Zellen waren nicht mehr zu PMA-induziertem Zelltod in der Lage. Dies ist somit der erste genetische Beweis für die Abhängigkeit des oxidativen Burst und der Bildung von NETs vom nicht-oxPPW. Diese Erkenntnis trägt zum einen zum mechanistischen Verständnis der NET-Entstehung bei und liefert zum anderen eine potentielle Erklärung für einige der bei TALDO beobachteten Symptome. Desweiteren wurden einige der metabolischen Erfordernisse für die Bildung von NETs mit Hilfe von Inhibitoren untersucht. Die erhaltenen Erkenntnisse zeigen, dass das initiale Maximum des oxidativen Bursts für NET-Bildung unerheblich ist und vielmehr die ROS-Generierung nach ca. 50 Minuten entscheidende Bedeutung für diese hat. / Transdaldolase 1-deficiency (TALDO) is a rare genetic disease with only 34 described cases globally. Transaldolase 1 is part of the non-oxidative pentose phosphate pathway (PPP) and its deficiency results in many clinical symptoms including kidney and liver failure, which can lead to early child-mortality. Some of these patients suffer from recurrent infections, for example in the respiratory tract. Neutrophils are the most abundant white blood cells and essential for the innate immune defence against bacterial and fungal pathogens. The PPP generates reduced NADPH that is crucial for the generation of superoxide by the NADPH oxidase NOX2. In turn, NOX2 is essential for neutrophil extracellular trap (NET) formation. NETs occur through the neutrophil-specific cell death netosis and consist of chromatin decorated with granular proteins. Here I report that neutrophils of three TALDO patients did not make NETs. Deletion of transaldolase 1, and its partner enzyme transketolase, in the neutrophil-like PLB-985 cell line reduced ROS generation and cell death. This confirms that transaldolase 1 is required for NET formation. We present, to the best of our knowledge, the first genetic evidence that the non-oxidative PPP is required for ROS generation and NET formation. Furthermore, some of the metabolic requirements for NET formation were assessed. The obtained data indicate that the initial peak of the oxidative burst is irrelevant for NET formation but the ROS generation after 50 minutes on the contrary has crucial significance.

Ljudski genom sadrži milijune regulatornih elemenata - enhancera - koji kvantitativno reguliraju ekspresiju gena. Unatoč ogromnom napretku u razumijevanju načina na koji enhanceri reguliraju ekspresiju gena, području još uvijek nedostaje pristup koji je sustavan, integrativan i dostupan za otkrivanje i dokumentiranje cis-regulatornih odnosa u cijelom genomu. Razvili smo novu računalnu metodu - reg2gene - koja modelira i integrira aktivnost enhancera~ekspresije gena. reg2gene sastoji se od tri glavna koraka: 1) kvantifikacija podataka, 2) modeliranje podataka i procjena značaja, i 3) integracija podataka prikupljenih u reg2gene R paketu. Kao rezultat toga, identificirali smo dva skupa enhancer-gen interakcija (EGA): fleksibilni skup od ~ 230K EGA (flexibleC) i strogi skup od ~ 60K EGA (stringentC). Utvrdili smo velike razlike u prethodno objavljenim računalnim modelima enhancer-gen interakcija; uglavnom u lokaciji, broju i svojstvima definiranih enhancera i EGA. Izveli smo detaljno mjerenje performansi sedam skupova računalno modeliranih EGA-a, ali smo pokazali da se niti jedan od trenutno dostupnih skupova referentnih podataka ne može koristiti kao referentni skup podataka "zlatnI standard". Definirali smo dodatni referentni skup pozitivnih i negativnih EGA -a pomoću kojih smo pokazali da stringentC ima najveću pozitivnu prediktivnu vrijednost (PPV). Pokazali smo potencijal EGA-a za identifikaciju genskih meta nekodirajucih SNP-ova. Proveli smo funkcionalnu analizu kako bismo otkrili nove genske mete, pleiotropiju enhancera i mehanizme aktivnosti enhancera. Ovaj rad poboljšava naše razumijevanje regulacije ekspresije gena posredovane enhancerima. / Das menschliche Genom enthält Millionen von regulatorischen Elementen - Enhancern -, die die Genexpression quantitativ regulieren. Trotz des enormen Fortschritts beim Verständnis, wie Enhancer die Genexpression steuern, fehlt es in diesem Bereich immer noch an einem systematischen, integrativen und zugänglichen Ansatz zur Entdeckung und Dokumentation von cis-regulatorischen Beziehungen im gesamten Genom. Wir haben eine neuartige Methode - reg2gene - entwickelt, die Genexpression~Enhancer-Aktivität modelliert und integriert. reg2gene besteht aus drei Hauptschritten: 1) Datenquantifizierung, 2) Datenmodellierung und Signifikanzbewertung und 3) Datenintegration, die in dem R-Paket reg2gene zusammengefasst sind. Als Ergebnis haben wir zwei Sätze von Enhancer-Gen-Assoziationen (EGAs) identifiziert: den flexiblen Satz von ~230K EGAs (flexibleC) und den stringenten Satz von ~60K EGAs (stringentC). Wir haben große Unterschiede zwischen den bisher veröffentlichten Berechnungsmodellen für Enhancer-Gene-Assoziationen festgestellt, vor allem in Bezug auf die Lage, die Anzahl und die Eigenschaften der definierten Enhancer-Regionen und EGAs. Wir führten ein detailliertes Benchmarking von sieben Sets von rechnerisch modellierten EGAs durch, zeigten jedoch, dass keiner der derzeit verfügbaren Benchmark-Datensätze als "goldener Standard" verwendet werden kann. Wir definierten einen zusätzlichen Benchmark-Datensatz mit positiven und negativen EGAs, mit dem wir zeigten, dass das stringentC-Modell den höchsten positiven Vorhersagewert (PPV) hatte. Wir haben das Potenzial von EGAs zur Identifizierung von Genzielen von nicht-kodierenden SNP-Gene-Assoziationen nachgewiesen. Schließlich führten wir eine funktionelle Analyse durch, um neue Genziele, Enhancer-Pleiotropie und Mechanismen der Enhancer-Aktivität zu ermitteln. Insgesamt bringt diese Arbeit unser Verständnis der durch Enhancer vermittelten Regulierung der Genexpression in Gesundheit und Krankheit voran. / Human genome contains millions of regulatory elements - enhancers - that quantitatively regulate gene expression. Multiple experimental and computational approaches were developed to associate enhancers with their gene targets. Despite the tremendous progress in understanding how enhancers tune gene expression, the field still lacks an approach that is systematic, integrative and accessible for discovering and documenting cis-regulatory relationships across the genome. We developed a novel computational approach - reg2gene- that models and integrates gene expression ~ enhancer activity. reg2gene consists of three main steps: 1) data quantification, 2) data modelling and significance assessment, and 3) data integration gathered in the reg2gene R package. As a result we identified two sets of enhancer-gene associations (EGAs): the flexible set of ~230K EGAs (flexibleC), and the stringent set of ~60K EGAs (stringentC). We identified major differences across previously published computational models of enhancer-gene associations; mostly in the location, number and properties of defined enhancer regions and EGAs. We performed detailed benchmarking of seven sets of computationally modelled EGAs, but showed that none of the currently available benchmark datasets could be used as a “golden-standard” benchmark dataset. To account for that observation, we defined an additional benchmark set of positive and negative EGAs with which we showed that the stringentC model had the highest positive predictive value (PPV) across all analyzed computational models. We reviewed the influence of EGA sets on the functional analysis of risk SNPs and demonstrated the potential of EGAs to identify gene targets of non-coding SNP-gene associations. Lastly, we performed a functional analysis to detect novel gene targets, enhancer pleiotropy, and mechanisms of enhancer activity. Altogether, this work advances our understanding of enhancer-mediated gene expression regulation in health and disease.