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Functional and molecular characteristics of a helminth immunomodulator-induced suppressive macrophage population

Ziegler, Thomas 03 April 2013 (has links)
Helminthen besitzen effektive Strategien um das Immunsytem ihrer Wirte zu modulieren. Sie sekretieren Moleküle mit deren Hilfe Immunzellen unterdrückt werden und verhindern dadurch Immunantworten, die ihnen schaden. AvCystatin ist ein Cystein-Protease-Inhibitor der Filarie Acanthocheilonema viteae. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass dieses Molekül in Makrophagen MAPK (p38, ERK) sowie Transkriptionsfaktoren (CREB, STAT3) anspricht und zur Expression von spezifischen Markergenen führt, die eine M2a/M2b Makrophagen-Aktivierung repräsentieren. Ein intravenöser Transfer solcher Zellen 18-20 Stunden nach Stimulation mit AvCystatin führte in Mäusen zu einer signifikanten Reduktion von wichtigen Merkmalen der Ovalbumin-induzierten Atemwegshyperreaktivität wie Schleimproduktion, Th2 Zytokinen, IgE und Eosinophilen. Die Linderung von Krankheitsparametern war mit einem lokalen und systemischen Anstieg von IL-10 assoziiert. Unter Verwendung eines in vitro Systems zeigte sich, dass AvCystatin induzierte Makrophagen einen löslichen Faktor sekretieren, der eine IL-10-Produktion durch CD4+ T-Zellen induziert und parallel die Produktion von IL-13, IL-2 und IFN-gamma unterdrückt. Um zu untersuchen, ob die suppressive Aktivität der AvCystatin-Makrophagen auf Entzündungsprozesse der Atemwege beschränkt ist, wurde ein Makrophagen-Transfer in Tiere durchgeführt, die unter DSS-induzierter Kolitis litten. Eine einmalige Gabe von Zellen verhinderte den Verlust von Körpergewicht, eine Verkürzung des Kolons und verminderte die Migration entzündungsvermittelnder Zellen in die Lamina Propria. Im Gegensatz zum Krankheitsmodell der Ovalbumin-induzierten Atemwegshyperaktivität korrelierten die Effekte nicht mit erhöhten Mengen an IL-10. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass AvCystatin Makrophagen adressiert und eine immunsuppressive Population generiert, welche Mäuse im Kontext von Atemwegsentzündung und Kolitis gegen überschießende Immunantworten schützen kann. / Helminth parasites possess effective strategies to modulate the immune system of their hosts. They release molecules which target immune cells and prevent reactions directed against them. AvCystatin is a cysteine protease inhibitor secreted by the nematode Acanthocheilonema viteae. The present thesis shows that this molecule modulates signaling pathways in murine macrophages through activation of MAPK (p38, ERK) and transcription factors (CREB, STAT3). Such macrophages express specific marker genes reflecting M2a/M2b activation. A single intravenious transfer of macrophages 18-20 hours after treatment with AvCystatin significantly reduced major parameters of ovalbumin-induced airway hyperreactivity in mice such as mucus production, Th2 cytokines, IgE and recruitment of eosinophils to the airways. The amelioration of inflammation was associated with significantly increased levels of local and systemic IL-10. By using an in vitro co-culture assay AvCystatin-induced macrophages were shown to secrete a soluble factor which induces IL-10 in CD4+ T cells and in parallel to suppress production of IL-13, IL-2 and IFN-gamma. To evaluate whether the suppressive potential of AvCystatin-macrophages is restricted to airway inflammation, macrophages were administered to animals suffering from DSS-induced colitis. A single application of cells into the tail vein sufficiently prevented body weight loss, colon shortening and suppressed the influx of inflammatory cells to the lamina propria. In contrast to the model of ovalbumin-induced airway inflammation the effects were not associated with increased levels of IL-10. On the whole these findings show that the helminth immunomodulator AvCystatin targets macrophages thereby inducing a distinct immunosuppressive population which protects mice against overshooting immune responses in disease models for airway and intestinal inflammation.
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Charakterisierung der T-Zell-Antwort auf eine intestinale Nematodeninfektion

Rausch, Sebastian 09 March 2010 (has links)
Parasitische Nematoden beeinflussen gezielt die Abwehrreaktionen ihres Wirtes. Dies wird besonders während der chronischen Infektionsphase durch eine herabregulierte T-Zell-Antwort auf Parasitenantigene und andere Stimuli ersichtlich. In dieser Arbeit wurde die T-Zell-Antwort gegen einen intestinalen Nematoden untersucht. Mäuse wurden mit dem Trichostrongyliden Heligmosomoides polygyrus infiziert und in der Folge Effektor- sowie regulatorische T-Zellen (Tregs) untersucht. Subpopulationen von CD4+ T-Zellen wurden aus chronisch infizierten Mäusen isoliert und in naive Empfänger transferiert, welche nachfolgend infiziert wurden. Dabei zeigte sich, dass der Transfer von CD4+ Effektor-T-Zellen zu einer verminderten Wurmlast in den Empfängertieren führte, diese Zellen also einen partiellen Schutz gegen die Primärinfektion vermitteln. Der gleichzeitige Transfer von Tregs beeinflusste diesen Effekt nicht. Tregs allein zeigten keinerlei Einfluss auf die Wurmlast der Empfänger. Die Protektion durch Transfer von Effektor-T-Zellen kann vermutlich auf eine kleine Antigen-spezifische Population von CD4+ Zellen zurückgeführt werden. Diese Zellen wurden durch die Expression von CD40-L (CD154) nach Restimulation mit Parasitenantigen in vitro charakterisiert und enthielten einen Großteil der Zytokinproduzenten unter den CD4+ Zellen. Während diese Effektorzellen ein deutliches Th2-Zytokinprofil durch Produktion von Interleukin-4 (IL-4) und IL-13 zeigten, reagierte eine Treg-Subpopulation mit der Sekretion hoher Mengen von IL-10 auf Antigenstimulation. Diese Tregs waren durch Expression des Integrins AlphaE (CD103)Beta7 sowie CD25 und Foxp3 charakterisiert und vermittelten in vitro die stärkste Suppression anderer T-Zellen, wenn sie aus chronisch infizierten Mäusen isoliert wurden. Durch Untersuchung der zellulären Zusammensetzung von mesenterialen Lymphknoten und Milz konnte gezeigt werden, dass die Frequenz solcher regulatorischer Zellen im Verlauf der Infektion dauerhaft und überproportional zunimmt. Im Gegensatz dazu wurde am Infektionsort nur eine vorübergehende Akkumulation von Tregs (Foxp3+) während der akuten Phase der Infektion nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen den Einfluss einer intestinalen Nematodeninfektion auf die Aktivität von Tregs und das Potential parasitenspezifischer CD4+ Effektor-Zellen zur Vermittlung von Schutz gegen die Infektion. Ein weiteres Projekt dieser Arbeit wahr die Verabreichung eines immunmodulatorischen Parasitenproteins, des Filariencystatins Av17, in einem Mausmodell entzündlicher Darmerkrankungen. In Mäusen wurde eine kolitisartige Entzündung durch eine Chemikalie im Trinkwasser induziert. Die regelmäßige Verabreichung von rekombinant exprimiertem Cystatin verminderte die Entzündungsreaktion signifikant. Damit konnte in dieser Arbeit gezeigt werden. dass Entzündungsreaktionen, die nicht durch den Parasiten selbst hervorgerufen werden, durch die Applikation einer einzelnen Parasitenkomponente unterdrückt werden können. / Parasitic nematodes specifically modulate the immune response of their hosts. A cellular hyperreactivity, especially during the chronic phase of infection, is a distinct finding of such infections. The T cell response against an intestinal nematode was analyzed in this work. Mice were infected with the trichostrongylid Heligmosomoides polygyrus and surveyed for changes concerning effector and regulatory T cells (Tregs). Subpopulations of CD4+ T cells were isolated from chronically infected mice and adoptively transferred to naive recipients, which were subsequently infected. The Transfer of CD4+ effector cells conferred partial protection, seen as decreased worm burdens in recipients. This effect was unimpaired by simultaneous transfer of Tregs. The transfer of purified Tregs alone showed no effect on worm burdens. The protection by transfer of effector T cells was probably due to a small parasite-specific population, which was characterized by the expression of CD40-L (CD154) after antigen-restimulation. The CD154+ population contained high frequencies of cells reacting with production of the Th2 key cytokines interleukin-4 (IL-4) and IL-13. On the other hand, a subpopulation of Tregs secreted high amounts of IL-10 in response to the antigen. These Tregs were characterized by the expression of the integrin AlphaE (CD103)Beta7, as well as CD25 and Foxp3. They showed a peculiar strong suppressive efficacy on the proliferation of other T cells, especially when derived from chronically infected donors. Analyzing the cellular composition of mesenteric lymph nodes and spleens in response revealed a lasting and over-proportional increase in frequencies of these Tregs. In clear contrast, only a transient increase of Foxp3-expressing Tregs was detected at the site of infection during the acute phase. These results point out the changes Treg activity during an intestinal nematode infection and show the potential of CD4+ effector cells in mediating protection against infection. A second project of this work was the application of an immunomodulatory parasite protein, the filarial cystatin Av17, in a mouse model of inflammatory bowel disease. Mice developed an inflammatory response to a chemical applied in the drinking water. The repeated application of recombinantly expressed cystatin significantly diminished the inflammatory response. Hence, this work showed the potential of a single parasite component in suppressing inflammatory processes not caused by the parasite itself.
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Mathematical models of IL-10 regulation in macrophages stimulated with immunomodulatory molecules of parasitic nematodes

Figueiredo, Ana Sofia Cabrita 27 June 2012 (has links)
Der parasitische Nematode Acanthocheilonema viteae kann die Immunantwort seines Wirtes abschwächen, indem er in diesem die Produktion immun-regulatorischer Cytokine Interleukin-10 (IL10) induziert. In dieser Arbeit entwickelte ich spezifische mathematische Modelle um die Mechanismen der IL10 Regulation zu erforschen. Die Annahmen des Modells waren: 1) Av17, ein immun-modulatorisches Protein von A. viteae, zur Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK und p38 führt; 2) Av17 induzierte IL10 ist ERK und p38 abhängig. Beide Annahmen waren in Übereinstimmung mit experimentellen Ergebnissen zur Aktivierung von ERK and p38. Weiter habe ich mehrere Signalregulationsmodelle getestet und eine Methode entwickelt, die theoretische und experimentelle Ansätze kombiniert. Von hier aus konnte ich ein Modell auswählen, dass unabhängige experimentelle Daten korrekt vorhersagt. Modelle selection identifizierten die Duale-Spezifizität Kinasen (DUSP) als integrale Rückkopplungsregulatoren dieses Systems. Eine Sensitivitätsanalyse zeigte, dass p38 durch DUSP, ERK beeinflusst, das Gegenteil aber nicht. Dieser Befund legt eine autokrine Rückkopplung der Signalkomponenten nahe, die auch experimentell bestätigt werden konnte. Allgemein müssen die immunoregulatorischen Mechanismen im Wirt robust gegen Störungen, z.B. durch Parasiten wie A. viteae, sein. Dies veranlasste mich mit Hilfe eines Monte-Carlo Ansatzes die Robustheit der ausgewählten Modelle gegenüber Variationen zu testen. Ich verglich das zuvor ausgewählte Modell und ein Modell mit transienter Rückkopplung. Das Resultat ließ darauf schließen, dass in diesem Fall die integrale Rückkopplung robuster gegenüber Variationen ist als eine transiente Rückkopplung. Insgesamt verbindet der systembiologische Ansatz meiner Arbeit erfolgreich theoretisches Wissen mit experimenteller Expertise um einen Mechanismus vorzuschlagen, der beschreibt, wie der Parasit A. viteae mit Makrophagen seines Wirtes interagiert, um IL10 Exprimierung zu induzieren. / The parasitic nematode Acanthocheilonema viteae can downregulate the immune response of its host by inducing immunoregulatory cytokines such as interleukin-10 (IL10). In this thesis, I developed specific mathematical models to investigate IL10 regulation mechanisms. These models assumed that Av17, an immunomodulatory protein secreted by A.viteae, leads to the Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK) ERK and p38 phosphorylation and that IL10 transient expression was dependent on the activation of both MAP kinases. These assumptions were validated with experimental data on ERK and p38 activation. Further, I tested alternative ways of signalling regulation and developed a method of model selection that combines the theoretical predictions with experimental evidences. Model selection identified dual specificity phosphatase (DUSP) as integral feedback regulators in this system. Dedicated experiments showed that DUSP1 was responsible for regulation of ERK and p38 phosphorylation and controlled IL10 expression in this system. Furthermore, a sensitivity analysis suggested that p38 affects ERK via DUSP, but ERK does not affect p38, revealing a negative feedback between the components. This model prediction was validated experimentally. Generally, host immune regulation mechanisms should be robust against variations, e.g., by parasites like A. viteae. This prompted me to test the robustness of the selected model against noise, by comparing it with a transient feedback model. The results suggest that the integral feedback model is more robust against noise than the transient feedback model, in the case under study. In summary, based on a systems biology approach that successfully combines theoretical and experimental expertise, this thesis proposes a mechanism that describes how the parasite A. viteae interacts with its host macrophages to induce IL10 expression.
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Developmental and functional characterization of cystatin and chitinase of Acanthocheilonema viteae

Pillai, Smitha 23 May 2007 (has links)
Die Infektion mit Filarien (Nematoden) ruft massive Schädigungen beim Menschen hervor. Strategien zur Bekämpfung dieser Parasitose basieren auf einer Massenbehandlung mit Ivermectin und Derivaten. Allerdings ist die Behandlung der Patienten zeitaufwändig und teuer. In diesem Zusammenhang stellt Aufklärung molekularer Mechanismen, die die parasitische Lebensform dieser Würmer ermöglichen, einen neuen Ansatzpunkt für die Entwicklung von Therapeutika und Präventivmaßnahmen dar. Die Moleküle Cystatin und Chitinase wurden, auf Grund ihrer immunodulatorischen und katalytischen Eigenschaften, bei der Nager-Filarie Acanthocheilonema viteae als essentielle Proteine identifiziert. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die detaillierte, funktionale Charakterisierung dieser beiden Proteine. Um das räumliche Expressionsmuster und damit potentielle Funktionen des Sekretionsprotein Cystatins zu ermitteln, wurde der frei lebende Nematode Caenorhabditis elegans als heterologes Expressionssystem genutzt. Unter dem Einfluss des Cystatin-Promoters konnte GFP in pharyngealen und rektalen Zellen von C. elegans exprimiert werden. Möglicherweise ist das Cystatin damit bei A. viteae in den Häutungsprozess involviert, da bei C. elegans derartige Enzyme in den pharyngealen Zellen gespeichert werden. Des Weiteren wurde der Häutungsprozess der infektiösen L3 zum Stadium der L4 durch Ausschalten des Gens mittels RNAi um drei Tage verzögert. Allerdings war der Effekt transient und die Verzögerung des Häutungsprozesses beeinflusste weder die Viabilität noch die Infektiösität der Larven. Die Analyse der Regulation von Cystatin während der Entwicklung des Parasiten mittels der Real-Time PCR zeigte, dass das Gen im Stadium der Mikrofilarien, die der Immunantwort des Wirtes voll exponiert sind, maximal exprimiert wird. Für die Chitinase von A. viteae konnte eine essentielle Rolle im Häutungsprozess nachgewiesen werden. Das Ausschalten des Gens führte zu einer Hemmung der Häutung bei 90 % der L3 und damit zu ihrem Tod. Die maximale Expression im L3 Stadium des Parasiten ist ein weiterer Hinweis darauf, dass dieses Protein in den Häutungsprozess involviert ist. Mittels RNAi bei adulten Parasiten konnte die katalytische Rolle der Chitinase beim Abbau des Chitins im Ei bestätigt werden, da hier nur ungeschlüpfte Mikrofilarien ausgeschieden wurden. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern weitere Hinweise darauf, dass sowohl das Cystatin als auch die Chitinase von A. viteae auf Grund ihrer essentiellen endogenen Funtionen attraktive Zielmoleküle in der Bekämpfung von Filariosen darstellen. / Nematodes which cause filariasis have detrimental effect on humans. Strategies to eliminate this disease are based on mass treatment with drugs like ivermectin. However, they have several drawbacks such as long duration required for treatment and tenuous financial supports. Understanding the molecular mechanisms of genes required for parasitism will help to develop novel therapeutic and preventive strategies. The aim of this study was a detailed functional characterization of cystatin and chitinase of Acanthocheilonema viteae, a rodent filarial nematode. To this end, C. elegans was used as a heterologous system to determine the spatial expression pattern of A. viteae cystatin and chitinase and thereby their possible functions. The promoter of cystatin drove the expression of reporter, GFP, to the pharyngeal and rectal gland cells of transgenic C. elegans lines, this being compatible with the fact that cystatin is secreted in the parasites. This also suggests that cystatin in A. viteae is probably required for moulting since generally in C. elegans the enzymes required for moulting are stored in the pharyngeal gland cells. Moreover, knockdown of cystatin by RNAi delayed moulting of the infective L3 to the L4. However, the RNAi effect was transient and the delay in moulting did not affect the viability and infectivity of the larvae. Analyses of the developmental regulation of cystatin by real-time PCR showed that it is maximally expressed in the blood microfilarial stage, which are exposed to the full force of host immune responses. This is compatible to the fact that A. viteae cystatin immunomodulates the host immune responses. This study also determined that chitinase of A. viteae plays an essential role in the moulting of the L3 larvae since knockdown of chitinase inhibited moulting in 90% of the L3 larvae thereby killing them. Moreover, maximum expression of chitinase was observed by real-time PCR in the L3 stage supplementing that it is involved in moulting. RNAi of chitinase in adults led to the release of unhatched microfilariae confirming the essential catalytic role of chitinase in the degradation of the chitin egg shells. This study substantiates that cystatin and chitinase of A. viteae are attractive intervention targets due to their essential endogenous functions in the parasite.
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Kliniskt handledarskap med hjälp av Informations- och kommunikationsteknik (IKT) : -         En intervjustudie

Svensson, Helena January 2011 (has links)
The purpose of this study was to describe senior nurses’ expectations concerning how a digital information and communication technology systems (ICT) can contribute to the improvement of care leadership and how it can strengthen ties between the school's theoretical world and the practical clinical work-based training (WP) in nursing. The study has a descriptive design with a qualitative approach. The study involved seven leading care nurses. Data were collected through semi-structured interviews. Subject matter was analyzed based on qualitative content analysis.  The analysis yielded in a first category practical examples of how using ICT as a tool could strengthen the ties between theory and practice in order to understand the usefulness of theory in practice.  The informants also gave specific examples of ICT content that could be given to students and also to supervisors both in terms of information and education. The second category described the supervisors’ views on receiving students in clinical placements. The senior care nurses felt that at present the reception of students was unsatisfactory due to a muddled organization. It was often unclear what responsibilities they had as mentors and what the responsibility of the student was for his or her practice placement. Conclusions of the study are that the supervisors could see ICT as a tool to clarify these ambiguities. In the future it is necessary to respond to the needs of supervisors with respect to their views on what an ICT system should provide them with in order to improve their care supervision. By providing an ICT learning tool the two worlds could meet and the ties between theory and practice in the nursing program could be strengthened.
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Charakterisierung der immunmodulierenden Wirkung eines Cysteinproteasen-Inhibitors der humanpathogenen Filarie Onchocerca volvulus

Schönemeyer, Annett 12 December 2000 (has links)
Filarien persistieren bis zu 15 Jahren in ihren Wirten. Als eine Ursache dieser Persistenz diskutiert man die Fähigkeit der Filarien, die Immunantwort des Wirtes gezielt zu modulieren und eine zelluläre Hyporeaktivität zu induzieren. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob ein sezernierter Cysteinproteasen-Inhibitor (Onchocystatin) der humanpathogenen Filarie Onchocerca volvulus immunmodulierende Eigenschaften besitzt und an der Herausbildung eines hyporeaktiven Immunstatus des Wirtes beteiligt ist. Für die Untersuchungen wurde Onchocystatin als full length Molekül (rOv17) und als verkürztes Molekül (trOv17) rekombinant hergestellt. Das verkürzte trOv17 besitzt aufgrund des Fehlens des N-terminalen Bereiches eine verminderte proteaseinhibitorische Aktivität. Die in vitro Studien mit den rekombinant hergestellten O. volvulus Cystatinen verdeutlichen, daß rOv17 und auch trOv17 potente Immunmodulatoren sind, die sowohl die antigenspezifische als auch die polyklonal-stimulierte Proliferation von humanen PBMC inhibieren. Die zelluläre Hyporeaktivität ist dabei auf die Modulation von Monozytenfunktionen zurückzuführen. rOv17 und trOv17 modulieren die Antigenpräsentation, die Zytokinproduktion und die Expression kostimulatorischer Signale von humanen Monozyten. So konnte gezeigt werden, daß rOv17 und trOv17 die Aktivität von humanem Cathepsin L und S inhibieren und die Expression von HLA-DR, CD40 und CD86 vermindern. Die Modulation der Zytokinproduktion durch rOv17 und trOv17 ist durch eine verstärkte TNF-alpha und IL-10 Produktion und durch eine verminderte IL-12 Produktion charakterisiert. Desweiteren konnte in Neutralisationsstudien mit anti-IL-10 Ak gezeigt werden, daß die verminderte Expression von HLA-DR, CD40 und CD86 Folge der durch rOv17 und trOv17 induzierten verstärkten IL-10 Produktion ist. Im Gegensatz dazu bleibt die verminderte IL-12 Produktion und die verminderte polyklonal-stimulierte Proliferation humaner PBMC auch nach der Neutralisation von IL-10 bestehen. Die Studien mit den rekombinant hergestellten O. volvulus Cystatinen zeigen, daß rOv17 und trOv17 ihr immunologisches Umfeld auf vielfältige Art und Weise modulieren. Dabei spielt vermutlich die Inhibition der Aktivität einer Wirtscysteinprotease, aber auch ein von der Funktion als Cysteinproteasen-Inhibitor unabhängiger Mechanismus eine Rolle. Der Cysteinproteasen-Inhibitor der Filarie O. volvulus besitzt somit die Eigenschaft, die Immunantwort des Wirtes zu modifizieren, und ist vermutlich eine wesentliche Komponente, die dem Parasiten eine lange Persistenz im Wirt ermöglicht. / Immune responses of individuals infected with filarial nematodes are characterized by a marked cellular hyporesponsiveness. The establishment of this hyporesponsiveness is considered as an important mechanism to avoid host immune responses which could eliminate the parasites. The present study is investigating the immunomodulatory potential of a 17 kD secreted cysteine protease inhibitor (onchocystatin) of the human pathogenic filaria Onchocerca volvulus. In vitro studies using recombinant onchocystatin (rOv17) identified this inhibitor as a potent immunomodulator. rOv17 suppresses the antigen-driven and the polyclonally-stimulated proliferation of human PBMC. This cellular hyporeactivity is due to the modulation of monocytic function by rOv17, comprising the modulation of antigenpresentation, the expression of costimulatory molecules and the production of cytokines. Thus rOv17 strongly inhibits the activity of human cathepsin L and S and reduces the expression of MHC class II molecules as well as the expression of CD40 and CD86 on human monocytes. The modulation of cytokine production by rOv17 is characterized by an initial increase of TNF-alpha which is followed by an increase of IL-10 and a decrease of IL-12. By neutralization studies it was shown that the suppression of MHC class II molecules and of CD86 and CD40 is mediated by the rOv17 induced increase of IL-10. In contrast cellular hyporeactivity and the reduced IL-12 production remain unaffected by neutralization of IL-10. In comparison to rOv17 a truncated onchocystatin (trOv17) with lowered protease inhibitory activity was investigated. Surprisingly even trOv17 is immunomodulatory active suggesting that immunomodulation by onchocystatin is mediated by both an inhibitor-dependent and an inhibitor-independent mechanism. These data demonstrate that onchocystatin is a potent immunomodulator of host immune responses and in consequence is an essential component that enables the parasites a long persistence within their hosts.
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Cleavage and cell fates in Phoronida

Pennerstorfer, Markus 28 July 2015 (has links)
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit Aspekten der frühen Entwicklung der Phoronida („Hufeisenwürmer“). An drei Arten wird der Furchungsprozess untersucht (Phoronis pallida, Phoronis muelleri, Phoronis vancouverensis). Dies erfolgt sowohl mithilfe der 4D-Mikroskopie als auch anhand von immunocytochemischen Markierungen der Mitosespindeln und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. Verschiedene morphologische Merkmale des Furchungsprozesses werden quantitativ erfasst und innerhalb sowie zwischen den Arten verglichen. Die Ergebnisse zeigen eine weitgehend übereinstimmende Furchung bei P. pallida und P. muelleri Embryonen: Ab dem dritten Zellzyklus teilen sich die Blastomeren meist schräg – und alternierend dextral und sinistral – zur animal-vegetativ Achse. Dieses Muster zeigt überraschende Übereinstimmungen mit dem Muster der Spiralfurchung. Dies kann als morphologische Unterstützung molekular-phylogenetischer Befunde einer Stellung der Phoronida innerhalb der Spiralia/Lophotrochozoa interpretiert werden. Die Furchung bei P. vancouverensis unterscheidet sich von der Furchung der anderen beiden Arten; sie weist jedoch auch Unterschiede zu einer Radiärfurchung auf. Generell zeigt die Furchung aller drei Arten einen gewissen Grad an Variabilität. Anhand von in-vivo Einzelzellmarkierungen untersucht die Studie darüber hinaus das Schicksal der Blastomeren früher P. pallida Embryonen bis zu späten Gastrulationsstadien. Diese Analysen zeigen, dass die ersten beiden Furchungsteilungen durch die spätere Achse Blastoporus-Apikalplatte, jedoch in keinem konstanten Orientierungsverhältnis zur Ebene der Bilateralsymmetrie der Gastrula verlaufen. Dies unterscheidet sich von der Situation, wie sie von spiralfurchenden Tieren bekannt ist. Die Unterschiede und die beobachtete Variabilität des Furchungsprozesses werden im Licht unterschiedlicher Mechanismen der Spezifizierung von Zellschicksalen und Körperachsen bei verschiedenen Taxa der Spiralia und den Phoronida diskutiert. / This study addresses aspects of the early development of Phoronida (“horseshoe worms”). The cleavage process is analyzed for three species (Phoronis pallida, Phoronis muelleri, Phoronis vancouverensis). These investigations are performed using 4D-microscopy as well as immunocytochemical stainings of the mitotic spindle apparatuses in combination with confocal laser-scanning microscopy. Different morphological features of the cleavage process are quantified and compared within as well as between the species. The results reveal a highly consistent cleavage of P. pallida and P. muelleri embryos: from the third cell cycle onward, the blastomeres divide mostly obliquely – and alternatingly dextral and sinistral – with respect to the animal-vegetal axis. This cleavage pattern shows surprising correspondences to the pattern of spiral cleavage. The finding can be interpreted as morphological support for recent molecule-based phylogenies, which indicate a position of Phoronida within the Spiralia/Lophotrochozoa clade. The cleavage of P. vancouverensis differs from the cleavage in the other two species; however, it also shows differences to a radial cleavage pattern. In all three species, the cleavage process also involves some degree of variability. Furthermore, the study traces the cell fates of early P. pallida embryos up to the state of late gastrulation, by the use of fluorescent in-vivo single cell markings. These analyses reveal that the first two cleavage divisions both pass through the later axis blastopore-apical plate of the gastrula, yet they do not pass in a constant relationship with respect to the later plane of bilateral symmetry. This differs from the situation known from spiral cleaving animals. The differences and the encountered variability of the cleavage process are discussed with respect to different mechanisms of the specification of cell fates and body axes in different taxa of the Spiralia and the Phoronida.
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Small but powerful

Scharroba, Anika 19 May 2017 (has links)
In der vorliegenden Arbeit wurden die Einflüsse der landwirtschaftlichen Nutzung auf die Struktur und Biomasse von Nematoden entlang eines Tiefengradientens und innerhalb zweier Vegetationsperioden an einem Ackerstandort untersucht. Die Freilandanalyse der Nematodengemeinschaft wies auf ein mit Nährstoffen angereichertes und gestörtes Ökosystem, mit einer geringen Diversität, hin. Entlang des Tiefengradienten bildeten die Nematoden Metacommunities, welche Umweltgegebenheiten wie Nahrungsquellen und abiotischen Faktoren widerspiegeln. Signifikant höhere Biomassen wurden unter Weizen im Vergleich zu Mais als Ackerfrucht beobachtet. Die Streuapplikation induzierte einen „bottom-up“ Effekt mit größeren Biomassen in den niedrigen als in den höheren trophischen Stufen. Die Nematoden Biomassen sowie die faunistischen Indizes (Channel Index, Enrichment Index) zeigten, dass der Kohlenstofffluss im Bakterienkanal des Bodens dominierte. Allerdings deckte das 13C Pulse-Labelling Experiment im Feld auf, dass der Kohlenstofffluss durch die Pilzgemeinschaft sowie die pilzfressenden Nematoden wesentlich höhere Umsatzraten aufweist. In einem 14C-Laborexperiment wurde ein vollständiges Budget des Flusses von wurzelbürtigem Kohlenstoff in das Nahrungsnetz der Nematoden bestimmt. Hierbei wiesen die pflanzenparasitären Nematoden die höchsten 14C-Gehalte innerhalb weniger Tage auf, da sie direkt an den Wurzeln fressen und über die Herbivorenkette den Nährstoffzyklus im Boden eröffnen. / The present research considered the effects of agricultural management practice on the nematode community structure and biomass in three different depths and two successive vegetation periods at an arable field site. The resource quality was manipulated by crop plant and organic amendment, to investigate the major soil carbon pathways based on roots, bacteria and fungi. The nematode community analysis pointed to a highly enriched and disturbed ecosystem with low biodiversity. Along the depth gradient the nematodes formed distinct metacommunities, reflecting resource availability and abiotic environmental factors. Wheat supported significantly greater nematode biomass than maize. The litter amendment induced bottom-up effects, with greater biomass allocation at lower than at higher trophic levels. The biomass of nematode families as well as faunal indices (Channel Index, Enrichment Index) revealed a predominance of the bacterial carbon channel in the arable soil. A 13C pulse-labelling experiment investigating the flux of root- derived C into the soil food web revealed high turnover rates in the fungal carbon pathway. This was evident for soil fungi as well as for fungal-feeding nematodes and contradicts general assumptions of a more active bacterial pathway in arable soils. A laboratory experiment with 14C isotope was used to compile a complete budget for the root-derived carbon in the nematode food web. Here plant-feeding nematodes, which feed on living plant roots, thereby opening the root C cycling into the food web, showed highest amounts of 14C allocation within a few days.
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Molecular approaches to direct diagnosis and characterization of Leishmania donovani in clinical isolates

Tai, Nahla Omer Ahmed El 06 March 2003 (has links)
Die vorliegende Studie wurde in einer Gruppe von Dörfern im Ostsudan, Gedaref State, durchgeführt. Bei 100 Patienten mit der Verdachtsdiagnose Kala Azar- oder Post-Kala Azar- Leishmaniose war der Erregernachweis mit der PCR direkt in klinischen Proben, die auf Filterpapier aufgebracht worden waren, ohne vorherige Kultivierung erfolgreich. In dieser PCR wurden die ribosomalen, internal transcribed spacer (ITS1 & ITS2) amplifiziert, weil sie sehr variabel sind, eine klare Speziesidentifizierung gestatten und bei weiterführenden Analysen der PCR-Produkte auch der Nachweis stammspezifischer Unterschiede erwartet werden konnte. Für die Analyse der Diversität von Leishmania donovani-Isolaten aus dem Sudan wurden 4 verschiedene PCR-basierte Methoden eingesetzt: das PCR-Fingerprinting mit unspezifischen Einzelprimern, die RFLP- Analyse des amplifizierten ITS-Locus, ,,single strand conformation polymorphism (SSCP)- Analysen der amplifizierten ITS-Region, des Gens, welches für die Hauptoberflächenprotease (gp63) kodiert, und anonymer DNA- Fragmente sowie Sequenzanalysen der entsprechenden Zielregionen. Das PCR-Fingerprinting und die Restriktionsanalyse der ITS-Region lieferten weitgehend übereinstimmende Fragmentmuster für alle untersuchten L.donovani-Stämme. 12 unterschiedliche Profile wurden bei der SSCP-Analyse des ITS1-Locus für 86 Isolate aus dem Sudan erhalten, während der ITS2-Locus bei diesen Stämmen hochkonserviert war und nur ein Stamm ein unterschiedliches SSCP-Muster aufwies. L. Donovani -Stämme anderer geographischer Herkunft hatten unterschiedliche ITS2-Profile in der SSCP. Für den gp63 - Locus waren 3 polymorphe SSCP-Muster bei 31 untersuchten sudanesischen Isolaten nachweisbar. Für die meisten der anonymen DNA-Fragmente, L510, L413, LK413, L0308 UND L0114, konnten leider nur von 8 kultivierten Stämmen gute PCR-Produkte erhalten werden. Lediglich das Fragment L0110 konnte erfolgreich von 31 auf Filterpapier aufgebrachten Proben direkt amplifiziert werden. Die Suche nach Polymorphismen mit der SSCP ergab keine Unterschiede in diesen anonymen DNA-Regionen, mit Ausnahme des Fragments L0114, das zwei verschiedene Muster aufwies. Die Ergebnisse der SSCP-Analysen und der DNA- Sequenzierung stimmten gut überein, wodurch bestätigt wurde, dass die SSCP genetische Unterschiede auf dem Niveau einzelner Basenaustausche nachweisen kann. Die SSCP- Technik hat Vorteile gegenüber den anderen Methoden, die für die Untersuchung von Sequenzvariationen innerhalb der Spezies L. donovani angewandt wurden. Es konnten keine Korrelationen zwischen der Form der klinischen Manifestation und den Ergebnissen des PCR- Fingerprinting, der ITS-RFLP- und ITS-SSCP- Analysen festgestellt warden. Diese Studie ist von besonderem Nutzen in epidemiologischen Feldstudien, bei denen die Kultivierung der Erreger besonders in Entwicklungsländern extrem schwierig sein kann. / This study was carried out in clusters of villages that represent an endemic focus of visceral leishmaniasis (VL). These villages were located in Gedaref state, eastern Sudan. For diagnostic purposes polymerase chain reaction (PCR) was performed successfully, directly from clinical samples spotted on filter papers with no prior cultivation from 100 patients suspected of having kala-azar or post kala-azar dermal leishmaniasis. Mainly the ribosomal internal transcribed spacer (ITS1 & ITS2) were targeted in PCR because this region is more variable and allows clear species identification and also strain differences could be expected by further analysis of these PCR products. PCR was found to be more sensitive compared to the gold standard microscopic method. Four PCR based approaches were used to analyse diversity within Sudanese isolates of Leishmania donovani. Methods compared were fingerprinting with single non-specific primers, restriction analysis of the amplified ITS locus (RFLP), single-stranded conformation polymorphism (SSCP) of the ITS region, major surface protease (gp63) gene, anonymous DNA fragments and sequencing of these targeted regions. When PCR fingerprinting and restriction analysis of ITS region were applied, highly similar fragment patterns were observed for all strains of L. donovani studied. The ITS1 locus gave 12 different SSCP profiles among the 86 Sudanese isolates, where as the ITS2 locus was highly conserved among the 86 samples with the exception of 1 isolate. Strains of L. donovani derived from other geographical areas were found to have different ITS2 patterns. The gp63 locus gave 3 polymorphic patterns among 31 Sudanese isolates. Concerning most of the anonymous DNA fragments namely, L510, L413, LK413, L0308 and L0114 unfortunately, we succeeded to get good PCR products only from DNA extracted 8 successful cultures. Only for the fragment L0110 we were able to get good PCR products from 31 samples spotted on filter papers. When these PCR products were investigated for polymorphisms using SSCP no differences were observed with exception of L0114 region, which showed 2 patterns. SSCP analysis correlates well with results of DNA sequencing and confirmed that SSCP was able to detect genetic diversity at the level of a single nucleotide. SSCP had advantages over the other methods employed for investigating of sequence variation within the species L. donovani. There was no correlation between the form of clinical manifestation of the disease and the PCR fingerprinting, ITS-RFLP, or ITS-SSCP characteristics. This study is beneficial particularly in epidemiological studies based on field-work where obtaining cultures can be extremely difficult especially in developing countries.
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Das Dauerstadium als Präadaptation

Chang, Zisong 08 January 2015 (has links)
Wir fanden konservierte molekulare Signaturen der Regulation durch Δ7-DA und Ascarosid bei Dauer- und infektiösen Larven. Danach wurde die hohe Konservierung durch unsere Analyse in Dauer- und Postdauer-Stadium zwischen den zwei nah verwandten freilebenden Arten C. elegans und C. briggsae identifiziert. Das heißt, dass die relative Veränderung auf mRNA- oder Protein- Ebene zwischen zwei Arten stark korreliert ist. Aber die relative Veränderung innerhalb derselben Art zeigt keine hochgradige Korrelation zwischen mRNA- und Protein-Ebene. Unsere Ergebnisse zeigen in C. elegans Dauerlarven die signifikante Reduzierung der RNA-Mengen in 20 Stoffwechselwegen. Im Gegensatz dazu speicherten Dauerlarven reichlich RNA-Mengen in GO Termen wie Ribosome und Aminoacyl-tRNA biosynthesis. Auf Protein-Ebene sind die Stoffwechselwege von Proteinsynthese und Proteinverarbeitung im endoplasmatischen Retikulum in Dauerlarven herunterreguliert und GO Terme wie Lysosome sind hochreguliert. Durch die Zeitreihenanalyse der Proteom-Remodellierung der molekularen Signaturen beim Austritt aus dem Dauer-Stadium fand wir, dass GO Terme wie metal ion binding signifikant herunterreguliert sind und der Proteinabbau hochreguliert ist. Unsere Ergebnisse vom pSILAC Experiment deuten an, dass die Proteine für Energieerzeugung und Chaperone/Proteinfaltung beim Daueraustritt schnell verbraucht sind und wieder hergestellt werden. Zum Schluss haben wir als Erste den popomR-Assay in C. elegans etabliert und ein Screening der vermeintlichen Proteinbindestellen auf poly-A-RNA durchgeführt, um in der Zukunft die konservierten Mechanismen der post-transkriptionellen Regulation durch RBPs im Dauer-Stadium zu analysieren. / We found the conservation of molecular signatures by regulating with Δ7-DA and Ascarosid in dauer larvae and infective larvae. Then by our comparative analysis, the high degree of conservation between two closely related free-living species C. elegans and C. briggsae was identified in dauer and post-dauer stages. This means that the relative changes are strongly correlated on the mRNA or the protein level between two species. But the relative changes in the same species don’t show any strong correlation between the mRNA and the protein levels. Our results showed a significantly reduced amount of RNA in 20 metabolic pathways in C. elegans dauer larvae. In contrast, dauer larvae stored a large amount of RNA in GO terms such as ribosome and aminoacyl-tRNA biosynthesis. On the protein level, the metabolic pathways of protein synthesis and protein processing in endoplasmic reticulum were downregulated in dauer larvae and the term of lysosome was up-regulated. Due to time course analysis for proteome remodeling of molecular signatures during exit process from dauer stage, we found that GO terms such as metal ion binding were significantly downregulated during dauer exit and at the same time the protein degradation was up-regulated. Our results of pSILAC experiment suggest that the proteins for energy generation and chaperone/protein folding are quickly spent and rebuilded during dauer exit. Finally, we were the first to establish the popomR assay in C. elegans and performed a screening of the putative protein binding sites on poly-A RNA to analyze the conserved mechanisms of post-transcriptional regulation by RBPs in dauer larvae in the future.

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