Im Mittelpunkt der Arbeit stehen Betrachtungen zur Mobilität von epikutan applizierten ESR-Spinsonden, sowie noch weitgehend ungeklärte Fragen zu den Wechselwirkungen zwischen Liposomen und Haut. Dazu gehört vor allem die Frage nach der Integrität von epikutan applizierten Liposomen. Weiterhin wurden die Auswirkungen von Liposomen auf die Flexibilität der intercorneozytären Lipiddoppelmembranen, die Penetration von ESR-Spinsonden unterschiedlicher Hydro-/Lipophilie, sowie die Mobilität von ESR-Spinsonden in der Haut und die Polarität ihrer Mikroumgebung untersucht. Als wichtigste Ergebnisse der Arbeit sind folgende Punkte zu nennen. Liposomen verlieren nach epikutaner Applikation ihre Integrität und bilden auf dem Stratum corneum einen Lipidfilm aus. Dabei nimmt nicht nur der Dispersitätsgrad der Liposomen sondern auch die Flexibilität ihrer Membranen ab. Entgegen der Erwartung führt die epikutane Applikation von liposomalen Zubereitungen nicht zu einer stärkeren Fluidisierung der intercorneozytären Lipiddoppelmembranen als Phosphatpuffer, wohingegen durch Ölsäure eine deutlich stärkere Fluidisierung erreicht wird. Liposomen mit rigiden Membranen führen zu höheren Spinsondenkonzentrationen in der Haut als Liposomen mit fluiden Membranen, und solche aus partialsynthetischen Lipiden führen zu höheren Konzentrationen als Liposomen aus Sojabohnenphospholipiden. Der Vergleich der Penetration von ESR-Spinsonden in die Haut nach epikutaner Applikation von Liposomen mit der Penetration der Spinsonden aus anderen topischen Zubereitungen zeigt, dass eine generelle Aussage zur Penetrationsförderung durch die Anwendung von Liposomen problematisch ist. Es konnte ein Polaritätsprofil der Mikroumgebung von Spinsonden in der Haut erstellt werden, das belegt, dass die Polarität in der Epidermis geringer ist als in der Dermis. Mit zunehmender Inkubationsdauer konnte ein Anstieg der Polartiät in den Hautproben nachgewiesen werden. Die Anwendung eines durch Freed et al. entwickelten Computerprogramms zur Bestimmung von Rotationskorrelationszeiten sich langsam bewegender Moleküle aus Spektren, die mittels spektral-räumlich aufgelöster ESR-Tomografie erhalten wurden, erlaubt die Erstellung von Viskositätsprofilen der oberen Hautschichten in Abhängigkeit von den epikutan applizierten Zubereitungen. Die Bandbreite der ortsabhängig berechneten Rotationskorrelationszeiten von CAT-1 und TEMPOL in der Haut nach epikutaner Applikation der Spinsonden in Liposomen reicht von 5,94 ns bis 1,97 ns. Dies entspricht einer Viskosität der Mikroumgebung von 118 bis 26 mPas. / The present thesis was focused on the mobility of epicutaneously applied ESR spinprobes and open questions concerning the interactions between liposomes and skin e.g. the integrity of liposomes after epicutaneous application. Additionally the effect of liposomes on the flexibility of lipid membranes in the stratum corneum, the penetration of ESR spinprobes with different hydrophilic / lipophilic properties as well as the mobility and polarity of the microsurrounding of ESR spinprobes in the skin were investigated. The main results of the investigations are mentioned in the following. There will be a loss of integrity of epicutaneously applied liposomes and a lipid film will be formed on the stratum corneum. At the same time the degree of dispersity and the flexibility of their membranes decreases. Contrary to the expectation the application of liposomal formulations does not lead to a stronger fluidity of the lipid membranes of the stratum corneum than the incubation of the samples with phosphate buffer, whereas the incubation with oleic acid results in a substantial increase of the fluidity. The application of ESR spinprobes in liposomes with rigid membranes leads to higher spinprobe concentrations in the skin than with liposomes having fluid membranes. At the same time the application of liposomes made from semi-synthetic lipids leads to higher concentrations of the spinprobe in the skin, than the application of liposomes made from soybean phospholipids. The penetration of spin probes into the skin out of liposomes compared to other topical preparations shows, that a general statement concerning the penetration enhancing effect of liposomes is difficult. On using the ESR tomography a polarity profile of the skin was obtained, showing that the polarity in the epidermis is lower than in the dermis. With increasing incubation time of the skin samples the polarity increases. The application of a computer program, developed by Freed et al. in order to determine rotational correlation times for slowly tumbling molecules, to spectra, obtained from spectral-spatially resolved ESR tomography, allowed the establishment of viscosity profiles for the upper skin layers in dependency on the applied formulations. The range of the calculated rotational correlation times of CAT-1 and TEMPOL in the skin reaches from 5.94 ns to 1.97 ns. This corresponds to a viscosity of the spinprobes microsurrounding from 118 to 26 mPas.

Sinnessysteme erfassen und verarbeiten staendig die vielfaeltigen und komplexen Reize der Umwelt. Um die funktionellen Eigenschaften eines solchen Systems zu untersuchen, verwendet man jedoch oft relativ einfache, abstrakte Reize. Diese Reize erlauben aber meist nicht, die Funktion des Systems im Verhaltenskontext zu interpretieren. Ferner erhaelt man durch einfache Reize im allgemeinen eine unvollstaendige Beschreibung des Systems. Innerhalb dieser Arbeit zeige ich exemplarisch am Beispiel von auditorischen Rezeptorneuronen von Heuschrecken, wie man natuerliche Stimuli einsetzen kann, um die sensorische Codierung zu untersuchen.Heuschrecken verwenden akustische Kommunikation zur Partnerfindung und -auswahl. Dabei sind die Weibchen hochselektiv bei der Wahl eines Maennchens. Von besonderem Interesse ist daher, inwieweit Informationen ueber Unterschiede zwischen Maennchengesaengen durch die auditorischen Rezeptoren des Weibchens erhalten werden. Wie in der Arbeit gezeigt wird, liefern selbst einzelne Rezeptorneuronen hinreichend Information, um selbst kleine Unterschiede zwischen den Maennchengesaengen zu erkennen. Diese erstaunliche Aufloesung der Gesaenge dient vermutlich der Auswahl von genetisch hochwertigen Partnern. Ferner wird gezeigt, dass auditorische Rezeptoren nicht allgemein viel Information ueber Stimuli liefern, sondern auf spezifische Zeitskalen und Strukturen der natuerlichen Stimuli optimiert sind. Falls sensorische Systeme generell gut auf die jeweilig verhaltensrelevanten Stimuli abgestimmt sind, so kann man diese Stimuli auch automatisch finden. Im letzten Teil der Arbeit wird ein Online-Algorithmus vorgestellt, der dieses Ziel unter Verwendung informationstheoretischer Prinzipien erreicht. Dieser Algorithmus kann in Zukunft dazu dienen, die Effizienz elektrophysiologischer Experimente in beliebigen Systemen zu erhoehen. / In their natural environment, sensory systems process a wealth of complex stimuli. In contrast, most experimental tests of sensory systems employ simple stimuli that can be described by one or two parameters. However, these simple stimuli do usually not allow to relate the function of a specific system to an animal's behaviour. Furthermore, in many cases a complete characterisation of a sensory system cannot be achieved by simple stimuli alone. Within this thesis, I demonstrate how one can employ natural stimuli to study aspects of sensory coding. Grasshoppers use acoustic communication for mate detection and selection. Females show preferences for certain "qualities" of the signals produced by different conspecific males. In this thesis, I investigated how much information female grasshoppers obtain about differences between the mating songs of males. Already single auditory receptor neurons of female grasshoppers encode sufficient information to distinguish even fine variations of male songs. Presumably, this astonishing resolution is needed to single out males of high genetic quality. Furthermore, I show that the ensemble of stimuli that best explores the coding regime of a given receptor has features and time scales that are typical for grasshopper songs. If a close match between the behaviourally relevant stimuli and the sensory system is an evolutionary design principle, then one can extract the relevant stimuli from a given system without prior knowledge. In the last part of the thesis, an online algorithm is introduced, that achieves this goal using information-theoretic principles. This algorithm might help to improve the performance of experiments within the limited time of an electrophysiological recording session.

Die Eigenschaften einzelner Nervenzellen sind von grundlegender Bedeutung für die Verarbeitung von Informationen im Nervensystem. Neuronen antworten auf Eingangsreize durch Veränderung der elektrischen Spannung über die Zellmembran. Die Spannungsantwort wird dabei durch die Dynamik der Ionenkanäle in der Zellmembran bestimmt. In dieser Arbeit untersuche ich anhand von leitfähigkeits-basierten Modellneuronen den Einfluss von Ionenkanälen auf zwei Aspekte der Signalverarbeitung: die Frequenz-Selektivität sowie die Zuverlässigkeit und zeitliche Präzision von Aktionspotentialen. Zunächst werden die zell-intrinsischen Mechanismen identifiziert, welche the Frequenz-Selektivität und die Zuverlässigkeit bestimmen. Weiterhin wird untersucht, wie Ionenkanäle diese Mechanismen modulieren können, um die Integration von Signalen zu optimieren. Im ersten Teil der Arbeit wird demonstriert, dass der Mechanismus der unterschwelligen Resonanz, so wie er bisher für periodische Signale beobachtet wurde, auch auf nicht-periodische Signale anwendbar ist und sich ebenfalls in den Feuerraten niederschlägt. Im zweiten Teil wird gezeigt, dass zeitliche Präzision und Zuverlässigkeit von Aktionspotentialen mit der Stimulusfrequenz variieren und dass, in Abhängigkeit davon, ob das Stimulusmittel über- oder unterhalb der Feuerschwelle liegt, zwei Stimulusregime unterschieden werden müssen. In beiden Regimen existiert eine bevorzugte Stimulusfrequenz, welche durch die Gesamtleitfähigkeit und die Dynamik spezifischer Ionenkanäle moduliert werden kann. Im dritten Teil wird belegt, dass Ionenkanäle die Zuverlässigkeit auch direkt über eine Veränderung der Sensitivität einer Zelle gegenüber neuronalem Rauschen bestimmen können. Die Ergebnisse der Arbeit lassen auf eine wichtige Rolle der dynamischen Regulierung der Ionenkanäle für die Frequenz-Selektivität und die zeitliche Präzision und Zuverlässigkeit der Spannungsantworten schließen. / The properties of individual neurons are of fundamental importance for the processing of information in the nervous system. The generation of voltage responses to input signals, in particular, depends on the properties of ion channels in the cell membrane. Within this thesis, I employ conductance-based model neurons to investigate the effect of ionic conductances and their dynamics on two aspects of signal processing: frequency-selectivity and temporal precision and reliability of spikes. First, the cell-intrinsic mechanisms that determine frequency selectivity and spike timing reliability are identified on the basis of conductance-based model neurons. Second, it is analyzed how ionic conductances can serve to modulate these mechanisms in order to optimize signal integration. In the first part, the frequency selectivity of subthreshold response amplitudes previously observed for periodic stimuli is proven to extend to nonperiodic stimuli and to translate into firing rates. In the second part, it is demonstrated that spike timing reliability is frequency-selective and that two different stimulus regimes have to be distinguished, depending on whether the stimulus mean is below or above threshold. In both cases, resonance effects determine the most reliable stimulus frequency. It is shown that this frequency preference can be modulated by the peak conductance and dynamics of specific ion channels. In the third part, evidence is provided that ionic conductances determine spike timing reliability beyond changes in the preferred frequency. It is demonstrated that ionic conductances also exert a direct influence on the sensitivity of the timing of spikes to neuronal noise. The findings suggest an important role for dynamic neuromodulation of ion channels with regard to frequency selectivity and spike timing reliability.

Die Langlebigkeit reifer periphärer B Zellen ist abhängig von mindestens zwei Überlebenssignalen, einem tonischen Signal, welches vom B Zellrezeptor ausgeht und dem Zytokin B Zell aktivierender Faktor der TNF-Familie (BAFF). BAFF fördert nicht nur das Überleben von reifen B Zellen, sondern kontrolliert auch deren Funktionstüchtigkeit, indem es vielschichtige physiologische Prozesse wie Zellwachstum und –metabolismus, Energiehaushalt und Eintritt in den Zellzyklus reguliert. Zwei BAFF-induzierte molekulare Mechanismen, zum einen die Aktivierung des Akt Signaltransduktionsweges sowie die erhöhte Expression der onkogenen kinase Pim-2 zum anderen, führen zu Veränderungen in Effektorproteinen welche in der Lage sind diese physiologischen Zellveränderungen auszulösen. Die BAFF-induzierte Aktivierung von Akt hängt von der klassischen Proteinkinase C (PKC) beta ab und sowohl PKC beta-defiziente B Zellen als auch Mäuse zeigen Anzeichen von Unsensitivität gegenüber BAFF-Stimulation. Die Proteintyrosinkinase Syk spielt eine Rolle während der frühen B Zellentwicklung und wird in reifen B Zellen durch Stimulation des B Zellrezeptors aktiviert. Induzierbare Inaktivierung von Syk in Mäusen führt zum Verschwinden reifer B Zellen aus den periphären lymphoiden Organen, was auf eine unverzichtbare Funktion von Syk in der Vermittlung des tonischen B Zellrezeptorsignals schliessen läßt. / The maintenance of mature peripheral B cells depends on at least two survival cues, tonic signaling from the B cell receptor (BCR) complex and the extracellular cytokine B cell activating factor of the TNF family (BAFF). In addition to enhancing viability, BAFF controls the functional efficiency of the peripheral B cell pool by regulating complex physiological processes including cell growth, metabolism, energy homeostasis and entry into the cell cycle. BAFF-mediated induction of two molecular mechanisms, namely activation of the Akt signal transduction pathway and upregulation of the oncogenic kinase Pim-2 results in the modification of effector proteins including transcription factors and regulators of protein synthesis which are capable of executing the observed cellular physiological changes. The classic protein kinase C beta is instrumental in BAFF-induced Akt-activation and PKC beta-deficient B cells and mice show signs of partial refractiveness to BAFF. The protein tyrosine kinase Syk plays a role in early B cell development and is activated in mature B cells by immunogenic BCR-stimulation. Inducible ablation of Syk in mice results in the loss mature B cells from the peripheral lymphoid organs and reveals an indispensable function for Syk in tonic BCR survival signaling.

In der vorliegenden Arbeit wurden einseitig mit Human-Cochlea-Implantat versorgte Meerschweinchen verwendet, die auf dem anderen Ohr normalhörend waren und mit einer einseitig vertäubten, aber nicht elektrostimulierten Kontrollgruppe verglichen wurden. Untersucht wurde der Einfluss von drei unterschiedlichen Stimulationsraten und drei Stimulationsintensitäten während einer einseitigen Elektrostimulation. Dabei wurde zunächst der Einfluss der Elektrostimulation auf die Hörschwellen mittels Hirnstammaudiometrie (ABR) untersucht. Anschließend wurden die Zelldichten in der aufsteigenden Hörbahn (dorsaler Nucleus Cochlearis, Colliculus Inferior, medialer Kniehöcker und auditorischer Cortex) im Hirnschnitt unter Verwendung einer Hämalaun-Eosin Färbung bestimmt. Ein Zusammenhang zwischen der verwendeten Stimulationsrate und den in der zentralen Hörbahn gefundenen Zelldichten wurde ebenso wenig gezeigt wie ein Zusammenhang mit den mittels ABR ermittelten Hörschwellen der normalhörenden Seite. Dagegen wurde jedoch ein Zusammenhang zwischen den in der Elektrostimulation verwendeten Stimulationsintensitäten und den ermittelten Zelldichten festgestellt. Die niedrigste verwendete Stimulationsintensität führte zu einer bilateralen Konservierung der Zelldichten in der gesamten untersuchten Hörbahn, wogegen eine Elektrostimulation mit der höchsten Stimulationsintensität zum Teil einen bilateralen Zellverlust im dorsalen Nucleus Cochlearis, medialen Kniehöcker und im auditorischen Cortex zur Folge hatte. Dieser Zellverlust führte in dem Untersuchungszeitraum nicht zu einer signifikanten Veränderung der Hörschwelle. / In this study, human cochlear implants (CI) were implanted unilaterally in the cochlea of guinea pigs that were normal hearing on the contralateral side. Electro-stimulation was used on the cochlea with the implanted CI. They were compared to an unilaterally implanted but not electro-stimulated control group. This study investigates the effect of three different stimulation-rates and three different stimulation-intensities in unilateral electro-stimulation. The effect of the electro-stimulation on the hearing thresholds was determined using auditory brainstem recordings (ABR). Afterwards, cell densities in the ascending auditory pathway (dorsal cochlear nucleus, inferior colliculus, medial geniculate body and auditory cortex) were measured in brain slices stained with hematoxylin and eosin. No evidence was found of a connection between the different stimulation rates of electro-stimulation in the cochlea with a CI and cell densities seen in the central auditory pathway. Furthermore, there were no links found between hearing thresholds determined by ABR and the different parameters that were used for the electro-stimulation. However a significant effect of the different stimulation intensities on the cell densities identified in the auditory pathway was demonstrated. The lowest intensity used in the electro stimulation led to a bilateral preservation of cell densities in the entire auditory pathway whereas electro-stimulation with the highest intensity induced a significant cell loss in the auditory pathway (dorsal cochlear nucleus, the medial geniculate body and the auditory cortex). Interestingly, this cell loss was not accompanied by significant changes in the auditory threshold.

Aufgrund des wachsenden Interesses an der Systembiologie werden zunehmend mathematische Modelle in Kombination mit Experimenten für die Analyse von Stoffwechselnetzwerken, Genregulationsnetzwerken und zellulären Signalweiterleitungswegen verwendet. Diese Dissertationsschrift benutzt die mathematische Modellierung und kinetische Untersuchungsmethoden zum Studium von zelluären Signalwegen, insbesondere des Netzwerkes zur Festlegung der Rezeptorlokalisation und des Tumorwachstumsfaktor-beta-Signalweges. Ergänzend wurde ein Computerwerkzeug (SBML-PET) entwickelt, das die Modellentwicklung unterstützt und der Parameterschätzung dient. Mit diesem Werkzeug kann man Modelle bearbeiten, die in der Systems Biology Markup Language (SBML) formuliert sind. In dieser Arbeit wird ein quantitatives mathematisches Modell benutzt, um die Signalantwort in unterschiedlichen Rezeptorlokalisationsnetzwerken in Abhängigkeit von der Ligandenanzahl und der Zelldichte zu untersuchen. Die rechnergestützte Analyse des Modells hat ergeben, dass der Zustand eines Rezeptorlokalisationsnetzwerkes potenziell eine sigmoide Abhängigkeit von dem Verhältnis zwischen Ligandenanzahl und Oberflächenrezeptoranzahl pro Zelle zeigen. Dieses Verhältnis ist die entscheidende Kontrollgröße der Signalantwort in Rezeptorlokalisationsnetzwerken. Mit Hilfe des SBML-PET Software-Paketes haben wir eine Modellierungsmethode mit Randbedingungen vorgeschlagen, um ein umfangreiches mathematisches Modell für den Smad-abh?ngigen TGF-beta Signalweg zu erstellen und dessen Parameter aus experimentellen Daten unter Berücksichtigung qualitativer Nebenbedingungen zu fitten. Die Ergebnisse der kinetischen Untersuchung dieses Modells legen nahe, dass die Signalantwort auf einen TGF-beta-Reiz durch die Balance zwischen clathrin-abhängier Endozytose und clathrin-unabhängiger Endozytose reguliert wird. / With growing interests in systems biology, mathematical models, paired with experiments, have been widely used for the studies on metabolic networks, gene regulatory networks and cellular signaling pathways. This dissertation employs the mathematical modeling and kinetic analysis method to study cellular signaling pathways, in particular, the receptor trafficking network and TGF-beta signaling pathway. On the other hand, a systems biology markup language (SBML) based parameter estimation tool (SBML-PET), was developed for facilitating the modeling process. A quantitative mathematical model is employed to investigate signal responses in different receptor trafficking networks by simultaneous perturbations of the ligand concentration and cell density. The computational analysis of the model revealed that receptor trafficking networks have potentially sigmoid responses to the ratio between ligand number and surface receptor number per cell, which is a key factor to control the signaling responses in receptor trafficking networks. Using the SBML-PET software package, we proposed a constraint-based modeling method to build a comprehensive mathematical model for the Smad dependent TGF-beta signaling pathway by fitting the experimental data and incorporating the qualitative constraints from the experimental analysis. Kinetic analysis results indicate that the signal response to TGF-beta is regulated by the balance between clathrin dependent endocytosis and non-clathrin mediated endocytosis.

Die Untersuchung kausaler Zusammenhänge in komplexen dynamischen Systemen spielt in der Wissenschaft eine immer wichtigere Rolle. Ziel dieses aktuellen, interdisziplinären Forschungsbereiches ist ein grundlegendes, tiefes Verständnis der vorherrschenden Prozesse und deren Wechselwirkungen in solchen Systemen. Die Untersuchung von Zeitreihen mithilfe moderner Kopplungsanalysemethoden liefert dabei Möglichkeiten zur Modellierung der betreffenden Systeme und somit bessere Vorhersagemethoden und fortgeschrittene Interpretationsmöglichkeiten der Ergebnisse. In der vorliegenden Arbeit werden zunächst einige existierende Kopplungsmaße mit ihren jeweiligen Anwendungsgebieten vorgestellt. Eine Gemeinsamkeit dieser Maße liegt in der Voraussetzung stationärer Zeitreihen, um die Anwendbarkeit zu gewährleisten. Daher wird im Verlauf der Dissertation eine Möglichkeit zur Erweiterung solcher Maße vorgestellt, die eine Kopplungsanalyse mit einer sehr hohen Zeitauflösung und somit auch die Untersuchung nichtstationärer, transienter Ereignisse ermöglicht. Die Erweiterung basiert auf der Verwendung von Ensembles von Messreihen und der Schätzung der jeweiligen Maße über das Ensemble anstatt über die Zeit. Dies ermöglicht eine Zeitauflösung bei der Analyse in der Größenordnung der Abtastrate des ursprünglichen Signals, die nur von der Art der verwendeten Kopplungsmaße abhängt. Der Ensemble-Ansatz wird auf verschiedene Kopplungsmaße angewandt. Zunächst werden die Methoden ausführlich an verschiedenen theoretischen Modellen und unter verschiedenen Bedingungen getestet. Anschließend erfolgt eine zeitaufgelöste Kopplungsanalyse kardiovaskulärer Zeitreihen, die während transienter Ereignisse aufgenommen wurden. Die Ergebnisse dieser Analyse bestätigen zum einen aktuelle Studienresultate, liefern aber auch neue Erkenntnisse, die es in Zukunft ermöglichen können, Modelle des Herz-Kreislauf-Systems zu erweitern und zu verbessern. / The analysis of causal relationships in complex dynamic systems plays a more and more important role in various scientific fields. The aim of this current, interdisciplinary field of research is a fundamental, deep understanding of predominant processes and their interactions in such systems. The study of time series using modern coupling analysis tools allows the modelling of the respective systems and thus better prediction methods and advanced interpretation possibilities for the results. In this work, initially some existing coupling measures and their fields of application are introduced. One trait these measures have in common is the requirement of stationary time series to ensure their applicability. Therefore, in the course of this thesis a possibility to extend these measures is presented, which allows a coupling analysis with a high temporal resolution and thus also the analysis of transient, nonstationary events. The extension is based on the use of ensembles of time series and the calculation of the respective measures across these ensembles instead of across time. This allows for a temporal resolution of the same order of magnitude as the sampling rate in the original signal. The resolution only depends on the kind of coupling analysis method employed. The ensemble extension is applied to different coupling measures. To begin with, the regarded tools are tested on various theoretical models and under different conditions. This is followed by a coupling analysis of cardiovascular time series recorded during transient events. The results on the one hand confirm topical study outcomes and on the other hand deliver new insights, which will allow to extend and improve cardiovascular system models in the future.

Die muskelspezifischen RING-Finger Ubiquitin E3 Ligasen MuRF1, MuRF2 und MuRF3 werden mit verschiedenen zellulären Prozessen in Verbindung gebracht. MuRF1 und MuRF3 beteiligen sich am Abbau mehrerer Muskelstrukturproteine über das Ubiquitin Proteasom System (UPS) und spielen somit eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Skelett- und Herzmuskelstruktur und -funktion. MuRF1 wurde als Atrophie-Marker identifiziert, da seine Expression während der Muskelatrophie ansteigt, und MuRF2 und MuRF3 wirken bei der Stabilisierung von Mikrotubuli und Differenzierung von Myozyten mit. Dennoch sind bisher viele Aspekte der Funktion von MuRF-Proteinen ungeklärt. Die Domänenstruktur der MuRF-Proteine zeigt mehrere hochkonservierte Domänen, die sich an Protein-Protein Interaktionen beteiligen. Die Identifizierung und Charakterisierung ihres Interaktoms ermöglicht ein besseres Verständnis ihrer Funktionen. Aus diesem Grund wurden quantitative massenspektrometrische Analysen durchgeführt, um neue Interaktionspartner und Substrate für MuRF1, 2 und 3 zu identifizieren. Sorting nexin 5 (SNX5), eine Untereinheit des Retromers in Säugetieren, wurde als Interaktionspartner von MuRF3 identifiziert. SNX5, das eine wichtige Rolle in subzellulären Transport-Signalwegen spielt, interagierte über seine BAR-Domäne mit MuRF3. SNX5 und MuRF3 co-lokalisierten und assoziierten mit vesikulären Strukturen des subzellulären Transport-Signalweges. SNX5 wurde außerdem als Substrat von MuRF2 identifiziert. MuRF2 band und ubiquitinierte SNX5 in vivo und vermittelte damit dessen Abbau über das UPS. MuRF3 stabilisierte SNX5 durch die Inhibierung dieses Abbaus. Somit konnten MuRF2 und MuRF3 mit einem in subzellulärem Transport aktiven Protein in Verbindung gebracht werden, das direkt mit Mikrotubuli assoziiert und funktionell von einem stabilen Mikrotubuli-Netzwerk abhängig ist. Dies legt eine mögliche regulatorische Rolle von MuRF2 und MuRF3 in Mikrotubuli-abhängigen subzellulären Transportwegen nahe. / Muscle specific RING-Finger ubiquitin E3 ligases MuRF1, MuRF2 and MuRF3 have been implicated in several cellular functions. MuRF1 and MuRF3 have been shown to bind and degrade muscle contractile and structural proteins via the ubiquitin proteasome system (UPS), thus playing an important role in the maintenance of skeletal and cardiac muscle structure and function. MuRF1 is considered an atrophy marker since its expression increases during muscle atrophy. MuRF2 and MuRF3 are involved in myocyte differentiation and both bind to and stabilize microtubules. Nevertheless, many aspects of the functions of the MuRF-family are unknown. The domain structure of the MuRF family implicates several highly conserved domains involved in protein-protein interaction. Accordingly, one way to better understand the role of MuRF proteins in myocyte function and protein homeostasis is to identify and characterize their interactome. Therefore, quantitative mass spectrometric analysis was used to identify novel interaction partners and target proteins of MuRF1, 2 and 3. Sorting nexin 5 (SNX5), a mammalian retromer subunit which plays an important role in subcellular trafficking pathways, was identified as a novel interaction partner of MuRF3, with which it interacted via its Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR)-domain. SNX5 and MuRF3 co-localized and associated with early endosomes, connecting the microtubule-binding MuRF3 to structures of subcellular trafficking pathway. SNX5 was also identified as a substrate of MuRF2, which interacted with and ubiquitinated SNX5 in vivo, mediating its degradation in a UPS-dependent manner. This MuRF2-mediated degradation was inhibited by MuRF3, which stabilized SNX5. Thus, MuRF2 and MuRF3 were linked to a subcellular trafficking protein, SNX5, which is directly associated with microtubules and functionally dependent on a stable microtubule network, suggesting a possible regulatory role of MuRF2 and MuRF3 in microtubule-dependent subcellular trafficking pathways.

Die Erkrankungen des atopischen Formenkreises sind durch eine hypererge Immunreaktion auf harmlose Umwelt-Antigene gekennzeichnet und umfassen u.a. die klinischen Bilder der allergischen Rhinokonjunktivitis, des allergischen Asthmas und der atopischen Dermatitis. Die Pathogenese atopischer Krankheiten ist zwar noch nicht hinreichend aufgeklärt, aber man schreibt der Regulation des IgE bei der Entstehung und Erhaltung dieser Krankheiten eine zentrale Rolle zu. Auf der Suche nach potentiellen anti-allergischen Therapeutika wurde in dieser Arbeit erstmalig der Einfluß von 1alpha,25-Dihydroxyvitamin-D3 (VD) und dem niedrigkalzämischen Derivat EB1089 in vitro auf die IgE-Produktion humaner B-Zellen gesunder Spender untersucht, die zuvor mit anti-CD40+IL-4 stimuliert wurden, wodurch der Isotypenklassenwechsel nativer B-Zellen nach IgE resultierte. Das Steroidhormon VD ist für die Kalziumhämostase essentiell, jedoch sind die immunregulatorischen Funktionen des VD noch relativ unerforscht. Die Experimente dieser Arbeit zeigen eine starke, dosisabhängige Hemmung der IgE-Produktion in diesem Modell, die spezifisch von VD und dem Derivat EB1089 vermittelt wird. Auch bei PBMC atopischer Spender konnte die basale IgE-Produktion mit VD dosisabhängig signifikant gehemmt werden. Eine mögliche Proliferationshemmung, die diese Wirkung erklären könnte, konnte ausgeschlossen werden. Die Messung der Produktion der anderen Immunglobulinklassen (Ig) IgA, IgG und IgM bestätigte, daß die Zellviabilität und die Ig-Produktion außer der von IgE durch VD und EB1089 in diesem Modell nur wenig beeinflußt wird. Diese Beobachtungen weisen auf eine selektive, spezifische Inhibition der IgE-Synthese durch das Molekül aus der Familie der Steroidhormone hin. Auf der Suche nach möglichen indirekten Mechanismen der IgE-Regulation, die die VD-vermittelte Inhibition der IgE-Synthese erklären könnten, wurde der Einfluß von VD auf die Expression der kostimulatorischen Faktoren der IgE-Produktion CD23 (Fc(-RII), CD54 (ICAM-1) und CD86 (B7.2) sowie auf die Sekretion der Zytokine, IL-6, sCD23 und IFN-gamma untersucht. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuteten jedoch nicht auf eine Beteiligung der genannten Faktoren an der Regulation der VD-vermittelten Hemmung der IgE-Produktion hin. Diese in vitro Arbeit stellt einen wichtigen Hinweis auf eine potentielle Nutzung von VD in der anti-allergischen Therapie dar, jedoch deutet die beobachtete Hemmung der IgE-Synthese von PBMC atopischer Spender darauf hin, daß auch in vivo die IgE-Synthese gehemmt werden kann. Es sind daher weitere Studien des Signalweges des VD auf molekularer Ebene, sowie in vivo Versuche notwendig, um zu klären, ob VD selbst oder ein möglichst nicht-kalzitropes VD-Derivat mit ausgeprägten immunologischen Eigenschaften für die anti-allergische Therapie geeignet ist. / Atopic diseases are characterized by a hyperergic immunoreaction towards harmless environmental antigens, expressed by the clinical phenotype of allergic rhinitis, allergic asthma and atopic dermatitis. Even though the pathogenesis of atopic diseases are not completely clear, the regulation of IgE plays a crucial role in the development and maintenance of these disorders. In search of new potentially anti-allergic drugs, the effect of 1alpha,25-Dihydroxyvitamin-D3 (VD) and the low-calcemic synthetic analogue EB1089 was determined in anti-CD40+Il-4-mediated IgE-production by B-cells of healthy donors in vitro. The essential role of VD in calcium hemostasis is well understood, but the immunoregulatory functions of the hormone are still quite unclear. The present data show for the first time, that VD and the analogue EB1089 mediate a strong, dose-dependent inhibition of IgE-synthesis. In PBMC of atopic donors, the baseline IgE-production was also significantly inhibited by VD. Anti-CD40+IL-4-mediated proliferation of B-cells in the presence of VD was only modestly modulated, as well as the production of the other immunoglobulin-isotypes IgA, IgG and IgM. Taken together these data suggest a specific and selective inhibition of IgE-synthesis by VD and EB1089. In order to explore possible mechanisms of VD induced IgE-inibition, the expression of CD23 (Fc(-RII), CD54 (ICAM-1) and CD86 (B7.2) on anti-CD+IL-4 stimulated B-cells was determined as well as IL-6, sCD23 und IFN-gamma. However, none of these molecules were significantly modulated in the presence of VD. Taken together, these in vitro experiments suggest a potential role of VD as a new anti-allergic drug, which is underlined by the observed inhibition of IgE-production by PBMC in allergic donors.

Die Semaphorine Sema3A und Sema3C sowie Netrin-1 und deren Rezeptoren, die Neuropiline und DCC wurden in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich ihrer Expression und auf ihre funktionellen Eigenschaften bezüglich des Auswachsens von Axonen, die die intrinsischen und afferenten hippokampalen Projektionen bilden, untersucht. Während die Expressionsmuster von Sema3A schon gut bekannt waren, wurde in der hier vorliegenden Arbeit die Expression des Rezeptors von Sema3A, Neuropilin-1 (NP-1), untersucht. NP-1 wird von Embryonaltag E17 an im entorhinalen Kortex, dem Subiculum und der hippokampalen Anlage exprimiert. Es konnte eine starke postnatale Expression von NP-1 in der CA3-Region und eine schwächere Expression in der CA1-Region, dem Gyrus dentatus und dem entorhinalen Kortex gezeigt werden. Außerdem wurden in dieser Arbeit die Expressionsmuster von Sema3C und Neuropilin-2 (NP-2) genauer analysiert. Etwa zum Zeitpunkt der Geburt (P0) wurde Sema3C im Gyrus dentatus und in der Cornu ammonis Region exprimiert. Der Sema3C-Rezeptor Neuropilin-2 wurde zu diesem Zeitpunkt ebenso im Gyrus dentatus und CA3-Region, schwächer auch in der CA1-Region exprimiert. Es wurde keine Expression dieser beiden Faktoren im entorhinalen Kortex detektiert. In Kokulturstudien zwischen mit Sema3A bzw. Sema3C transfizierten Zellaggregaten und Explantaten aus den hippokampalen Subregionen wurden für spezifische Explantate ein funktioneller Zusammenhang zwischen der Sekretion der Semaphorine und dem Auswachsen der jeweiligen Explantate in einer drei-dimensionalen Kollagenmatrix deutlich. Sema3A besitzt repulsive Eigenschaften auf Explantate vom Gyrus dentatus, der CA1- und der CA3-Region sowie dem entorhinalen Kortex. Die Interaktion zwischen Sema3A und NP1 beeinflußt das Einwachsen bzw. die Terminierung entorhinaler Fasern in der Molekularschicht des Gyrus dentatus, indem Sema3A eine repulsive Barriere für einwachsende Fasern und Moosfasern, die in Richtung der CA3-Region auswachsen, darstellt. Sema3C besitzt repulsive Eigenschaften auf Fasern des medialen Septums und beeinflußt dadurch das Einwachsen dieser Fasern entlang der Cornu ammonis Region in den Hippokampus. Weiterhin wurden in dieser Arbeit die Expressionsmuster von Netrin-1 und DCC im Hippokampus sowie die funktionellen Eigenschaften von Netrin-1 untersucht. Netrin-1 wird bereits zum Zeitpunkt E17 im Neokortex exprimiert, konnte im Hippokampus jedoch erst ab dem postnatalen Entwicklungsstadium P1 detektiert werden. Während im Gyrus dentatus nur ein schwaches und im entorhinalen Kortex kein Signal gefunden werden konnte, wird Netrin-1 stark in der Cornu ammonis Region exprimiert. Der Rezeptor DCC wird dagegen schon früher in der Embryonalentwicklung, ab E15, diffus in der hippokampalen Anlage exprimiert. Ab P1 lassen sich diese Signale im Gyrus dentatus und in den CA1-CA3-Regionen unterscheiden. Von den untersuchten Explantaten der hippokampalen Region zeigte Netrin-1 nur auf die Fasern von Gyrus dentatus und CA3, welche die hippokampale Kommissur bilden, einen attraktiven Wachstumseffekt. Dies bestätigt Befunde aus Netrin-1- und DCC-defizienten Tieren, in denen die hippokampale Kommissur aufgrund des fehlenden axonalen Leitmoleküls bzw. seines Rezeptors nicht ausgebildet wird. / In this work, the semaphorins Sema3A and Sema3C as well as Netrin-1 and their receptors, the neuropilins and DCC, were investigated regarding their expression and functional properties on outgrowing axons, which are forming the intrinsic and afferent hippocampal projections. Because of the already well known expression patterns of Sema3A, this work focused on the expression of the receptor of Sema3A, NP-1. From embryonic stage E17 on, NP-1 is expressed in the entorhinal cortex, the subiculum and the hippocampal Anlage. A strong postnatal expression of NP-1 in the CA3-region could be detected, while the expression pattern in the CA1-region, the dentate gyrus and the entorhinal cortex was weaker. Additionally, the expression patterns of Sema3C and NP-2 were investigated in greater detail. At birth (P0), Sema3C was expressed in the dentate gyrus and the cornu ammonis region. The expression of its receptor NP-2 could be detected at the same timepoint P0 in the dentate gyrus and the CA3-region and, less pronounced, in the CA1-region.There could not be detected any expression of Sema3C or NP-2 in the entorhinal cortex. In functional coculture studies between with Sema3A or Sema3C transfected cell clusters and neuronal explants from subregions of the hippocampal formation, these factors were investigated for their influence on axonal outgrowth within a three-dimensional collagen gel matrix. Sema3A has repulsive properties on explants from the dentate gyrus, the CA1- and CA3- regions and the entorhinal cortex. I the resulting model, the interaction between Sema3A and NP-1 influences the ingrowth and/or the termination of entorhinal fibers into the molecular layer of the dentate gyrus by a repulsive barrier formed by Sema3A. The same barrier also acts on mossy fibers to allow them to grow only in direction of the CA3-region. Sema3C has repulsive properties on fibers from the medial septum and shapes the ingrowth of these fibers along the cornu ammonis region into the hippocampus. Additionally, the expression patterns of Netrin-1 and DCC and their functional properties in the hippocampus were investigated. Netrin-1 is already expressed in the cortex at E17, although the onset of expression in the hippocampus is at P1. In the dentate gyrus, a weak signal could be detected, but no signal was found in the entorhinal cortex. In the cornu ammonis region, however, Netrin-1 showed a strong expression signal. The Netrin-1 receptor DCC could be detected as early as E15 with a diffuse distribution in the hippocampal Anlage. From P1 on, these signals could be distinguished in the dentate gyrus and the CA1-CA3-regions. Netrin-1 showed attractive properties only on fibers from explants of the dentate gyrus and the CA3-region, which form the hippocampal commissure. These results confirm previous findings from Netrin-1 and DCC deficient animals in which the absence of the hippocampal commissure was described.