Ein vielversprechender Ansatz zur Verhinderung von Infektionen mit Influenzavirus ist die kompetitive Inhibition der Virusanhaftung an die Wirtszellen durch Behinderung der Bindung des viralen Hemagglutinin (HA) an sialylierte Glykanrezeptoren. Allerdings erschwert die hohe Variabilität des HA die Entwicklung von universellen Sialinsäure (SA)-basierten Virostatika. In dieser Arbeit wurde der antivirale Effekt von mit SA funktionalisierten Polyglycerolen (PGs) auf Influenza A Viren (IAV) evaluiert. SA-basierte PGs waren nur bei der Inhibition einer geringen Anzahl an IAV Stämmen effektiv. Um die molekulare Basis für diese Beschränkung zu ergründen, wurden mittels Serienpassagen IAV Mutanten selektiert, die gegen sialyliertes PG resistent waren. Es entwickelten sich drei unabhängige resistente Virusvarianten, die einen einfachen bzw. doppelten Aminosäuren-Austausch in der HA RBS aufwiesen. Durch Hemagglutinations-Elution, Einzel-Virus Kraft-Untersuchungen und Glykanarray Analysen konnte eine verringerte Rezeptorbindungsstabilität sowie ein verändertes Rezeptorbindeprofil für diese Virusvarianten gezeigt werden. Interessanterweise wurden drei unterschiedliche Fälle von Virusbindung und Inhibition beobachtet: 1) Virales HA wurde vom PG gebunden und die Virusreplikation inhibiert, 2) virales HA wurde vom PG gebunden ohne Inhibition der Virusreplikation und 3) Virales HA wurde nicht vom PG gebunden und es gab keine Inhibition. Diese Ergebnisse suggerieren, dass es eine Mindestanforderung an die Affinität oder Avidität für eine effektive kompetitive Inhibition von HA gibt. Durch modifizierte PGs, die Sialyllaktose statt SA und einen Amidlinker enthielten, konnte das Potential von PGs als breite IAV Inhibitoren demonstriert werden. Zusammenfassend bieten die Ergebnisse dieser Arbeit wertvolle Einblicke in die Entwicklung von Resistenzen in IAV gegen Inhibitoren des HA-Attachment und in das strategische Design von sialylierten mutlivalenten Inhibitoren gegen IAV. / A promising approach to block influenza virus infections is competitive inhibition of virus attachment to host cells by interfering with binding of the viral surface protein hemagglutinin (HA) to sialylated glycan receptors. However, the high structural and genetic variability of the viral HA has hampered the development of universal sialic acid (SA)-based antivirals. Here, the antiviral effect of biocompatible Polyglycerols (PGs) functionalized with SA on influenza A virus (IAV) was evaluated. PG compounds were only effective at inhibiting a narrow spectrum of IAV strains. To elucidate the molecular basis for this restriction, PG-resistant IAV mutants were selected using serial passaging. Three independent resistant variants developed with single or double amino acid changes mapping to the HA RBS. By employing hemagglutination elution, single-virus force measurements and glycan array analyses, a reduced receptor binding stability as well as an altered receptor binding profile of mutant viruses was shown. Intriguingly, three different cases of virus binding and inhibition were observed using Cy3-labeled compound: 1) viral HA was bound by the compound and resulted in inhibition of replication, 2) viral HA was bound by the compound but replication was not inhibited and 3) viral HA was not bound by the compound and no inhibition occurred. These results suggest that there is an affinity or avidity requirement for effective competitive inhibition of HA attachment. The suitability of PGs as IAV inhibitors with potential for broad activity was demonstrated by a modified PG incorporating sialyllactose instead of SA and an amide linkage covering an extended spectrum of inhibited IAV strains. Taken together, results described in this thesis provide valuable insights into the development of resistance against inhibitors of HA attachment in IAV and into the strategic design of sialylated, multivalent inhibitors aiming at broad activity against influenza viruses.

Morbus Whipple (MW) ist eine chronische multisystemische Infektionskrankheit, die durch das Bakterium Tropheryma whipplei verursacht wird. Während asymptomatische Trägerschaften und selbst-limitierende Infektionen mit T. whipplei häufig vorkommen, ist die chronische Manifestation des MW sehr selten. Die geringe Inzidenz des MW bei ubiquitärer Verbreitung der Erreger deutet auf eine Assoziation mit prädisponierenden Faktoren bei der Entstehung der Erkrankung hin. Die zugrundeliegenden Faktoren und Mechanismen der Manifestation sind nicht ausreichend geklärt, sodass die vorliegende Arbeit die T-Zell-Reaktivität auf die Antigenpräsentation sowie die Interaktion von T. whipplei mit peripheren monozytären Zellen (PBMC) in vitro analysierte. Hierbei wiesen allogene PBMC von MW-Patienten bei produktiver Präsentation des T. whipplei GrpE Antigens über den MHC-I-Komplex einen vermehrten Anteil Perforin+ CD8+ T-Zellen auf. Die Interferon-g Produktion zeigte sich nach optimierter GrpE Präsentation mit gesunden Kontrollen vergleichbar, wodurch erstmalig nachgewiesen wurde, dass die verminderte T-Zell-Reaktion in MW-Patienten auf eine Dysfunktion im Zuge der Antigenpräsentation zurückzuführen ist. Die Infektion in vitro differenzierter Makrophagen mit vitalen T. whipplei resultierte in einer Reduktion der HLA-DR und CC-18 Expression. Stimulationen mit Bakterienlysat und -überstand induzierten keine phänotypischen Änderungen, wodurch die Hypothese einer aktiven Immunmodulation durch T. whipplei gestützt wurde. Transkriptomanalysen führten zur Identifikation von 105 Kandidaten-Gene, die die chronische Manifestation des MW bedingen könnten. Die klinische Relevanz der Gene ist in weiteren Studien zu prüfen, ebenso wie die Bedeutung CD14+ depletierter Zellen für die Pathogenese des MW. Diese gelangten im Zuge einer prospektiven Pilotstudie erstmalig in den Fokus und deuten darauf hin, dass neben Monozyten weitere Zellen in die systemische Verbreitung von T. whipplei involviert sind. / Whipple’s disease (WD) is a chronic systemic infection with the ubiquitous bacterium Tropheryma whipplei. Whereas self-limiting infections with T. whipplei occur frequently and lead to a protective immunity, a chronic manifestation of WD is rare and seems to be associated with predisposing immunological factors. These underlying factors have not yet been sufficiently understood. The present work analysed T cell reactivity against T. whipplei antigens and interaction of the pathogen with peripheral blood mononuclear cells in vitro. Upon stimulation with bacterial lysate, recombinant GrpE or Hsp70 of T. whipplei, the proportions of activated CD4+ and CD8+ T cells were significantly lower in WD-patients as compared to healthy controls. Productive presentation of GrpE antigens via the MHC-I complex resulted in an increase of perforin+ CD8+ T-cells in WD-patients. The proportion of interferon-gamma+ CD8+ T cells was comparable to healthy controls, thus demonstrating that the reduced T cell response in WD-patients is not due to a T cell defect, but to a dysfunction in antigen presentation. T. whipplei infection of in vitro differentiated macrophages significantly reduced the expression of HLA-DR and CC-18 in WD-patients and controls, whereas bacterial lysate and bacterial supernatant did not induce phenotypic changes. These findings supported the hypothesis of an active immunomodulation by T. whipplei, resulting in reduced antigen presentation and enabling intracellular persistence. Microarray based transcriptome analysis identified 105 candidate genes that may be related to the chronic manifestation of WD. Clinical relevance of these genes has to be examined in further studies, as well as the importance of CD14+ depleted cells for the pathogenesis of WD. The detection of bacterial DNA in CD14+ depleted cells in the course of a prospective pilot study indicated that, in addition to monocytes, other cells are involved in the systemic distribution of T. whipplei.

Malaria ist eine Krankheit, die durch den Protozoen Plasmodium verursacht und von Anopheles Moskitos durch infektiöse Stiche übertragen wird. Diese ̈Übertragung kann durch verschiedene Interventionsstrategien blockiert werden. Eine relativ neue Strategie, die bisher nur im Labor getestet wurde, ist der Einsatz genetisch veränderter Moskitos, die den Parasiten nicht auf einen neuen menschlichen Wirt übertragen können. Ein Ansatz ist die Entwicklung von Moskitos, die mit murinen Antikoepern ausgestattet sind, die gegen relevante Oberflächenproteine des Parasiten, dem Circumsporozoite Protein (CSP) gerichtet sind. Es ist jedoch nach wie vor unklar, welches Entwicklungsstadium angegriffen werden soll und welche Antikörper für diesen Ansatz effizient sind. Hier zeige ich, dass in Stechmücken, die mit einem humanen Anti-CSP-Antikörper ausgestattet sind, die Sporogonie der Oozysten in Abhängigkeit von der Parasiten-dichte blockiert wird und somit die Sporozoitenlast in den Mücken signifikant verringern. Insbesondere Antikörper, die sich an die ’Repeat Region’ des CSP binden, können die Sporozoitenlast in der Stechmücke verringern. Des Weitern, zeigen diese Stechmücken kaum Defekte in der Entwicklung und im Überleben. Diese Ergebnisse bestätigen die zuvor beschriebene Bedeutung von CSP während der Sporogonie und unterstreichen die Effizienz von humanen, ’Repeat Region’ bindenden Anti-CSP-Antikörpern bei der Beeinträchtigung der Parasitenentwicklung in dem Vektor. Darüber hinaus ist in Stechmücken, die mit humanen Anti-CSP Antikörpern ausgestattet sind, die Entwicklung von Sporozoiten teils limitiert und teils komplett verhindert. Dies macht sie zu einem vielversprechenden Instrument für Maßnahmen zum Malaria Kontrolle. In dieser Arbeit habe ich weitere Einblicke in den Mechanismus , durch den Anti-CSP-Antikörper die Parasitenentwicklung in der Mücke stören, und gezeigt, dass Oozysten ein effizientes Ziel für diesen Ansatz sind. / Malaria is a disease caused by the protozoan parasite Plasmodium and transmitted by Anopheles mosquitoes trough infectious bites, these transmission events can potentially be blocked by different intervention strategies. A relatively new strategy which has been only tested in the laboratory is the use of genetically modified mosquitoes unable to transmit the parasite to a new human host. In the past, murine derived antibodies directed against relevant parasite surface proteins were used with limited success. It remains unclear which developmental stage is targeted, and which antibodies are useful. Here, I show that in mosquitoes equipped with a human derived anti-CSP repeat binding antibody, oocyst sporogony is blocked in a parasite density dependent manner. Only repeat binding antibodies could decrease sporozoite loads in the mosquito. These results confirm the previously described importance of CSP during sporogony and highlight the efficiency of human derived repeat binding anti-CSP antibodies in interfering with parasite development even in a different host. Additionally, mosquitoes equipped with human derived anti-CSP antibodies show little (in high density infections) to no (in low density infections) sporogonic development, making them a promising tool for malaria transmission blocking interventions. I provided additional insights into the mechanism by which anti-CSP antibodies interfere with parasite development in the mosquito showing that oocysts are an efficient target for this approach. Therefore, the mosquitoes used here are potentially resistant in a more natural setting. Additionally, I provided a new tool allowing a faster screening of antibodies in a mosquito context by injection of single chain Fabs into the mosquito hemolymph. Taken together, this approach could one day give rise to alternative strategies in tackling malaria transmissions.

Bisher gibt es keine effektive Impfung gegen Malaria und der beste immunologische Schutz wird durch wiederholte intravenöse Injektion von nicht-vermehrungsfähigen Sporozoiten erreicht. Im Gegensatz dazu bietet die Infektion im Blutstadium nur eine Teilimmunität gegen schwere Verläufe der Krankheit. Um beide Prozesse besser zu verstehen, ist eine tiefgehende Untersuchung der Reaktion des angeborenen Immunsystems auf Sporozoiten, sowie Parasiten im Blutstadium erforderlich. Erkenntnisse hieraus können dabei helfen, die Überlegenheit des Sporozoiten-Impfstoffs zu verstehen und, letztendlich, seine Wirksamkeit in einem sichereren, kostengünstigeren und skalierbaren Impfstoff zu rekapitulieren. Um sterile Sporozoiten aus Mückenprärationen für in-vitro experimente zu gewinnen, wurden die Parasiten FACS sortiert und anschließend mit Makrophagen co-kultivert. RNA Sequenzierung der Makrophagen, zeigte ein von Sporozoiten induziertes Expressionsprofil, das durch die Expression von inflammatorischen Genen gekennzeichnet ist. Insbesondere CD201 wurde auf Makrophagen stark hochreguliert und könnte eine Rolle bei der gamma-delta T-Zell-Aktivierung spielen. Darüber hinaus kann gezeigt werden, dass die Aktivierung von Makrophagen durch Sporozoiten teilweise von TLR2 und MyD88 abhängig ist. Interessanterweise waren die genetischen Signaturen „Reaktion auf Verwundung" und „Makroautophagie" in Makrophagen überrepräsentiert die mit Sporozoiten co-kultiviert wurden und sind wahrscheinlich Folgen von aktiver Sporozoiten-Traversierung durch Makrophagen. In der Tat zeigten Mäuse, die mit Traversierungs-defizienten Sporozoiten geimpft wurden stark reduzierte CD8 T-Zell Antworten. Dies deutet auf eine mögliche Rolle der Zelltraversion bei der Induktion effektiver adaptiver Immunantworten hin. Insgesamt tragen diese Ergebnisse zu dem Verständnis der angeborenen Immunantwort auf Plasmodium-Parasiten bei und bieten weitere Möglichkeiten zur zukünftigen Forschung. / Effective vaccination against malaria remains a critical element in the effort to eradicate the disease. So far, best protection is induced by repeated intravenous injection of irradiated, non-replicating sporozoites. In contrast, blood stage infection only affords semi-immunity after several disease episodes are endured. Therefore, in-depth analyses of innate immune responses to sporozoite and blood stage parasites are needed to understand the superiority of the attenuated sporozoite vaccine and ultimately, to recapitulate its efficacy in a safer, cheaper and more practical vaccine. To probe sporozoite-induced innate cell activation, parasites were flow sorted from salivary gland extracts. In a reductionist system, sorted P. berghei sporozoites were co-cultured with primary mouse macrophages. Transcriptomic analysis of sporozoite-experienced macrophages revealed a distinct expression profile characterized by NF-κB driven expression of inflammatory mediators. In particular, CD201, a CD1d-like transmembrane receptor with lipid presentation capabilities, was strongly upregulated on macrophages and might play a role in gamma-delta T-cell activation. In addition, first evidence is provided that macrophage activation by sporozoites is partly dependent on TLR2 and MyD88. Intriguingly, ‘response to wounding’ and ‘macroautophagy’ signatures were enriched in sporozoite-stimulated macrophages and are likely consequences of active sporozoite traversal through innate cells. Indeed, in vivo vaccination with spect1 knockout sporozoites, which are deficient in cell traversal, induced a defective CD8 T-cell response, showcasing a potential role for cell traversal in the induction of effective adaptive responses. Taken together, these findings open up several interesting avenues for future research which will paint a clearer picture of innate immune responses to Plasmodium parasites.

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Bei neun von vierzehn Serogruppen der Subspezies E. coli Flexneri (SF) konnte ein pHS-2-Plasmid nachgewiesen werden. Es besteht eine positive Korrelation zwischen pHS-2-positiven SF und dem Auftreten einer Reaktiven Arthritis, eine Komplikation der bakteriellen Ruhr. Verschiedene Autoren führen das gehäufte Auftreten der Reaktiven Arthritis bei pHS-2-positiven SF auf eine erhöhte Serumresistenz zurück, die den Bakterien durch das cld(pHS-2)-Gen vermittelt wird. Das cld(pHS-2)-Gen als längstes aller 18 "open reading frames" auf dem pHS-2-Plasmid kodiert für ein 35 kD großes Protein, das aufgrund seiner Funktion als "chain length determinant" (Cld(pHS-2)) bezeichnet wurde. Cld(pHS-2) ist maßgeblich an der Produktion von Lipopolysacchariden vom VL-Typ beteiligt. LPS vom VL-Typ produzieren O-Seitenketten mit mehr als 70 bis 80 Oligosaccharideinheiten und sollen die bakterielle Membran vor einer Komplementbindung und Serum-Antikörpern schützen, wodurch den Bakterien eine erhöhte Serumresistenz vermittelt werde. In dieser Arbeit wurde cld(pHS-2) in einen pHS-2-negativen Stamm der SF Serogruppe 6 integriert, um nachzuweisen, dass cld(pHS-2) das LPS-Muster pHS-2-negativer SF in charakteristischer Weise modifiziert. Während der Expressionsnachweis von cld(pHS-2) als Einzelprotein misslang, war eine Expression von cld(pHS-2) als Fusionsprotein in SF Serogruppe 6 erfolgreich. Im Vergleich zu pHS-2-negativen SF war unsere SF Serogruppe 6-Mutante nun in der Lage, LPS vom VL-Typ in Form einer zusätzlichen Bande mit ca. 80 Oligosaccharideinheiten zu produzieren. Diese phänotypische Veränderung war zwar nur gering ausgeprägt, konnte jedoch den spezifischen Einfluss von cld(pHS-2) als Fusionsprotein auf das LPS-Muster pHS-2-negativer SF nachweisen. / In nine out of fourteen serogroups of E. Coli Flexneri (SF) a pHS-2 plasmid has been isolated. There is a positive correlation between pHS-2-positive SF and the occurence of reactive arthritis (ReA) which is a complication of bacterial dysentery. Different authors reduce the widespread appearance of ReA by pHS-2-positive SF to an increased serum resistance caused by a cld(pHS-2)-gene. The cld(pHS-2)-gene ist the longest of 18 open reading frames in pHS-2 and it is the coding for a 35 kD protein which has been identified as a chain length determinant because of its function. Cld(pHS-2) plays a decisive role in the production of lipopolysaccharides (LPS) of the VL-type. LPS of the VL-type produce O antigen with more than 70-80 repeat units, and protect the bacterial outer membrane from complement factors and serum antibodies by a higher serum resistance. In this research the cld(pHS-2)-gene was integrated in a pHS-2-negative SF serogroup 6 to prove that cld(pHS-2) is able to modify the LPS pattern (destribution) of pHS-2-negative SF in a characteristic manner. The expression of cld(pHS-2) in SF serogroup 6 as an isolated protein failed, but the expression of cld(pHS-2) as a fusion protein was successful. In contrast to the pHS-2-negative SF our SF serogroup 6 mutant was able to produce LPS of the VL-type with 80-90 repeat units. Despite the slight effect, a specific influence of cld(pHS-2) as a fusion protein on LPS pattern and the bacterial phaenotype has to be confirmed.

Leishmania infantum ist für einen beträchtlichen Teil der viszeralen Leishmaniosen weltweit verantwortlich. Die allgemein anerkannte Methode zu Klassifizierung wie auch zur Identifizierung von Leishmanien ist die Isoenzymanalyse. Speziell für L. infantum reicht das Auflösungsvermögen dieser Methodik allerdings nicht aus, da mehr als 80 % der analysierten Stämme dem prädominanten Zymodem MON-1 angehören. In dieser Arbeit wurden Primerpaare für die Amplifikation von 15 unabhängigen Mikrosatelliten entwickelt. Das verwendete Protokoll zur Erstellung einer angereicherten genetischen Bibliothek ist leicht für andere Leishmanienspezies adaptierbar. Die Marker wurden an 13 Stämmen des L. donovani-Komplexes getestet mit Schwerpunkt auf L. infantum MON-1. Die berechneten Dendrogramme entsprachen weitestgehend den Ergebnissen früherer, auf genotypischen Methoden basierenden phylogenetischen Studien. In Abhängigkeit von Zymodem und Spezies wurden unterschiedlich hohe Anteile heterogener Allele beobachtet. Das ist der erste Satz von unabhängigen Mikrosatellitenmarkern entwickelt speziell für L. infantum, der groß genug für phylogenetische Anwendungen ist. Für jedem untersuchten Stamm wurde ein eigener Multilocus-Genotyp beobachtet, was diese Methode zu einem wichtigen Werkzeug für epidemiologische und populationsgenetische Untersuchungen macht. / Leishmania infantum is responsible for a large proportion of visceral leishmaniasis all over the world. The universally accepted standard method for characterizing and identification of Leishmania is the isoenzyme analysis. Especially for L. infantum, this procedure lacks of discriminative power because the predominant zymodeme MON-1 is represented by more than 80 % of the analysed isolates. In this study, PCR assays amplifying 15 independent microsatellites were developed using a method to create highly enriched libraries that can easily be adapted for other species of Leishmania. The panel of markers was tested for 13 strains of the L. donovani complex with main emphasis on L. infantum MON-1. The calculated dendrograms corresponded to the results of former phylogenetic investigations based on genotypic methods. Depending of zymodeme and species, different degrees of allelic heterozygosity were observed. This is the first set of independent microsatellite markers especially developed for L. infantum, which is large enough for phylogenetic applications. An unique multi locus genotype is produced for each analysed isolate what makes this approach to a powerful tool for epidemiological and population genetic investigations.

Shigellen sind enteroinvasive E. coli-Klone, die beim Menschen das Krankheitsbild der bakteriellen Ruhr verursachen. Wichtige Virulenzeigenschaften dieser Bakterien werden von dem 220 kb großen Plasmid pINV kodiert. Die für das Krankheitsbild typischen blutig-eitrigen Durchfälle sind Folge der retrograden Zerstörung der Kolon-Mukosa ausgehend von der initialen Infektion im Bereich des Recto-Sigmoids. Die Infektion der Darmmukosa erfolgt über M-Zellen und assoziierte Makrophagen, nach deren apoptotischem Untergang das Bakterium Zugang zum basolateralen Pol der Enterozyten erhält; eine direkte Infektion der Enterozyten vom Darmlumen über deren apikalen Pol wird nicht beobachtet. Das eigentliche Ziel der invasiven Shigellen ist das Zytoplasma des Enterozyten, da nur dort eine relevante Replikation der Bakterien stattfindet. Dabei wird die Ausbreitung der Bakterien durch ihre Fähigkeit begünstigt, von einer primär infizierten Epithelzelle ausgehend benachbarte Epithelzellen über Plasmamembran-Ausstülpungen zu infizieren, ohne dabei den geschützten Raum des epithelialen Zytoplasmas zu verlassen. Die Aufklärung des epithelialen Invasionsmechanismus auf molekularer Ebene ist deshalb von essenzieller Bedeutung für das Verständnis sowohl der Pathogenese der Erkrankung als auch der Ökologie des Erregers. Die Infektion humaner Epithelzellen durch Shigellen erfolgt durch bakterielle Induktion von Membranausstülpungen, die über dem Bakterium fusionieren und morphologisch der Makropinozytose ähneln. Die Ausbildung der zellulären Protrusionen geht mit bedeutenden Umbauvorgängen des Zytoskeletts einher. Wir konnten zunächst in einer mikromorphologischen Analyse die einzelnen Etappen des Zytoskelett-Umbaus sowie die Mikroarchitektur der Protrusionen beschreiben. Anschließend gelang es, mit T-Plastin, Rho und einem Myosin IX Struktur- und Regulations-Moleküle zu identifizieren, die für die bakterielle Invasion funktionell bedeutend sind. Dabei fielen unterschiedliche bakteriell induzierte Rekrutierungsmuster verschiedener Rho-Isoformen und verschiedener Proteine der Rho-Familie auf. Insbesondere wurden RhoA und RhoC in unterschiedliche Bereiche des Invasionskomplexes rekrutiert. Mit umfangreichen Mutationsanalysen dieser Rho-Isoformen gelang es schließlich erstmals, ein humanes Proteinmotiv mit Techniken der `zellulären Mikrobiologie´ zu charakterisieren. Das mit Hilfe unseres Shigellen-Infektionsmodells an Epithelzellen beschriebene Rekrutierungsmotiv von Rho dürfte von fundamentaler Bedeutung sein für die räumliche Aktivitätsregulation dieser Proteinfamilie in normalen und in stimulierten Zellen. / Shigella comprise enteroinvasive clones of E. coli and are the cause of bacillary dysentery in humans. Important virulence traits of these bacteria are encoded by the 220 kb pINV plasmid. The bloody-purulent diarrhea typically seen in this disease results from retrograde destruction of colonic mucosa after inital infection of the recto-sigmoid. Infection of intestinal mucosa is via M-cells and associated macrophages. After apoptotic degradation of macrophages the microorganism gains access to the basolateral pole of enterocytes. Direct infection of enterocytes from the intestinal lumen via the apical pole is not observed. Invasive shigella target the cytoplasm of enterocytes since relevant microbial replication only takes place in this compartment. Microbial spread within the epithelial cell layer is via protrusions of the cytoplasmic membrane that reach from cell to cell thus enabling intercellular transitions without leaving the safe cytoplasmic compartment of epithelial cells. Insight into the molecular mechanisms of epithelial cell invasion is therefore essential for the comprehension of the pathogenesis of the disease as well as the ecology of the microorganism. Infection of human epithelial cells by Shigella results from bacteria-induced formation of membraneous protrusions that finally fuse above the bacterium and morphologically resemble macropinocytosis. The formation of cellular protrusions is associated with important rearrangements of the cytoskeleton. In a micromorphological study we first described the different steps of cytoskeletal reorganization and the microarchitecture of the protrusions. We then could identify structure and regulatory molecules that are functionally involved in bacterial entry: T-plastin, Rho and a myosin IX. These studies also showed different bacteria-induced recruitment patterns of Rho isoforms and of various members of the Rho protein family. In particular, RhoA and RhoC were recruited into different regions of the invasion structure. Using exhaustive mutation analysis of these Rho isoforms, we for the first time characterized a human protein motif using methods of `cellular microbiology´. The recruitment motif described using our model of epithelial cell invasion by Shigella should be significant for the spatial regulation of activity of this protein family in normal and in stimulated cells.

In der vorliegenden Arbeit wurden modernste Multiplexing-Ansätze der quantitativen Proteomanalyse angewandt, um das neuartige Virus SARS-CoV-2 zu untersuchen, den Erreger der globalen COVID-19 Pandemie, die Ende 2019 begann. Trotz enormer internationaler Anstrengungen zur Erforschung dieser Krankheit sind viele Aspekte der grundlegenden Virusbiologie, Virus-Wirt-Interaktionen und der COVID-19-Pathophysiologie noch immer unbekannt. Dies verhindert die Entwicklung gezielter Behandlungen, insbesondere für COVID-19-Patienten mit schwerem Verlauf. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Infektionsdynamik in lungenähnlichen Zelllinien untersucht. Der Vergleich von SARS-CoV mit SARS-CoV-2-Infektion in Zellen mit niedriger ACE2 Expression ermöglichte es, die Rolle anderer Membranproteine ​​als Virus Eintrittsfaktoren neu zu bewerten. In SARS-CoV-2 infizierten Calu-3-Zellen konnten Reaktionen der Wirtszellen beobachtet werden, die die Interaktion zwischen viralen Proteinen und Proteikinasen der Wirtszelle vermitteln. Im nächsten Teil wurde die angeborene Immunantwort des Wirts auf das Virus untersucht. Primäre, aus Blut isolierte Monozyten, die mit SARS-CoV-2 behandelt wurden, wiesen eine spezifische Protein-Signatur auf, die auf eine Polarisierung der Zellen zu einem profibrischen Makrophagen-Phänotyp hindeutet. Weitere Analysen zeigten, dass dieser Prozess weitgehend unabhängig von bekannten antiviralen Reaktionen und viraler RNA-Sensoren in Monozyten abläuft. Die durch das Virus hervorgerufene Phosphoproteom-Signatur deutet an, dass die profibrotische Polarisierung durch die kombinierte Wechselwirkung von viralen Proteinen und Infektionsnebenprodukten mit Wirtsrezeptoren induziert wurde. Zusammenfassend liefert diese Arbeit einen wertvollen Beitrag zur Aufklärung von Mechanismen, die zu einem schweren COVID-19 Verlauf führen können und hebt dabei die Bedeutung von Proteomanalysen in der Erforschung viraler Erkrankungen hervor. / In this thesis, we used cutting-edge multiplexed quantitative proteomics and phosphoproteomics approaches to study the virus SARS-CoV-2. The newly emerged betacoronavirus is the causative agent of the global pandemic of COVID-19 that began in late 2019. Despite the tremendous research effort in studying this disease, many aspects of the basic viral biology, virus-host interactions and COVID-19 pathophysiology still remain obscure. This prevents the development of targeted treatments, especially for severe COVID-19 patients. In the first part of this thesis, we studied infection dynamics in lung-like cell lines. Comparison between SARS-CoV and SARS-CoV-2 infections in low-ACE2-expressing cells allowed us to re-evaluate the role of other membrane proteins as entry factors. In Calu-3 cells, we could observe host responses mediating the interactions between viral proteins and host kinases. Next, we focused on the innate immune response of the host to the virus. Ex vivo monocytes treated with SARS-CoV-2 exhibited a specific proteomic signature indicating a polarization toward a profibric macrophage phenotype. Further dissection of this response revealed it to be largely independent from the viral RNA sensing and antiviral response cellular mechanisms. Furthermore, the specific phosphoproteomics signature induced by the virus indicated that the profibrotic polarization was induced by the combined interaction between viral proteins and infection byproducts with host receptors. In summary, this thesis shows the power of mass spectrometry based proteomics to study the complex dynamics between viruses and host cells. Furthermore, we uncovered a potential mechanism contributing to the development of severe COVID-19.

Beeinträchtigungen der humanen Immunantwort durch primäre Immundefekte (PID) oder Immundysfunktionen können zu einer lebensbedrohlichen Anfälligkeit für Infektionen führen. Der erste Abschnitt dieser Arbeit umfasst die Charakterisierung einer unbekannten IKBKG-Mutation, die zu einer bisher unbeschriebenen NEMO-Defekt-Variante führt. NEMO-Defekte wurden bislang den Defekten der angeborenen Immunität zugeordnet. Die Mutation verursachte jedoch einen zusätzlichen schweren T-Zelldefekt, infolgedessen der Patient in seinem ersten Lebensjahr vermehrt an schweren bakteriellen Infektionen litt. Die Analyse der NEMO-kodierenden Sequenz ergab, dass die Mutation zu einem Exon-Verlust und somit zu einem verkürzten, funktionell-eingeschränkten Protein führte. Im Vergleich mit vorbeschriebenen NEMO-Defekten wurde deutlich, dass das Spektrum der Erkrankungen durch IKBKG-Mutationen breiter als bisher angenommen und die frühzeitige Charakterisierung der Immunantwort zur Abschätzung der individuellen Prognose essentiell ist. Der zweite Abschnitt umfasst die Charakterisierung von anti-Interleukin (IL)-6-Autoantikörpern (AAk) in Patienten, die an mindestens einer schweren bakteriellen Infektion erkrankt waren. 0,6 % dieser Patienten wiesen neutralisierende AAk gegen IL-6 auf, während 0,4 % einer Patientenkohorte mit Autoimmunerkrankungen, 0 % einer Patientenkohorte mit mykobakteriellen Infektionen und 0,1 % von Individuen ohne schwere bakterielle Infektionen anti-IL-6-AAk präsentierten. Des Weiteren wurden drei bislang gesunde Frauen mit neutralisierenden AAk identifiziert. Das Epitop-Mapping zeigte Bindungsstellen, die für die Bildung des IL-6-Rezeptorkomplexes notwendig sind. Die Verlaufsanalyse der Titer ergab, dass trotz persistentem bzw. abfallendem Titer keine weiteren Infektionen eintraten. Zusammenfassend führen anti-IL-6-AAk einerseits zu einer erhöhten Anfälligkeit für bakterielle Infektionen, andererseits ist diese Anfälligkeit nicht in dem Maße ausgeprägt wie bei einem PID. / Disturbances of the human immune response in the form of primary immunodeficiencies (PID) or immune dysfunctions can lead to life-threatening infections. The first chapter of this work refers to the analysis of an unknown IKBKG mutation resulting in an undescribed variant of NEMO-deficiency. These defects have been previously assigned to immunodeficiencies of the innate immunity. However, the mutation additionally leads to a severe T-cell defect, whereupon the patient suffered from several severe bacterial infections in his first year of life. Analysis of the NEMO-coding sequence indicated that the mutation leads to an exon skipping and a shortened, functionally restricted protein. The range of diseases caused by IKBKG mutations is broader than previously presumed when compared to other NEMO-deficiencies. Therefore, the early characterization of the immune response is essential for the assessment of the individual prognosis. The second chapter comprises the characterization of anti-IL-6-autoantibodies in a cohort of patients who suffered from at least one severe bacterial infection. 0.6 % of these patients presented neutralizing autoantibodies against IL-6 whereas 0.4 % of patients with autoimmune diseases, 0 % of patients with mycobacterial infections and 0.1 % of individuals without severe infections demonstrated neutralizing autoantibodies against IL-6. In addition, three so far healthy women with neutralizing anti-IL-6-autoantibodies were identified. Analysis of the binding characteristics identified IL-6-binding sites that are essential for the formation of the IL-6 signaling complex. The examination over several years revealed that, despite persistent or decreasing antibody titers, no further or new infections occurred. In summary, anti-IL-6-autoantibodies seem to have an extenuated predisposition to severe infections, but this susceptibility is not as severe as in PID.