Aus der großen physiologischen Bedeutung, die NO im menschlichen Organismus zukommt, ergibt sich die Notwendigkeit, die Bildung dieses Radikals im gesunden Organismus und im pathophysiologischen Zusammenhang zu quantifizieren. Erst wenn die NO-Bildung in der konkreten physiologischen Situation nachvollziehbar ist, ist es möglich, medikamentös in das Geschehen einzugreifen. Ziel der Arbeit war der Ver gleich von Quantifizierungsmethoden für in vivo gebildetes NO bzw. dessen Meta bolisierungsprodukte und die Anwendung ausgewählter Methoden an einer klinisch relevanten Patientengruppe. Dabei wurde deutlich, daß der Nachweis der NO-Bildung im Organismus in klinischen Patientenstudien nur auf indirektem Weg möglich ist. Von den untersuchten indirekten NO-Quantifizierungsmethoden haben sich für Tierexperimentelle Studien folgende Methoden als nutzbar erwiesen: der ESR-spektroskopische HbNO-Nachweis und der Nitrat-Nachweis. Für Untersuchungen des Expressions- und Aktivierungsmechanismus sind die Western-Blot-Analyse und die NOS-Aktivitätsmessung einsetzbar. In Patientenstudien ist die Nitratquantifizierung die zu bevorzugende Methode, wenn ein nitrit- und nitratreduzierter Diätplan eingehalten werden kann und keine Untersuchung von Patienten mit hohen Dosierungen NO-freisetzender Arzneimittel erfolgt. Als ergänzendes Verfahren kann die Quantifizierung der N[omega]-Hydroxy-L-arginin-Konzentration als Maß für die NO-Syntheserate erfolgen, wenn die L-Arginin-Konzentration im Plasma nicht erniedrigt ist. Von den Methoden zur Quantifizierung von Nitrat ist in größeren klinischen Studien die Analyse mittels GC-MS am effektivsten anzuwenden. Ist die HPLC- Quantifizierungsmethode wegen des hohen Zeitaufwandes nur bei geringen Probenzahlen einsetzbar, so führt die Quantifizierung von Nitrit und Nitrat mittels Griess- Reaktion wegen der mangelhaften Wiederfindungsrate im Blutplasma nicht zu richtigen Ergebnissen. Außerdem ist durch die Anwendung der GC-MS-Methode zur Nitratquantifizierung die Analyse sehr geringer Probenvolumina um 5[mycro]l möglich. Dadurch können Erkenntnisse über die lokalen Verhältnisse der NO-Synthese gewonnen werden, was z. B. die Untersuchung ophthalmologischer Fragestellungen an Nagern ermöglicht.

Eine HPLC-Methode zur simultanen Bestimmung des Sulfons Dapson, dem Hauptmetabolit Monoacetyldapson und dem Dihydrofolsäurereduktasehemmer Pyrimethamin wurde entwickelt. Als Probenaufbereitung konnte eine Festphasen-extraktion mit C18-Röhrchen etabliert werden. Konsekutiv wurden die Parameter der HPLC systematisch variiert und optimiert. Die chromatographische Trennung erfolgte als Gradientenelution mit Methanol, Acetonitril und 5,0 mmol/l Hexansulfonsäure als mobile Phase. Sulfadimethoxin kam als interner Standard zum Einsatz. Als optimale Detektionswellenlängen wurden 295 nm (DDS, MADDS, IS) und 210 nm (PYR) ermittelt. Die gesamte analytische Methode zeichnet sich durch einen effizienten Probendurchsatz sowie eine hohe Spezifität, Sensibilität und Präzision aus (Eljaschewitsch E; Padberg J; Schürmann D; Ruf B 11/1996). Zur Prophylaxe der bei HIV-infizierten Patienten häufigen opportunistischen Infektionen Pneumocystis carinii-Pneumonie und Toxoplasma gondii-Enzephalitis wurden 100 mg Dapson, 25 mg Pyrimethamin und 15 mg Folinsäure zweimal pro Woche gegeben. Die steady-state Plasmaspiegel von DDS, MADDS und PYR wurden aus 224 Blutproben von 31 HIV-seropositiven Patienten bestimmt. Die medianen Plasmakonzentrationen der als compliant klassifizierten Patienten erreichten 1162 ng/ml für DDS und 331 ng/ml für PYR am Einnahmetag. Die medianen Talspiegel vor der nächsten Tabletteneinnahme lagen bei 136 ng/ml für DDS und 230 ng/ml für PYR. Insgesamt zeigten die Plasmakonzentrationen der HIV-seropositiven Patienten eine Übereinstimmung mit den pharmakokinetischen Daten gesunder Probanden. Lediglich absolute Höhe der Dapsonspiegel war vergleichsweise niedrig. Aus dem MADDS/DDS-Quotienten konnte der individuelle Acetyliererphänotyp der Patienten ermittelt werden. Die Verteilung in 58,6% langsame und 41,4% schnelle Acetylierer entspricht der Häufigkeit in der Normalbevölkerung weißer Hautfarbe. In der als non-compliant klassifizierten Gruppe erkrankte ein Patient an zerebraler Toxoplasmose. Bei den als compliant eingestuften Patienten hingegen trat keine Toxoplasma gondii-Enzephalitis auf. Die Prophylaxe der Pneumocystis carinii-Pneumonie versagte jedoch bei einem als compliant bestimmten Patienten. Die gut dokumentierten Plasmaspiegel von DDS und PYR lagen bei dem betreffenden Patienten kontinuierlich in einem hohen Bereich.

Im Unterschied zu anderen RNA Viren vervielfältigen Influenzaviren ihr Genom im Zellkern infizierter Zellen. Für die erfolgreiche Vermehrung müssen neu gebildete Genomsegmente (virale Ribonukleoproteine, vRNPs) wieder aus dem Zellkern exportiert werden. Dafür nutzt Influenza einen Exportkomplex, der sich aus dem viralen Matrixprotein 1 (M1) und Nukleusexportprotein (NEP) zusammensetzt und vRNPs unter Verwendung des zellulären Exportproteins CRM1 aus dem Zellkern transportiert. Zahlreiche Fragen im Zusammenhang mit dem Exportkomplex sind noch unbeantwortet: Wie viele Exportkomplexe werden pro vRNP gebunden? Wie interagieren die Proteine innerhalb des Komplexes mit vRNPs? Wie wird die zeitliche und räumliche Präsenz der beteiligten Proteine im Verlauf der Infektion reguliert? Um zu einem besseren Verständnis beizutragen, wurden in der vorliegenden Arbeit Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie und molecular brightness-Analysen genutzt, um die Oligomerisierung der beteiligten Exportkomplexproteine zu quantifizieren. Werden Fluoreszenzproteine für solche Untersuchungen verwendet, treten häufig nicht-fluoreszente Zustände auf, die die Bestimmung des Oligomerzustandes beeinflussen. Daher wurde in dieser Arbeit ein einfaches Korrekturmodel vorgestellt, das die Population an nicht-fluoreszenten Zuständen berücksichtigt, und somit die genaue Bestimmung des Oligomerzustandes erlaubt. Dadurch konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass NEP Homodimere im Zytoplasma ausbildet, wohingegen eine um das 2,5-fach geringere Homodimerpopulation im Zellkern vorhanden war. Durch die Integration von Informationen über den Lokalisationsphänotyp und den Oligomerzustand von NEP sowie mehrerer Mutanten, konnte ein Modell abgeleitet werden, dass den Regulationsmechanismus beschreibt: Durch vorrübergehendes Maskieren und Demaskieren der beiden Nukleusexportsignale wird der Transport von NEP reguliert. Die Dimerisierung im Zytoplasma und Monomerisierung im Zellkern unterstützen diesen Mechanismus. / Influenza viruses are the causative agent of severe epidemics and pandemics, causing up to 650,000 deaths annually. Unlike other RNA viruses, Influenza viruses replicate their genome within the nucleus of cells. Hence, progeny genome segments - viral ribonucleoproteins (vRNPs) - need to be exported from the nucleus to complete the replication cycle. To fulfil this task, Influenza relies on a viral nuclear export complex built from M1 and NEP, that mediates export by hijacking the cellular CRM1-dependent export machinery. In this context a number of questions remain unanswered, such as how many export complexes bind to a single vRNP, what is the exact interaction pattern of vRNPs with export complex proteins, and how translocation of nuclear export relevant proteins such as NEP are regulated and optimally timed during the course of infection? In the present study, the potential of NEP to form homo-dimers in situ was shown for the first time by applying fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) and molecular brightness analysis, that allows determination of protein oligomerization in living cells. However, when using fluorescent proteins in FFS studies non-fluorescent states are observed, which strongly affect molecular brightness analysis. Therefore, in this study a simple correction model was described, taking into account quantified non-fluorescent state fractions, to finally allow accurate and unbiased determination of oligomerization. This way it was shown, that NEP forms homo-dimers within the cytoplasm of cells, whereas a 2.5-fold lower homo-dimer population was observed in the nucleus. Combining the subcellular localization dependent oligomeric state of NEP and several NEP mutants with their localization phenotypes, a regulation mechanism was proposed in which the translocation of NEP is regulated by transient masking and unmasking of its two NESs, which is supported by dimerization in the cytoplasm and monomerization in the nucleus of cells, respectively.

Shigellen sind die Erreger der bakteriellen Ruhr beim Menschen, ihrem einzigen bisher bekannten Wirt. Ein wesentlicher Virulenzfaktor von Shigellen ist ihre Fähigkeit, in Epithelzellen des Intestinaltraktes einzudringen. Dabei induziert Shigella in der Wirtszelle Zytoskelettrearrangements, die zur Ausbildung einer blütenartigen Membranstruktur um das Bakterium herum führen, die schließlich über dem eindringenden Bakterium konfluiert und damit den Mikroorganismus internalisiert. Die Zytoskelettveränderungen sind essenziell für den Internalisierungsmechanismus und werden von der kleinen GTPase Rho gesteuert, wobei die Rho-Aktivität zeitlich und räumlich streng reguliert wird, um eine überschießende Bildung von F-Aktin auf Kosten des zellulären G-Aktin-pools zu verhindern. Myr5, ein atypisches Myosin der Klasse IX, ist das erste beschriebene Myosin mit einem Rho inaktivierenden GAP-Modul. Deshalb vermuteten wir, dass der Rho-Antagonist Myr5 während der Shigelleninvasion funktionell von Bedeutung sein könnte. Wir konnten zeigen, dass Myr5 bei der Shigelleninvasion in die zellulären Protrusionen rekrutiert wird. Dort kolokalisierte Myr5 mit F-Aktin und den Rho-Isoformen B und C, nicht jedoch mit RhoA. Die Rekrutierung von Myr5 in die Invasionszone erfolgte unabhängig von der Myosin-Kopf- und der GAP-Funktion. Die Resultate funktioneller quantitativer Untersuchungen zu einer möglichen Rolle während der bakteriellen Invasion sind kompatibel mit der Hypothese, dass sowohl die GAP-Funktion als auch die Myosin-Kopf-Funktion von Myr5 während unterschiedlicher Phasen der Shigelleninvasion von Bedeutung sind. / Shigella causes bacillary dysentery in humans, the only known host. A major feature of its pathogenic potential is the capacity to invade intestinal epithelial cells. Shigella entry into epithelial cells is considered a parasite induced internalization process requiring cytoskeletal rearrangements. Shigella induces a blossom-like membrane structure consisting of membrane sheaths that coalesce above and thus internalize the invasive microorganism. Cytoskeletal remodeling is an essential part of the entry process and is regulated by the small GTPase rho. Temporal and special regulation of rho activity is important to prevent excessive generation of F-actin in depense of the cellular G-actin pool. The class IX myosin myr5 is characterized by a GTPase activating protein (GAP)-module in the tail region. The GAP-module of myr5 is able to inactivate rho. We therefore hypothesized a potential role of myr5 in the regulation of rho activity during Shigella entry into epithelial cells. We could show that myr5 is recruited into bacterial entry spot. Myr5 colocalized with F-actin, rhoB and rhoC but not rhoA. Shigella-induced recruitment of myr5 did not require a functional myosin head or GAP-domain. The results of quantitative functional studies of a potential role of myr5 during bacterial entry suggest a dual role of the myosin head function and the GAP module of myr5 during different steps of the internalization process.

BEZERRA, Walderly Melgaço. Expressão de uma proteína YD de Chromobacterium violaceum em sistemas heterólogos: potencial no controle de pragas e fungos. 2008. 53 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2008. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-19T11:44:51Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_wmbezerra.pdf: 488580 bytes, checksum: 8867bb56552a329eb81d971c78c66730 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:26:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_wmbezerra.pdf: 488580 bytes, checksum: 8867bb56552a329eb81d971c78c66730 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:26:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_wmbezerra.pdf: 488580 bytes, checksum: 8867bb56552a329eb81d971c78c66730 (MD5) Previous issue date: 2008 / Chromobacterium violaceum is a free-living betaproteobacterium, which is found in the water and soil environments of tropical and subtropical regions. C. subtsugae, another species of the same genus, is toxic towards insects belonging to several orders. Among the genes that may be involved in the insecticidal activity displayed by these bacteria are those that encode chitinases. In addition to these chitinases, a protein containing YD repeats with potential insecticidal activity, encoded by the gene cv2776, was also identified in the genome of C. violaceum ATCC 12472. Similar proteins have also been found in the genomes of Xenorhabdus bovienii and Photorhabdus luminescens. The YD motif comprises 20 amino acids, with the consensus sequence Gx3-9YxYDx2GR(L, I or V)x3-10G, where x represents any amino acid. The protein TccC, from P. luminescens, has nine YD repeats in its sequence, as well as the protein SepC, from Serratia entomophila. SepC, along with two other toxins, SepA and SepB, are able to cause the "amber" disease in Costelytra zealandica (Coleoptera: Scarabaeidae). In the present work, the DNA coding seuquence of the gene cv2776 of C. violaceum ATCC 12472 was cloned in two different heterologous systems. In Escherichia coli, the coding sequence was expressed under control of the promoter araBAD, induced by L-arabinose. The protein rCV2776 was detected by imunoblotting in the insoluble fraction of induced E. coli cells. The rCV2776 present in the total insoluble cell fraction caused the death of Callosobruchus maculatus larvae, reducing the number of emerged adults in 78% and also decreasing the average weight of the insects. The E. coli cell fraction containing the recombinant protein also affected the vegetative growth of the phytopatogenic fungi Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii. When the fraction containing rCV2776 was incorporated at 1.% (w/v) in the medium, the inhibition percentages of the mycelium growth were 38.5% (R. solani), 60.7% (M. phaseolina) and 71.1% (S. rolfsii). In the yeast Pichia pastoris, the coding sequence was expressed under the control of the promoter PAOX, which is induced by methanol as the sole carbon source. When expressed in P. pastoris, the recombinant protein was apparently degraded by endogenous proteases and could not be detected by SDS-PAGE or Western Blotting, even when 8 mg of protein was loaded into the gel. In conclusion, the recombinant protein CV2776 present in the insoluble fraction of induced E. coli cells was effective in controlling the emergence of the cowpea weevil, as well as slowing the growth of M. phaseolina and S. rolfsii / Chromobacterium violaceum é uma betaproteobactéria de vida livre encontrada em regiões tropicais e subtropicais. C. subtsugae, bactéria do mesmo gênero, possui atividade tóxica contra insetos de diversos gêneros. Entre os genes que podem estar envolvidos no potencial inseticida dessa bactéria, destacam-se aqueles que codificam quitinases. Em adição, identificou-se também no genoma de C. violaceum ATCC 12472 uma proteína contendo repetições YD com potencial atividade inseticida, codificada pelo gene cv2776, similar àquelas produzidas por Xenorhabdus bovienii e Photorhabdus luminescens. O motivo YD compreende 20 aminoácidos, com sequência consenso Gx3-9YxYDx2GR(L, I ou V)x3-10G (x representa qualquer aminoácido). A proteína TccC, de P. luminescens, possui 9 repetições YD, assim como a proteína SepC, de Serratia entomophila. SepC, juntamente com outras duas toxinas, SepA e SepB, são suficientes para causar a doença “âmbar” em Costelytra zealandica (Coleoptera: Scarabaeidae). No presente trabalho, a região codificadora do gene cv2776 de C. violaceum ATCC 12472 foi clonada em dois diferentes sistemas de expressão heteróloga. Em Escherichia coli, o gene foi expresso sob controle do promotor araBAD, induzido por L-arabinose. A proteína rCV2776 foi detectada por ensaio de imunoblotting na fração insolúvel das células de E. coli induzidas. A rCV2776 presente na fração insolúvel das células dessa bactéria teve efeito letal sobre larvas de Callosobruchus maculatus, diminuindo em até 78% o número de insetos adultos emergidos, além de diminuir o peso médio desses insetos. Além disso, a fração celular de E. coli contendo rCV2776 mostrou-se capaz de inibir o crescimento vegetativo de três fungos fitopatogênicos, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. Quando incorporada no meio de cultura em uma concentração de 1% (m/v), essa fração causou percentuais de inibição de crescimento do micélio de 38.5% (R. solani), 60.7% (M. phaseolina) e 71.1% (S. rolfsii), respectivamente. Na levedura Pichia pastoris, a região codificadora foi expressa sob controle do promotor PAOX, que é induzido na presença de metanol como única fonte de carbono. Quando expressa em P. pastoris, a proteína recombinante foi aparentemente degradada por proteases endógenas, e não pôde ser detectada em análises de SDS-PAGE ou Western Bloting, mesmo quando foram aplicados 8,0 mg do sobrenadante concentrado e liofilizado no gel de eletroforese. Em conclusão, a proteína rCV2776 presente na fração insolúvel das células de E. coli induzidas foi efetiva em controlar a emergência do caruncho do feijão-de-corda, bem como em retardar o crescimento de M. phaseolina e S. rolfsii

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Chromobacterium violaceum à uma betaproteobactÃria de vida livre encontrada em regiÃes tropicais e subtropicais. C. subtsugae, bactÃria do mesmo gÃnero, possui atividade tÃxica contra insetos de diversos gÃneros. Entre os genes que podem estar envolvidos no potencial inseticida dessa bactÃria, destacam-se aqueles que codificam quitinases. Em adiÃÃo, identificou-se tambÃm no genoma de C. violaceum ATCC 12472 uma proteÃna contendo repetiÃÃes YD com potencial atividade inseticida, codificada pelo gene cv2776, similar Ãquelas produzidas por Xenorhabdus bovienii e Photorhabdus luminescens. O motivo YD compreende 20 aminoÃcidos, com sequÃncia consenso Gx3-9YxYDx2GR(L, I ou V)x3-10G (x representa qualquer aminoÃcido). A proteÃna TccC, de P. luminescens, possui 9 repetiÃÃes YD, assim como a proteÃna SepC, de Serratia entomophila. SepC, juntamente com outras duas toxinas, SepA e SepB, sÃo suficientes para causar a doenÃa âÃmbarâ em Costelytra zealandica (Coleoptera: Scarabaeidae). No presente trabalho, a regiÃo codificadora do gene cv2776 de C. violaceum ATCC 12472 foi clonada em dois diferentes sistemas de expressÃo heterÃloga. Em Escherichia coli, o gene foi expresso sob controle do promotor araBAD, induzido por L-arabinose. A proteÃna rCV2776 foi detectada por ensaio de imunoblotting na fraÃÃo insolÃvel das cÃlulas de E. coli induzidas. A rCV2776 presente na fraÃÃo insolÃvel das cÃlulas dessa bactÃria teve efeito letal sobre larvas de Callosobruchus maculatus, diminuindo em atà 78% o nÃmero de insetos adultos emergidos, alÃm de diminuir o peso mÃdio desses insetos. AlÃm disso, a fraÃÃo celular de E. coli contendo rCV2776 mostrou-se capaz de inibir o crescimento vegetativo de trÃs fungos fitopatogÃnicos, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. Quando incorporada no meio de cultura em uma concentraÃÃo de 1% (m/v), essa fraÃÃo causou percentuais de inibiÃÃo de crescimento do micÃlio de 38.5% (R. solani), 60.7% (M. phaseolina) e 71.1% (S. rolfsii), respectivamente. Na levedura Pichia pastoris, a regiÃo codificadora foi expressa sob controle do promotor PAOX, que à induzido na presenÃa de metanol como Ãnica fonte de carbono. Quando expressa em P. pastoris, a proteÃna recombinante foi aparentemente degradada por proteases endÃgenas, e nÃo pÃde ser detectada em anÃlises de SDS-PAGE ou Western Bloting, mesmo quando foram aplicados 8,0 mg do sobrenadante concentrado e liofilizado no gel de eletroforese. Em conclusÃo, a proteÃna rCV2776 presente na fraÃÃo insolÃvel das cÃlulas de E. coli induzidas foi efetiva em controlar a emergÃncia do caruncho do feijÃo-de-corda, bem como em retardar o crescimento de M. phaseolina e S. rolfsii / Chromobacterium violaceum is a free-living betaproteobacterium, which is found in the water and soil environments of tropical and subtropical regions. C. subtsugae, another species of the same genus, is toxic towards insects belonging to several orders. Among the genes that may be involved in the insecticidal activity displayed by these bacteria are those that encode chitinases. In addition to these chitinases, a protein containing YD repeats with potential insecticidal activity, encoded by the gene cv2776, was also identified in the genome of C. violaceum ATCC 12472. Similar proteins have also been found in the genomes of Xenorhabdus bovienii and Photorhabdus luminescens. The YD motif comprises 20 amino acids, with the consensus sequence Gx3-9YxYDx2GR(L, I or V)x3-10G, where x represents any amino acid. The protein TccC, from P. luminescens, has nine YD repeats in its sequence, as well as the protein SepC, from Serratia entomophila. SepC, along with two other toxins, SepA and SepB, are able to cause the "amber" disease in Costelytra zealandica (Coleoptera: Scarabaeidae). In the present work, the DNA coding seuquence of the gene cv2776 of C. violaceum ATCC 12472 was cloned in two different heterologous systems. In Escherichia coli, the coding sequence was expressed under control of the promoter araBAD, induced by L-arabinose. The protein rCV2776 was detected by imunoblotting in the insoluble fraction of induced E. coli cells. The rCV2776 present in the total insoluble cell fraction caused the death of Callosobruchus maculatus larvae, reducing the number of emerged adults in 78% and also decreasing the average weight of the insects. The E. coli cell fraction containing the recombinant protein also affected the vegetative growth of the phytopatogenic fungi Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii. When the fraction containing rCV2776 was incorporated at 1.% (w/v) in the medium, the inhibition percentages of the mycelium growth were 38.5% (R. solani), 60.7% (M. phaseolina) and 71.1% (S. rolfsii). In the yeast Pichia pastoris, the coding sequence was expressed under the control of the promoter PAOX, which is induced by methanol as the sole carbon source. When expressed in P. pastoris, the recombinant protein was apparently degraded by endogenous proteases and could not be detected by SDS-PAGE or Western Blotting, even when 8 mg of protein was loaded into the gel. In conclusion, the recombinant protein CV2776 present in the insoluble fraction of induced E. coli cells was effective in controlling the emergence of the cowpea weevil, as well as slowing the growth of M. phaseolina and S. rolfsii

Hantaviren sind wichtige menschliche Krankheitserreger und können das Hämorrhagische Fieber mit renalem Syndrome (HFRS) auslösen, welches sich durch endotheliale Dysfunktion kennzeichnet. Pathogene und nicht-pathogene Hantaviren replizieren sich in Endothelzellen, ohne zytopathische Effekte auszulösen. Dies legt nahe, dass immunpathologische Mechanismen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese spielen. Wir haben die antivirale Antwort nach Infektion mit dem pathogenen Hantaan Virus (HTNV) sowie mit dem weniger pathogenen Tula Virus (TULV) in humanen Endothelzellen (HUVEC) verglichen. Die mit HTNV und auch die mit TULV infizierten Zellen zeigten eine erhöhte Expression von Antigen-präsentierenden Molekülen. Hierbei induzierte TULV die Expression von HLA Klasse I-Molekülen noch effizienter. HTNV sorgte für die Induktion von Interferon (IFN)-???während dieses Zytokin im Überstand von TULV-infizierten HUVEC kaum nachzuweisen war. Trotzdem konnte die Hochregulation von HLA Klasse I-Molekülen auf HTNV- und TULV-infizierten Zellen durch anti-IFN-?-Antikörper blockiert werden. Interessanterweise wurde das antiviral wirksame MxA-Protein, welches die virale Replikation hemmt, bereits 16 Stunden nach einer Infektion mit TULV induziert. Im Gegensatz dazu war MxA in HTNV-infizierten Zellen erst nach 48 Stunden der Infektion nachzuweisen. Der Kinetik der MxA-Expression entsprechend, replizierte sich TULV nur sehr schwach in HUVEC, wohingegen HTNV-infizierte Zellen hohe Virustiter aufwiesen, die nach 48 Stunden der Infektion wieder zurückgingen. Beide Hantavirus-Spezies waren jedoch gleichermaßen effizient in der Lage, sich in Vero E6-Zellen zu replizieren, denen die IFN-induzierte MxA-Antwort fehlt. Die verzögerte Induktion des MxA nach einer Infektion der HUVEC mit HTNV, könnte die Virusausbreitung ermöglichen und mit zur Pathogenese des HFRS beitragen. Das Risiko, sich während der Arbeit im Forschungslabor versehentlich mit Hantaviren zu infizieren, macht spezielle Sicherheitsmaßnahmen zwingend erforderlich. Die Wirkung von chemischen oder physikalischen Inaktivierungsmethoden wurde an HTNV-infizierten Proben untersucht. Die beschriebenen Maßnahmen zur Virus-Desinfektion sind geeignet, eine sichere Handhabung der Proben zu gewährleisten. / Hantaviruses represent important human pathogens and can induce hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS), which is characterised by endothelial dysfunction. Both pathogenic and nonpathogenic hantaviruses replicate without causing any apparent cytopathic effect suggesting that immunopathological mechanisms play an important role in pathogenesis. We compared the antiviral response triggered by Hantaan virus (HTNV), a pathogenic hantavirus associated with HFRS, and Tula virus (TULV), a rather nonpathogenic hantavirus, in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Both HTNV- and TULV-infected cells showed increased levels of molecules involved in antigen presentation. However, TULV-infected HUVEC more rapidly upregulated HLA class I molecules. Interestingly, HTNV clearly induced the production of interferon (IFN)-( whereas expression of this cytokine was barely detectable in the supernatant or in extracts from TULV-infected HUVEC. Nevertheless, upregulation of HLA class I on both TULV- and HTNV-infected cells could be blocked by neutralising anti-IFN-( antibodies. Most strikingly, antiviral MxA protein, which interferes with hantavirus replication, was induced already 16 h after infection with TULV. In contrast, HTNV-infected HUVEC showed no expression of MxA until 48 h postinfection. In accordance with the kinetics of MxA expression TULV only inefficiently replicated in HUVEC whereas HTNV-infected cells produced high titers of virus particles that decreased 48 h postinfection. Both hantavirus species, however, could replicate equally well in Vero E6 cells which lack an IFN-induced MxA response. Thus, a delayed induction of antiviral MxA in endothelial cells after infection with HTNV could allow viral dissemination and contribute to the pathogenesis leading to HFRS. The potential risk of accidental infection by hantaviruses in a clinical or research laboratory necessitates special precautionary measures. To study the elimination of hantavirus infectivity, the effects of different chemical and physical inactivation and depletion procedures were investigated on HTNV-containing materials. The virus inactivation and depletion methods described herein are suitable to prepare non-infectious samples for further use in immunological, virological and cell biological assays.

Der septische Schock geht bis heute mit einer hohen Mortalität einher und stellt für die Intensivmedizin ein schwer beherrschbares Krankheitsbild dar. Er ist die häufigste Todesursache auf nicht kardiologischen Intensivstationen und es wird davon ausgegangen, dass der Anteil septischer Patienten relativ wie absolut zunehmen wird. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, den Einfluss von Hydrokortison auf die Schockdauer und die Wirkung von Hydrokortison in Abhängigkeit der Nebennierenrindenfunktion sowie den Einfluss auf die Morbidität, gemessen am SOFA-Score zu untersuchen. Es wurden 41 Patienten mit frühem septischem Schock in eine doppelblinde, placebokontrollierte, randomisierte Studie eingeschlossen. Zur Beurteilung der Nebennierenfunktion wurde vor Beginn der Studie ein ACTH-Test durchgeführt und je nach Anstieg wurden die Patienten in „Non-Responder“ und „Responder“ unterteilt. Es zeigte sich, dass Hydrokortison zu einer signifikanten Verkürzung der Schockdauer führte. Die Frage nach dem unterschiedlichen Effekt von Hydrokortison bei „Respondern“ und „Non-Respondern“ konnte nicht abschließend geklärt werden; es zeigte sich bei den „Respondern“ und „Non-Respondern“, die Hydrokortison erhalten hatten, ein Trend zu einer kürzeren Schockdauer, der aber keine statistische Signifikanz erreichte, vermutlich weil die Gruppengröße durch die Aufteilung zu klein wurde. Die vorliegenden Ergebnisse sind insofern mit anderen Studien kongruent, bedürfen aber noch der weiteren Abklärung in Studien mit größeren Patientenkollektiven. Der SOFA-Score war unter Hydrokortison in den ersten 48 Stunden signifikant reduziert. In anderen Studien war dies mit einer geringeren Mortalität assoziiert. Die Behandlung mit Hydrokortison reduziert also die Schockdauer und stellt eine wichtige Therapierationale zur Vorbeugung des sepsis-induzierten Organversagens dar. / Up to the present day septic shock is often accompanied with high mortality. For the medical intensive care field it is a hardly controllable disease pattern. Septic shock is the most frequent cause of death at non-cardiological intensive care units. It is believed that the number of septic patients will increase relatively as well as absolutely. The aim of this paper was to examine the influence of hydrocortisone on shock duration, the effect of hydrocortisone dependent on the adrenal function and the influence on morbidity, measured with SOFA score. 41 patients with early septic shock participated in a double-blind, placebo-controlled, randomised study. In the beginning of the study an ACTH-test was conducted in order to assess the adrenal function. Dependent on the increase of ACTH, the patients were classified into "non-responder" and "responder". It became apparent that hydrocortisone leads to a significant reduction of shock duration. The question about the different effect of hydrocortisone on “responder“ and “non-responder“ could not cleared up conclusively. “Responder“ and „non-responder“ who received hydrocortisone showed a trend towards shorter shock duration. There was, however, no statistic significance, probably because the groups became too small because of the division. The present results are insofar congruent with other studies, but they need further clarification through studies with bigger patient groups. For those using hydrocortisone the SOFA score was significantly reduced during the first 48 hours. In other studies this fact was associated with less mortality. The treatment with hydrocortisone therefore reduces the shock duration and is an important therapy rationale for the prevention of septic induced multi-organ failure.

Als ein Grund für die vertikale Transmission von HIV von der Mutter auf das Kind während der Schwangerschaft bzw. der Geburt wird der Transport von HIV durch die Eihaut diskutiert. Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um einen rezeptorvermittelten Transport, der auf einer Interaktion zwischen einer Lektin-bindenden Domäne auf dem viralen Oberflächenglykoprotein gp120 und einem Rezeptor auf der epithelialen Oberfläche beruht. In der vorliegenden Arbeit konnte die in den Transport von zellfreien HIV-1 durch epitheliale Zellen beteiligte Domäne auf gp120 erstmals näher charakterisiert werden. Überlappende Oligopeptide –basierend auf der Aminosäurensequenz von gp120– wurden zur Hemmung der Transzytose von HIV-1 durch humane Amnionzellen verwendet. Vier dieser Oligopeptide inhibierten die Transzytose von HIV-1 signifikant. Ein synthetisches Peptid (Env362-420) mit einer Länge von 59 Aminosäuren, welches die Sequenz der inhibierenden Oligopeptide darstellt, reduzierte die Menge an transportierten Viren ebenfalls, unabhängig vom HIV-1 Subtyp. Im Weiteren konnte der Transport von HIV-1 durch polyklonale Antikörper in Seren HIV-Infizierter, die mit Env362-420 reagierten, und durch Seren, die durch eine Immunisierung von Kaninchen mit Env362-420 gewonnen wurden, inhibiert werden. Antikörper gegen die in den Transport involvierte Domäne konnte in Seren HIV-Infizierter zu jedem Stadium der Infektion nachgewiesen werden. Bei einer Expression der Antikörper in der frühen Infektionsphase wäre ein positiver Einfluss auf die Prognose der Krankheit vorstellbar. Ob ein Zusammenhang zwischen einer Antikörperexpression gegen Env362-420 in HIV-infizierten Schwangeren und der Wahrscheinlichkeit einer HIV-Transmission auf das Kind besteht, muss noch geklärt werden. Env362-420 kann zur Identifizierung des Rezeptors auf der epithelialen Oberfläche, welcher in die Transzytose von HIV involviert ist, und zur Entwicklung von Inhibitoren der Mutter–Kind-Übertragung von HIV herangezogen werden. / The transport of HIV through the fetal membranes is discussed as one possible reason for the vertical transmission of HIV from mother to child during pregnancy or labor. HIV can penetrate epithelial barriers by a receptor-mediated transport mechanism involving interaction of a lectin-like domain on the viral glycoprotein gp120 and a receptor on the epithelial surface. In this study the domain on gp120 involved in transcytosis of cell-free HIV-1 through epithelial cells was characterized in more detail. Overlapping oligopeptides of gp120 were used to inhibit transcytosis of HIV 1 through an amnion cell monolayer. Four oligopeptides significantly inhibited transcytosis of HIV 1. A synthetic oligopeptide (Env362-420) with a length of 59 amino acids representing the sequence of the four inhibiting oligopeptides significantly reduced the transport of HIV, independent of the HIV 1 subtype. Furthermore, human HIV-positive sera with antibodies reacting with the domain Env362-420 and rabbit sera raised against the oligopeptide Env362-420 also inhibited the transport of HIV-1. Antibodies directed against the transcytosis domain could be detected in sera from every stage of infection. The development of these antibodies in the early stage of infection might play a role in the outcome of the HIV disease.It has to be investigated whether HIV 1-infected women who developed these antibodies show a lower rate of HIV transmission to their offspring than those without such antibodies. Env362–420 can also be used as a tool to identify the receptor involved in transcytosis on the epithelial cell surface and to develop inhibitors that could help prevent mother-to-child transmission of HIV during pregnancy or labor.

Toxoplasma gondii ist ein weltweit verbreiteter Parasit. In Europa ernährt sich der Endwirt (Katzen) hauptsächlich von kleinen Säugetieren wie Myodes glareolus und Microtus spp. (Wühlmäusen) und Apodemus spp., seltener von Mus spp. Erstere zeigen gegenüber Mus spp. erhöhte Prävalenzen von T. gondii und überleben diese eher als Mus spp. Daher wird vermutet, dass Wühlmäusen und Apodemus spp. eine größere Rolle als Zwischenwirte besitzen, als Mus spp. Der Schutz wird auf das IFN-γ-induzierte IRGb2-b1 zurückgeführt, die den zentralen parasitären Virulenzfaktor ROP5 inhibiert. Daher liegt der Fokus meiner Arbeit auf der protektiven Rolle von IRGb2-b1 bei der Infektion mit T. gondii in Wühlmäusen und Apodemus spp. Mit dieser Arbeit trage ich nützliche Werkzeuge zur Erforschung von Wühlmäusen bei, wie ein rekombinantes M. glareolus IFN-γ Zytokin und neuartige Zellsysteme. Alle untersuchten Wühlmaus-Systeme besaßen einen Phänotyp bei Infektion mit in vivo Resistenz beschrieben wurde: einem IFN-γ-vermittelten Reduktion der Parasitenbürde (mit Wirtszelltod für Typ I Parasiten, ohne für Typ II). Darüber hinaus bestätigen vorläufige Resultate aus Wühlmäusen und Apodemus spp. in Deutschland hohe genetische Vielfalt der IRGb2 Untereinheit zeigen, insbesondere an der vermuteten Grenzfläche zum ROP5, was auf eine Rolle dieses Proteins bei der Infektion hindeutet. Um die Funktion der IRGb2-b1 Proteine zu untersuchen, habe ich ein Zellkultur System, entwickelt, welches erlaubt wild-derived Gene stabil zu exprimieren. Dieses Setup gestattet es, die Auswirkungen von Polymorphismen in Irg Genen bei der Infektion mit T. gondii zu evaluieren. Insgesamt habe ich Werkzeuge erarbeitet, um den Ansatz der Öko-Immunologie in eine Labor-Umwelt zu bringen, wodurch die molekulare Untersuchung ökologisch relevanter Arten möglich wird. Durch Anwendung dieser Werkzeuge stütze ich die Hypothese, dass nicht-Mus Nagetiere, insbesondere M. glareolus, ein bedeutendes Reservoir für T. gondii darstellen. / Toxoplasma gondii is an ubiquitous parasite grouped in three main clonal lineages, type I-III. In Europe, felids, definitive hosts for the parasite, mostly prey on small mammals of Myodes glareolus and Microtus spp. (voles), and Apodemus spp., rather than Mus spp. Voles and Apodemus spp. also display higher T. gondii prevalence and survive infection to a larger extent than Mus spp., although tolerant Mus subspecies exist. This suggests that voles and Apodemus spp. are more relevant intermediate hosts than Mus spp.. Resistance to infection relies on the IFN-γ-induced IRGb2-b1, which inhibits the major parasite virulence factor ROP5. Thus, this work focuses on the protective role of IRGb2-b1 during T. gondii infection in voles and Apodemus spp. With this project I contribute with valuable tools for research on voles, such as the supply of the recombinant M. glareolus IFN-γ cytokine and novel cell systems. All vole systems show a phenotype to type I infection which is associated with in vivo resistance in Mus spp: IFN-γ-mediated host cell death and a decrease in parasite burden. The latter without cell death was observed for type II parasites, suggesting novel protective mechanisms. Further, preliminary results from voles and Apodemus spp. in Germany confirm the expected high diversity in the IRGb2-like subunit, especially at the putative interface with ROP5, which suggests a role of the protein during infection. To assess the role of IRGb2-b1-like in this phenotype, I developed a system which allows establishment of cell lines stably expressing wild-derived Irg-like genes. This setup allows evaluation of the effect of polymorphisms of Irg-like genes during infection. Taken together, I have provided tools to bring eco-immunology into a lab setting to perform molecular investigations of ecologically relevant species. Using these tools, I offer support for the hypothesis that non-Mus rodents, especially M. glareolus, constitutes a relevant T. gondii reservoir in Germany.