Wir nutzten in dieser Studie den apikomplexen Parasiten Eimeria falciformis als Modell. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das in infizierten Wildtypmäusen dominierende Zytokin IFN-γ für Immunschutz und für die Entwicklung der Darmpathologie entbehrlich war. E. falciformis-infizierte IFN-γR-/- and IFN-γ-/- Mäuse zeigten extremen Körpergewichtsverlust und starke Pathologie im Darm. Die Entwicklung des Parasiten in diesen Mäusen war überraschenderweise reduziert. Diese Beobachtungen gingen mit einer drastisch erhöhten Produktion von parasiten-spezifischem IL-17A und IL-22 durch CD4+ T Zellen einher. Gleichzeitige Neutralisierung von IL-17A und IL-22 in E. falciformis-infizierten IFN-γR-/- Mäusen verringerte den Körpergewichtsverlust und die Darmpathologie, und führte zu einer erhöhten Ausscheidung von Parasiten. Die Behandlung einer E. falciformis-infizierten intestinalen Epithelzelllinie mit IL-17A oder IL-22 führte zu einer signifikant reduzierten Entwicklung von E. falciformis in vitro. Diese Daten demonstrieren erstmalig einen anti-parasitären Effekt von IL-22 im Darm und deuten auf redundante Rollen von IL-17A und IL-22 im Hinblick auf die Förderung von Darmpathologie in Abwesenheit von IFN-γ hin. Um E. falciformis als Modellsystem weiter zu entwickeln, haben wir die Transfektion von E. falciformis Sporozoiten mit verschiedenen Plasmiden die den Reporter YFP und den Resistenzmarker DHTS enthalten etabliert. Rektal in Mäuse injizierte Sporozoiten entwickelten sich erfolgreich zu Oocysten, wenn auch mit geringerer Effizienz im Vergleich zur oralen Infektion mit Oozysten. Wiederholte in vivo Selektion YFP-exprimierender Oozysten führte zu Populationen mit maximal 34 % YFP-exprimierenden Parasiten. Wir demonstrieren in dieser Arbeit zum ersten Mal die Transfektion von E. falciformis und zeigen Perspektiven im Hinblick auf die Etablierung einer stabil transgenen Parasitenlinie auf. / The roles of Th1 and Th17 responses as mediators of host protection and pathology in the intestine are the subjects of intense research. Here we investigated a model of intestinal inflammation driven by the intracellular apicomplexan parasite Eimeria falciformis. Although IFN-γ was the predominant cytokine during E. falciformis infection in wild type mice, it was found to be dispensable for host defence and the development of infection-driven intestinal inflammation. E. falciformis-infected IFN-γR-/- and IFN-γ-/- mice developed dramatically exacerbated body weight loss and intestinal pathology, but surprisingly harboured fewer parasites. This was associated with a striking increase in parasite-specific IL-17A and IL-22 production in the mesenteric lymph nodes and at the site of infection. Concurrent neutralisation of IL-17A and IL-22 in E. falciformis infected IFN-γR-/- mice resulted in a reduction in infection induced body weight loss and inflammation and significantly increased parasite shedding. Taken together these data demonstrate for the first time an anti-parasitic effect of IL-22 during an intestinal infection and suggest that IL-17A and IL-22 have redundant roles in driving intestinal pathology in the absence of IFN-γ signalling. To further develop E. falciformis as a model system, we established transfection of E. falciformis sporozoites using various plasmids that contain the fluorescent reporter YFP and the resistance marker DHTS. Sporozoites applied rectally to mice were shown to complete their life cycle, albeit with a lower efficiency in comparison to oral infection with oocysts. Repeated in vivo selection using pyrimethamine and/or FACS and manual sorting led to a maximum percentage of 34 % YFP-expressing oocysts. Taken together, we demonstrate for the first time transfection of E. falciformis and provide perspectives for further work on the establishment of a stable transgenic parasite line.

Chlamydia trachomatis ist ein obligat intrazelluläres Humanpathogen, welches sich, nach der Einnistung in seiner Wirtszelle, innerhalb einer membranumhüllten Vakuole, der sogenannten Inklusion, befindet. Die Inklusionsmembran stellt dabei die primäre Kontaktfläche für Pathogen–Wirtszell-Interaktionen dar und definiert dadurch die Nische, in welcher sich die Bakterien vermehren können. Zum ersten Mal beschreiben wir in dieser Arbeit die Isolation und biochemische Charakterisierung der Inklusion von C. trachomatis, mittels herkömmlicher Organellaufreiniungsverfahren und massenspektrometrischer Proteomanalyse an einem zentralen Zeitpunkt der Infektion. Die relative Quantifizierung von Proteinen mittels stabiler isotopenmarkierter Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) und die zusätzliche markierungsfreie Quantifizierung erlaubten uns die Darstellung dieses subzellulären Proteoms mit hohem Konfidenzniveau. Mithilfe dieser Methoden haben wir über dreihundert Wirtszellproteine identifiziert und quantifiziert, welche noch nicht als inklusionslokalisiert bekannt waren. Die globale Analyse dieser Daten bestätigte die Rekrutierung vieler Proteine, welche in verschiedenen Membrantransportwegen involviert sind. Zudem fanden sich viele Proteine des retrograden Transportweges, welcher bislang nicht im Zusammenhang mit Chlamydien-Infektionen untersucht wurde. Die detaillierte Analyse dieser Proteine zeigte, dass Sorting Nexine sehr spezifisch zur Inklusion rekrutiert werden. Zudem haben wir mithilfe des unlängst beschriebenen Inhibitors Retro-2 gezeigt, dass retrograder Transport essenziell für die effiziente intrazelluläre Replikation von C. trachomatis ist. Zusammengefasst haben wir eine große Anzahl zuvor unbekannter inklusionsassoziierter Proteine identifiziert und quantifiziert, und auf Basis unserer Daten schlagen wir den retrograden Transportweg als neues Potenzielles Angriffsziel von Therapeutika zur Behandlung von C. trachomatis Infektionen vor. / Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular human pathogen which, after invasion of its host cell, resides within a membrane bounded vacuole called the inclusion. The inclusion membrane represents the main host-pathogen interface of Chlamydiae and thereby defines the environment in which the bacteria thrive. Here we describe for the first time the isolation and biochemical characterization of the mid-infection inclusion of C. trachomatis using mass spectrometry based proteomics in combination with traditional organelle purification techniques. Relative quantification by Stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) and additional label free quantification allowed the generation of a high confidence subcellular proteome. Using this approach, we were able to identify and quantify over three hundred host cell proteins that were not reported previously to be inclusion localized. By analyzing the obtained data on a global scale, we were able to confirm previous reports on the recruitment of proteins implied in several membrane trafficking pathways. Detailed analysis of proteins identified to be involved in retrograde trafficking, a pathway that has not been described previously in the context of chlamydial infections, showed that sorting nexins are specifically recruited to the inclusion. We furthermore identified retrograde trafficking to be essential for the efficient intracellular replication of C. trachomatis using the recently described inhibitor Retro-2, which drastically reduced bacterial progeny formation upon treatment. Taken together, we identified and quantified a large number of previously unknown inclusion associated proteins, and we propose retrograde trafficking as a novel potential drug target for the treatment of infections with C. trachomatis.

Klinische, epidemiologische und experimentelle Daten deuten darauf hin, dass Autoimmunkrankheiten wie z.B. rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose oder Typ I Diabetes durch Infektionen ausgelöst oder verschlimmert werden können. Bis heute ist jedoch nicht bekannt, welche molekularen und zellulären Mechanismen den Zusammenhang zwischen Infektion und Autoimmunität vermitteln. Eine Hypothese, die diesen Zusammenhang zu erklären versucht, ist die Hypothese der molekularen Mimikry. Dieser Hypothese zufolge sind kreuzreaktive Lymphozyten, die sowohl Selbst- als auch Fremdantigene erkennen, für die Induktion von Autoimmunität verantwortlich. Die Hypothese der molekularen Mimikry erklärt die Kreuzreaktivität von Lymphozyten durch Sequenzhomologie oder Identität von Selbst- und Fremdantigenen. Wir haben diese Hypothese an zwei Modellen, der chronischen Lyme Arthritis und einem Maus Modell der multiplen Sklerose, getestet und dabei festgestellt, dass Kreuzreaktivität von Lymphozyten weitaus häufiger ist als bis vor kurzem noch vermutet wurde. Wir konnten weiterhin zeigen, dass nicht die Primärstruktur sondern definierbare strukturelle Motive die Ursache für die Kreuzerkennung von Selbst- und Fremdpeptiden sind, und das Kreuzreaktivität in den seltensten Fällen von pathogenetischer Relevanz ist. Die Vorstellung, immunologische Kreuzreaktivität zwischen einem definierten mikrobiellen Antigen und einem definierten Selbstantigen sei für die Pathogenese von Autoimmunkrankheiten verantwortlich, ist also zu einfach. Der zweite Schwerpunkt dieser Arbeit ist die immunologische Analyse eines von uns charakterisierten Th2-spezifisch exprimierten Moleküls, T1/ST2. Wir konnten zeigen, dass T1/ST2 auf Th2, nicht jedoch Th1-Zellen exprimiert wird; dass die Expression von T1/ST2 ex vivo die Lokalisation aktueller Th2-Antworten widerspiegelt; und dass T1/ST2 von funktioneller Bedeutung für die Th2 Zellen ist: Kreuzvernetzung des T1/ST2 Moleküls durch einen T1/ST2-spezifischen monoklonalen Antikörper induziert Proliferation und die Produktion von Typ 2 Zytokinen. In vivo läßt sich durch Applikation des löslichen Antikörpers gegen T1/ST2 die pathogene Th2-Immunantwort im Mausmodell von Asthma modulieren. T1/ST2 ist also ein Kandidat für die gezielte immunmodulatorische Therapie Th2-dominierter Erkrankungen wie Asthma und Allergie. / Clinical, epidemiological, and experimental data suggest that infections can sometimes trigger or exacerbate autoimmune diseases such as multiple sclerosis, type I diabetes, or rheumatoid arthritis. To date, the molecular and cellular mechanisms leading from infection to autoimmunity have not been defined. The molecular mimicry hypothesis proposes that crossreactive lymphocytes that recognize both self- and microbial antigens are key factors in the pathogenesis of autoimmunity. According to the molecular mimicry hypothesis, sequence identity or marked sequence similarity between self- and microbial antigens is the cause of such crossreactivity. We have examined the molecular mimicry hypothesis systematically in two different models: treatment-resistant Lyme arthritis and experimental autoimmune encephalitis (EAE). The major findings were: i) crossreactivity at the level of peptide recognition by T cells is far more frequent than previously expected; ii) structural criteria rather than sequence similarity determine cross-recognition; iii) immunoregulatory mechanisms normally prevent pathogenic effects mediated by crossreactive lymphocytes. Thus, the idea that crossrecognition of a defined microbial peptide and a particular self-peptide would explain autoimmunity is most likely too simple. The other major topic of this work was the immunological analysis of T1/ST2, a Th2-specific molecule that we characterized. Here, we could show that T1/ST2 is expressed on Th2 but not Th1 cells. Furthermore, T1/ST2 expression can be used to identify sites of ongoing Th2 reactions directly ex vivo. Most importantly, T1/ST2 is important for Th2 effector functions: crosslinking of T1/ST2 via a T1/ST2-specific monoclonal antibody induces proliferation and type 2-cytokine production. In vivo, administration of the soluble antibody against T1/ST2 ameliorates the immunological parameters of bronchial hyperreactivity in a murine model of asthma. Thus, T1/ST2 is a candidate target for therapeutic immunomodulation of diseases such as allergy and asthma.

Erreger des Leishmania donovani Komplexes (LDC) verursachen viszerale Leishmaniose (VL), eine der häufigsten durch Sandmücken übertragenen Infektionskrankheiten beim Menschen. Die vorliegende von der EU geförderte Dissertation untersucht die weltweite Populationsstruktur des LDC mit besonderem Schwerpunkt auf dem Indischen Subkontinent (ISC), wo das gehäufte Auftreten von Therapieversagen ein Problem für die geplante Eliminierung von VL darstellt. Zwei hoch diskriminierende molekulare Typisierungsverfahren wurden angewendet. 845 LDC-Isolate wurden mittels Multi-Lokus-Mikrosatelliten-Typisierung (MLMT) charakterisiert. Die Parasiten wurden in Gebieten mit endemischer VL aus unterschiedlichen Wirten isoliert und repräsentieren verschiedene klinische Formen der Leishmaniose. Eine 125 Parasiten umfassende Teilprobe wurde vollständig sequenziert und in einem next-generation Multi-Lokus-Sequenz-Ansatz (ng-MLSA) typisiert, welcher auf der Analyse von genomweiten Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNP) beruht. Sowohl die MLMT- als auch die SNP-Daten wurden mit den gleichen populationsgenetischen Methoden ausgewertet. Der ng-MLSA Ansatz bestätigte weitgehend die Populationsstrukturen des mit dem MLMT analysierten größeren Datensatzes, die genetische Struktur korrelierte mit der geographischen Herkunft der Isolate. Die Unempfänglichkeit der Parasiten gegenüber Antimon- oder Miltefosin sowie die in vitro gemessene Resistenz der Isolate vom ISC konnten nicht auf einen spezifischen Genotyp zurückgeführt oder mit einem spezifischen genetischen Merkmal verknüpft werden. Die Gesamtgenomsequenzierung konnte bisher keine Mutationen im Parasitengenom nachweisen, die in Zusammenhang mit der Antimon- und Miltefosin-Unempfindlichkeit bzw. dem Therapieversagen gebracht werden könnten. Analysen basierend auf ausgewählten Sequenzen deuten auf eine variable chromosomale Ploidie und eine erhöhte Kopienzahl einiger Gene hin, die zur Entstehung von Arzneimittelresistenzen beitragen könnten. / Parasites of the Leishmania donovani species complex (LDC) cause most cases of visceral leishmaniasis (VL), one of the most fatal vector-borne parasitic human diseases. As part of an EU funded project, this dissertation has investigated the worldwide genetic population structure of parasites of the LDC, with special focus on the Indian subcontinent (ISC) where unresponsiveness to anti-leishmanial drugs has recently become an urgent problem for the containment of VL. Two types of highly discriminatory approaches have been used. Multi-locus microsatellite typing (MLMT) has been applied to 845 LDC isolates from numerous Old and New World foci of VL, from different clinical forms of the disease and from various hosts. A subset of 125 fully sequenced isolates, reflecting the worldwide distribution of the LDC, was analysed using a next-generation multi-locus sequence approach (ng-MLSA) including single nucleotide polymorphisms (SNP). Both microsatellite and SNP data sets were analysed using, in general, the same population genetic tools. The ng-MLSA approach has, in general, corroborated the population structures obtained with MLMT for the larger data set. With the exception of non MON-1 parasites, the genetic structure revealed was largely associated with the geographic origin of the isolates, but not with the clinical presentation, host specificity and the immune status of the host or year of parasite isolation. Unresponsiveness to antimony or miltefosine treatment as well as the respective resistances measured in vitro could not be linked to a specific genotype or genetic trait. Wg sequencing also failed, so far, to identify mutations, which could be related to the unresponsiveness of LDC isolates from the ISC to antimony and miltefosine therapy. Analyses of selected targets have revealed extensive variation in chromosomal ploidy in all wg sequenced isolates under study and copy number variations for some genes possibly involved in drug resistance.

Proteasomen, die die proteolytisch aktiven Untereinheiten LMP7, LMP2 und MECL1 inkorporieren, nennt man Immunoproteasomen. Während einer Immunreaktion führen diese regulierende sowie modulierende Funktionenaus. Sie sind konstitutiv exprimiert in Zellen hämatopoetischen Ursprungs, ein Bestandteil des angeborenen Immunsystems, die die erste Angriffsfront gegen pathogene Mikroorganismen ausbilden. Um die Bedeutung des Immunoproteasoms für die angeborene Immunantwort bei einer Streptococcus pneumoniae Infektion auf zu zeigen, charakterisierten wir den Krankheitsverlauf einer bakteriellen Pneumonie und analysierten lokale aber auch systemische Immunreaktionen in LMP7 ko Mäusen mit Hilfe eines S. pneumoniae Infektionsmodels. Die hier generierten Daten zeigten einen fortgeschrittenen Krankheitsverlauf in LMP7 ko Mäuse, der in einer systemischen inflammatorischen Immunreaktion endete und sich in klinischen Parametern, wie physiologische Kondition, spezifische diagnostische Marker und Immunsuppression, andeutete. Der Zustand der Sepsis entwickelte sich vermutlich aufgrund einer erhöhten bakteriellen Last im Blut und führte zu einer vorzeitigen Mortalität infizierter LMP7 ko Tiere. Obwohl die Fähigkeit von LMP7 ko Leukozyten ex vivo Bakterien zu eliminieren nicht beeinträchtigt war, zeigten LMP7 ko Mäuse in vivo eine verminderte Genexpression immunmodulierender Moleküle, wie Pentraxine, Fikoline und Kollektine. Diese Moleküle fördern die Aufnahme, Elimination und Degradation pathogener Mikroorganismen. Die reduzierte Expression opsonierender Moleküle wurde begleitet von einer veränderten proteasomalen Zusammensetzung in murinen Makrophagen und Lebergewebe. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass diese Ergebnisse eine bisher unbekannte Rolle von Immunoproteasomalen Untereinheiten bei der Regulierung der angeborenen Immunantwort auf extrazelluläre bakterielle Infektionen unterstreichen. / Immunoproteasomes, harboring the active site subunits LMP7, LMP2, and MECL1 exert protective, regulatory or modulating functions during infection-induced immune responses. Immunoproteasomes are constitutively expressed in hematopoietic derived cells, constituting the first line of defense against invading pathogens. To clarify the impact of immunoproteasomes on the innate immune response against Streptococcus pneumoniae, we characterized the progression of disease and analyzed the local as well as systemic innate immune response in LMP7 ko mice by using a S. pneumoniae infection model. Data showed that mice deficient in LMP7 suffered from a more severe case of pneumonia which ended in a systemic inflammatory response indicated by aggravated clinical signs, diagnostic parameters, and immune suppression. The systemic inflammatory response probably established in consequence of an increased bacteremia and resulted in early mortality. Although, bacterial killing efficiency of LMP7 ko leukocytes was unaffected ex vivo, LMP7 ko mice exhibited a reduction in the transcription of genes encoding immune modulating molecules such as pentraxins, ficolins, and collectins, which facilitate opsonophagocytosis. The reduced expression of opsonins was accompanied by an affected subunit composition of proteasomes in murine macrophages and liver. In summary these results highlight an unsuspected role for immuno-subunits in modulating the innate immune response to extracellular bacterial infections.

Schistosomen verursachen die Tropenparasitose Schistosomiasis mit 250-300 Millionen infizierten Menschen weltweit. Zur Analyse von Genfunktionen, durch die wirksame Medikamente entwickelt werden könnten, wird ein System zur Herstellung transgener Schistosomen benötigt. In dieser Arbeit wurde daher versucht, ein System zur Transfektion von Schistosoma mansoni von der transienten Expression von Reportergenen ausgehend zu entwickeln. Die Funktionalität der hergestellten Plasmide zur transienten Transfektion wurde durch die Expression der Reporter Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) und beta-Galatosidase unter der Kontrolle der schistosomalen Promotoren für das Calreticulin, die 28 kDa-Glutathion-S-Transferase und das 70 kDa-Hitzeschockprotein in cos7-Zellen nachgewiesen. Für den Gentransfer in S. mansoni wurden Mikroinjektion, Elektroporation und Mikroprojektilbeschuss eingesetzt. Der Mikroprojektilbeschuss erwies sich als geeignete Methode, Plasmid-DNA zur transienten Expression von EGFP und beta-Galaktosidase in adulte und larvale Stadien zu transferieren. Da die beobachtete Reportergenexpression schwach war, wurde durch den Einsatz von Discosoma Red Fluorescent Protein (DsRed) als Reportergen versucht, das Transfektionsssytem zu optimieren. Außerdem wurden die potentiellen Promotoren für das Cathepsin D und für ein Aktin durch inverse PCR aus genomischer DNA isoliert. Die Funktionalität dieser Promotoren wurde in cos7- bzw. HeLa-Zellen nachgewiesen, eine verbesserte Expression in S. mansoni dagegen wurde mit diesen zwei Promotoren und unter Einsatz von DsRed nicht erreicht. Da S. mansoni sich in vitro nicht kultivieren lässt, muss für die Etablierung eines Transfektionssystems ein in seinen Keimzellen transgenes Stadium in den Lebenszyklus eingeschleust werden. Durch Mikroprojektilbeschuss transfizierte Mirazidien (freilebende Stadien des Parasiten) infizierten Zwischenwirtsschnecken und entwickelten sich zu transgenen Sporozysten, was durch die Transkription von EGFP nachgewiesen wurde. Für eine stabile Integration in das Genom werden unter anderem mobile genetische Elemente eingesetzt. Boudicca ist ein endogenes long terminal repeat (LTR) Retroelement. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass es in adulten Würmern, Sporozysten und Zerkarien transkribiert wird. Das LTR kann in vitro als Promotor zur Expression von EGFP eingesetzt werden. Außerdem wurde eine transkribierte Kopie kloniert und analysiert. Die in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse weisen darauf hin, dass Boudicca als Vektor zur stabilen Transfektion von S. mansoni eingesetzt werden kann. / Schistosomiasis caused by schistosomes affects about 250-300 million people world wide. The establishment of a transgenesis system for schistosomes is a pre-requisite to the identification of new drug targets and to the analysis of gene regulation and will add to our knowledge of parasite physiology and development. In this study, plasmids expressing Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) and beta-galactosidase driven by the schistosomal promoters of the calreticulin, the 28kDa-glutathione-S-transferase and the 70kDa-heatshock protein were cloned and successfully tested in cos7-cells. Microinjection, electroporation and particle bombardment were used to introduce plasmid DNA into Schistosoma mansoni. Adult and larval stages of S. mansoni subjected to particle bombardment transiently expressed the reporter genes, although the observed transfection rates were very low. To optimize the transfection system Discosoma Red Fluorescent Protein (DsRed) was used as a reporter gene. Furthermore, the schistosomal promoters of the aspartic protease cathepsin D and a cytoplasmatic actin gene were isolated from genomic DNA using inverse PCR. The isolated promoters were able to drive EGFP and DsRed expression in cos7- or HeLa-cells, but improved expression could not be observed in S. mansoni. Due to the complexity of the life cycle S. mansoni cannot be cultured in vitro. In order to develop a transgenesis system for schistosomes, the life cycle must consequently be completed by genetically modified parasites. In this study it was shown that the free-living and mobile miracidium that infects the intermediate host snail could be transformed by particle bombardment and reintroduced in the life cycle using the natural path of infection. Development into transgenic sporocysts was shown through the isolation of EGFP transcripts from intermediate host snails. Mobile genetic elements are used as molecular tools to achieve stable integration of a foreign gene into a genome. Boudicca is an endogeneous long-terminal repeat (LTR) transposon in the schistosomal genome. In this study it was shown that it is transcribed in adult worms, sporocysts and cercariae. The LTR drives EGFP expression in cell cultures. Furthermore, a Boudicca transcript was cloned and analyzed by sequencing. The results suggest that Boudicca can be used as a molecular tool for stable integration of transgenes into the schistosomal genome.

Störungen im Bereich der Mikrozirkulation gelten als ursächlich für die Entstehung des Multiorganversagens bei Sepsis, wobei der Darm eine zentrale Rolle einnimmt. Aktivierte Leukozyten setzen u.a. Sauerstoffradikale frei, die entscheidend zur Zerstörung der endothelialen Integrität beitragen. Die Antagonisierung schädigender Mediatoren stellt ein Prinzip der adjunktiven Sepsis-Therapie dar, wobei die antioxidativ wirkenden Substanzen N-Acetylcystein (NAC) und Tirilazad Mesylat (TM) in mehreren Studien positive Effekte gezeigt haben. In einer tierexperimentellen Untersuchung an Ratten wurde der Effekt der kombinierten Gabe von NAC und TM auf die mesenteriale Mikrozirkulation, auf die Freisetzung von TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, IL-10 und auf die Leukozytenzahl unter einer kontinuierlichen Lipopolysaccharidbelastung (LPS) von 10 mg/kg KG untersucht. Die Beurteilung der mesenterialen Mikrozirkulation erfolgte mittels Intravitalmikroskopie. Hierbei wurde das Ausmaß der Leukozytenadhärenz am Endothel der mesenterialen Venolen als Maß für die Leukozytenaktivierung und die Plasmaextravasation als Parameter für die Endotheldysfunktion bestimmt. Dabei konnte während zwei Stunden Endotoxinämie die Zunahme der Plasmaextravasation an mesenterialen Venolen durch die kombinierte Gabe von NAC und TM nicht signifikant beeinflusst werden (p>0,05). Eine tendenziell erhöhte Plasmaextravasation unterstützt die Hypothese, dass leukozytenunabhängige Mechanismen für die Plasmaextravasation existieren. Während zwei Stunden Endotoxinämie kam es zu einer signifikanten Reduktion der Anzahl der fest adhärenten Leukozyten in der NAC/TM-Gruppe im Vergleich zur LPS-Gruppe (p=0,001). Durch die kombinierte Gabe von NAC und TM konnte die endotoxininduzierte Freisetzung von TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, IL-10 und die endotoxinbedingte Leukopenie nicht signifikant beeinflusst werden. / Disturbances of the microcirculation are causal for the pathophysiology of multiorgan failure related to sepsis in which the gut plays a central part. Activated leukocytes release i.e. oxygen radicals which decisively contribute to the destruction of the endothelial integration. To antagonize the damaging mediators is a principle of the adjunctive sepsis therapy in which the antioxidant agents N-acetylcysteine (NAC) and tirilazad mesylate (TM) showed positive effects in several studies. The effect of the combined administering of NAC and TM under continuous lipopolysaccharide (LPS) exposure of 10 mg/kg BW on the mesenteric microcirculation, on the release of TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, IL-10 and on the number of leukocytes was examined in an animal study on rats. The appraisal of the microcirculation was done by intravital microscopy. The degree of leukocyte adherence on the endothelium of mesenteric venules was determined for the degree of leukocyte activation, and the plasma extravasation was the parameter for the endothelial dysfunction. The increase of plasma extravasation on mesenteric venules during 2 hours of endotoxemia could not be affected significantly by the combined administering of NAC and TM. The tendency of increased plasma extravasation supports the hypothesis of the existence of a leukocyte independent mechanism of plasma extravasation. During 2 hours of endotoxemia the NAC/TM group showed a significant decrease in the number of firmly adherent leukocytes in comparison to the LPS group. There was no significant effect on the endotoxin induced release of TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, IL-10 and the endotoxin induced leukopenia by the combined administration of NAC and TM.

Im Kampf gegen eine Virusinfektion spielen CD8+ T Zellen des adaptiven Immunsystems eine besondere Rolle. Sie patroullieren im Körper und entdecken spezifische Virusepitope, welche mittels MHC Klasse I Molekülen auf der Oberfläche infizierter Zellen präsentiert werden. Wird eine virus-infizierte Zelle erkannt, kann diese schnell und effizient eliminiert. Für die Generierung viraler Peptide, welche auf MHC Klasse I Komplexe geladen werden, ist das Ubiquitin-Proteasom-System von essentieller Bedeutung. Kürzlich wurden weitere Funktionen des Immunoproteasoms aufgedeckt wie zum Beispiel der Schutz gegen oxidativen Stress. Innerhalb der vorliegenden Arbeit konnte die Fähigkeit des Immunoproteasoms gegen eine Akkumulation oxidativ geschädigter Proteine zu schützen mit der Generierung von MHC Klasse I Liganden kombiniert und neu interpretiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass während einer Virusinfektion in Nicht-Immunzellen die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies durch die alternative NADPH Oxidase Nox4 eine bedeutende Rolle spielt. Die Aktivierung von Nox4 resultiert in der Akkumulation oxidativ geschädigter Proteine. Innerhalb von zwei Stunden nach dem Eintreten von Viruspartikeln in die Zellen wurden strukturelle Virusproteine oxidiert und anschließend ubiquityliert. Die gleichzeitige, virus-induzierte Expression von Immunoproteasomen führte zu einem schnellen und effizienten Abbau ubiquitylierter Virusantigene. Infolgedessen konnten immundominante Virusepitope vermehrt freigesetzt werden. Folglich wurde ein soweit unbekannter Mechanismus gefunden, welcher Substrate für das Proteasom zur Generierung von MHC Klasse I Liganden bereitstellt. Zusammenfassend konnte innerhalb dieser Arbeit gezeigt werden, dass das Immunoproteasom den Schutz vor oxidativen Stress mit der Generierung antigener Peptide verbindet, wodurch eine effektive adaptive Immunantwort etabliert werden kann. / An efficient immune control of virus infection is predominantly mediated by CD8+ T cells which patrol through the body and eliminate infected cells. Infected cells are recognized when they present viral antigenic peptides on their surface via MHC class I molecules. To make antigenic peptides available for loading on MHC class I complexes, the ubiquitin proteasome system plays a crucial role. Moreover, the induction of the i-proteasome is known to support the generation of MHC class I ligands. Recently, new functions of the i-proteasome have been discovered. Evidence is increasing that the i-proteasome is involved in the protection of cells against oxidative stress. Within this thesis the characteristic of the i-proteasome to protect cells against the accumulation of oxidant-damaged proteins could be linked to its role in improving the generation of MHC class I ligands. It could be demonstrated that during a virus infection in non-immune cells the production of reactive oxygen species by the alternative NADPH oxidase Nox4 is of critical importance resulting in the accumulation of potentially toxic oxidant-damaged proteins. Indeed, within two hours of infection structural virus proteins were oxidized and subsequently poly-ubiquitylated. The concomitant formation of i-proteasomes led to a rapid and efficient degradation of ubiquitylated virus antigens thereby improving the liberation of immunodominant viral epitopes. In conclusion, a so far unknown mechanism to fuel proteasomal substrates into the MHC class I antigen presentation pathway has been revealed. A new protein pool consisting of exogenously delivered viral proteins provides proteasomal substrates in the very early phase of a virus infection. Within the scope of this thesis the i-proteasome has been shown to link the protection against oxidative stress, initiated directly by pathogen recognition, with the generation of antigenic peptides. Together, an effective adaptive immune response is triggered.

Bei der Hornhauttransplantation (Keratoplastik) handelt es sich um die häufigste Transplantation humanen Gewebes. Das Hornhautendothel, eine empfindliche Zellschicht auf der Innenseite der Kornea, verfügt nicht über die Fähigkeit, Zellverluste durch Proliferation auszugleichen. Zwei grundsätzliche Probleme ergeben sich aus dieser Eigenschaft des kornealen Endothels für die Keratoplastik: ein Endothelzellverlust tritt zum einen während der Hornhautkonservierung vor Keratoplastik auf und führt zu einem Ausschluss vieler Transplantate, zum anderen ist er oftmals im Zuge von immunvermittelten Abstoßungsreaktionen oder in Folge chronischer Vorgänge nach Keratoplastik zu beobachten. Aus diesem Grund ist eine möglichst hohe Endothelzelldichte auf kornealen Transplantaten eine Voraussetzung für den Erfolg einer Keratoplastik. Das erste Ziel dieser Arbeit war deshalb die Übertragung des Gens für den aziden FGF (aFGF) in korneale Endothelzellen mit Hilfe des nicht-viralen Gentransfers. Dazu wurden verschiedene Lipid-Formulationen für den Gentransfer in humane korneale Endothelzellen in vitro optimiert. Der Einsatz von DAC-30 und Lipofectin für den aFGF-Gentransfer führte zu einer deutlichen Proliferationssteigerung (um ca. 50 %) der Zellen, womit der Einsatz dieses Wachstumsfaktors eine gute Möglichkeit darzustellen scheint, die prä-operative Ausgangssituation kornealer Transplantate zu verbessern. Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit Untersuchungen zur Immunmodulation nach Keratoplastik. Eine Hauptrolle bei der Abstoßung kornealer Transplantate spielen CD4+ T- Lymphozyten. In anderen Transplantationsmodellen konnte durch die lokale Überexpression immunmodulatorischer Zytokine die Entstehung und Aktivierung dieser Zellen gehemmt und eine verlängerte Transplantatüberlebenszeit erzielt werden. Mit Hilfe gentherapeutischer Vektoren (Adenoviren, Liposomen) wurden die immunmodulatorischen Zytokine vIL-10 und rIL-4 ex vivo in korneale Transplantate eingebracht. Nach erfolgreichen in vitro- Untersuchungen zur Genexpression wurden die transduzierten/transfizierten Hornhäute in einem starken Abstoßungsmodell der Ratte transplantiert, was jedoch zu keiner signifikanten Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit führte. Diese Arbeit liefert Hinweise darauf, dass der lokale Gentransfer von vIL-10 in der Keratoplastik nicht für eine Immunmodulation geeignet ist, und dass sowohl die Zytokindosis, als auch der Zeitpunkt und der Ort der Vektorapplikation eine entscheidende Rolle für den Transplantationserfolg spielen. / Keratoplasty is the most common transplantation of human tissue. The corneal endothelium constitutes a damagable cell layer on the inner surface of the cornea, unable to proliferate. From this, two general problems arise for the outcome of keratoplasty: loss of corneal endothelial cells occurs on the one hand during corneal long time storage before keratoplasty and enforces the lack of donor tissue, on the other hand it is often correlated with immune mediated rejections as well as with chronic processes after keratoplasty. Therefore an endothelial cell number as high as possible on corneal grafts displays a requirement for successful keratoplasties. The first aim of this study was non-viral gene transfer of the aFGF (acidic FGF) gene in corneal endothelial cells. Different lipid formulations were optimized for gene transfer in human corneal endothelial cells in vitro. Application of DAC-30 and Lipofectin for aFGF gene transfer clearly showed a stimulating effect on cell proliferation (approximately 50 %). Thus, the use of aFGF seems to be a good possibility for improving the pre-operative situation of corneal allografts. The second part of this study deals with the immune modulation after keratoplasty. CD4+ T- lymphocytes play a key role in rejection processes after keratoplasty. Local over expression of immunomodulatory cytokines in different transplantation models could inhibit the development and activation of these cells and was able to prolong the allograft survival time. Using different gene therapeutic vectors (adenoviruses, liposomes) the immunomodulatory cytokines vIL-10 and rIL-4 were transferred ex vivo in corneal allografts. After successfully determined gene expression in vitro, the transduced/transfected corneal allografts were transplanted in a strong rejection model of the rat. However, this was not sufficient in prolonging the graft survival time significantly. This study provides indications, that local gene transfer of vIL-10 in keratoplasty is not suitable for an immune modulation, and that both cytokine dose as well as time point and site of vector application play an important role for successful transplantation.

Influenza Viren stellen eine große Bedrohung der öffentlichen Gesundheit dar. Die saisonale Grippeschutzimpfung induziert Antikörper gegen den Kopfbereich des viralen Oberflächenproteins Hämagglutinin (HA), in dem verstärkt Antigendrift auftritt. Dadurch wird die Effektivität der saisonalen Grippeimpfung auf den Impfstamm beschränkt und es besteht kein ausreichender Schutz gegen virale Driftvarianten. Eine universellere Grippeimpfung wird dringend benötigt. Die Entdeckung breit reaktiver Antikörper gegen den konservierten HA-Stammbereich hat die Erforschung neuartiger Impfstrategien vorangetrieben. Mit Chimären oder Headless HA kann eine Fokussierung der Immunantwort auf immunsubdominante Bereiche im HA-Stammbereich erzielt werden. Auch innovative Impfstoffplattformen wie Adeno-assoziierte Virus (AAV)-Vektoren bergen ein immenses Potenzial, da sie zum einen für die Verwendung im Menschen zugelassen sind und zum anderen die Immunogenität des Antigens positiv beeinflusst. Die Immunisierung mit AAV-Vektoren, die wildtypisches HA, Chimäre HA oder Nukleoprotein exprimieren, führte in dieser Arbeit in Mäusen zur Induktion breit reaktiver Antikörper, nicht aber die Immunisierung mit AAV-Headless HA oder inaktiviertem Grippeimpfstoff. Die AAV-Vektor Impfstoffe führten zur robusten Induktion Fc-Gamma-Rezeptor-aktivierender Antikörper, die beispielsweise Antikörper-vermittelte zelluläre Zytotoxizität auslösen können. Nicht nur die Impfung mit AAV-Chimären HA, sondern auch mit AAV-wildtypischem HA induzierte Antikörper gegen den HA-Stammbereich. Somit kann anscheinend allein durch eine AAV-Vektor vermittelte Expression des Antigens die Immundominanz des HA-Kopfbereiches abgemildert werden. Abschließend konnte zum ersten Mal die Schutzwirkung einer AAV-Vektor Immunisierung gegen HA im Frettchen demonstriert werden. Die in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse zeigen somit das große Potenzial von AAV-Vektoren als Impfvehikel für eine breit reaktive Grippeschutzimpfung auf. / Influenza viruses represent a severe threat to public health. A seasonal vaccine is available, which readily leads to the induction of antibodies against the head domain of the viral surface protein hemagglutinin (HA), which is prone to antigenic drift. Thus, seasonal vaccination induces only strain specific protection, while it is not effective against drifted virus strains. Hence, there is an urgent need for a universal influenza vaccine. The discovery of broadly reactive antibodies against the highly conserved HA-stalk domain has prompted great interest into research on vaccination strategies to induce broadly protective HA antibodies. Chimeric and headless HA have shown promising results with respect to re-focusing immunity towards immunosubdominant epitopes in the HA-stalk to induce protective HA-stalk antibodies. Also, innovative vaccine delivery platforms such as Adeno-associated virus (AAV)-vectors offer an attractive developmental perspective. AAV-vectors are licensed for use in humans and the AAV-vectored antigen expression positively influences its immunogenicity. In this thesis, immunization with AAV-vectors expressing wildtype HA, chimeric HA or nucleoprotein induced broad protection in mice, but not vaccination with AAV-vectors expressing headless HA or an inactivated influenza vaccine. Protection was associated with the ability of the AAV-vectored vaccines to induce Fc-gamma-receptor-activating antibodies, which might activate antibody-dependent cellular cytotoxicity. Not only chimeric HA but also wildtype HA induced antibodies against the HA-stalk, suggesting that AAV-vectored antigen expression can mitigate the immunodominance of virus strain-specific epitopes in the HA-head. Importantly, for the first time a protective effect AAV-vectored immunization towards HA could be shown in ferrets. Thus, results described in this thesis suggest a large potential for the development of AAV-vectors as carriers for a broadly protective influenza vaccine.