Acinetobacter baumannii é considerado um dos patógenos de maior importância clínica atualmente, sendo responsável por uma variedade de infeções nosocomiais como, bacteremias, infecções no trato urinário, pneumonias associadas a ventilação mecânica, meningites secundárias e infecções em feridas. Desde a última década o tratamento de infecções por Acinetobacter spp. vem sendo dificultado pela emergência de cepas multirresistentes. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi determinar a dinâmica populacional e as características moleculares envolvidas na resistência de Acinetobacter spp. Foram avaliados isolados de Acinetobacter spp. provenientes de seis hospitais da cidade de Porto Alegre coletados entre janeiro de 2013 e março de 2014. A espécie Acinetobacter baumannii foi identificada pela presença do gene blaOXA-51, além de PCR multiplex para o gene gyrB. Carbapenemases (blaNDM, blaOXA-23-like, blaOXA-24/40-like, blaOXA-58-like e blaOXA-143-like), além dos integrons de classe 1 e 2 foram pesquisados por PCR. Um total de 524 isolados de Acinetobacter spp. foram coletados, e a maioria (487/92,9%) foram identificados como A. baumannii, seguidos pelas espécies A. nosocomialis (9/1,7%), A. pittii (3/0,6%), A. calcoaceticus (3/0,6%) e por fim, 22 (4,2%) isolados não pertenciam ao complexo A. baumannii-calcoaceticus. Quanto ao perfil de sensibilidade, 83% dos isolados demonstraram não ser sensíveis aos carbapenêmicos (imipenem e meropenem). Dos isolados de A. baumannii, 429 (88,1%) continham o gene blaOXA-23, além disso, foram observados dois isolados de A. nosocomialis contendo o gene blaOXA-23. Foi possível identificar dois isolados de A. baumannii produtores de blaOXA24/40 (0,8%) pela primeira vez na região Sul do país. A análise do gene por sequenciamento caracterizou como sendo a variante blaOXA-72, e a tipagem por MLST caracterizou os isolados como pertencentes a ST730 (CC79). Também foram analisados por MLST, isolados produtores de OXA-72 do estado de São Paulo e do Paraná. A análise dos dados demonstrou que estes isolados estão associados aos complexos clonais epidêmicos CC15 e CC79. A pesquisa para o gene blaNDM foi positiva para um isolado de A. pittii, sendo o primeiro isolado de Acinetobacter não baumannii produtor de NDM-1 no Brasil. A análise do contexto genético de blaNDM-1 demonstrou a presença de ISAba125 upstream ao gene, além disso, o gene demonstrou estar localizado no cromossomo da bactéria. Foi observada uma maior prevalência de integrons de classe 2 nos isolados avaliados (134/25,5%), quando comparada aos integrons de classe 1 (72/13,7%). Raros (2/0,4%) isolados apresentaram ambas as classes de integrons. Um total 244 isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos foram submetidos à tipagem por REP-PCR, que demonstrou a presença de 20 grupos clonais entre os isolados analisados. Isolados de diferentes grupos clonais foram selecionados para a tipagem por MLST. Com o objetivo de realizarmos uma análise longitudinal dos clones circulantes desde o primeiro surto de Acinetobacter baumannii resistente aos carbapenêmicos (CRAB) na cidade de Porto Alegre, também foram selecionados para análise por MLST isolados de A. baumannii pertencentes ao nosso banco de dados com diferentes perfis clonais, coletados entre 2007 e 2008. Através da análise dos dados gerados pelo MLST no banco de dados do Instituto Pasteur, foram descritas 13 novas STs: ST883 (CC32), ST884 (CC221), ST885 (CC79), ST886, ST887, ST888, ST889 (CC464), ST892 (CC15), ST899, ST902 (CC1), ST903 (CC79), ST904 (CC15) e ST905 (CC32). A avaliação da dinâmica populacional de A. baumannii nos dois períodos avaliados demonstrou a permanência de isolados pertencentes aos complexos clonais CC15 e CC79 desde o período do primeiro surto de CRAB da cidade de Porto Alegre até o ano de 2014, demonstrando a capacidade desses clones de se manter por longos períodos no ambiente hospitalar. Além disso, estes CCs apresentaram uma elevada prevalência durante o primeiro período avaliado (2007-2008). Este dado que nos permite inferir que o primeiro surto de CRAB produtor de OXA-23 da cidade de Porto Alegre foi relacionado a disseminação de CC15 e CC79. / Acinetobacter baumannii is considered one of the main pathogens of clinical importance currently, being responsible for a wide range of nosocomial infections such as, bacteremias, urinary tract infections, ventilator-associated pneumonia, secondary meningitis and wound infections. Since the last decade the treatment of these infections has been impaired by the emergence of multiresistant strains. In this context, the aim of this study was to determine the population dynamic and the molecular characteristics involved in Acinetobacter spp. resistance. A total of 524 Acinetobacter spp. isolates were collected from six Porto Alegre hospitals from January 2013 to March 2014. A. baumannii species were identified by the presence of blaOXA-51 gene and by the gyrB multiplex PCR. Carbapenemase genes (blaNDM, blaOXA-23-like, blaOXA-24/40-like, blaOXA-58-like and blaOXA-143-like) as well as class 1 and 2 integrons were investigated by PCR. As expected, the majority (487/92.9%) of isolates were identified as A. baumannii, followed by A. nosocomialis (9/1.7%), A. pittii (3/0.6%), and A. calcoaceticus (3/0.6%). A total of 22 (4.2%) isolates were not identified as A. baumannii-calcoaceticus complex. Analysis of the susceptibility profile demonstrated that 83% of the isolates were not susceptible to carbapenems (imipenem e meropenem). Among the A. baumannii isolates, 429/487 (88.1%) presented blaOXA-23 gene. Two A. nosocomialis isolates also presented the blaOXA-23 gene. We also found, for the first time in Southern Brazil, two A. baumannii isolates containing blaOXA24/40 (0.8%). The sequencing of blaOXA24/40 identified the variant blaOXA-72, and MLST analysis characterized both isolates as ST730 (CC79). In addition, OXA-72-producing A. baumannii isolates from the states of São Paulo and Paraná were analyzed by MLST. Data analysis demonstrated that the isolates were associated to the clonal complexes CC15 and CC79. The screening of blaNDM gene was positive for an A. pittii isolate. Therewith, in the present study we described for the first time a Acinetobacter non-baumannii producing NDM-1 in Brazil. Analysis of the genetic environment of blaNDM-1 gene demonstrated the presence of ISAba125 upstream of the gene and that the gene was chromosome-located in A. pittii. It was observed an increased prevalence of class 2 integrons (134/25.5%) compared to class 1 integrons (72/13.7%). Only a few isolates presented both classes (2/0.4%). A total of 244 carbapenem-resistant A. baumannii isolates were typed by REP-PCR, which demonstrated the presence of 20 clonal groups. Isolates belonging to different clonal groups were selected for MLST typing. In order to conduct a longitudinal analysis of circulating clones from the first CRAB outbreak in the city of Porto Alegre, we also selected A. baumannii isolates with different clonal profiles collected between 2007 and 2008. According to MLST database from Pasteur Institute, we identified 13 new STs: ST883 (CC32), ST884 (CC221), ST885 (CC79), ST886, ST887, ST888, ST889 (CC464), ST892 (CC15), ST899, ST902 (CC1), ST903 (CC79), ST904 (CC15) and ST905 (CC32). The analysis of A. baumannii population dynamics in the two periods of the study demonstrated the persistence of the clonal complexes CC15 and CC79 from the first CRAB outbreak in Porto Alegre city, up to the year of 2014. Besides, these CCs presented a high prevalence during the first period (2007-2008) evaluated. These data allow us to infer that the first CRAB OXA-23-producing outbreak in Porto Alegre city was related to the dissemination of CC15 and CC79.

Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos associados a infecções nosocomiais, incluindo pneumonias, meningites secundárias, infecções urinárias e bacteremias. Esse microrganismo apresenta uma grande capacidade de se disseminar, além de adquirir novos mecanismos de resistência. Devido a essas propriedades, numerosos surtos de Acinetobacter baumannii multirresistente têm sido relatados em diversos países, inclusive no Brasil. O objetivo deste estudo foi analisar mecanismos envolvidos na resistência em Acinetobacter baumannii, avaliando a relação de elementos promotores com o aumento da resistência aos carbapenêmicos, além de analisar a presença de integrons envolvidos na disseminação de genes de resistência. Este foi um estudo transversal experimental no qual foram incluídas amostras provenientes de cinco hospitais da cidade de Porto Alegre obtidas no período de julho de 2007 a junho de 2008. Foram selecionados 41 isolados resistentes aos carbapenêmicos representantes de diferentes clones determinados por pulsed field gel eletrophoresis (PFGE) além de 17 amostras sensíveis aos carbapenêmicos, totalizando 58 isolados no estudo. Todos os isolados analisados apresentaram o gene blaOXA-51-like, caracterizando a espécie A. baumannii. Integrons de classe 2 foram os mais prevalentes (50; 86.2%) nos isolados testados, entretanto, integrons de classe 1 (15; 25.9%) também foram detectados. O elemento de inserção ISAba1 foi evidenciado em associação com o gene blaOXA-23-like em 36 isolados resistentes, e demonstrou uma significativa relação (p<0,001) com o aumento das concentrações inibitórias mínimas (MICs) dos carbapenêmicos imipenem e meropenem. A associação de ISAba1 com blaOXA-51-like não apresentou relação com aumento das MICs para os carbapenêmicos. A partir dos dados mostrados nesse trabalho, demonstramos a importância do elemento ISAba1, quando associado ao gene blaOXA-23-like, no aumento dos níveis de resistência aos carbapenêmicos meropenem e imipenem. A presença de integrons em todos os isolados resistentes aos carbapenêmicos reitera a importância desses elementos na disseminação de determinantes da resistência entre isolados de A. baumannii.

Acinetobacter baumannii é um patógeno nosocomial que está envolvido em um amplo espectro de infeções hospitalares. A maior preocupação atual é devido a sua alta capacidade de adquirir mecanismos de resistência, principalmente aos carbapenêmicos, fármacos utilizados normalmente para o tratamento dessas infecções. Desta forma, as opções terapêuticas tornam-se restritas e por isso, as polimixinas (polimixina B e colistina) voltaram a serem utilizadas na prática clínica. A heterorresistência a colistina já foi descrita em estudos recentes com isolados de A. baumannii e outros estudos detectaram a presença de resistência adaptativa as polimixinas. O objetivo deste estudo foi investigar a presença do fenômeno de heterorresistência e resistência adaptativa a polimixina B, e avaliar sua estabilidade. A pesquisa foi feita em isolados pertencentes a 15 clones diferentes de A. baumannii resistentes aos carbapenênicos e sensíveis a polimixina B. A avaliação da heterorresistência foi feita através da análise do perfil da população (PAP) para 29 isolados, selecionados aleatoriamente (pelo menos um de cada clone). A indução da resistência foi avaliada para 22 isolados, selecionados aleatoriamente (pelo menos um de cada clone), submetendo os isolados ao cultivo em concentrações crescentes de polimixina B. A determinação da estabilidade das subpopulações e da indução da resistência foi feita através de passagens, em dias consecutivos, em meio livre de antibiótico. Foram consideradas subpopulações heterogêneas aquele isolado que possuía colônias com uma CIM maior do que a população original para polimixina B. A CIM foi reavaliada após 75 e 60 dias de estocagem em -80ºC para os isolados que apresentaram subpopulação heterogênea ou indução da resistência para a polimixina B, respectivamente. Dos 29 isolados, submetidos a avaliação da heterorresistência, 26 (90%) apresentaram subpopulações heterogêneas para polimixina B. Nenhum isolado apresentou subpopulação superior a 2 μg/mL para polimixina B, ou seja, não foi encontrado neste estudo subpopulações heterorresistentes. As CIMs das subpopulações heterogêneas permaneceram iguais após os subcultivos em meio livre de antibiótico, mas quando a CIM foi reavaliada depois da estocagem, os valores obtidos foram os mesmos da população original. Dos 22 isolados submetidos a indução de resistência, 12 (55%) apresentaram algum crescimento até a concentração de 64 μg/mL de polimixina B. Após as passagens em meio livre de antibiótico a CIM diminuiu, voltando a CIM original na reavaliação após a estocagem a -80ºC. Este estudo mostra pela primeira vez a avaliação da heterorresistência e indução da resistência para polimixina B em isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos. O fenômeno de heterorresistência não foi encontrado neste estudo, no entanto, subpopulações com uma CIM maior do que a original foram identificadas em 90% dos isolados. As CIMs das subpopulações permaneceram estáveis após 4 dias de passagens em meio livre de antibiótico, mas retornaram a CIM original após estocagem, o que sugere o envolvimento de mecanismos moleculares neste fenômeno. A presença da resistência induzida a polimixina B foi detectada em 55% dos isolados, sugerindo que este fenômeno pode ser comum entre os isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos, frente a polimixina B. Embora a presença de subpopulações heterogêneas e a indução da resistência a polimixina B tenha sido comum neste estudo, mais estudos são necessários para um melhor entendimento do significado clínico e das implicações terapêuticas destes dois fenômenos.

Introdução: O gênero Acinetobacter sp apresenta considerável heterogeneidade possuindo inúmeras espécies. Atualmente, 23 espécies já foram nomeadas e nove outras espécies já foram descritas. Quatro destas espécies possuem contextos clínicos e epidemiológicos diferentes, no entanto são agrupadas em um complexo denominado Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii (ABC) devido à sua similaridade genética e fenotípica. Diversos testes para diferenciação do complexo já foram descritos, porém a maioria não pode ser realizado na rotina laboratorial, pois são caros e laboriosos. Objetivos: Avaliar um método rápido e viável na rotina laboratorial, capaz de diferenciar as espécies do complexo ABC; Determinar a prevalência das diferentes espécies do complexo ABC; Avaliar o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos nas diferentes espécies. Métodos: Foram analisadas 118 amostras de dois hospitais de Porto Alegre-RS através do método Multiplex PCR para o gene gyrB e posteriormente confirmadas pelo padrão-ouro: sequenciamento do 16S-23S ITS. O perfil de suscetibilidade foi realizado através de microdiluição em caldo. Resultados: Das 118 amostras identificadas inicialmente como Acinetobacter sp., a grande maioria dos isolados (106 -89.9%) foram identificados como A. baumannii; mas doze isolados foram identificados como sendo das demais espécies do complexo ABC: 6 (5.1%) A. nosocomialis, 5 (4.2%) A. pittii, e 1 (0.8%) A. genoespécie 10, através da técnica de Multiplex PCR. Todos os resultados foram confirmados por sequenciamento. A. baumannii apresentou um elevado nível (72,6%) de resistência ao imipenem em comparação com as outras espécies seguido da espécie A. nosocomialis que apresentou metade de seus isolados resistentes. Todas as espécies apresentaram baixos índices (inferior a 7,5%) de resistência à Polimixina B e Tigeciclina. Conclusão: O Multiplex PCR para o gene gyrB apresentou resultados fidedignos quando comparados ao padrão-ouro, demonstrando, assim, ser um método confiável para a identificação das espécies do complexo ABC. Outras espécies, além de A. baumannii, ABC podem apresentar percentuais significativos de resistência ao imipenem. / Background: Introduction: The genus Acinetobacter sp presents considerable heterogeneity possessing numerous species. Currently, 23 species have been named and nine other species have been described. Four of these species have different clinical and epidemiological contexts, but are grouped in a complex called Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii (ABC) due to their genetic and phenotypic similarity. Several tests for differentiation of the complex have been described, but most can not be performed routinely in the laboratory, they are expensive and laborious. Objectives: To evaluate a fast and feasible in routine laboratory able to differentiate the species of the complex ABC; determine the prevalence of different species of the complex ABC; evaluate the antimicrobial susceptibility profile of the different species. Methods: We analyzed 118 samples from two hospitals in Porto Alegre-RS by the method of Multiplex PCR for gene gyrB and subsequently confirmed by the gold standard: sequencing the 16S-23S ITS. The susceptibility profile was performed by microdilution. Results: Of the 118 samples initially identified as Acinetobacter sp. The great majority of isolates (106 -89.9%) were identified as A. baumannii, but twelve isolates were identified as being from other species of the complex ABC: 6 (5.1%) A. nosocomialis, 5 (4.2%) A. pittii, and 1 (0.8%) A. genospécie 10 by Multiplex PCR technique. All results were confirmed by sequencing. A. baumannii showed a high level (72.6%) of imipenem resistance in comparison with the other species followed by the species A. nosocomialis showed that half of his resistant isolates. All species showed low levels (less than 7.5%) of resistance to Polymyxin B and Tigecycline. Conclusion: Multiplex PCR for gene gyrB results presented totally reliable when compared to the gold standard, demonstrating thus be a safe method for the laboratory. Other species besides A. baumannii, ABC may have significant percentages of resistance to imipenem.

A capacidade de adquirir, com facilidade, resistência à terapia antimicrobiana torna-se uma das características mais estudadas em Acinetobacter sp., mundialmente conhecido por estar relacionado a surtos de infecções associadas à assistência a saúde (IAAS) e por ser apontado como um grave problema de saúde pública. Embora isolados clínicos desse gênero sejam extensivamente estudados quanto à presença e a diversidade de genes do tipo OXA-carbapenemases,existem poucos estudos sobre essa relação em isolados ambientais. Este trabalho teve como objetivo determinar a presença de carbapenemases do tipo OXA (e sua diversidade), de ISAba1 e de sua relação com as carbapenemases em isolados clínicos e de esgoto hospitalar de Acinetobacter sp. na cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul. Um total de 310 isolados (145 clínicos e 165 ambientais) foram submetidos a análise por PCR das regiões genéticas de interesse. A diversidade dos genes do tipo blaOXA-51 foi realizada por DGGE. Os resultados indicam a presença do gene blaOXA-58 em um isolado, pela primeira vez no Brasil. A sequência ISAba1 foi frequentemente encontrada (92,9%), porém, a sua associação com blaOXA-51 foi baixa e encontrada em 9,8% dos isolados clínicos e em 6,5% dos isolados ambientais. A análise de diversidade revelou uma baixa freqüência de alelos de OXA-51 entre os isolados estudados, sendo blaOXA-65 a variante mais encontrada. Contudo, podemos afirmar que o esgoto hospitalar analisado constitui-se de uma fonte de contaminação de bactérias patogênicas e que as precárias políticas de saneamento podem proporcionar a disseminação de multirresistência para o meio ambiente. / The ability of easily acquiring resistance to antimicrobial therapy becomes one of the most studied features in Acinetobacter sp., world renowned for being related to outbreaks of infection associated with health care and for being appointed as a serious public health problem. Although clinical isolates of this genus are extensively studied for the presence and diversity of OXAcarbapenemase genes, there are few studies about this relationship in environmental isolates. This study aimed to determine the presence of OXAtype carbapenemases (and yours diversity), of ISAba1 and its relationship with carbapenemases in clinical and hospital sewage isolates of Acinetobacter sp. in Porto Alegre, Rio Grande do Sul. A total of 310 strains (145 of clinical origin and 165 of environmental origin) were subjected to PCR analysis of genetic regions of interest. The diversity of blaOXA-51-like genes was performed by DGGE. The results indicate the presence of the gene blaOXA-58 in an isolated, for the first time in Brazil. ISAba1 was frequently found (92.9%) but its association with blaOXA-51-like was low and was found in 9.8% of clinical isolates and in 6.5% of environmental isolates. The diversity analysis showed that there is a low frequency of alleles of OXA-51 among the studied isolates being blaOXA-65 variant the most often found. However, we can state that the hospital sewage is considered to be a source of pathogenic bacteria contamination and that the poor sanitation politics contributes to the spread of multidrug resistance in the environment.

Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos associados a infecções nosocomiais, incluindo pneumonias, meningites secundárias, infecções urinárias e bacteremias. Esse microrganismo apresenta uma grande capacidade de se disseminar, além de adquirir novos mecanismos de resistência. Devido a essas propriedades, numerosos surtos de Acinetobacter baumannii multirresistente têm sido relatados em diversos países, inclusive no Brasil. O objetivo deste estudo foi analisar mecanismos envolvidos na resistência em Acinetobacter baumannii, avaliando a relação de elementos promotores com o aumento da resistência aos carbapenêmicos, além de analisar a presença de integrons envolvidos na disseminação de genes de resistência. Este foi um estudo transversal experimental no qual foram incluídas amostras provenientes de cinco hospitais da cidade de Porto Alegre obtidas no período de julho de 2007 a junho de 2008. Foram selecionados 41 isolados resistentes aos carbapenêmicos representantes de diferentes clones determinados por pulsed field gel eletrophoresis (PFGE) além de 17 amostras sensíveis aos carbapenêmicos, totalizando 58 isolados no estudo. Todos os isolados analisados apresentaram o gene blaOXA-51-like, caracterizando a espécie A. baumannii. Integrons de classe 2 foram os mais prevalentes (50; 86.2%) nos isolados testados, entretanto, integrons de classe 1 (15; 25.9%) também foram detectados. O elemento de inserção ISAba1 foi evidenciado em associação com o gene blaOXA-23-like em 36 isolados resistentes, e demonstrou uma significativa relação (p<0,001) com o aumento das concentrações inibitórias mínimas (MICs) dos carbapenêmicos imipenem e meropenem. A associação de ISAba1 com blaOXA-51-like não apresentou relação com aumento das MICs para os carbapenêmicos. A partir dos dados mostrados nesse trabalho, demonstramos a importância do elemento ISAba1, quando associado ao gene blaOXA-23-like, no aumento dos níveis de resistência aos carbapenêmicos meropenem e imipenem. A presença de integrons em todos os isolados resistentes aos carbapenêmicos reitera a importância desses elementos na disseminação de determinantes da resistência entre isolados de A. baumannii.

Acinetobacter baumannii is an important microorganism involved in hospital-acquired infections with a remarkable ability to develop resistance to multiple antibiotics (multidrug-resistance, MDR) which makes it a highly troublesome pathogen in many hospitals around the world. Third-generation cephalosporins (such as ceftazidime) and carbapenems (such as imipenem and meropenem) represent important treatment options for infections caused by this microorganism. Nevertheless, the number of strains resistant to these antibiotics has been increasing during the last decade. The ability to capture, mobilise and regulate the expression of resistance-genes of this microorganism is a cornerstone factor in the development of the MDR, where the Mobilome, defined as “all the mobile genetic elements in a cell”, is responsible for its genetic plasticity. The aim of this work was to analyse the role of insertion sequences (ISs), transposon-like structures, resistance-plasmids and ISCR1-like elements in the resistance to carbapenems and ceftazidime in A. baumannii. Fifteen carbapanem-resistant strains of Acinetobacter baumannii isolated from Chile and two ceftazidime-resistant strains from the United Arab Emirates were studied. Different ceftazidime- and carbapenem-resistance genes were analysed and their genetic environments were characterised. The Mobilome in the carbapenem-resistant strains was composed of insertion sequences (ISs), specifically by ISAba1 associated with blaOXA-51-like, ISAba3 associated to blaOXA-58, which in turn was detected in two different plasmids, and ISAba15 interrupting ISAba3. In the case of the ceftazidime-resistant strain, the presence of an ISCR1 element was harbouring the blaPER-7, which was detected in a megaplasmid. The Mobilome, in the strains analysed, was composed of a wide variety of genetic elements, such as plasmids, insertion sequences, ISCR-like elements, which reflects the ability of A. baumannii to use different genetic platforms to capture and use resistance genes, making the Mobilome an important contributor in the resistance and the dissemination of resistance genes among nosocomial pathogens around the world.

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Acinetobacter spp é um dos mais freqüentes agentes de infecções nosocomiais nos hospitais brasileiros. Vários surtos hospitalares causados por Acinetobacter resistente aos carbapenêmicos já foram descritos no Brasil. O presente estudo verificou a presença de alteração de proteínas da membrana externa e produção de carbapenemases em cepas de Acinetobacter spp. resistentes aos carbapenêmicos isoladas de corrente sanguínea de pacientes internados no HC-FMUSP. Os isolados foram identificados pelo método miniaturizado API20NE. As concentrações inibitórias mínimas dos carbapenêmicos foram realizadas através da técnica de microdiluição em caldo. As carbapenemases foram estudas através de testes fenotípicos, detecção dos genes foi realizada pela reação de amplificação em cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento e hidrólise de imipenem. As proteínas de membrana externa foram caracterizadas através da técnica de SDS-Page e PCR. A tipagem molecular foi realizada usando a técnica de eletroforese em campo pulsado. Noventa e oito por cento dos isolados apresentaram genes codificadores da enzima Oxa-51-like, sendo que a única amostra que não apresentou essa enzima, após seqüenciamento do gene codificador da porção 16S do RNA ribossomal, foi considerada da espécie A. calcoaceticus. A presença do gene blaoxa-51-like não foi encontrada adjacente a seqüência ISAba1. Em dezoito por cento do total das amostras foi detectada pela reação de PCR o gene blaoxa-51-like/oxa-23- like, sendo que sete desses isolados pertenciam ao mesmo clone. Somente em um isolado não foi detectada a presença do grupamento ISAba-1 adjacente ao gene codificador da enzima Oxa-23. Dessas amostras apenas uma hidrolisou o antimicrobiano imipenem. Cinco isolados apresentaram o gene blaimp (IMP-1 pelo seqüenciamento). Apenas dois desses isolados se mostraram capazes de hidrolisar imipenem e através da inibição com o EDTA confirmou-se a presença da produção de enzimas Metalo-- lactamase. Vários testes fenotípicos foram utilizados para a detecção de carbapenemase como DDST, CD e Etest. Quando comparados com a PCR (metodologia padrão-ouro), os melhores resultados foram observados com a aproximação de disco de imipenem (10g) com um disco contendo 3L do ácido -mercaptoetanol não diluído (sensibilidade de 100% e especificidade de 71%). Observou-se que na maioria dos isolados, as proteínas de membrana externa analisadas estavam diminuídas ou ausentes. Três isolados apresentaram ausência dessas proteínas, suas CIM variaram de 32 a 128g/mL e de 64 a 256g/mL para o imipenem e meropenem respectivamente. O presente estudo verificou que a resistência aos carbapenêmicos está relacionada à presença de carbapenemases e alterações de membrana externa. Além disso, a importância das carbapenemases como principal mecanismo de resistência em isolados de Acinetobacter deve ser melhor investigada, já que esses genes podem não estar sendo expressos / Acinetobacter spp is an important etiologic agent causing nasocomial infection in Brazilian hospitals. Carbapenem resistance among this agent has been increasing in the last decade, and several outbreaks due to resistant Acinetobacter had been identified in Brazil. This study verified the presence of altered outer membrane proteins and production of carbapenemase in carbapenem-resistant Acinetobacter spp. strains isolated from bloodstream infections of patients hospitalized in the HC-FMUSP. This study verified the presence of altered outer membrane proteins and production of carbapenemase in Acinetobacter spp. carbapenem-resistant strains isolated from bloodstream of patients hospitalized in the HC-FMUSP. The isolates were identified by miniatured method API20NE and the miminal inhibitory concentration of carbepenem was performed by broth microdilution. Carbapenemases were studied by phenotypic screnning tests, detection of its genes coder by amplification polymerase chain reaction (PCR), sequence and imipenem hydrolise. The proteins of external membrane were studied by SDS-PAGE and PCR. Molecular typing was performed using the technique of pulsed field gel electrophoresis. About 98% of these isolates were positives for genes encoding the enzyme Oxa-51-like, only one strain did not exhibit this enzyme. After sequencing of the gene encoding portion 16S ribosomal RNA this strain was considered the species A. calcoaceticus. The presence of the sequence adjacent ISAba1 was not found in none of these isolates with the gene blaOXA-51-like. Eighteen percent of the total of strains demonstrated by PCR the gene blaoxa-51-like/oxa-23-like. Seven of these strains belonged to the same clone. Only one isolate did not show the presence of ISAba1 adjacent to the gene encoding Oxa-23. Only one of this strain hydrolyzed imipenem. Five isolates had the gene blaimp, (IMP-1 by sequencing). Two of these isolates had proved capable of hydrolyzing the antibiotic imipenem and the inhibition with EDTA confirmed the presence of MBL-producing enzymes. Several phenotypic tests were used to screnning of carbapenemase as DDST, CD and Etest. When compared with PCR, the gold standard, the best results were seen with the next disk of imipenem (10 mg) with another disk containing 3L acid -mercaptoethanol pure (100% sensitivity and specificity 71%). In most isolates the outer membrane proteins were decreased or absent. Three isolate showed total absence of these proteins, their MIC ranged from 32 to 64 to 128g/mL and 256g/mL to imipenem and meropenem respectively. This study has shown that carbapenem resistance was linked to the presence of carbapemenases and alteration of the outer membrane. Moreover, the significance of carbapenemase as the main mechanism of resistance in isolates of Acinetobacter should be better investigated, since these genes might not be cast

A resistência aos carbapenêmicos em amostras de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter spp aumentou na última década. Vários surtos causados por esses agentes já foram descritos no Brasil. O presente estudo comparou métodos fenotípicos de triagem de carbapenemase em P. aeruginosa e Acinetobacter spp. isolados de hemoculturas de pacientes internados no HC-FMUSP. Foram estudados 108 isolados de P. aeruginosa identificados por sistema automatizado Vitek® e 50 isolados Acinetobacter spp. identificados pelo método miniaturizado API20NE. A determinação inibitória mínima dos carbapenêmicos foi realizada pela técnica de microdiluição em caldo e a tipagem molecular pela técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE). Os genes codificadores de carbapenemase foram identificados por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e foi avaliada a hidrólise de imipenem de todos os isolados positivos para esses genes. Sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo e positivo dos testes fenotípicos foram calculados usando como padrão-ouro a detecção dos genes codificadores das carbapenemases por PCR. Nos isolados de Acinetobacter spp, foram pesquisados os genes das oxacilinases, dos quais quarenta e nove (98%) apresentaram pela técnica de PCR genes codificadores da enzima Oxa-51-like, sendo que um isolado não apresentou essa enzima e após sequenciamento do gene codificador da porção 16S do RNA ribossomal, foi considerado da espécie A. calcoaceticus. Em trinta e oito (76%) dos isolados foi detectado o gene blaOXA-143, em nove (18%) foi detectado o gene blaOXA-23, sendo que sete desses isolados pertenciam ao mesmo clone. Apenas cinco (10%) isolados de Acinetobacter spp apresentaram o gene blaIMP-1. Para os isolados de P. aeruginosa o gene blaSPM-1 foi o mais frequente sendo identificado em vinte e um (19,4%) dos isolados e quatro (3,7%) foi identificado com o gene blaVIM-2. Nove dos vinte e um isolados positivo para gene blaSPM-1, apresentaram a mesma clonalidade. O gene codificador blaGES-5 foi encontrado em quatro (3,7%) dos isolados de P. aeruginosa. Dos vinte quatro isolados P. aeruginosa que apresentaram gene codificador da M?L, apenas um isolado não hidrolisou IMI entre os Acinetobacter spp e apenas dois dos cincos isolados positivos para o gene codificador de M?L, hidrolisaram o IMI e apresentaram inibição com o EDTA. Dos vários testes fenotípicos realizados, os melhores resultados foram observados com Etest® M?L para ambos microrganismos com sensibilidade de 100%, mas esse teste foi pouco específico. Para os isolados de Acinetobacter spp o melhor resultado foi observado com o teste de aproximação de disco de IMI com disco de ABM, que apresentou sensibilidade de 100% e especificidade de 71% e para P. aeruginosa foi a aproximação de disco de CAZ com um disco de EDTA, que apresentou sensibilidade de 48% e especificidade de 93%. O presente estudo verificou que não existe um único teste fenotípico que consiga identificar carbapenemases nesses isolados e que a performace dos testes varia de acordo com as carbapenemases encontradas / Carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp increased in the last decade. Several outbreaks caused by these agents resistant to carbapenems have been reported in Brazil. This study compared several phenotypic methods for screening of carbapenemase in P. aeruginosa and Acinetobacter spp isolated from blood cultures of hospitalized patients in HCFMUSP. One hundred and eight isolates were studied of P. aeruginosa identified by the automated system Vitek® and fifty isolates Acinetobacter spp identified by the API20NE method miniaturized. The determination of cabapenem minimum inhibitory was performed by the microdilution broth. Molecular typing was performed using the technique of pulsed field gel electrophoresis (PFGE). Genes encoding carbapenemase were identified by the technique of polymerase chain reaction (PCR) and was evaluated by hydrolysis of imipenem of all the positives isolates. Sensitivity, specificity, positive and negative predictive value of phenotypic tests were calculated using as the gold standard the detection of genes encoding carbapenemases by PCR. Oxacilinases genes were evaluated in isolates of Acinetobacter spp, of which forty-nine (98%) exhibited by PCR enzyme- encoding gene OXA-51-like, and the one isolate that did not show this enzyme, after gene sequencing encoding portion 16S ribosomal RNA was considered the species A. calcoaceticus. In thirty-eight (76%) isolates the gene OXA-143- like was detected and seven belonged to the same clone. Only five (10%) isolates of Acinetobacter spp showed the gene blaIMP-1. For the isolates of P. aeruginosa, gene blaSPM-1 was the most frequent being present in twenty-one (19,4%) isolates and four (3,7%) was identified with the gene blaVIM-2. Nine of the twenty-one isolates positive for gene blaSPM-1, showed the same clonality. The gene encoding blaGES-5 was found in four (3,7%) isolates of P. aeruginosa. Among the twenty-four isolates P. aeruginosa harboring M?L, not only one isolated hydrolyzed IMI, between Acinetobacter spp two of five isolates harboring M?L hydrolyzed IMI that was inhibited by EDTA. Of the various phenotypic tests conducted, the best results were observed for Etest® for both micro-organisms with sensitivity 100%, but this test was not specific. For the isolates of Acinetobacter spp best result was observed in the nearest IMI disk a disk of ABM, which had a sensitivity of 100% and specificity of 71% and for P. aeruginosa was approaching CAZ disk with a disk EDTA which had a sensitivity of 48% and specificity of 93%. This study verified that there is no single phenotypic test which can identify those isolates carbapenemases and that the performance of the tests various according to carbapenemases found