Introdução: Tem sido um desafio determinar o verdadeiro impacto clínico do Acinetobacter spp., devido a predileção desse microrganismo em colonizar e infectar pacientes críticos, os quais apresentam prognóstico ruim independente de complicações infecciosas secundárias. Objetivo: Avaliar se a sobrevida de pacientes com bacteremia por Acinetobacter spp. é menor em relação a de pacientes com bacteremia causada por outras bactérias prevalentes em unidade de terapia intensiva. Método: Trata-se de um estudo de coorte retrospectivo de pacientes internados nas unidades de terapia intensiva do Instituto Central do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, que desenvolveram bacteremia no período de 1 de janeiro de 2010 a 31 de dezembro de 2011. Pacientes com bacteremia por Acinetobacter spp. foram comparados a pacientes com bacteremia causada por outros patógenos (Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterobacter spp., Enterococcus spp. e Pseudomonas aeruginosa). Foi realizada análise de sobrevida em 30 dias. O método de Kaplan-Meier e teste de log-rank foram usados para determinar a sobrevida global. Fatores prognósticos potenciais foram identificados por análise bivariada e regressão multivariada de Cox. Resultados: 141 pacientes foram avaliados. Não houve diferenças entre os pacientes com bacteremia por Acinetobacter spp. e outros patógenos com relação à idade, sexo, APACHE II, índice de comorbidade de Charlson e tipo de infecção. A análise bivariada mostrou que idade > 60 anos, diabetes mellitus, infecção por Acinetobacter spp., tratamento inadequado, score de Pitt > 3, presença de choque séptico, uso de ventilação mecânica, uso de acesso central e número de falência de órgãos > 2 foram significativamente associados a pior prognóstico. Foram realizados dois modelos de análise de regressão logística. O modelo A mostrou que tratamento inadequado e score de Pitt > 3 pontos foram estatisticamente associados com letalidade. No modelo B, infecção por Acinetobacter spp. (HR = 1,93 IC 95%: 1,25-2,97) e idade > 60 anos foram fatores prognósticos independentes. Conclusão: Pacientes com bacteremia por Acinetobacter spp. apresentaram menor sobrevida em relação a pacientes com bacteremia causada por outras bactérias prevalentes em unidade de terapia intensiva / Introduction: It has been challenging to determine the true clinical impact of Acinetobacter spp., given the predilection of this pathogen to colonize and infect critically ill patients, who often have a poor prognosis irrespective of secondary infective complications. Objective: The aim of this study was to assess whether the survival of patients with Acinetobacter spp. bacteremia is lower than that of patients with bacteremia caused by other bacteria prevalent in intensive care unit. Setting: A retrospective review of medical records was conducted for all patients admitted to the ICUs who developed bacteremia from January 2010 through December 2011. Patients with Acinetobacter spp. were compared with those with other pathogens (Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterobacter spp., Enterococcus spp., Pseudomonas aeruginosa). We did a 30-day survival analysis. The Kaplan-Meier method and log-rank test were used to determine the overall survival. Potential prognostic factors were identified by bivariate and multivariate Cox regression analysis. Results: 141 patients were evaluated. No differences between patients with Acinetobacter spp. and other pathogens were observed with regard to age, sex, APACHE II score, Charlson Comorbidity Score and type of infection. Bivariate analysis showed that age > 60 years, diabetes mellitus, Acinetobacter spp. infection, inappropriate treatment, Pitt Bacteremia score >3, presence of septic shock, mechanical ventilation, use of central line and number of organ failures > 2 were significantly associated with a poor prognosis. We did two models of logistic regression analysis. Model A showed that inappropriate treatment and Pitt score > 3 points were statistically associated with mortality. In model B, Acinetobacter spp. infection (HR= 1.93, 95%CI: 1.25-2.97) and age > 60 years were independent prognostic factors. Conclusion: Patients with Acinetobacter spp. bacteremia had lower survival compared with patients with bacteremia caused by other bacteria prevalent in intensive care unit

Lipases são enzimas que hidrolisam especificamente óleos e gorduras, podendo ser de grande interesse para vários segmentos industriais como têxtil, cosméticos, alimentícios e tratamento de efluentes com elevada carga de gordura. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a produção de complexos enzimáticos lipolíticos produzidos por microrganismos isolados de um sistema de tratamento biológico de efluentes de um hotel, visando obter lipases com potencial para emprego em processos biotecnológicos. Para a seleção do microrganismo lipolítico foram utilizados 65 isolados bacterianos oriundos do efluente bruto e tratado da wetland e da caixa de gordura do restaurante do hotel. A produção de lipase foi testada em placa em meio de cultivo acrescido de azeite de oliva e rodamina B, incubados a 25°C e 30ºC por 24h-48h e as placas observadas sob luz UV 350 nm. Deste total de isolados, sete oriundos da wetland e 22 isolados da caixa de gordura foram positivos para lipase, pois apresentaram halos fluorescentes alaranjado. Os isolados foram testados novamente em placa, porém numa condição mais estressante em termos de nutrientes para induzir a utilização do azeite e assim selecionar as melhores produtoras de enzimas Desses, 12 isolados apresentaram atividade lipolítica e aquele que apresentou halo mais evidente e maior foi selecionado para ensaios com crescimento em cultura submersa em agitador orbital e biorreator em três substratos diferentes (azeite de oliva, óleo de semente de uva e óleo de canola) para a determinação da atividade enzimática. As bactérias lipolíticas identificadas bioquimicamente foram do gênero Enterobacter, Acinetobacter, Pseudomonas, Klebsiella e Burkholderia. Os ensaios em cultura submersa em biorreator nos três substratos avaliados apresentaram a máxima produção de lipase após 12 horas de cultivo; azeite de oliva 0,358 U/mL.min-1, óleo de semente de uva 0,352 U/mL.min-1 e óleo de canola 0,348 U/mL.min-1. Em cultivo submerso em agitador orbital, o meio de cultivo na presença de Tween 80, apresentou melhor atividade enzimática que o meio de cultivo sem a presença do emulsionante. A identificação molecular do isolado apresentou identidade com o gênero Acinetobacter baylyi. A análise por SDS-PAGE sugere uma lipase com massa molecular de 35 kDa. / Lipases are enzymes that specifically hydrolyze oils and fats and may be of great interest to various industrial segments such as textiles, cosmetics, food and effluent treatment with the high fat load. The aim of this work was to evaluate the production of lipolytic enzymatic complexes produced by microorganisms isolated from a biological treatment system of effluents of a hotel, aiming to obtain lipases with potential for use in biotechnological processes. To select the best lipolytic microorganism, we used 65 bacterial isolates, recovered from the raw and treated effluent of the wetland system and from the fat tank of the hotel restaurant. Lipase production was evaluated in culture medium supplemented with olive oil and rhodamine B, incubated at 25°C and 30°C for 24h-48h. The grown colonies were observed under UV light at 350 nm. Out of that, seven isolates from wetland and 22 isolated from the fat tank were positive for lipase as they exhibited orange fluorescent halos. The isolates were again seeded on medium with a stressful nutrient condition to induce the use of olive oil and thus select the best enzyme producers Of these, 12 isolates presented lipolytic activity, and the one that showed the most evident halo was selected for assays in submerged culture in an orbital shaker and bioreactor using three different substrates (olive oil, grape seed oil, and canola oil). The lipolytic bacteria identified were of the genus Enterobacter, Acinetobacter, Pseudomonas, Klebsiella, and Burkholderia. The assays run in the bioreactor showed the maximum lipase production after 12 hours of culture with the three substrates evaluated; 0,358 U/mL.min-1 in olive oil, 0,352 U/mL.min-1 grape seed oil, and 0.348 U/mL.min-1 canola oil. The results obtained in an orbital shaker showed better enzymatic activities in the presence of Tween 80 on the culture medium. The molecular identification showed identity with the genus Acinetobacter baylyi. Analysis by SDS-page suggests a lipase with a molecular mass of 35 kDa.

Introdução: O complexo Acinetobacter baumannii-calcoaceticus (ACB) inclui as espécies: A. baumannii, A. calcoaceticus, A. pittii e A. nosocomialis. As infecções causadas pelas diferentes espécies do ACB, principalmente A. baumannii tornam-se cada vez mais graves com a emergência de cepas resistentes a quase todos os antimicrobianos incluindo os carbapenêmicos, principalmente devido à produção de oxacilinases. O objetivo desse estudo foi identificar as diferentes espécies do complexo Acinetobacter baumanniicalcoaceticus (ACB) e determinar a prevalência de oxacilinases em isolados resistentes aos carbapenêmicos obtidos de quatro estados brasileiros. Materiais e métodos: No período de abril a outubro de 2013, avaliamos 92 isolados identificados previamente como ACB complexo, resistente aos carbapenêmicos de quatros estados brasileiros: Paraná, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul e São Paulo. Os isolados foram submetidos a identificação utilizando o equipamento MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics®, Bremen, Germany) e após, comparados com o sequenciamento do gene gyrB. Uma amostra de conveniência de 11 isolados não-A. baumannii também foram submetidas à identificação no sistema MALDI-TOF e ao sequenciamento. A avaliação da suscetibilidade foi determinada pelo método de disco difusão para os antimicrobianos: amicacina, ampicillina-sulbactam, cefepime, ceftazidima, gentamicina, piperacilina-tazobactam e para polimixina por microdiluição em caldo. Foi realizado ensaio de PCR multiplex para avaliação de genes de resistência: OXA-23-like, OXA-24-like, OXA-51-like, OXA-58-like e OXA-143. Resultados: Oitenta e nove (97%) isolados clínicos foram identificados como A. baumannii pelo sistema MALDI-TOF e confirmados pelo sequenciamento do gene gyrB. O sistema MALDI-TOF identificou corretamente 8/11 (72,7%) das espécies não-A. baumannii. Em relação a polimixina B, a maioria do isolados (96,7%) foram sensíveis (CIM ≤ 2 μg/mL) sendo que apenas 3 (3,3%) isolados apresentaram CIM ≥ 4 μg/mL para esse antimicrobiano. Quanto a presença das oxacilinases, 80 (87%) dos isolados apresentaram OXA-23-like e esses foram procedentes dos 4 estados avaliados. No entanto, foram identificados 12 (13%) isolados produtores de OXA-24-like sendo todos procedentes do Rio Grande do Sul, Paraná e São Paulo. Conclusão: Neste estudo foi possível constatar que o sistema MALDI-TOF identifica corretamente a espécie de A. baumannii mas apresentou limitações para identificação das espécies de A. nosocomialis e A. pittii. Observamos elevadas taxas de resistência aos antimicrobianos e a disseminação de OXA-23 em todos os estados avaliados. Além disso, Identificamos pela primeira vez a presença da enzima OXA-24-like em isolados de A. baumannii no sul do Brasil. / Introduction: The Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex (ACB) includes species: A. baumannii, A. calcoaceticus, A. pittii and A. nosocomialis. Infections caused by different species of the ACB, especially A. baumannii became increasingly severe, with the emergence of strains resistant to almost all antibiotics including carbapenems, primarily due to the production of oxacilinases. The aim of this study was to identify the different species of Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex (ACB) and to determine the prevalence of oxacilinases in isolates resistant to carbapenems obtained from four Brazilian states. Material and Method: Between April to October 2013, we analized 92 strains previously identified as ACB complex, resistant to carbapenems from four Brazilian states: Paraná, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul and São Paulo. The isolates were subjected to identification using MALDITOF MS System (Bruker Daltonics®, Bremen, Germany) and to sequencing of the gyrB gene. A convenience sample comprising 11 isolates of non-A. baumannii were also submitted to identification in MALDI-TOF system, and sequencing. The evaluation of the susceptibility was determined by disk diffusion method for the following antimicrobials: amikacin, ampicillin-sulbactam, cefepime, ceftazidime, gentamycin, piperacillin-tazobactam; for polymyxin we used the broth microdilution method. A multiplex PCR assay was performed to evaluate the resistance genes: OXA-23-like, OXA-24-like, OXA-51-like, OXA- 58-like and OXA-143. Results: Eighty-nine (97%) clinical isolates were identified as A. baumannii by MALDI-TOF system, and confirmed by sequencing of the gyrB gene. The MALDI-TOF system correctly identified only 8/11 (72.7%) of non-A. baumannii isolates. In relation to polymyxin B, the majority of isolates (96.7%) were susceptible (MIC ≤ 2 μg/mL) and only 3 (3.3%) of the isolates showed MIC ≥ 4 μg/mL for this antimicrobial. Regarding the presence of oxacilinases, 80 (87%) isolates presented OXA-23-like and these were obtained from the 4 states evaluated. Furthermore, 12 (13%) isolates producing OXA-24-like were identified, all from Rio Grande do Sul, Paraná and São Paulo. Conclusion: In the present study, we were able to determine that the MALDI TOF System correctly identifies the species of A. baumannii and has limitations for identification of A. nosocomialis and A. pittii. We notice high rates of antimicrobial resistance and the spread of OXA-23 in all states evaluated. Moreover, for the first time we identified the presence of the enzyme OXA-24- like in isolates of A. baumannii in southern Brazil.

Acinetobacter spp é um dos mais freqüentes agentes de infecções nosocomiais nos hospitais brasileiros. Vários surtos hospitalares causados por Acinetobacter resistente aos carbapenêmicos já foram descritos no Brasil. O presente estudo verificou a presença de alteração de proteínas da membrana externa e produção de carbapenemases em cepas de Acinetobacter spp. resistentes aos carbapenêmicos isoladas de corrente sanguínea de pacientes internados no HC-FMUSP. Os isolados foram identificados pelo método miniaturizado API20NE. As concentrações inibitórias mínimas dos carbapenêmicos foram realizadas através da técnica de microdiluição em caldo. As carbapenemases foram estudas através de testes fenotípicos, detecção dos genes foi realizada pela reação de amplificação em cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento e hidrólise de imipenem. As proteínas de membrana externa foram caracterizadas através da técnica de SDS-Page e PCR. A tipagem molecular foi realizada usando a técnica de eletroforese em campo pulsado. Noventa e oito por cento dos isolados apresentaram genes codificadores da enzima Oxa-51-like, sendo que a única amostra que não apresentou essa enzima, após seqüenciamento do gene codificador da porção 16S do RNA ribossomal, foi considerada da espécie A. calcoaceticus. A presença do gene blaoxa-51-like não foi encontrada adjacente a seqüência ISAba1. Em dezoito por cento do total das amostras foi detectada pela reação de PCR o gene blaoxa-51-like/oxa-23- like, sendo que sete desses isolados pertenciam ao mesmo clone. Somente em um isolado não foi detectada a presença do grupamento ISAba-1 adjacente ao gene codificador da enzima Oxa-23. Dessas amostras apenas uma hidrolisou o antimicrobiano imipenem. Cinco isolados apresentaram o gene blaimp (IMP-1 pelo seqüenciamento). Apenas dois desses isolados se mostraram capazes de hidrolisar imipenem e através da inibição com o EDTA confirmou-se a presença da produção de enzimas Metalo-- lactamase. Vários testes fenotípicos foram utilizados para a detecção de carbapenemase como DDST, CD e Etest. Quando comparados com a PCR (metodologia padrão-ouro), os melhores resultados foram observados com a aproximação de disco de imipenem (10g) com um disco contendo 3L do ácido -mercaptoetanol não diluído (sensibilidade de 100% e especificidade de 71%). Observou-se que na maioria dos isolados, as proteínas de membrana externa analisadas estavam diminuídas ou ausentes. Três isolados apresentaram ausência dessas proteínas, suas CIM variaram de 32 a 128g/mL e de 64 a 256g/mL para o imipenem e meropenem respectivamente. O presente estudo verificou que a resistência aos carbapenêmicos está relacionada à presença de carbapenemases e alterações de membrana externa. Além disso, a importância das carbapenemases como principal mecanismo de resistência em isolados de Acinetobacter deve ser melhor investigada, já que esses genes podem não estar sendo expressos / Acinetobacter spp is an important etiologic agent causing nasocomial infection in Brazilian hospitals. Carbapenem resistance among this agent has been increasing in the last decade, and several outbreaks due to resistant Acinetobacter had been identified in Brazil. This study verified the presence of altered outer membrane proteins and production of carbapenemase in carbapenem-resistant Acinetobacter spp. strains isolated from bloodstream infections of patients hospitalized in the HC-FMUSP. This study verified the presence of altered outer membrane proteins and production of carbapenemase in Acinetobacter spp. carbapenem-resistant strains isolated from bloodstream of patients hospitalized in the HC-FMUSP. The isolates were identified by miniatured method API20NE and the miminal inhibitory concentration of carbepenem was performed by broth microdilution. Carbapenemases were studied by phenotypic screnning tests, detection of its genes coder by amplification polymerase chain reaction (PCR), sequence and imipenem hydrolise. The proteins of external membrane were studied by SDS-PAGE and PCR. Molecular typing was performed using the technique of pulsed field gel electrophoresis. About 98% of these isolates were positives for genes encoding the enzyme Oxa-51-like, only one strain did not exhibit this enzyme. After sequencing of the gene encoding portion 16S ribosomal RNA this strain was considered the species A. calcoaceticus. The presence of the sequence adjacent ISAba1 was not found in none of these isolates with the gene blaOXA-51-like. Eighteen percent of the total of strains demonstrated by PCR the gene blaoxa-51-like/oxa-23-like. Seven of these strains belonged to the same clone. Only one isolate did not show the presence of ISAba1 adjacent to the gene encoding Oxa-23. Only one of this strain hydrolyzed imipenem. Five isolates had the gene blaimp, (IMP-1 by sequencing). Two of these isolates had proved capable of hydrolyzing the antibiotic imipenem and the inhibition with EDTA confirmed the presence of MBL-producing enzymes. Several phenotypic tests were used to screnning of carbapenemase as DDST, CD and Etest. When compared with PCR, the gold standard, the best results were seen with the next disk of imipenem (10 mg) with another disk containing 3L acid -mercaptoethanol pure (100% sensitivity and specificity 71%). In most isolates the outer membrane proteins were decreased or absent. Three isolate showed total absence of these proteins, their MIC ranged from 32 to 64 to 128g/mL and 256g/mL to imipenem and meropenem respectively. This study has shown that carbapenem resistance was linked to the presence of carbapemenases and alteration of the outer membrane. Moreover, the significance of carbapenemase as the main mechanism of resistance in isolates of Acinetobacter should be better investigated, since these genes might not be cast

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-08-18T14:20:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 00 TESE PAULA Doc Final VD-30-03-2016 Com Ficha cat.pdf: 3292123 bytes, checksum: 3a9cccec1214620cbdc7f55f0d159fe1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-18T14:20:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 00 TESE PAULA Doc Final VD-30-03-2016 Com Ficha cat.pdf: 3292123 bytes, checksum: 3a9cccec1214620cbdc7f55f0d159fe1 (MD5) Previous issue date: 2015-12-16 / CAPEs / Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp. e Acinetobacter spp. estão entre as cinco principais causas de infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS), e estão associadas a um elevado índice de mortalidade em pacientes oncológicos. Diante da vulnerabilidade destes pacientes e da crescente incidência de patógenos multidroga resistentes (MDR), o presente trabalho teve por objetivo realiza um estudo epidemiológico e molecular de infecções ocasionadas por P. aeruginosa, Klebsiella spp. e Acinetobacter spp. em pacientes com neoplasias sólidas, internados em um hospital de Recife-PE. Para tal, foi realizado um estudo descritivo de corte transversal dos dados clínicos, microbiológicos e hospitalares e os genes de resistência blaSPM-1, blaIMP, blaVIM, blaKPC, blaTEM e blaCTX-M, foram investigados por meio da reação em cadeia da polimerase. Também foi realizada tipagem molecular dos isolados MDR utilizando a técnica Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-based PCR (ERIC-PCR). Entre 2012 e 2014, foram obtidos 169 isolados, sendo 58 P. aeruginosa, 36 Acinetobacter spp. e 75 Klebsiella spp.. A frequência de patógenos MDR (69,6%, IC95% 61,5% - 76,9%) foi significativamente maior que os isolados não MDR (30,4%, IC95% 23,1% - 38,5%). Dentre as bactérias resistentes aos carbapenêmicos, o gene blaSPM-1 foi detectado em P. aeruginosa (35,5%) e Acinetobacter spp. (3,8%), e o gene blaKPC detectado apenas em P. aeruginosa (25,8%). Já entre os isolados resistentes às cefalosporinas de terceira e quarta geração, o gene blaTEM estava presente em Acinetobacter spp. (25,9%) e Klebsiella spp. (30,6%) e o gene blaCTX-M em 58,3% das Klebsiella spp.. Também foi observado que o câncer de pulmão e os pacientes do sexo masculino foram predominantes na amostra e que o uso prévio de antimicrobianos durante o internamento e até três meses antes do isolamento do patógeno descrito neste estudo, apresentaram associação com o desenvolvimento de infecções por patógenos MDR. Assim, os resultados encontrados podem contribuir com epidemiologia molecular dos genes de resistência presentes no ambiente hospitalar, além de ressaltar a importância da monitorização contínua das IRAS em pacientes com câncer internados por longos períodos, a fim de melhorar os cuidados prestados a estes pacientes. / Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp. and Acinetobacter spp. are among the five leading causes of Healthcare-associated Infections (HAI) in cancer patients, and those associated with a high mortality rate. Because of the vulnerability of patients and the increasing incidence of multidrug-resistant pathogens (MDR), this study aimed to realize an epidemiological and molecular study of infections caused by P. aeruginosa, Klebsiella spp. and Acinetobacter spp. in patients with solid tumors, admitted to a Recife-PE hospital. Therefore, we conducted a descriptive cross-sectional study of clinical, microbiological and hospital, and the resistance genes blaSPM-1, blaIMP, blaVIM, blaKPC, blaTEM and blaCTX-M, were investigated by polymerase chain reaction. It was also performed molecular typing of MDR isolates using Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-based PCR (ERIC-PCR). Between 2012 and 2014, were obtained 169 isolates, 58 P. aeruginosa, 36 Acinetobacter spp. and 75 Klebsiella spp.. The frequency of MDR pathogens (69.6% 95% 61.5% - 76.9%) was significantly higher than non-MDR isolates (30.4% 95% 23.1% - 38.5%). Among the carbapenem-resistant bacteria, the blaSPM-1 gene was detected in P. aeruginosa (35.5%) and Acinetobacter spp. (3.8%), and blaKPC gene detected only in P. aeruginosa (25.8%). Among the resistant isolates to the third and fourth generation cephalosporins, the blaTEM gene was present in Acinetobacter spp. (25.9%) and Klebsiella spp. (30.6%) and blaCTX-M gene in 58.3% of the Klebsiella spp.. It was also noted that lung cancer and male patients were predominant in the sample and the previous use of antimicrobials during hospitalization and antibiotic use up to three months before the pathogen isolation described in this study were associated with the development of pathogen infections MDR. Thus, the results can contribute to molecular epidemiology of resistance genes present in the hospital, and underline the importance of continuous monitoring of HAI in cancer patients hospitalized for long periods aiming improve the care provided to these patients.

Introdução: O complexo Acinetobacter baumannii-calcoaceticus (ACB) inclui as espécies: A. baumannii, A. calcoaceticus, A. pittii e A. nosocomialis. As infecções causadas pelas diferentes espécies do ACB, principalmente A. baumannii tornam-se cada vez mais graves com a emergência de cepas resistentes a quase todos os antimicrobianos incluindo os carbapenêmicos, principalmente devido à produção de oxacilinases. O objetivo desse estudo foi identificar as diferentes espécies do complexo Acinetobacter baumanniicalcoaceticus (ACB) e determinar a prevalência de oxacilinases em isolados resistentes aos carbapenêmicos obtidos de quatro estados brasileiros. Materiais e métodos: No período de abril a outubro de 2013, avaliamos 92 isolados identificados previamente como ACB complexo, resistente aos carbapenêmicos de quatros estados brasileiros: Paraná, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul e São Paulo. Os isolados foram submetidos a identificação utilizando o equipamento MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics®, Bremen, Germany) e após, comparados com o sequenciamento do gene gyrB. Uma amostra de conveniência de 11 isolados não-A. baumannii também foram submetidas à identificação no sistema MALDI-TOF e ao sequenciamento. A avaliação da suscetibilidade foi determinada pelo método de disco difusão para os antimicrobianos: amicacina, ampicillina-sulbactam, cefepime, ceftazidima, gentamicina, piperacilina-tazobactam e para polimixina por microdiluição em caldo. Foi realizado ensaio de PCR multiplex para avaliação de genes de resistência: OXA-23-like, OXA-24-like, OXA-51-like, OXA-58-like e OXA-143. Resultados: Oitenta e nove (97%) isolados clínicos foram identificados como A. baumannii pelo sistema MALDI-TOF e confirmados pelo sequenciamento do gene gyrB. O sistema MALDI-TOF identificou corretamente 8/11 (72,7%) das espécies não-A. baumannii. Em relação a polimixina B, a maioria do isolados (96,7%) foram sensíveis (CIM ≤ 2 μg/mL) sendo que apenas 3 (3,3%) isolados apresentaram CIM ≥ 4 μg/mL para esse antimicrobiano. Quanto a presença das oxacilinases, 80 (87%) dos isolados apresentaram OXA-23-like e esses foram procedentes dos 4 estados avaliados. No entanto, foram identificados 12 (13%) isolados produtores de OXA-24-like sendo todos procedentes do Rio Grande do Sul, Paraná e São Paulo. Conclusão: Neste estudo foi possível constatar que o sistema MALDI-TOF identifica corretamente a espécie de A. baumannii mas apresentou limitações para identificação das espécies de A. nosocomialis e A. pittii. Observamos elevadas taxas de resistência aos antimicrobianos e a disseminação de OXA-23 em todos os estados avaliados. Além disso, Identificamos pela primeira vez a presença da enzima OXA-24-like em isolados de A. baumannii no sul do Brasil. / Introduction: The Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex (ACB) includes species: A. baumannii, A. calcoaceticus, A. pittii and A. nosocomialis. Infections caused by different species of the ACB, especially A. baumannii became increasingly severe, with the emergence of strains resistant to almost all antibiotics including carbapenems, primarily due to the production of oxacilinases. The aim of this study was to identify the different species of Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex (ACB) and to determine the prevalence of oxacilinases in isolates resistant to carbapenems obtained from four Brazilian states. Material and Method: Between April to October 2013, we analized 92 strains previously identified as ACB complex, resistant to carbapenems from four Brazilian states: Paraná, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul and São Paulo. The isolates were subjected to identification using MALDITOF MS System (Bruker Daltonics®, Bremen, Germany) and to sequencing of the gyrB gene. A convenience sample comprising 11 isolates of non-A. baumannii were also submitted to identification in MALDI-TOF system, and sequencing. The evaluation of the susceptibility was determined by disk diffusion method for the following antimicrobials: amikacin, ampicillin-sulbactam, cefepime, ceftazidime, gentamycin, piperacillin-tazobactam; for polymyxin we used the broth microdilution method. A multiplex PCR assay was performed to evaluate the resistance genes: OXA-23-like, OXA-24-like, OXA-51-like, OXA- 58-like and OXA-143. Results: Eighty-nine (97%) clinical isolates were identified as A. baumannii by MALDI-TOF system, and confirmed by sequencing of the gyrB gene. The MALDI-TOF system correctly identified only 8/11 (72.7%) of non-A. baumannii isolates. In relation to polymyxin B, the majority of isolates (96.7%) were susceptible (MIC ≤ 2 μg/mL) and only 3 (3.3%) of the isolates showed MIC ≥ 4 μg/mL for this antimicrobial. Regarding the presence of oxacilinases, 80 (87%) isolates presented OXA-23-like and these were obtained from the 4 states evaluated. Furthermore, 12 (13%) isolates producing OXA-24-like were identified, all from Rio Grande do Sul, Paraná and São Paulo. Conclusion: In the present study, we were able to determine that the MALDI TOF System correctly identifies the species of A. baumannii and has limitations for identification of A. nosocomialis and A. pittii. We notice high rates of antimicrobial resistance and the spread of OXA-23 in all states evaluated. Moreover, for the first time we identified the presence of the enzyme OXA-24- like in isolates of A. baumannii in southern Brazil.

Submitted by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2014-10-23T17:35:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Daniella Pereira.pdf: 902804 bytes, checksum: adb33a2bb49d4c2298f2b7aa2db9410e (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-23T17:35:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Daniella Pereira.pdf: 902804 bytes, checksum: adb33a2bb49d4c2298f2b7aa2db9410e (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Entre as espécies do gênero Acinetobacter, A. baumannii tem se destacado como um importante patógeno oportunista, responsável por infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) e surtos hospitalares, particularmente em unidades de tratamento intensivo. Geralmente, esses microrganismos acometem pacientes hospitalizados submetidos a procedimentos invasivos, ou imunodeprimidos. Na última década as cepas de A. baumannii tornaram-se rapidamente multirresistentes a diversos agentes antimicrobianos, facilitando a disseminação entre os pacientes e a persistência no ambiente hospitalar por longos períodos. Neste estudo, tivemos como objetivos identificar isolados clínicos de A. baumannii oriundos de dois hospitais públicos do Rio de Janeiro utilizando-se métodos convencional e automatizado, além de técnicas moleculares. Foi também verificada a suscetibilidade desses isolados, através de métodos fenotípicos e genotípicos, às drogas antimicrobianas e a um desinfetante à base de compostos quaternários de amônio (QACs). A capacidade de sobrevivência em ambientes escassos de água foi também verificada. Dentre os 94 isolados pertencentes à espécie A.baumanni, 89 (94,7%) isolados apresentaram os genes codificadores de oxacilinases, genes blaOXA-23, blaOXA-51 e a sequência de inserção ISAba1, concomitantemente. Foram verificados 87 (92,6%) isolados de A. baumannii, que apresentaram perfil de multirresistência (MDR), representando uma séria preocupação, pois a maioria deles apresentou suscetibilidade apenas às classes de antibióticos polipeptídicos (colistina) e glicilciclinas (tigeciclina), e resistência aos carbapenêmicos (imipenem e meropenem), aos ß-lactâmicos (penicilinas) e às cefalosporinas. A resistência aos ß-lactâmicos também foi examinada fenotipicamente pela produção de enzima metalo-ß-lactamases (MBL) através do teste de difusão em discos contendo ceftazidima e ácido 2-mercaptopropiônico. Não foi detectada a produção de MBL em nenhum dos isolados. A análise genotípica e fenotípica da resistência aos QACs, determinou que os isolados de A. baumanni mais suscetíveis às drogas antimicrobianas não apresentavam o gene qacE 1. Em apenas 5 (5%) isolados com perfil MDR o gene qacE 1, foi detectado. Não foi possível estabelecer uma relação entre a presença desse gene com a suscetibilidade reduzida ao desinfetante. Todos os isolados demonstraram ser sensíveis ao desinfetante utilizado no estudo através do método da Diluição de Uso. Em contra partida foi possível verificar que um isolado que apresentou todas as características fenotípicas e genotípicas de resistência aos antimicrobianos e presença do gene de resistência aos QACs foi capaz de sobreviver até o quadragésimo dia de incubação em condições totalmente adversas, ou seja, em um ambiente totalmente escasso de água. É necessário que uma maior atenção seja direcionada para o controle das IRAS, buscando o uso criterioso de drogas antimicrobianas, antissépticos e desinfetantes, para evitar a seleção, permanência e disseminação de microrganismos resistentes no ambiente hospitalar. / Acinetobacter baumannii has standed out among species from Acinetobacter genus as an important opportunistic pathogen, responsible for infections related to health assistance and hospital outbreaks, particularly in intensive care units. Usually, these microorganisms affect hospitalized patients submitted to invasive procedures or the immunosuppressed ones. In the last decade, A. baumannii strains fast became multiresistant to many antimicrobial agents, favouring the spread between patients and the persistence in hospital environment for long periods. In this study, the goal was to identify A. baumannii clinical isolates originated from two public hospitals from Rio de Janeiro using conventional and automatized methods, besides molecular techniques. Also, antimicrobial drugs and a quaternary ammonium compound (QACs) disinfectant susceptibility of these isolates was investigated using phenotypic and genotypic methods. Survival ability in environments with lack of water was also investigated. Among the ninety-four isolates belonging to A. baumannii species, eighty-nine presented oxacillinases codifying genes blaoxa-23, blaoxa-51 and the insertion sequence ISAba1 at the same time. Eighty-seven (92,6%) A. baumannii isolates presenting multiresistant (MDR) profile were detected, representing a serious concern because most of these presented susceptibility only to polipeptidic (colistin) and glycylcyclines (tigecycline) and resistance to carbapanemics (imipenem and meropenem), to β-lactamics (penicillins) and to cephalosporins. Resistance to β-lactamics was also screened phenotypically through metalo-β-lactamases (MBL) production using disk diffusion test containing ceftazidime and 2-mercaptopropionic acid. MBL production was not detected in none of the isolates. Genotypic and phenotypic analysis of the resistance to QACs demonstrated that A. baumannii isolates most susceptible to antimicrobial drugs did not presented qacE∆1 gene. In only 5 (5%) isolates presenting MDR profile, qacE∆1 gene was detected. It was not possible to establish a relation between the presence of this gene with reduced susceptibility to the disinfectant. All isolates shown to be susceptible to disinfectant used in this study through use dilution method. On the other hand, was observed that an isolate that presented all phenotypic and genotypic antimicrobial resistance characteristics and QACs resistance gene was able to survive until the fortieth day of incubation in total adverse conditions, in other words, in an environment totally lack of water. It is necessary a bigger attention in direction to the control of infections related to health assistance, searching a rational use of antimicrobial drugs, antiseptics and disinfectants, to avoid the selection, remaining and spreading of resistant microorganisms in the hospital environment.

A study to assess the potentials of some commensal bacteria that belong to Staphylococcus, Acinetobacter and Stenotrophomonas genera as reservoirs of antibiotic resistance determinants in the environment of Nkonkobe Municipality of the Eastern Cape Province, South Africa, was carried out using standard microbiological and molecular techniques. A total of 120 Staphylococcus isolates which consisted of Staphylococcus haemolyticus (30%), Staphylococcus aureus (23.3%) from pig; Staphylococcus capitis (15%) from goat; Staphylococcus heamolyticus (5%) and Staphylococcus xylosus (15%) from cattle and other Staphylococci (11%) from dead chicken and pigs were isolated. About 23.3% of these isolates were coagulase positive and 76.7% were coagulase negative. This difference in prevalence along coagulase production divide was statistically significant (p < 0.05). Eighty-six Acinetobacter species (Acinetobacter baumannii/calcoaceticus and Acinetobacter haemolyticus) were also isolated from Alice and Fort Beaufort towns samples, while 125 Stenotrophomonas maltophilia isolates were from grass root rhizosphere (96%) and soil butternut root rhizosphere (4%). Between 75-100% of the Staphylococccus species were resistant to Penicillin G, tetracycline, sulphamethaxole and nalidixic acid; about 38 % were methicillin resistant, consisting of 12.6% methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) from pig and a total of 12% vancomycin resistant were observed. Also, 12% of the isolates were erythromycin resistant while 40.2 % were resistant to the third generation cephalosporin, ceftazidime. The antibiotic resistance genes vanA, VanB, eryA, eryB, eryC were not detected in all the phenotypically resistant Staphylococccus species, but mec A gene and mph genes were detected. In the Acinetobacter species, a wide range of 30-100% resistance to penicillin G, ceftriazone, nitrofurantoin, erythromycin, and augmentin was observed. Polymerase chain reaction (PCR) revealed the presence of Tet(B) and Tet(39) genes in these species, while Tet (A), Tet(M) and Tet(H) were absent. Also, 9.3% of the Acinetobacter species showed phenotypic production of extended spectrum beta lactamases (ESBLs) while 3.5% were positive for the presence of blaCTX-M-1 genes. The Stenotrophomonas maltophilia isolates showed varying resistance to meropenem (8.9%), cefuroxime (95.6 %), ampicillin-sulbactam (53.9%), ceftazidime (10.7%), cefepime (29.3 %), minocycline (2.2%), kanamycin (56.9%), ofloxacin (2.9%), levofloxacin (1.3%), moxifloxacin (2.8%), ciprofloxacin (24.3%), gatifloxacin (1.3%), polymyxin B (2.9 %), cotrimoxazole (26.1%), trimethoprim (98.6%), aztreonam(58%) and Polymyxin B (2.9 %). The isolates exhibited significant susceptibility to the fluoroquinolones (74.3-94.7 %), polymycin (97.1%) and meropenem (88.1%). Only sul3 genes were the only sulphonamide resistance gene detected among the trimethoprim-sulphamethoxazole resistant isolates. The observed multiple antibiotic resistance indeces (MARI) of >2 for Staphylococcus species, Acinetobacter species and Stenotrophomonas maltophilia suggest that they have arisen from high-risk sources where antibiotics are in constant arbitrary use resulting in high selective pressure. The presence of tetracycline resistance genes in Acinetobacter species justifies the observed phenotypic resistance to oxytetracycline and intermediate resistance to minocycline. High phenotypic resistance and the presence of some resistance genes in Staphylococcus species is a possible threat to public health and suggests animals to be important reservoirs of antibiotic resistance determinants in the environment. Indiscriminate use of antibiotics induces this kind of antibiotic resistance and should be discouraged. Personal hygiene is encouraged as it reduces the load of Acinetobacter species contacted from the environment that may be difficult to control. Commensal Stenotrophomonas maltophilia are as important as their clinical counterparts due to their roles in opportunistic infection, antibiotic resistance and their associated genes, especially sul gene. Personal hygiene is hereby advocated especially when in contact with soil, plants and plants’ rhizospheric soil

Bactérias Gram-negativas não fermentadoras são frequentemente encontradas em águas superficiais, sendo muitas vezes carregadoras de múltipla resistência. O presente trabalho teve como objetivo principal analisar a participação de Pseudomonas sp. e Acinetobacter sp. na manutenção da resistência a antimicrobianos em quatro pontos na laguna de Tramandaí e se a presença deles poderia contribuir para a sua permanência. As amostras de água superficial foram coletadas em quatro pontos de coleta na laguna e submetidas a tratamento com os antimicrobianos: ácido nalidíxico, ceftazidima, imipenem e tetraciclina na concentração de 20mg/L. Em cada ponto de coleta uma das alíquotas não foi suplementada com os mesmos sendo utilizada como controle. Os isolados de Pseudomonas sp. foram identificados por provas bioquímicas e MALDI-TOF MS, enquanto que os isolados de Acinetobacter sp. somente por provas bioquímicas. O perfil de suscetibilidade de ambos foi avaliado pela técnica de disco-difusão e a produção de ESBL pela técnica de disco combinado. Os pontos 3 e 4 foram os que exibiram maior número de isolados resistentes. Os maiores percentuais de resistência estiveram associados às amostras submetidas ao tratamento com antimicrobianos. Em todos os pontos de coleta foram encontrados isolados de P. aeruginosa e Acinetobacter sp. multirresistentes. Ambas amostras (com e sem tratamento) exibiram diferentes padrões de resistência nos diferentes pontos de coleta e tanto isolados de P. aeruginosa como de Acinetobacter sp. exibiram isolados produtores de ESBL. A presença de P. aeruginosa e Acinetobacter sp. multirresistentes na Laguna de Tramandaí atenta para o risco de disseminação de resistência neste ambiente e que o mesmo pode estar atuando como reservatório de resistência. / Non-fermenting Gram-negative bacteria are often found in surface water, and are often carriers of multiple resistance to antimicrobials. The present work had as main objective to analyze the role of Pseudomonas sp. and Acinetobacter sp. in maintaining antimicrobial resistance at four points in the Tramandaí lagoon. The surface water samples were collected at four sampling points in the lagoon and treated with the antimicrobials: nalidixic acid, ceftazidime, imipenem and tetracycline at a concentration of 20mg/L. At each collection point, one of the aliquots was not supplemented with the antimicrobial and were used as the control for the treatment. The isolates of Pseudomonas sp. were identified by biochemical tests and MALDITOF MS, whereas the isolates of Acinetobacter sp. were identified only by biochemical tests. The susceptibility profile of both was evaluated by the disc diffusion method and the ESBL production by the combined disk method. Sampling points 3 and 4 showed the highest number of resistant isolates. The highest percentages of resistance were associated with the samples that were submitted to antimicrobial treatment. In all sampling points, multiresistant P. aeruginosa and Acinetobacter were isolated. Both samples (with and without treatment) showed different resistance patterns within the sampling points. P. aeruginosa and Acinetobacter sp. isolates exhibited ESBL producers. The presence of multiresistant P. aeruginosa and Acinetobacter sp. in the Tramandaí Lagoon attempted to the risk of spreading resistance in the aquatic environment, since it can act as a reservoir of resistance.

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