TESIS DOCTORAL"Streptococcus pneumoniae", también llamado neumococo, es una bacteria Gram positiva caracterizada por la severidad de las infecciones que produce en la especie humana, siendo responsable de una elevada morbilidad y letalidad, especialmente en niños y ancianos, colectivos particularmente sensibles a sus consecuencias. La emergencia de cepas de S. pneumoniae resistentes a antibióticos como la penicilina y otros beta-lactámicos, comúnmente utilizados en el tratamiento de las infecciones neumocócicas, ha llevado a la utilización de nuevos agentes antimicrobianos como las fluoroquinolonas. Sin embargo, su extensa utilización y el uso prolongado y en ocasiones inadecuado de esta clase de antibióticos ha desencadenado el rápido desarrollo y selección de bacterias resistentes. La ciprofloxacina proporciona un marcador valioso de evaluación de la actual y potencial emergencia de la resistencia a fluoroquinolonas en esta especie, por ser la fluoroquinolona más utilizada en las últimas dos décadas y la que ha ejercido una mayor presión de selección en S. pneumoniae. Uno de los objetivos iniciales de este trabajo fue el de poner de manifiesto el posible papel de otros estreptococos orales en la eventual transferencia de genes de resistencia a quinolonas en "S. pneumoniae". Concretamente, los experimentos de transformación de la cepa de "S. pneumoniae" R6 con DNA procedente de cepas de estreptococos del grupo "viridans" resistentes a ciprofloxacina permitieron demostrar la posible transferencia génica horizontal de la resistencia a fluoroquinolonas entre cepas de estreptococos.El siguiente objetivo fue el estudio de los mecanismos implicados en la resistencia a fluoroquinolonas en cepas clínicas de "S. pneumoniae". En esta bacteria se han descrito dos posibles mecanismos de resistencia a las fluoroquinolonas: alteraciones en las dianas de esta clase de antibióticos y una disminución de la acumulación intracelular debida a la sobreexpresión de la bomba de reflujo PmrA.Los mecanismos de resistencia a ciprofloxacina en las cepas clínicas de "S. pneumoniae" estudiadas fueron debidos, principalmente, a mutaciones en las dianas de las fluoroquinolonas parC, parE y gyrA. Los niveles bajos de resistencia se debieron a mutaciones en el gen parC, mientras que se detectaron niveles de resistencia más elevados en aquellas cepas que presentaron mutaciones en parC y gyrA. Por otro lado, dos de las cepas de "S. pneumoniae" estudiadas presentaron una concentración mínima inhibitoria de ciprofloxacina considerable pero su resistencia no respondió a mutaciones en las dianas de las fluoroquinolonas. En estas dos cepas se estudió la posible implicación de un mecanismo de reflujo en su destacada resistencia, mediante la determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias de distintos compuestos así como realizando ensayos de inhibición del crecimiento y fluorimétricos, en presencia y ausencia de un inhibidor de los sistemas de reflujo, la reserpina. Estos ensayos indicaron la posible implicación de un mecanismo de reflujo en la resistencia de dichas cepas a ciprofloxacina, que podría deberse a la acción de la bomba PmrA La inactivación del gen pmrA en transformantes de reflujo de R6, obtenidos con DNA de estas dos cepas, indicó que la bomba PmrA no estaba implicada en la resistencia a ciprofloxacina, sugiriendo la presencia de otra bomba de reflujo distinta de PmrA en "S. pneumoniae", también inhibible por reserpina.El análisis comparativo de secuencias BLAST entre el genoma de R6 y distintas proteínas de reflujo descritas en otras bacterias Gram positivas evidenciaron la posible existencia de al menos otra bomba de reflujo no descrita hasta el momento en "S. pneumoniae". Analizados los dos mecanismos principales de resistencia, se aplicó una metodología basada en la técnica de "microarrays", que mostró el potencial de esta valiosa herramienta en la determinación de nuevos genes involucrados en la resistencia a fluoroquinolonas en "S. pneumoniae".

DE LA TESI DOCTORAL: L'augment de la incidència de bacteris amb resistència als agents antimicrobians és deguda a les característiques intrínseques de les soques antimicrobianes, a una pressió selectiva per l'ús extensiu dels antibiòtics i a uns canvis socials i tecnològics que ha facilitat la transmissió d'organismes resistents o de gens de resistència. Aquest constitueix un problema sanitari de primera magnitud. Els bacteris presenten característiques que poden influir poderosament en l'emergència i la transmissió dels gens que codifiquen per a la resistència als agents antimicrobians.Els mecanismes de resistència dels bacteris als antibiòtics poden ser diversos. Des de la inactivació enzimàtica de l'antibiòtic, la modificació de la diana de l'antibiòtic així com mecanismes de caire més generals com la disminució de la permeabilitat de la membrana, l'expressió de bombes de reflux i l'intercanvi de material genètic per transferència de plasmidis, transposons o integrons. Precisament aquests últims mecanismes són objecte de la present tesi doctoral.El nostre grup de recerca ha treballat durant anys sobre diferents mecanismes de resistència als antibiòtics en diferents espècies bacterianes, continuant a l'actualitat amb aquesta activitat investigadora.Com a objectiu general d'aquesta tesi ens plantegem la caracterització molecular i funcional dels mecanismes de resistència d'un bacteri Gram negatiu: Morganella morganii. I en concret s'ha centrat en els següents punts:1. Investigar la susceptibilitat antimicrobiana de diverses soques de Morganella morganii d'origen clínic. 2. Investigar la importància de la permeabilitat de les envoltes cel·lulars bacterianes de Morganella morganii a diferents antibiòtics.3. Realitzar experiments de transformació i conjugació amb les soques clíniques resistents.4. Obtenir la porina de Morganella morganii purificada i realitzar estudis físico-químics seguint la tècnica de lipid planar bylayer.5. Investigar sobre l'existència d'integrons en la soca de Morganella morganii resistent i obtenir les seqüències dels gens de resistència inserits en aquests integrons.6. Estudiar la possible funcionalitat de bombes de reflux que puguin expulsar els antibiòtics fora de la cèl·lula.

La capacidad de Acinetobacter baumannii para causar infecciones nosocomiales se relaciona con su habilidad para desarrollar rápidamente resistencia a los antibióticos, junto con la capacidad que tiene este organismo para sobrevivir durante largos períodos de tiempo en el hábitat hospitalario.A pesar de ser un problema emergente en la UCIs, falta mucha información sobre los mecanismos de virulencia y resistencia a los antimicrobianos, a la desecación y a la desinfección. Los objetivos principales de este trabajo fueron estudiar los mecanismos de resistencia a diferentes agentes antimicrobianos en cepas clínicas de la especie Acinetobacter, haciendo énfasis en la identificación de nuevas bombas de expulsión y porinas, junto con un estudio del efecto que produce la formación de biopelícula en el éxito de A. baumannii como patógeno.Con A. baumannii, se ha estudiado la prevalencia de bombas de expulsión específicas para tetraciclinas (TetA y TetB) y β-lactamasas en una colección de cepas clínicas españolas. Adicionalmente, se ha estudiado el efecto de la secuencia de inserción ISAba1 como promotor de estas β-lactamasas y se ha concluido que este elemento móvil, que puede ser adquirido o perdido en el ámbito hospitalario, se está convirtiendo en un activador importante de estos genes de resistencia. Paralelamente, se ha analizado la actividad de ceftobiprole y doripenem, dos nuevos β-lactámicos, frente a cepas clínicas de este microorganismo que únicamente ofrecen una pequeña mejoría frente a las antiguas carbapenemas y cefalosporinas. También se ha detectado y secuenciado un gen homológo a mdfA en Escherichia coli que codifica una bomba de expulsión en una cepa clínica de A. baumannii.Aproximaciones genómicas y proteómicas han demostrado ser metodologías importantes para la identificación y caracterización de nuevos mecanismos de resistencia. Se ha hecho un análisis proteómico de una fracción enriquecida en proteínas de membrana en una cepa clínica y un estudio proteómico entre una cepa clínica sensible a quinolonas y un mutante isogénico resistente a quinolonas con la obtención de diversas proteínas de membrana que se sobre-expresaban en el mutante resistente; estas porinas podrían hacer la membrana bacteriana más impermeable a los agentes antimicrobianos. Un análisis de la membrana en mutantes resistentes a colistina demuestran que esta resistencia puede estar asociada a cambios a nivel proteico y a un incremento en la producción de lipopolisacáridos.Finalmente se ha analizado la formación de biopelícula en una colección de cepas clínicas de A. baumannii, estudiando la relación entre la formación de biopelícula y otras características clínicas o microbiológicas. Se ha demostrado que hay una clara asociación entre formación de biopelícula y sensibilidad a imipenem y ciprofloxacino; las cepas resistentes a quinolonas son menos propensas a formar biopelícula que sus equivalentes sensible debido a una expresión reducida de una fimbria de tipo 1, el primer paso en la formación de biopelícula. Además, pacientes tratados previamente con aminoglucósidos tienen un riesgo de ser colonizados o infectados con cepas de A. baumannii formadoras de biopelícula.En este trabajo también se han considerado otras genospecies y se han estudiado los mecanismos de resistencia a quinolonas y colistina, concretamente en cepas de la Genospecie 3 y 13. Cepas clínicas no pertenecientes al grupo A. baumannii están probablemente siendo subestimadas como agentes patogénicos porque las cepas resistentes pueden ser clasificadas como A. baumannii por equivocación. A pesar de que estas cepas son generalmente más sensibles a los antibióticos, están adquiriendo nuevos mecanismos de resistencia.

INTRODUCCIÓN:Tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo las Salmonellas son responsables de un alto nivel de morbilidad y mortalidad. Este problema es especialmente relevante en áreas en vías de desarrollo donde la carencia de fuentes económicas no permite disponer de un amplio potencial antibacteriano. Además, en algunas de estas áreas tanto la situación social como la presencia de otras enfermedades favorecen la infección por estos microorganismos. El género Salmonella está compuesto por 2501 serotipos con diferentes características fenotípicas y genotípicas y aunque usualmente produce una infección autolimitada, la duración o la severidad de los síntomas pueden requerir tratamiento antibiótico.Las especies de Salmonella disponen de altos niveles de resistencia natural a los agentes antimicrobianos más usados, sin embargo la aparición de cepas de Salmonella mostrando resistencia a uno o más agentes antibacterianos ha aumentado considerablemente probablemente debido a la continua presión antibiótica, lo cual constituye un importante problema para la salud pública. La resistencia a algunos antibióticos, tales como β-lactámicos, tetraciclina, cloranfenicol, o trimetoprim-sulfametoxazol está siendo reportada con alta frecuencia. Además se ha descrito el desarrollo de resistencia a quinolonas. Una eficiente ruta de adquisición de esta resistencia es a través de elementos genéticos tales como, plámidos, transposones e integrones.El principal objetivo de este estudio fue analizar la evolución de la resistencia en aislamientos de Salmonella de origen clínico, caracterizar los mecanismos de resistencia a diferentes agentes antimicrobianos y analizar el potencial de diseminación de clones resistentes.MATERIALES Y MÉTODOS:En este estudio se analizaron cepas (n=62) aisladas de muestras de heces procedentes de viajeros que padecían diarrea del viajero y cepas (n=34) aisladas de muestras de heces de pacientes con gastroenteritis aguda de diferentes regiones de Cuba. El estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Microbiología Clínica del Hospital Clínic de Barcelona. Los patógenos diarreagénicos encontrados fueron identificados por métodos convencionales. El serotipo se determinó utilizando antisueros somáticos y flagelares. La fase flagelar fue determinada por el método de inversión de fase descrito por Kauffman y White y siguiendo las recomendaciones de Edward y Ewing. También se identificaron los fagotipos de los serotipos Enteritidis, Typhimurium, Hadar y Virchow. Se determinó la susceptibilidad antimicrobiana por el método de Kirby-Bauer a diferentes agentes antimicrobianos: ampicilina, amoxicilina-ácido clavulánico, ácido nalidíxico, tetraciclina, trimetoprim-sulfametoxazol, cloranfenicol, gentamicina, amikacina, espectinomicina, imipenem, norfloxacino, ciprofloxacino y ceftazidima. La interpretación de los resultados se llevó a cabo según las normas del CLSI. Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 se utilizaron como cepas controles.Para determinar los mecanismos moleculares de resistencia a quinolonas se detectaron las mutaciones en los genes gyrA y parC mediante la técnica de PCR con iniciadores específicos. La presencia de los genes cmlA y floR asociados con la resistencia a cloranfenicol se determinó por PCR. La actividad cloranfenicol acetiltransferasa se determinó mediante un ensayo colorimétrico. La detección de los genes que codifican para beta-lactamasas (tipo tem, carb, shv, y oxa) así como la determinación de los mecanismos de resistencia a tetraciclina relacionados con la presencia de los genes tetA, tetB y tetG también fue determinada por PCR. Para determinar el mecanismo de resistencia a trimetoprim-sulfametoxazol la presencia de dihidrofolato reductasas fue determinada con primers genéricos y análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción. La detección de integrones Clase 1 también se determinó utilizando primes específicos ya descritos.Los productos de las diferentes PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 2%. El producto de la PCR visualizado en el gel fue secuenciado y analizado en un secuenciador automático usando el kit de secuenciación Big Dye3.1.La clonalidad de los aislamientos se determinó mediante análisis del ADN cromosómico digerido con XbaI y separación en electroforesis en campo pulsante.RESULTADOS:Los serotipos más frecuentes fueron Salmonella enteritidis y Salmonella typhimurium. La mayoría de las cepas mostraron resistencia al menos a uno de los agentes antimicrobianos utilizados, encontrándose un alto porcentaje de multirresistencia. Los antibióticos frente a los cuales se observó mayor resistencia fueron: tetraciclina, ampicilina, cloranfenicol, ácido nalidíxico y trimetoprim-sulfametoxazol. Una simple sustitución de aminoácidos en las posiciones 83 y 87 del gen gyrA ha sido descrita con anterioridad como causa de resistencia frente al ácido nalidíxico, mientras que sustituciones en ambas posiciones más sustituciones en el gen parC confieren elevada resistencia a fluoroquinolonas. En nuestro estudio se encontró resistencia al ácido nalidíxico y sensibilidad disminuida a ciprofloxacino y norfloxacino. Destacándose como principal causa de esta resistencia mutaciones en el gen gyrA. No se encontraron mutaciones en el gen parC. Ocho aislamientos mostraron resistencia a ampicilina provocada por la presencia de beta-lactamasas tipo CARB, TEM y OXA. Es algunas cepas productoras de beta-lactamasas tipo TEM también se encontraron niveles intermedios de sensibilidad a amoxicilina-ácido clavulánico. Está demostrado que la sobreexpresión de estas enzimas provoca sensibilidad disminuida o resistencia frente a este antibiótico.El principal mecanismo de resistencia involucrado en la resistencia al trimetoprim-sulfametoxazol fue la presencia de dihidrofolato reductasas presentes en cuatro aislamientos, específicamente dfrA1, dfrA12, dfrA14 y dfrA17. La resistencia al cloranfenicol estuvo determinada por la presencia de los genes cmlA, floR y la actividad cloranfenicol acetil transferasa (CAT). De los aislamientos resistentes a tetraciclina, el gen tetA fue el principal responsable de la resistencia. Los genes de resistencia localizados en integrones fueron asociados con resistencia a aminoglucosidos, beta-lactamasas, trimetoprim y cloranfenicol. El campo pulsante reveló la existencia y diseminación de un clon resistente de Salmonella typhimurium en diferentes regiones de Cuba.CONCLUSIONES:Nuestros resultados muestran niveles importantes de resistencia en cepas de Salmonella, principalmente frente al ácido nalidíxico, además de una gran heterogeneidad de mecanismos moleculares de resistencia frente a antibióticos de primera línea. A nuestro parecer con nuestro estudio contribuimos a mantener la vigilancia de esos microorganismos y así tener información de los niveles de resistencia para mejorar el tratamiento y desarrollar estrategias en la prevención de la diseminación de la resistencia.

La azitromicina ha mostrado resultados prometedores en el tratamiento de la infección respiratoria crónica por P. aeruginosa. No presenta actividad bactericida frente a este microorganismo en cultivo planctónico, pero se sabe que este macrólido inhibe la formación de biofilms gracias a su capacidad para interferir en el sistema quorum sensing bacteriano. En las infecciones crónicas frecuentemente se seleccionan mutantes que presentan un alto grado de adaptación al nicho ecológico y a los antimicrobianos, como ocurre con el mutante en nfxB, gen regulador negativo de la bomba de expulsión activa MexCD-OprJ. Este fenotipo es frecuentemente aislado en pacientes con fibrosis quística, EPOC y bronquiectasias, y se caracteriza por presentar resistencia a los antimicrobianos que puedan actuar como sustrato y por presentar una marcada hipersensibilidad a antibióticos betalactámicos no sustratos de la bomba y aminoglucósidos. Uno de los objetivos del presente trabajo fue averiguar si durante la exposición prolongada a azitromicina se seleccionan mutantes nfxB tanto en crecimiento planctónico como en forma de biofilm. Se evaluó el impacto de la hiperproducción de alginato y el efecto de la hipermutación sobre el efecto bactericida, sobre la dinámica de desarrollo de resistencias a azitromicina y sobre la posible aparición de resistencias cruzadas. También fue objeto de estudio la caracterización del mutante nfxB, así como la relación entre la hiperexpresión de MexCD-OprJ, la actividad de la cefalosporinasa cromosómica AmpC, y las bombas de expulsión intrínsecas MexAB-OprM y MexXY-OprM. Para llevar a cabo tales objetivos se construyeron mutantes deficientes en el gen mucA, mutS y la combinación de ambos y se evaluó su comportamiento en forma de biofilm al ser tratado con diversas concentraciones de azitromicina durante varios días. Se caracterizaron los mutantes resistentes a azitromicina, se determinó su perfil de sensibilidad, se cuantificó la expresión relativa de mexD mediante PCR a tiempo real y finalmente se secuenció su gen regulador nfxB revelando diversas mutaciones inactivantes. En síntesis, los resultados obtenidos demuestran que durante el tratamiento de los biofilms con azitromicina existe una selección de mutantes nfxB en las cepas salvajes, hiperproductoras de alginato y particularmente en las cepas hipermutadoras. Seguidamente se construyó el mutante nulo nfxB y se evaluaron sus propiedades biológicas, su sensibilidad al complemento del suero humano, la tasa y frecuencia de mutación en rifampicina. Finalmente se analizó su transcriptoma, mostrando que aparentemente no se sobrexpresan genes implicados en la resistencia antimicrobiana, a excepción de los pertenecientes al sistema mexCD-oprJ. Aunque en el perfil de proteínas fijadoras de penicilina no se hallaron diferencias entre el mutante nfxB y la cepa de referencia, el análisis de proteínas de membrana externa reveló una disminución de la expresión de de OprM, responsable de la hipersensibilidad a aminoglucósidos y betalactámicos con la excepción del imipenem. De igual forma, la disminución de la expresión de OprM no justificó la reversión del fenotipo de resistencia a betalactámicos en el mutante nfxB-dacB. Sin embargo, la determinación fraccionada (extracto crudo, periplasma y sobrenadante) de la actividad betalactamasa específica del mutante nfxB y del mutante doble nfxB-dacB reveló un drástico descenso de la actividad periplasmática, a expensas de un aumento de la actividad determinada en el sobrenadante. Nuestros datos revelan que la hipersensibilidad a betalactámicos es debida a la incapacidad para mantener AmpC en el espacio periplásmico, produciéndose una permeabilización al medio extracelular. No obstante un análisis más profundo de este fenómeno nos ha permitido demostrar cómo dicha permeabilización resulta beneficiosa en el seno de un biofilm tratado con betalactámicos, ya que AmpC quedaría recluido en su matriz. Finalmente, los datos preliminares sugieren que la permeabilización que experimenta AmpC en el mutante nfxB ocurre también para otras betalactamasas, particularmente de las clases B y D. Azithromycin has shown promising results in the treatment of P. aeruginosa chronic respiratory infections during the last years. Although it does not show bactericidal activity against planktonic cells, this macrolide is known to inhibit biofilm formation due to its ability to block or interfere with the bacterial quorum sensing. During chronic infections, mutants showing high level of adaptation to the lung environment and antibiotics are often selected, such as mutants in the gene nfxB, which encodes the negative regulator of the efflux pump MexCD-OprJ. This phenotype is frequently isolated in the respiratory tract of Cystic Fibrosis patients, but also in COPD and bronchiectasis, and it is characterized by showing antimicrobial resistance to those antimicrobials that can act as a substrate, and for presenting a marked hypersusceptibility to nonsubstrate beta-lactams and aminoglycosides. Therefore, one of the aims of this work was to assess if these nfxB mutants are selected during prolonged exposure to azithromycin in both planktonic and biofilm growth. Furthermore, we evaluated the effect of alginate overproduction and hypermutation on the bactericidal activity and the dynamics of development of resistance to azithromycin. In this work we have also characterized the nfxB mutant as well as the relationship between MexCD-OprJ overexpression (driven by nfxB inactivation), the activity of the chromosomal beta-lactamase AmpC and the major efflux pumps MexAB-OprM and MexXY-OprM. To carry out these objectives, strains PAO1, its mucA mutant, and their respective mutS-deficient hypermutable derivatives were constructed. The biofilms formed by these strains were treated with different azithromycin concentrations for several days and the dynamics of antibiotic resistance development was evaluated. Azithromycin resistant mutants were characterized, their susceptibility profiles were determined, their relative mexD expression was quantified and finally its regulatory gene nfxB was sequenced, revealing several inactivating mutations. In summary, our results demonstrate that nfxB mutants are readily selected during azithromycin treatment of biofilms in wild-type strains, alginate hyperproducers and particularly in hypermutable strains. Then, the knockout nfxB mutant was constructed and its biological features characterized, the susceptibility to the complement of human serum, its rifampicin resistance mutation rate and finally its whole genome gene expression was analyzed, showing that apparently there are no other overexpressed genes involved in antimicrobial resistance except for those belonging to MexCD-OprJ operon. Although no differences in the penicillin binding protein profile between the nfxB mutant and the reference strain were found, analysis of the outer membrane protein profile revealed a reduced expression of OprM, which is responsible for the hypersensitivity to aminoglycosides and beta-lactams, except imipenem. Likewise, a decrease in the OprM expression did not explain the reversion of the high beta-lactam resistance phenotype in the nfxB-dacB double mutant. However, beta-lactamase activity determination in different cell fractions (crude extract, periplasm, and supernatant) of nfxB and nfxB-dacB mutants revealed a dramatically decreased periplasmic beta-lactamase activity in contrast with an increased activity in supernatant. Then we assessed whether this difference was beneficial in a beta-lactam treated biofilm, showing that in this scenario the nfxB mutant yield higher survival rates than their respective parent strains in both induced and constitutively overexpressed AmpC conditions. Therefore, our data show that hypersusceptibility to beta-lactams is due to a deficient AmpC accumulation in the periplasmic space, resulting in a leakage out of the cell. However a deeper analysis has allowed us to demonstrate how that leakage was protective in biofilm growth, where AmpC could be confined in the extracellular matrix. Finally, preliminary data suggest that the AmpC leakage observed in the nfxB mutant also occurs with other beta-lactamases, particularly in B and D classes. L’azitromicina ha mostrat resultats prometedors en el tractament de la infecció respiratòria crònica per Pseudomones aeruginosa. No presenta activitat bactericida davant aquest microorganisme en cultiu planctònic, però es sap que aquest macròlid la formació de biofilms gràcies a la seva capacitat per interferir en el sistema quòrum sensing bacterià. En el transcurs de les infeccions cròniques sovint es seleccionen mutants que presenten un grau d’adaptació al nínxol ecològic i als antibiòtics, tal com escau amb el mutant nfxB, gen regulador negatiu de la bomba d’expulsió activa MexCD-OprJ. Aquest fenotip freqüentment és aïllat en mostres respiratòries de pacients amb fibrosi quística, MPOC i bronquièctasis, i es caracteritza per presentar resistència als antibiòtics que poden actuar com a substrat i per presentar una marcada hipersensibilitat als antibiòtics betalactàmics no substrats de la bomba i aminoglucòsids. Un dels principals objectius d’aquest treball va esser esbrinar si durant l’exposició perllongada a azitromicina es seleccionen mutants nfxB tant en cultiu planctònic com en forma de biofilm. Es va avaluar l’impacte de la hiperproducció d’alginat i l’efecte de la hipermutació sobre l’efecte bactericida, sobre la dinàmica de desenvolupament de resistències a azitromicina. També va esser objecte d’estudi la caracterització del mutant nfxB, així com la relació entre la hiperexpresió de MexCD-OprJ (a través de la mutació al seu gen regulador nfxB), la activitat de la cefalosporinasa cromosòmica AmpC, i les bombes d’expulsió intrínseques MexAB-OprM i MexXY-OprM. Per a dur a terme aquests objectius es van construir mutants deficients en el gen mucA, mutS) i la combinació de ambdós. Seguidament s’avaluà el comportament del mutants en dins un biofilm tractat amb diferents concentracions de azitromicina, així com la dinàmica de desenvolupament de resistències durant varis dies. Es caracteritzaren els mutants resistents a azitromicina, es va determinar el seu perfil de sensibilitat, es quantificà l’expressió relativa de mexD i finalment es va seqüenciar el seu gen regulador nfxB revelant diverses mutacions inactivants. En resum, els resultats obtinguts ens han permès demostrar que durant el tractament de biofilms amb azitromicina existeix una selecció de mutants nfxB a les soques salvatges, les hiperproductores d’alginat i particularment a les soques hipermutadores. Seguidament es va construir el mutant nul nfxB i es va procedir a l’avaluació de les seves propietats biològiques, la seva sensibilitat al complement del sèrum humà i la tassa i freqüència de mutació en rifampicina. Finalment es va analitzar el seu transcriptoma, mostrant que aparentment no es sobreexpressen gens implicats en la residència antibiòtica, exceptuant aquells que pertanyen a l’operó mexCD-oprJ. Al perfil de proteïnes fixadores de penicil•lina no es trobaren diferencies entre el mutant nfxB i la soca de referència, però l’anàlisi de proteïnes de membrana externa va revelar una disminució de la expressió de OprM, responsable de la hipersensibilitat a aminoglucòsids i betalactàmics amb l’excepció de l’imipenem. De forma anàloga, la disminució de l’expressió de OprM no justificà la reversió del fenotip de resistència a betalactàmics en el mutant nfxB-dacB. No obstant, la determinació fraccionada (extracte cru, periplasma i sobrenedant) de l’activitat betalactamasa específica del mutant nfxB i del mutant doble nfxB-dacB mostrà un dràstic descens de l’activitat periplasmática com a conseqüència de la inactivació de nfxB, a costa d’un augment de l’activitat mesurada al sobrenedant. Així, les nostres dades revelen que la hipersensibilitat a betalactámics és deguda a la incapacitat per acumular AmpC a l’espai periplàsmic, produint-se una permeabilització cap al medi extracel•lular. No obstant una anàlisi d’aquest fenomen ens ha permès descriure com aquesta permreabilització resulta beneficiosa en el si d’un biofilm tractat amb betalactàmics, degut a que AmpC quedaria reclòs dins la seva matriu. Finalment, les dades preliminars suggereixen que la permeabilització que experimenta AmpC al mutant nfxB ocorre també amb altres betalactamases, particularment de les classes B i D.

Las quinolonas son un grupo de antimicrobianos sintéticos, con un amplio espectro de acción y utilizados con gran éxito para el tratamiento de muy diversas patologías. Es también un grupo en plena fase de desarrollo, donde continuamente están apareciendo nuevas moléculas más activas que las preexistentes en muchos casos.Lamentablemente, la resistencia a quinolonas presenta entre la mayoría de sus moléculas lo que se conoce como resistencia cruzada, o susceptibilidad reducida. Por ello y para poder desarrollar nuevas moléculas dentro de esta familia es importante conocer cuales son los mecanismos de resistencia que presentan los microorganismos, en concreto las bacterias Gram-positivas, frente a estos compuestos. De este modo se podrían diseñar nuevas moléculas que no se vean afectadas por los mecanismos de resistencia ya conocidos. Otro de los parámetros importantes es conocer como las propias quinolonas seleccionan la aparición de mutantes resistentes.Por todos estos motivos, para el presente trabajo se plantearon los siguientes objetivos:1- Investigar las bases moleculares de los mecanismos de resistencia en bacterias Gram-positivas. En concreto, a Staphylococcus aureus un importante patógeno nosocomial, a Streptococcus pneumoniae un patógeno extrahospitalario y a Corynebacterium spp. un patógeno oportunista emergente, perteneciente a la flora habitual de la piel.2- Estudiar la selección in vitro de mutantes resistentes a quinolonas en aislamientos clínicos de S. aureus y S. pneumoniae.3- Determinar el grado de mutagenicidad de las diversas fluoroquinolonas y correlacionarla con la selección de mutantes resistentes. / The quinolones constitutes a group of synthetic antimicrobial agents, with broad spectrum, and have been used with great success for the treatment of a wide variety of pathologies. This group of antimicrobials still under development, and continuously, new molecules more active than the pre-existing ones in many cases are appearing. The resistance to quinolones is present between most of their molecules, this phenomenon is called crossed resistance, or reduced susceptibility. For that reason, to develop new molecules within this family, it is important to know the mechanisms of resistance that the microorganisms presented in front of these compounds, in particular in Gram-positive bacteria. In this way, new molecules could be designed to circumvent the mechanisms of resistance already known. Another important parameter is to know how the quinolones select for resistant mutants. By all these reasons, for the present work the following objectives were considered: 1 - To investigate the molecular bases of the mechanisms of resistance in Gram-positive bacteria. In particular, to Staphylococcus aureus an important nosocomial pathogen, Streptococcus pneumoniae a pathogen causing mainly community-acquired infections and to Corynebacterium spp. an emergent opportunistic pathogen, pertaining to the habitual skin flora. 2 - To study the "in vitro" selection of resistant mutants to quinolones in clinical isolates of S. aureus and S. pneumoniae. To determine the power of mutagenicity of different fluoroquinolones and to correlate it with the selection of resistant mutants.

Submitted by Alexandre Sousa (alexandre.sousa@incqs.fiocruz.br) on 2014-10-23T17:35:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Daniella Pereira.pdf: 902804 bytes, checksum: adb33a2bb49d4c2298f2b7aa2db9410e (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-23T17:35:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Daniella Pereira.pdf: 902804 bytes, checksum: adb33a2bb49d4c2298f2b7aa2db9410e (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Entre as espécies do gênero Acinetobacter, A. baumannii tem se destacado como um importante patógeno oportunista, responsável por infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) e surtos hospitalares, particularmente em unidades de tratamento intensivo. Geralmente, esses microrganismos acometem pacientes hospitalizados submetidos a procedimentos invasivos, ou imunodeprimidos. Na última década as cepas de A. baumannii tornaram-se rapidamente multirresistentes a diversos agentes antimicrobianos, facilitando a disseminação entre os pacientes e a persistência no ambiente hospitalar por longos períodos. Neste estudo, tivemos como objetivos identificar isolados clínicos de A. baumannii oriundos de dois hospitais públicos do Rio de Janeiro utilizando-se métodos convencional e automatizado, além de técnicas moleculares. Foi também verificada a suscetibilidade desses isolados, através de métodos fenotípicos e genotípicos, às drogas antimicrobianas e a um desinfetante à base de compostos quaternários de amônio (QACs). A capacidade de sobrevivência em ambientes escassos de água foi também verificada. Dentre os 94 isolados pertencentes à espécie A.baumanni, 89 (94,7%) isolados apresentaram os genes codificadores de oxacilinases, genes blaOXA-23, blaOXA-51 e a sequência de inserção ISAba1, concomitantemente. Foram verificados 87 (92,6%) isolados de A. baumannii, que apresentaram perfil de multirresistência (MDR), representando uma séria preocupação, pois a maioria deles apresentou suscetibilidade apenas às classes de antibióticos polipeptídicos (colistina) e glicilciclinas (tigeciclina), e resistência aos carbapenêmicos (imipenem e meropenem), aos ß-lactâmicos (penicilinas) e às cefalosporinas. A resistência aos ß-lactâmicos também foi examinada fenotipicamente pela produção de enzima metalo-ß-lactamases (MBL) através do teste de difusão em discos contendo ceftazidima e ácido 2-mercaptopropiônico. Não foi detectada a produção de MBL em nenhum dos isolados. A análise genotípica e fenotípica da resistência aos QACs, determinou que os isolados de A. baumanni mais suscetíveis às drogas antimicrobianas não apresentavam o gene qacE 1. Em apenas 5 (5%) isolados com perfil MDR o gene qacE 1, foi detectado. Não foi possível estabelecer uma relação entre a presença desse gene com a suscetibilidade reduzida ao desinfetante. Todos os isolados demonstraram ser sensíveis ao desinfetante utilizado no estudo através do método da Diluição de Uso. Em contra partida foi possível verificar que um isolado que apresentou todas as características fenotípicas e genotípicas de resistência aos antimicrobianos e presença do gene de resistência aos QACs foi capaz de sobreviver até o quadragésimo dia de incubação em condições totalmente adversas, ou seja, em um ambiente totalmente escasso de água. É necessário que uma maior atenção seja direcionada para o controle das IRAS, buscando o uso criterioso de drogas antimicrobianas, antissépticos e desinfetantes, para evitar a seleção, permanência e disseminação de microrganismos resistentes no ambiente hospitalar. / Acinetobacter baumannii has standed out among species from Acinetobacter genus as an important opportunistic pathogen, responsible for infections related to health assistance and hospital outbreaks, particularly in intensive care units. Usually, these microorganisms affect hospitalized patients submitted to invasive procedures or the immunosuppressed ones. In the last decade, A. baumannii strains fast became multiresistant to many antimicrobial agents, favouring the spread between patients and the persistence in hospital environment for long periods. In this study, the goal was to identify A. baumannii clinical isolates originated from two public hospitals from Rio de Janeiro using conventional and automatized methods, besides molecular techniques. Also, antimicrobial drugs and a quaternary ammonium compound (QACs) disinfectant susceptibility of these isolates was investigated using phenotypic and genotypic methods. Survival ability in environments with lack of water was also investigated. Among the ninety-four isolates belonging to A. baumannii species, eighty-nine presented oxacillinases codifying genes blaoxa-23, blaoxa-51 and the insertion sequence ISAba1 at the same time. Eighty-seven (92,6%) A. baumannii isolates presenting multiresistant (MDR) profile were detected, representing a serious concern because most of these presented susceptibility only to polipeptidic (colistin) and glycylcyclines (tigecycline) and resistance to carbapanemics (imipenem and meropenem), to β-lactamics (penicillins) and to cephalosporins. Resistance to β-lactamics was also screened phenotypically through metalo-β-lactamases (MBL) production using disk diffusion test containing ceftazidime and 2-mercaptopropionic acid. MBL production was not detected in none of the isolates. Genotypic and phenotypic analysis of the resistance to QACs demonstrated that A. baumannii isolates most susceptible to antimicrobial drugs did not presented qacE∆1 gene. In only 5 (5%) isolates presenting MDR profile, qacE∆1 gene was detected. It was not possible to establish a relation between the presence of this gene with reduced susceptibility to the disinfectant. All isolates shown to be susceptible to disinfectant used in this study through use dilution method. On the other hand, was observed that an isolate that presented all phenotypic and genotypic antimicrobial resistance characteristics and QACs resistance gene was able to survive until the fortieth day of incubation in total adverse conditions, in other words, in an environment totally lack of water. It is necessary a bigger attention in direction to the control of infections related to health assistance, searching a rational use of antimicrobial drugs, antiseptics and disinfectants, to avoid the selection, remaining and spreading of resistant microorganisms in the hospital environment.

Aquesta tesi doctoral se centra en l'estudi de l'aplicació de pèptids antimicrobians en la lluita contra agents patògens de cultius de plantes d'interès econòmic.L'estratègia sintètica s'ha portat a terme utilitzant metodologies convencionals de síntesi de pèptids en fase sòlida com l'estratègia tridimensional ortogonal Fmoc/tBut/Allyl. Ha calgut fer la recerca de les condicions òptimes per a l'eliminació del grup Allyl i la ciclació. D'entre els pèptids cíclics de 4-10 aminoacids sintetitzats, el decapèptid c(Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) ha resultat ésser el més efectiu i s'ha pres com a base per al disseny d'una quimioteca de 56 pèptids. Dels resultats obtinguts s'ha sintetitzat una segona quimioteca basada en l'estructura general c(X1-X2-X3-X4-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) determinada com la que posseix el millor perfil d'activitat. Els pèptids més efectius obtinguts constituixen els primers exemples de pèptids cíclics actius contra E. amylovora i poden ser considerats com a bons candidats pel desenvolupament d'agents antimicrobians efectius en protecció vegetal. / This PhD thesis was centred on the study of the application of de novo designed head-to-tail cationic cyclic peptides as inhibitors of the plant pathogenic microorganisms responsible for diseases in plants of great economic importance.The solid-phase synthesis of the cyclopeptides was carried out using a three-dimensional orthogonal Fmoc/tBut/Allyl strategy. The optimisation study of the allyl group removal and of the head-to-tail cyclization of linear peptides on SynPhase Lanterns was required for the syntheses. From the synthesized cyclic peptides of 4 to 10 residues, the cyclodecapeptide c(Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) was the most active and has been used as parent peptide in a using a combinatorial chemistry approach. From the results, a second library based on the structure c(X1-X2-X3-X4-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) has been synthesized. The best cyclodecapeptides are the first examples of cyclic peptides effective against E. amylovora and make them potential candidates for the development of antimicrobial agents for use in plant protection.

Yersinia enterocolitica es un patógeno Gram-negativo que provoca diversos síndromes gastrointestinales y expresa una panoplia de factores de virulencia, la mayoría regulados por la temperatura. El lipopolisacatido (LPS) es uno de los principales factores de virulencia de las bacterias Gram-negativas patógenas. Además, es una de las moléculas reconocidas por el sistema inmune innato y diana de los péptidos antimicrobianos. Por consiguiente, no es de extrañar que las bacterias modifiquen la estructura de su LPS con el fin de resistir a la defensa del sistema inmune. En esta Tesis Doctoral se han identificado los loci responsables de las modificaciones del lípido A de Y. enterocolitica O:8 (YeO8) y se ha demostrado que están reguladas por la temperatura. Se ha definido un circuito regulatorio complejo en el que intervienen los sistemas PhoP/PhoQ y PmrA/PmrB y en el que RovA y H-NS son piezas centrales. Además se demuestra que el lípido A tiene un papel en la virulencia de YeO8. Por último , se han identificado por primera vez en YeO8 la enzima PmrC, encargada de la adición de fosfoetanolamina al lípido A y la enzima LpxR encargada de la deacilación del lípido A.

Genetically modified crops are submitted to strict regulation to ensure the safety of consumers and the environment. To complement the comparison between GM plants and their counterparts, in the present Thesis, we evaluated the possible unexpected effects of the transgene on the host plant, by means of transcriptomic technologies. More exactly, we studied three pathogen-resistant GM rice lines: S-afp, expressing constitutively the antifungal protein AFP; and S-bp217 and S-bp213, expressing undecapeptide BP100 derivatives, which were developed in the UdG in the context of this Thesis. Although the high phytotoxicity of the BP100 derivatives on the host plant the transcriptional changes observed in S-afp, S-bp217 and S-bp213 compared to the conventional line Senia were similar that those observed in other GM crops, of other species and with different transgenes, and only the half of them was attributed to the insertion and/or expression of the transgene. / Les plantes modificades genèticament (MG) destinades a comercialització estan sotmeses a estricta legislació per garantir la seguretat del consumidor i del medi ambient. Per complementar la comparativa entre plantes MG i convencionals, en aquesta tesi s’ha abordat l’avaluació dels possibles efectes no esperats del transgèn sobre la planta hoste, mitjançant tècniques de transcriptòmica. Concretament s’han estudiat línies d'arròs MG que presenten fenotips de resistència a patògens: S-afp, que expressa constitutivament la proteïna antifúngica AFP, i S-bp213 i S-bp217, que expressen derivats de l’undecapèptid BP100, desenvolupat a la UdG, que s’han obtingut també en el marc d’aquesta tesi. Malgrat l’elevada fitotoxicitat dels derivats de BP100 enfront la planta hoste, els canvis transcripcionals de S-afp, S-bp213 i S-bp217 respecte la línia convencional Senia són similars als observats en altres events MG, de diferents espècies i amb diferents transgens; i només la meitat d’ells s’ha atribuit a la presència o expressió del transgèn.