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Avaliação imunoquimiluminescente em lesões tumoriais de mama

PATU, Vasco José Ramos Malta 31 January 2012 (has links)
Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9508_1.pdf: 2156372 bytes, checksum: 76c1e803c28acda81ef028ac3882938e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / Embora o estudo imunoistoquímico seja um método bastante utilizado na rotina do diagnóstico anatomopatológico, este teste ainda apresenta importantes limitações principalmente quanto a incapacidade de distinção entre alguns tipos de lesões tumorais. Dessa maneira, outras ferramentas vêm sendo desenvolvidas a fim de aumentar a sensibilidade e especificidade da identificação antígeno-anticorpo. Dentre estas, os ensaios quimiluminescentes vem sendo cada vez mais utilizados em estudos para o mapeamento de amostras biológicas para fins diagnósticos. Dentre os inúmeros benefícios da utilização dos métodos quimiluminescentes, podemos citar o limite de detecção ultrasensível, testes rápidos e um amplo campo de aplicações. O presente estudo buscou elaborar um protocolo para detecção da proteína galectina-3 em tecidos tumorais da mama a partir de anticorpo conjugado ao éster de acridina realizando ensaios imunoquimiluminescentes e compará-los aos resultados da imunohistoquímica convencional. O anticorpo monoclonal anti-galectina-3 foi conjugado ao éster de acridina e esse conjugado foi submetido à ensaios imunoquimiluminescentes em tecidos de mama além da imunohistoquímica convencional. Nossos resultados demonstram a eficiência na conjugação da anti-galectina-3 ao éster de acridina, um shelf-life do conjugado anticorpo/éster de acridina (AC-EA) com aproveitamento de 96,51% após 12 meses e a aplicação desse conjugado em ensaios imunoquimiluminescentes nos tecidos mamários com carcinoma ductal infiltrante (39.8 x 104 ± 29344) e com fibroadenoma (88.88 x 104 ± 17880) demonstraram padrões diferenciais entre a sua contraparte normal (58.87 x 104 ± 17880). Concluiu-se então, que o ensaio imunoquimiluminescente proposto pode ser utilizado como método diagnóstico alternativo na identificação de antígenos principalmente em amostras teciduais pequenas
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Síntese, caracterização estrutural e avaliação dos possíveis mecanismos de ação dos derivados espiro-acridínicos

Gouveia, Rawny Galdino 24 February 2017 (has links)
Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2017-10-24T13:09:10Z No. of bitstreams: 1 PDF - Rawny Galdino Gouveia.pdf: 21187770 bytes, checksum: 320540e5f560ea3cbfd7e23034f4444d (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2017-10-26T16:55:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Rawny Galdino Gouveia.pdf: 21187770 bytes, checksum: 320540e5f560ea3cbfd7e23034f4444d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-26T16:55:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Rawny Galdino Gouveia.pdf: 21187770 bytes, checksum: 320540e5f560ea3cbfd7e23034f4444d (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / Among the main alternatives for cancer treatment, chemotherapy is one of them, but most chemotherapeutic agents act nonspecifically, damaging several types of body cells. DNA intercalators are standout among the existing chemotherapeutics, for example, among these compounds, acridine derivatives have inhibitory activity against nuclear regulatory enzymes, such as topoisomerase, and there is a strong interaction with pairs of DNA bases. Therefore, researchers are seeking to find new candidates intercalators of DNA drugs and a significant number of molecules have been evaluated for their antitumor and intercalators properties. This paper proposed the synthesis of novel spiro-acridines derivatives; it was conducted to evaluate their interaction with BSA, DNA, and inhibition of the enzyme topoisomerase IIα. Thus, eleven new spiro-acridínicos compounds were synthesized and were determined their physicochemical characteristics and demonstrated the possible reaction mechanisms for obtaining these compounds. The compounds were obtained in parallel and convergent manner, initially the diphenylamine suffered an acylation followed by cyclization, leading to 9-metilacridina that by successive reactions led to 9-carboxaldehyde acridine. In parallel, 2- cianoacetohidrazina reacted with aromatic aldehydes substituted in acid and ethanol, leading to N-acylhydrazones intermediates substituted, finally, the two intermediates were condensed, through a Knovenagel reaction and suffered spontaneous cyclization, leading to spiro-acridine derivates. The compounds show yields ranging from 24% to 86.75%, and melting points ranging between 3 and 5 °C. Most of the compounds were characterized and had their chemical structures elucidated by spectroscopic H-NMR and C-NMR; IR and MS. By 1^H NMR analysis were observed singlets referring to NH, protons coming from the formation of the C = N bond (imino carbon) and C = C (vinyl carbon) corroborating the structural elucidation of all compounds. The 13^C NMR spectra showed the absorptions of carbon atoms characteristic of spiro-acridine derivatives, especially the chemical shift showed by the quaternary carbon evidenced on the signals from 69.33 to 71.59, demonstrating the occurrence of spontaneous cyclization of spiro-acridine derivatives. The compounds evaluated against the enzyme Topoisomerase IIα, presented different degrees of inhibition when compared with the mAMSA standard, and AMTAC 06 presented the best capacity for inhibition. The compounds that interacted with the DNA showed binding constants (Kb) 10^5M^-1, thus suggesting that the likely mechanism of action of these compounds may be related to the formation of a ternary complex between compound, DNA and Topoisomerase. The interactions with the BSA showed that all compounds evaluated were able to cause fluorescence extinction in a dose-dependent manner, and AMTAC 14 showed the highest fluorescence extinction capacity, probably due to its electronic effects. / Uma das principais abordagens para o tratamento do câncer é a quimioterapia, porém a maioria dos agentes quimioterápicos atua de forma não específica, lesando vários tipos de células do organismo. Entre os quimioterápicos existentes, destacam-se os intercaladores de DNA, como por exemplo, os derivados de acridina que possuem atividade inibitória frente a enzimas reguladoras nucleares, como as topoisomerase, além de uma forte interação com pares de bases do DNA. Por isto, pesquisadores vêm buscando a descoberta de novos candidatos a fármacos intercaladores do DNA e um número expressivo de moléculas tem sido avaliado quanto às suas propriedades antitumorais e intercaladoras. Este trabalho propôs síntetizar novos derivados espiro-acridínicos, analisar a interação destes com o BSA, DNA e a inibição da enzima topoisomerase IIα. Assim, onze novos compostos espiro-acridínicos foram sintetizados e determinados as suas características físico-químicas e demonstrados os possíveis mecanismos reacionais para a obtenção destes compostos. Os compostos foram obtidos de forma paralela e convergente, onde inicialmente a difenilamina sofreu uma acilação seguido de ciclização, obtendo-se a 9-metilacridina que por sucessivas reações foi obtido a 9-carboxialdeido acridina. Em paralelo, a 2-cianoacetohidrazina reagiu com aldeídos aromáticos substituídos em meio ácido e etanólico, conduzindo aos intermediários N- acilidrazônicos substituídos, por fim os dois intermediários foram condensados, através de uma reação de Knovenagel e ciclizaram espontaneamente, conduzindo aos derivados espiro- acridínicos. Os compostos apresentaram rendimentos que variaram de 24% a 86,75% e as faixas de fusão oscilaram entre 3 e 5ºC. A maioria dos compostos tiveram suas estruturas químicas caracterizadas e elucidadas através de técnicas espectroscópicas de RMN de 1^H RMN de 13^C ; IV e EM. Através da análise do RMN de 1^H foram observados singletos referentes ao grupo NH, prótons oriundos da formação da ligação C=N (iminico) e C=C (vinílico) corroborando para a elucidação estrutural de todos os compostos. Os espectros de RMN de 13^C evidenciaram as absorções dos átomos de carbono característicos dos derivados espiro-acridinicos, principalmente o deslocamento que mostrou o carbono quaternário evidenciado nos sinais entre 69.33 a 71.59 o qual demonstra a ocorrência da ciclização espontânea dos derivados espiro-acridinicos. Os compostos avaliados frente a enzima Topoisomerase IIα, apresentaram diferentes graus de inibição quando comparados com o padrão mAMSA, sendo o AMTAC 06 o que apresentou a melhor capacidade de inibição. Os compostos que interagiram com o DNA apresentaram constantes de ligação (Kb) 10^5M^-1, sugerindo dessa forma que o provável mecanismo de ação desses compostos pode estar relacionado a formação de um complexo ternário entre composto, DNA e Topoisomerase. As interações com a BSA, mostraram que todos os compostos avaliados foram capazes de causar a extinção da fluorescência de forma dose-dependente, sendo o AMTAC 14 o que apresentou a maior capacidade de extinção da fluorescência, provavelmente devido aos seus efeitos eletrônicos.
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Detecção de Galectina-3 por imunoquimiluminescência em tecidos tumorais próstata E tireóide

ARAÚJO FILHO, Jorge Luiz Silva 31 January 2011 (has links)
Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9637_1.pdf: 3541837 bytes, checksum: 335946642bbceea47297349a5c09095b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Embora o estudo imunoistoquímico seja um método bastante utilizado na rotina do diagnóstico anatomopatológico, este teste ainda apresenta importantes limitações principalmente quanto a incapacidade de distinção entre alguns tipos de lesões tumorais. Dessa maneira, outras ferramentas vêm sendo desenvolvidas a fim de aumentar a sensibilidade e especificidade da identificação antígeno-anticorpo. Dentre estas, os ensaios quimiluminescentes vem sendo cada vez mais utilizados em estudos para o mapeamento de amostras biológicas para fins diagnósticos. Dentre os inúmeros benefícios da utilização dos métodos quimiluminescentes, podemos citar o limite de detecção ultra-sensível, testes rápidos e um amplo campo de aplicações. O presente estudo buscou elaborar um protocolo para detecção da proteína galectina-3 em tecidos tumorais da tireóide e próstata a partir de anticorpo conjugado ao éster de acridina realizando ensaios imunoquimiluminescentes e compará-los aos resultados da imunoistoquímica convencional. O anticorpo monoclonal antigalectina- 3 foi conjugado ao éster de acridina e esse conjugado foi submetido à ensaios imunoquimiluminescentes em tecidos de próstata e tireóide além da imunohistoquímica convencional. Nossos resultados demonstram a eficiência na conjugação da anti-galectina-3 ao éster de acridina, um shelf-life do conjugado anticorpo/éster de acridina (AC-EA) com aproveitamento de 96,51% após 12 meses e a aplicação desse conjugado em ensaios imunoquimiluminescentes nos tecidos tireoidianos e prostáticos demonstraram padrões diferenciais entre as lesões estudadas e sua contraparte normal. Concluiu-se então, que o ensaio imunoquimiluminescente proposto pode ser utilizado como método diagnóstico alternativo na identificação de antígenos principalmente em amostras teciduais pequenas
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Síntese, caracterização e atividade biológica de novos derivados e atividade biológica de novos derivados da 3-(acridina-9-imetil) tiazolidina-2,4-diona

ALMEIDA, Marcel Lucas de 19 February 2015 (has links)
Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-29T14:00:29Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Minha dissertação final para biblioteca.pdf: 6771552 bytes, checksum: cc238895a0629230ce30655a760f5a10 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-29T14:00:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Minha dissertação final para biblioteca.pdf: 6771552 bytes, checksum: cc238895a0629230ce30655a760f5a10 (MD5) Previous issue date: 2015-02-19 / CAPEs / Estima-se que até 2030 o câncer será responsável por até 12 milhões de óbitos. Tendo em vista a necessidade de novos tratamentos para o câncer, este trabalho tem como objetivo sintetizar, caracterizar estruturalmente e avaliar a atividade anticâncer de sete novos derivados tiazacridínicos (LPSF AA-56, LPSF AA-57, LPSF AA-59, LPSF AA-60, LPSF AA-61, LPSF AA-62, LPSF AA-63). Estes derivados provém da hibridização molecular dos núcleos de tiazolidina e de acridina. As sínteses para obtenção destes compostos foram otimizadas para obtenção de um melhor rendimento. A síntese da tiazolidina-2,4-diona (TZD) foi feita por reação de ciclização. Uma posterior N-alquilação da TZD em presença de uma base e da 9-(bromo-metil)acridina, conduziu a formação do intermediário LPSF AA-1A. Os intermediários ésteres de Cope (IPs) foram obtidos a partir de uma reação de condensação Knoevenagel. A última etapa ocorreu por uma reação de adição de Michael através de reação entre a TZD N-alquilada com os ésteres de Cope, formando os derivados tiazacridínicos substituídos. A pureza e comprovação estrutural das moléculas sintetizadas foram obtidas através de cromatografia líquida acoplada a espectrômetro de massa (LC-MS), infravermelho (IV) e ressonância magnética nuclear (RMN) de hidrogênio. Ensaios de citotoxicidade dos derivados sintetizados foram realizados em células leucêmicas, fígado e próstata. Entre os compostos sintetizados, o LPSF AA-57 exibiu a atividade anti-cancerígena mais potente contra as linhagens celulares Jurkat (6,63 ± 2,65 μM), HL-60 (6,51 μM), K562 (3,97 ± 1,36 μM) e o LPSF AA-60 exibiu a atividade anti-cancerígena mais potente contra DU 145 (7,22 ± 3,12 μM). / It is estimated that cancer will be responsible for up to 12 million deaths by 2030. Given the need for new treatments for cancer this work aims to synthesize, characterize structurally and evaluate the anti-cancer activity of seven new thiazacridines derivatives (LPSF AA-56, LPSF AA-57, LPSF AA-59, LPSF AA-60, LPSF AA-61, LPSF AA-62, and LPSF AA-63). These derivatives derived of molecular hybridization from nucleus of thiazolidine and acridine. The syntheses for obtaining these compounds were optimized to obtain the best performance. Synthesis of thiazolidine-2,4-dione (TZD) was carried out by cyclization reaction. A further N-alkylation of the TZD in the presence of a base and 9-(bromomethyl)acridine, leading to formation of intermediate LPSF AA-1A. Intermediate esters of Cope (IPs) were obtained from a Knoevenagel condensation reaction. The last step was by a Michael addition, reaction between the N-alkylated TZD with ester of Cope, forming substituted thiazacridines derivatives. The purity and structural confirmation of the synthesized molecules were obtained from liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS), infrared (IR) and Proton nuclear magnetic resonance (NMR). Assays of cytotoxicity of the synthesized products was conducted in leukemic cells, liver and prostate. Among the synthesized compounds, the LPSF AA-57 exhibited the most potent anti-cancer activity against cell lines Jurkat (6,63 ± 2,65 μM), HL-60 (6,51 μM), K562 (3,97 ± 1,36 μM) and the LPSF AA-60 exhibited the most potent anti-cancer activity against DU 145 (7,22 ± 3,12 μM).
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Síntese de derivados indólicos/acridínicos e avaliação da interação com dna através de técnicas de espectroscopia utilizando brometo de etídio como sonda fluorescente

LAFAYETTE, Elizabeth Almeida 27 May 2016 (has links)
Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2017-05-04T19:42:55Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE.ELIZABETH.ALMEIDA.LAFAYETTE..pdf: 5409552 bytes, checksum: e75a96e9227604d98bcc02d9668c2c4a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-04T19:42:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE.ELIZABETH.ALMEIDA.LAFAYETTE..pdf: 5409552 bytes, checksum: e75a96e9227604d98bcc02d9668c2c4a (MD5) Previous issue date: 2016-05-27 / FACEPE / O DNA é um significativo receptor celular, onde muitos compostos químicos exercem seus efeitos antitumorais. A ligação de drogas ao DNA pode afetar a sua transcrição e a expressão da informação genética nas células, influenciando assim, na inibição do crescimento de células antitumorais, que é a base da concepção de fármacos mais eficazes. Moléculas com núcleos indois e acridínicos são biologicamente ativas e possuem atividades como antitumoral, antituberculose, anti-inflamatória e antiasmática; associado não apenas a interação com o DNA, mas também com proteínas, especialmente algumas enzimas-chaves na proliferação celular, as topoisomerases. Com base nestas informações, este trabalho teve como objetivo a síntese de onze novos derivados indólicos com anéis 3-amino-2-tioxo-tiazolidin-4-ona, 2-tioxo-tiazolidin-4-ona, tiazolidin-4-ona e 2-tioxo-imidazolidin-4-ona condensados como cadeias laterais e a síntese de oito novos derivados acridínicos com diferentes tiosemicarbazidas condensadas. Além disso, objetivou-se verificar a atividade antitumoral, investigar a capacidade de interação o DNA e atividade antitopoisomerase dos novos derivados obtidos. Os derivados foram sintetizados com êxito, com ponto de fusão em faixa de pureza e com estruturas elucidadas e comprovadas por espectrometria de massas (MS), infravermelho (IV), técnicas espectroscópicas unidimensionais de RMN1H e RMN13C, e algumas técnicas espectroscópicas bidimensionais, como COSY1H-1H e HSQC1H-13C. A avaliação antitumoral foi realizada com diferentes linhagens de células cancerígenas, por meio do ensaio antiproliferativo MTT e Sulforrodamina B. A análise da ligação ao DNA foi conduzido através da espectroscopia de absorção e da fluorescência utilizando o brometo de etídio (BE) como sonda fluorescente. Os derivados testados exibiram mudanças em suas propriedades espectroscópicas após a interação com ctDNA (DNA de timo bovino), com efeitos hipocrômico e hipercrômico, além de alterações na forma com desvio para a região do vermelho e do azul. Na série das acridinas testadas, o composto mais ativo no teste antiproliferativo foi o derivado não substituido (LT.26) na porção tiossemicarbazona, e o derivado com o substituinte cloro (LT.27) mostrou-se o mais eficiente na ligação com o DNA. Dentre os derivados indólicos, o composto com o grupamento amino livre e não substituído no anel indólico (SE.01) se destacou com eficácia nas linhagens de leucemias testadas e com o alto valor da constante de ligação ao DNA, Kb de 5.69 x 104, aliado a maior supressão da fluorescência, Ksv = 1.81 x 104, assegurando a participação do grupamento amino na interação com o DNA. O derivado indólico SE.05 apresentou destaque importante como compostos promissor, com atividade antitumoral para uma linhagem de mama testada, por apresentar potência superior ao controle positivo, a doxorrubicina. O derivado bis-indólico (TE.04) sintetizado, apresentou também eficácia nas linhagens de câncer testadas, entretanto com menor capacidade de ligação ao DNA. O derivado indólico SE.01 e TE.04 destaque foram conduzidos a uma avaliação da inibição da enzima topoisomerase I humana, porém mostraram-se ineficientes na inibição até a concentração de 50 μM analisada. Tais resultados mostram que o núcleo indol e acridínico, associados a heterocíclicos tiazolidinicos, imidazolidinicos e tiosemicarbazonas, são promissores como agentes antitumorais, com potencial capacidade de interação com o DNA. / DNA is a major cellular receptor, where many chemical compounds exercise their antitumor effects. The DNA binding drugs may affect its transcription and expression of genetic information in cells, thereby influencing, in inhibiting the growth of antitumor cells, which is the basis for design of more effective drugs. Molecules with indoles and acridines ring are biologically active and have activities such as anticancer, anti-tuberculosis, anti-inflammatory and anti-asthamatic; associated not only the interaction with DNA, but also to proteins, especially some key enzymes in cell proliferation, topoisomerases. Bases on this information, this study had as objective to the synthesis of eleven new indole derivatives with heterocyclic rings 3-amino-2-thioxo-thiazolidin-4-one, 2-thioxo-thiazolidin-4-one, thiazolidin-4-one and 2-thioxo-imidazolidin-4-one condensed as side chains; and synthesis of eight new derivatives acridine with different condensed thiosemicarbazides. Moreover, the objective was to determine the antitumor activity, investigate their ability to interact DNA and anti-topoisomerase activity. The derivative were synthesized successfully, with a melting range in purity and elucidated structures and proven by mass spectrometry (MS), infrared (IR), spectroscopic one-dimensional 1H NMR, 13C NMR, and some dimensional spectroscopic techniques such as COSY1H-1H and HSQC1H-13C. The antitumor evaluation was performed with different cancer cell lines, using the antiproliferative assay MTT and sulforrodamina B. Analysis of DNA binding was executed by absorption spectroscopy and fluorescence using ethidium bromide (EB) as a fluorescent probe. The derivatives tested exhibited changes in their spectroscopic properties, after interacting with ctDNA (DNA calf thymus), with hypochromic and hyperchromic effects and changes in form with deviation to the region of the red and blue. In the series of acridines tested, the most active compound in the antiproliferative test was the unsubstituted derivative (LT.26) in thiosemicarbazone moiety, and acridine derivative with the chloro substituent (LT.27) proved to be the most efficient in binding to DNA. Among the indole derivatives, the compound with the free amino group and unsubstituted in the indole ring (SE.01) was highlighted effectively tested on leucemia lines and the high value of the DNA binding constant, Kb of 5.69 x 104 ally to greater suppression of fluorescence, Ksv of 1.41 x 104, ensuring the participation of the amino group in the interaction with DNA. The indole derivative SE.05 presented significant attention as promising compounds with antitumor activity for a breast line tested by presenting power greater than the positivi control, doxorubicin. The bis-indole derivative synthesized (TE.04) also exhibit efficacy in cancer cell lines tested, however with lower DNA binding capacity. The indole derivatives SE.01 and TE.04 highlighted were conducted an evaluation of the inhibition of the enzyme topoisomerase I human, but proved to be inefficient in inhibition to the concentration of 50 μM analyzed. These results show that the indole and acridine nucleus, associated with thiazolidine and imidazolidine heterocyclic and thiosemicarbazones, are promising as antitumor agents with the potential ability to interact with DNA.
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Estudo da cinética e dos mecanismos de fototransformação do corante Acridina Laranja na sua interação com sistemas micro-organizados sob a ação da luz visível / Study of Kinetics and Mechanisms of Acridine Orange phototransformation at its interaction with micro-organized systems under the action of visible light

Silva, Érika Ribeiro e 06 December 2010 (has links)
O Acridina Laranja é um corante catiônico da família de Acridinas. Além de ser utilizado como um agente fototóxico contra bactérias e parasitas, devido a sua alta afinidade por estruturas biológicas, ele pode ser usado como um marcador fluorescente de compartimentos biológicos. Esta sua propriedade é também útil para o desenvolvimento de novos elementos micro e nanoeletrônicos. Ao ser irradiado, o corante pode sofrer fototransformação, causando uma série de transtornos, devido à perda da atividade ou o aumento de sua toxicidade, por exemplo. Por outro lado, a interação com estruturas nanoorganizadas pode alterar os mecanismos e as velocidades das fotoreações do fotossensibilizador. Isto torna importante o estudo da fototransformação do Acridina Laranja na sua interação com estruturas biológicas ou seus modelos. Neste trabalho foi realizado um estudo da dinâmica de fototransformação do corante Acridina Laranja na sua interação com DNA e micelas de SDS sob a ação da luz visível. O objetivo principal do trabalho foi avaliar o processo de fototransformação do Acridina Laranja na sua interação com sistemas micro/nanoorganizados de grande interesse biológico e médico, tendo em vista a sua possível aplicação prática. Para este estudo, utilizamos espectroscopia de absorção ótica UV-visível, espectroscopia de fluorescência estática e resolvida no tempo e espalhamento de ressonância de luz. Nos experimentos de fotólise do corante em soluções aquosas, observa-se que o Acridina Laranja sofre fototransformação sob a ação da luz visível. Os estudos mostraram que o Acridina Laranja se transforma mais rapidamente quando sua concentração é menor. Este efeito foi associado à formação de agregados em altas concentrações do composto. Na sua interação com DNA e micelas de SDS o Acridina Laranja também sofre fototransformação, sendo a velocidade de fotodecomposição mais baixa se compararmos com as soluções aquosas. Os experimentos na presença e na ausência de oxigênio mostraram que as moléculas excitadas do Acridina Laranja transferem sua energia para oxigênio molecular formando o oxigênio singleto que, por sua vez, pode atacar as ligações duplas do sistema de conjugação da estrutura do corante, contribuindo assim na sua fototransformação. De forma geral, podemos dizer que tanto as micelas de SDS como o DNA podem dificultar o contato do Acridina Laranja e o oxigênio molecular, provavelmente, devido à alta viscosidade do ambiente onde o Acridina Laranja se encontra nesses sistemas ou devido à localização separada das moléculas de Acridina Laranja e do oxigênio dentro da estrutura de micelas e DNA. / Acridine Orange is a cationic dye of the Acridine family. Besides it being used as a phototoxic agent against bacteria and parasites it can be used as a fluorescent tag of biological compartments due to its high affinity for biological structures. This property appears also useful for the development of new micro and nano-electronic elements. Under visible light irradiation Acridine Orange is phototransformed, causing a lot of inconvenience due to the loss of activity or the increased toxicity, for example. On the other hand the interaction with nanoorganized structures can change the mechanisms and rates photoreactions of a photosensitizer. This makes important the study of phototransformation of Acridine Orange at its interaction with biological structures or their models. This work represents a study of the dynamics of Acridine Orange phototransformation at its interaction with DNA and SDS micelles under the action of visible light. The main objective of this study was to evaluate the process of Acridine Orange phototransformation at its interaction with micro/nanoorganized of great biological and medical interest in view of their possible practical application. In this study we used optical absorption UV-visible spectroscopy, static fluorescence and time resolved spectroscopies and resonance light scattering. In the experiments in aqueous solutions, it was observed that the Acridine Orange suffers phototransformation under the visible light. It was shown that Acridine Orange becomes faster when its concentration is lower. This effect was associated with the formation of aggregates at high concentrations of the compound. Acridine Orange at its interaction with DNA and SDS micelles, also is phototransformated, the phototransformation rate being lower as compared with aqueous solutions. Experiments in the presence and absence of oxygen showed that excited molecules of Acridine Orange transfer their energy to molecular oxygen, generating singlet oxygen, which can attack the double bonds of the dye conjugation system, thereby contributing in its phototransformation. In general, we can say that both the SDS micelles as DNA can block the contact of Acridine Orange and molecular oxygen, probably due to the high viscosity of the environment, where Acridine Orange appears in these systems, and/or due to the separate location of Acridine Orange and oxygen molecules within the structure of micelles and DNA.
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Agregação da acridina laranja em soluções aquosas e na interação com micelas de SDS / Acridine orange aggregation in aqueos solutions and at its interaction with SDS micelles

Amado, André Miele 15 March 2013 (has links)
Esse trabalho apresenta um estudo experimental de agregação da Acridina Laranja (AL) em solução aquosa homogênea e na sua interação com o surfactante Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). Este estudo foi realizado com o objetivo de definir estruturas e características temporais de formação de agregados de compostos orgânicos com sistema desenvolvido de conjugação-, usados como fotossensibilizadores e marcadores de estruturas biológicas, em sua interação com nanoestruturas heterogêneas. A informação sobre as características de agregação de fotossensibilizadores é importante devido à influência deste processo na eficácia de suas aplicações práticas, em particular na biologia e medicina. A AL foi escolhida como modelo devido aos seguintes motivos: AL é um composto bem conhecido e várias de suas características já estão bem estabelecidas na literatura; Possui alto rendimento quântico de fluorescência, alta fotoatividade, alta afinidade com estruturas biológicas (membrana celular, DNA e RNA, em particular), por isso a AL é amplamente usada como marcador fluorescente e fotossensibilizador em fototerapia; AL possui a tendência de formar agregados em solução aquosa; A agregação da AL modifica seus espectros de absorção e de fluorescência, diminui o tempo de vida e o rendimento quântico de seus estados excitados. Isso a torna um modelo útil para o estudo do fenômeno da agregação. Foram analisados os espectros de absorção óptica, de fluorescência e de espalhamento ressonante da luz em regime estático e em função do tempo, como também o espalhamento dinâmico da luz para várias concentrações de AL e de SDS. Observamos que: em soluções aquosas a AL forma agregados tipo H; O aumento da concentração de AL em soluções homogêneas induz o aumento do número de agregação; A presença do sal estimula a agregação devido à diminuição da repulsão eletrostática entre as moléculas de AL; O SDS em concentrações acima de 60uM estimula a agregação da AL induzindo a formação de agregados mistos nAL+mSDS; A estrutura dos agregados nAL+mSDS é flexível e instável; Os agregados mistos possuem uma dinâmica de transformações caracterizada por quatro componentes, a primeira com tempo característico < 36 s e os outros três com tempos que variam de minutos até algumas horas; A agregação diminui a intensidade da fluorescência da AL e aumenta a intensidade do ERL; Em altas concentrações o SDS diminui o número de agregação da AL chegando finalmente à sua forma monomérica ligada com os agregados e/ou micelas de SDS; Se comparado com a AL em solução aquosa homogênea, a ligação de monômeros da AL com micelas de SDS aumenta a intensidade da sua fluorescência; O estudo demonstra que a agregação afeta a eficácia dos fotossensibilizadores em aplicações. Tal fato deve ser tomado em consideração, especialmente devido à sua dinâmica prolongada, pois as características dos fotossensibilizadores se modificam continuamente durante o seu uso. / In this work we present an experimental study of Acridine Orange (AO) aggregation in homogeneous aqueous solutions and its interaction with a surfactant Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). The objective of this study was to define the structure and temporal characteristics of aggregates of organic compounds with developed-conjugated system, used as photosensitizers and probes of biological structures, in its interaction with heterogeneous nano-structures. The information on photosensitizer aggregation characteristics is important as this process would affect its efficiency in practical applications, in biology and medicine, in particular. AO was chosen as a model for the following reasons: AO is a known compound with various characteristics well described in literature; AO has a high fluorescence quantum yield, high photoactivity, high affinity to biological structures (cell membrane, DNA and RNA, in particular), therefore, AO is widely used as a fluorescent marker and a photosensitizer in phototherapy; AO possesses a tendency to aggregate in aqueous solution. The aggregation of AO modifies essentially its absorption and fluorescence spectra, decreases the lifetime and quantum yield of its excited states. This makes AO a suitable model for studying the aggregation phenomenon. We have analyzed optical absorption, fluorescence and resonant light scattering spectra in the static mode and as a function of time as well as the dynamic light scattering for various AL and SDS concentrations. It was found that: in aqueous solutions AO forms H aggregates; The increase in concentration of AO in homogeneous solutions induces an increase in its aggregation number; The presence of salt stimulates aggregation due to decrease of electrostatic repulsion between AO molecules; The SDS concentrations above 60 M stimulate AO aggregation inducing the formation of mixed nAL + mSDS aggregates; Mixed nAL + mSDS aggregates are characterized by flexibility and instability; Transformation dynamics of the mixed aggregates is characterized by four components, the first one with a characteristic time <36 and the other three with times ranging from minutes to several hours; AO aggregation in a solution decreases its fluorescence and increases the resonant light scattering intensities; SDS at high concentrations reduces AO aggregation number until its monomeric form bound with SDS aggregates and / or micelles; AO monomers bound with SDS micelles possess higher fluorescence intensity as compared with that in homogeneous aqueous solutions. Our research shows that aggregation modifies efficacy of photosensitizers at their application. This has always to be considered especially due to its prolonged dynamics as the photosensitizer characteristics are modifying continuously during its application.
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Comparação e validação de técnicas clássicas e modificadas para estudos de potencial genotóxico de peptídeos utilizados na produção de radiofármacos / Comparison and validation of classical and modified techniques for studies of genotoxic potential of peptides used in radiopharmaceuticals production

Ivette Zegarra Ocampo 26 February 2016 (has links)
O teste de frequência de micronúcleos (FMN) in vitro é uma das metodologias de escolha no desenvolvimento de testes de segurança toxicológica. Para o seu desenvolvimento no trabalho foram realizadas modificações da técnica convencional, relativas ao substrato de cultivo das células e à sua coloração. As culturas celulares foram desenvolvidas diretamente nas lâminas e a coloração foi realizada com laranja de acridina (AO) ao invés da coloração segundo Giemsa. Foram utilizados controles positivos com potenciais clastogênico (mitomicina C, benzo[a]pireno) e aneugênico (colchicina), recomendados pela OCDE (Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico). Como moléculas-teste, foram utilizados compostos cuja associação a isótopos radioativos compõem radiofármacos produzidos pelo IPEN. DOTATATO e Ubiquicidina foram testados em diferentes concentrações proporcionais às concentrações máximas utilizadas em pacientes adultos. Para tanto, foram realizadas diluições correspondentes às concentrações 0,1X, 1X e 10X e culturas de células CHO-KI foram expostas a estas concentrações para ensaios de citotoxicidade e FMN. Nenhuma das concentrações induziu citotoxicidade significativa. Para análise de FMN, foram contabilizadas todas as células mononucleadas e multinucleadas até atingir a contagem de 1000 células binucleadas, com ou sem micronúcleos. Desta maneira foi possível analisar a frequência de micronúcleos e o índice de proliferação (CBPI). As concentrações dos fármacos em teste (0,1X, 1X e 10X) não induziram agressão às células. Nenhuma das concentrações revelou citotoxicidade ou genotoxicidade, ou ainda qualquer alteração no ciclo celular em comparação aos controles, comprovando sua segurança conforme os parâmetros exigidos pelas normas internacionais. Os resultados mostraram também uma boa concordância entre a comparação das leituras realizadas por analistas independentes, com pequenas discrepâncias discutíveis, e boa correlação com resultados obtidos com a coloração convencional. Desta maneira as modificações realizadas na técnica de FMN mostraram potencial para cumprir todos os quesitos como teste pré-clínico. / The in vitro micronucleus frequency test (FMN) is one method of choice in the development of toxicological safety tests. For its development, this work carried out modifications of the conventional technique regarding the cultivation substrate of the cells and staining for microscopy evaluation. The cell cultures were grown directly on slides, and staining was performed with acridine orange (AO) instead of the classical Giemsa staining. Positive controls were used for potential clastogenic (mitomycin C, benzo [a] pyrene) and aneugenic (colchicine) effects, recommended by the OECD (Organization for Economic Cooperation and Development). As test molecules, compounds were used whose association with radioactive isotopes make up radiopharmaceuticals produced by IPEN. DOTATATE and Ubiquicidine were tested at different concentrations proportional to the maximum concentrations used in adult patients. Therefore, corresponding to the concentrations dilutions were performed 0.1X, 1X and 10X cultures and CHO-KI cells were exposed to these concentrations for cytotoxicity assays and FMN. None of the concentrations induced significant cytotoxicity. For FMN analysis, it was recorded every mononuclear cells and multinucleated up to 1000 counts binucleated cells with or without micronuclei. In this way it was possible to analyze the frequency of micronuclei and the proliferation index (CBPI). The concentrations of the test drug (0.1X, 1X and 10X) did not induce aggression to cells. None of the concentrations showed cytotoxicity and genotoxicity, or any changes in cell cycle compared to controls, demonstrating their safety according to the parameters required by international standards. The results also showed good agreement between the comparison of readings by independent analysts, with minor discrepancies debatable, and good correlation comparing to classical staining technique. Thus the changes made in FMN technique showed potential to fulfill all requirements as preclinical test.
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Mecanismo molecular envolvido na resistência aos derivados de acridina e ao antimicótico tioconazol em Aspergillus nidulans. / Involved molecular mechanism in the resistance to the derivatives of acridine and antimycotic tioconazol in Aspergillus nidulans

Rocha, Eleusa Maria Ferreira 19 December 2002 (has links)
A humanidade tem aumentado drasticamente o uso de antibióticos, antifúngicos, inseticidas, herbicidas e agentes quimioterápicos para tratar infecções, câncer e obter ganho econômico com a produção agrícola e industrial. O repetido uso destas substâncias leva freqüentemente à sua ineficiência devido à seleção de organismos resistentes ou tolerantes, com graves conseqüências econômicas e sociais. Os mecanismos envolvidos no processo de resistência à antifúngicos são pouco conhecidos. A compreensão destes mecanismos auxiliará no desenvolvimento de estratégias para a identificação de isolados clínicos resistentes, no tratamento de infecções fúngicas, na prevenção do surgimento de isolados resistentes, na definição de novas estratégias de utilização de antifúngicos, na revelação de novos alvos terapêuticos e portanto, no controle dos patógenos. Para o entendimento das bases moleculares da resistência à acriflavina e outros agentes inibidores em fungos nós clonamos, por transformação, um gene que confere esta resistência em Aspergillus nidulans e o caracterizamos molecularmente. Construímos uma biblioteca a partir de uma linhagem duplo-resistente e isolamos um clone que se mostrou capaz de transformar uma linhagem receptora sensível em resistente à acriflavina. A seqüência deste clone proveniente do mutante resistente, e de seu alelo selvagem revelou um gene de aproximadamente 2276 nucleotídeos traduzido em 697 aminoácidos, com alta similaridade com a trealose sintase/fosforilase (glicosiltransferase) de vários organismos. Esta seqüência foi depositada no “GenBanK" (AY102266). As enzimas trealose sintase e fosforilase participam da síntese da trealose que, além de ser fonte de carbono, está relacionada com a proteção das proteínas de membrana e das enzimas, e contra o estresse térmico e oxidativo em fungos filamentosos. As seqüências nucleotídicas dos alelos selvagem e mutante não apresentaram diferenças nas regiões estruturais ou promotoras. No entanto, a seqüência do cDNA da linhagem selvagem apresenta um íntron extra quando comparada com o cDNA da linhagem mutante. Portanto, o mRNA do gene da linhagem mutante não estaria sendo adequadamente processado, provavelmente por uma alteração no mecanismo envolvido neste processamento, inviabilizando a funcionalidade da trealose sintase / fosforilase produzida. O nocaute deste gene e a análise do fenótipo dos mutantes nulos na presença de acriflavina ou brometo de etídio confirmaram que ele não é essencial para o fungo. Através de genética clássica verificou-se que não há interação gênica ou sinergismo entre as mutações acrA1, que confere resistência à acriflavina e a outros inibidores, e tebA1, que confere resistência ao antimicótico terbinafina no fungo A. nidulans. / Mankind has drastically increased the use of antibiotics, antifungals, insecticides, herbicides and chemotherapeutic agents to treat infections and cancer and to obtain economic gains with agricultural and industrial production. The continuous use of these substances frequently leads to their inefficiency due to the selection of resistant or tolerant organisms, with serious economic and social consequences. The mechanisms involved in the process of antifungal resistance are little known. Understanding these mechanisms will help in the development of strategies for the identification of resistant clinical isolates, the treatment of fungal infections, the prevention of the occurrence of resistant isolates, the definition of new strategies for the use of antifungal agents, and the discovery of new therapeutic targets, and therefore the control of pathogens. To better understand the molecular basis of resistance to acriflavine and other inhibitory agents among fungi we cloned by transformation a gene that confers this resistance to Aspergillus nidulans and characterized it molecularly. We constructed a library from a double-resistant strain and isolated a clone that proved to be able to transform a receptor strain sensitive into an acriflavine-resistant strain. The sequence of this clone obtained from the resistant mutant and of its wild allele revealed a gene of approximately 2276 nucleotides translated into 697 amino acids, with high similarity to the trehalose synthase/phosphorylase (glycosyltransferase) of various organisms. This sequence was deposited in GenBanK (AY102266). The enzymes trehalose synthase and trehalose phosphorylase are related to the synthesis of trehalose, which in addition to being a carbon source is related to protection of the membrane proteins and of the enzymes against thermal and oxidative stress in filamentous fungi. The nucleotide sequences of the wild and mutant alleles did not show differences in the structural or promoter regions. However, the cDNA sequence of the wild strain presents an extra intron compared to the cDNA of the mutant strain. Thus, the mRNA of the gene of the mutant strain may not be adequately processed, probably due to an alteration in the mechanism involved in this processing, leading to inviability of the functionality of the trehalose synthase/phosphorylase produced. Knock out of this gene and analysis of the null mutant phenotypes in the presence of acriflavine or ethidium bromide confirmed that this gene is not essential for the fungus. Using classical Genetics, no gene interaction or synergism was observed between the acrA1 mutation, which confers resistance to acriflavine and to other inhibitors, and the tebA1 mutation, which confers resistance to the antimycotic agent terbinafine in the fungus A. nidulans.
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Morfologia, morfometria e integridade da cromatina de espermatozoides epididimários de gatos / Morphology, morphometry and chromatin integrity of epididymal sperm in the domestic cat

Alves, Izabella Pazzoto [UNESP] 21 February 2017 (has links)
Submitted by Izabella Pazzoto Alves null (izapazzoto@hotmail.com) on 2017-03-29T18:48:37Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado - Alves, IP 2017.pdf: 1322169 bytes, checksum: 9b200f325b4ed42b13b4e4aafcd85329 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-03-30T18:04:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 alves_ip_me_jabo.pdf: 1322169 bytes, checksum: 9b200f325b4ed42b13b4e4aafcd85329 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-30T18:04:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alves_ip_me_jabo.pdf: 1322169 bytes, checksum: 9b200f325b4ed42b13b4e4aafcd85329 (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A avaliação de espermatozoides em tecnologias de reprodução assistida raramente analisa a integridade do DNA, crucial para o desenvolvimento embrionário. A técnica do azul de toluidina permite identificar alterações da cromatina com avaliação concomitante da morfometria espermática. O método foi descrito em diversas espécies, mas ao conhecimento dos autores, ainda não foi relatado em gatos. O objetivo deste estudo foi verificar a aplicabilidade da técnica de coloração de azul de toluidina em avaliar as anormalidades de DNA de espermatozoides epididimários (cabeça, corpo e cauda) de gatos. Investigar ainda se houve correlação entre as variáveis: condensação do DNA, morfologia e morfometria da cabeça espermática. Para este propósito, os índices de alteração de DNA obtidos pela técnica de azul de toluidina e laranja de acridina foram comparados, observando correlação de 65,38% (p<0,001). A estabilidade da cromatina aumentou significativamente da região da cabeça (92,06%) do epidídimo para a cauda (97,94%, p=0,0023), mas não houve diferença entre as regiões do corpo e da cauda, demonstrando que os espermatozoides provenientes destas regiões já possuem maturidade reprodutiva. Não houve correlação entre a anormalidade do DNA e a morfologia espermática como nas demais espécies, mas sim com a morfometria. Observou-se diminuição significativa do tamanho da cabeça do espermatozoide durante a passagem pelas três regiões epididimárias (p < 0,0001). A porcentagem de espermatozoides com cromatina descondensada diminuiu significativamente da região da cabeça até a cauda do epidídimo (26,36%, 15,69%, 3,38%, respectivamente, p<0,0001). Assim, concluímos que existe correlação entre área da cabeça do espermatozoide felino e condensação da cromatina. / Sperm selection in assisted reproductive technologies rarely evaluates the DNA integrity, which is crucial to the embryo’s development. The toluidine blue technique allows identification of chromatin alterations, simultaneously with evaluation of sperm morphometry. The method has been described in many species, but to the authors’ knowledge, it has yet to be described in cats. The objective of this study was to verify the applicability of the toluidine blue technique in analyzing DNA abnormalities of epididymal sperm (caput, corpus and cauda) in cats and further investigating if there was correlation between the variables: DNA condensation, morphology and morphometry of the sperm head. For this purpose, the DNA alteration indexes obtained by both toluidine blue and acridine orange techniques were compared and a 65.38% (p < 0.001) correlation was observed. The chromatin stability increased significantly in the head region of the epididymis (92.06%) in relation to the cauda (97.94%, p = 0.0023), however there was no difference between the caput and cauda regions, which demonstrates that sperm coming from these region are already mature. There was no correlation between the DNA abnormality and the sperm morphology as observed in other species, however there was correlation to morphometry. A significant decrease of the sperm head size was observed during the passage of the three epididymal regions (p < 0.0001). The percentage of sperm with deficient chromatin condensation decreased significantly from caput region to cauda of the epididymis (26.36%, 15.69%, 3.38%, respectively, p < 0.0001). Therefore, the evaluation of sperm head size can predict the quality of chromatin condensation.

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