Made available in DSpace on 2015-04-14T14:50:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 401915.pdf: 528070 bytes, checksum: d3061dc4db639040f254d5c17da71d31 (MD5) Previous issue date: 2008-06-09 / O sistema purin?rgico, especialmente a adenosina, pode desempenhar um papel na patofisiologia da esquizofrenia. A ativa??o dos receptores de adenosina A1 inibe a libera??o de v?rios neurotransmissores como o glutamato, a dopamina, a serotonina e a acetilcolina, e diminui a atividade neuronal pela hiperpolariza??o p?s-sin?ptica. A adenosina (ADA) participa no metabolismo da adenosina convertendo-a em inosina. O polimorfismo funcional mais freq?ente da ADA (22 G - (seta)A) (ADA1 *2) exibe 20-30% menos atividade enzim?tica em indiv?duos com o gen?tipo G/A do que em indiv?duos com o gen?tipo G/G. Esse polimorfismo foi avaliado em 152 pacientes esquizofr?nicos e 111 controles saud?veis. N?s observamos uma diminui??o significativa na freq??ncia do alelo de baixa atividade ADA1 *2 em pacientes esquizofr?nicos (7 4,6%) em rela??o aos controles (13 17%, p= 0,032, OR= 2,6). Esses resultados sugerem que o alelo ADA1 *2 associado ? baixa atividade da ADA, e conseq?entemente a altos n?veis de adenosina, ? menos freq?ente entre os pacientes esquizofr?nicos.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 447376.pdf: 1656350 bytes, checksum: c0a2b1db197a97d3100dfa1ffa101f1f (MD5) Previous issue date: 2012-12-26 / Benzodiazepines, such as diazepam and midazolam, are a widely used class of drugs for anxiety treatment, with anxiolytic, hypnotic, and anticonvulsant properties. The use of zebrafish (Danio rerio) as a model for evaluating pharmacological mechanisms has gained importance due to their rapid development and high sensitivity to drugs. Studies have shown that behavioral parameters were altered in zebrafish after benzodiazepine treatment. Many neurotransmitter systems have been identified in this species, including purinergic and cholinergic system. Purinergic system is characterized by the action of ATP and adenosine on purinoreceptor P2 and P1, respectively. The levels of these molecules are regulated by ectonucleotidases, especially nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDases) and ecto-5'-nucleotidase, which constitute the extracellular cascade for ATP hydrolysis to adenosine. Adenosine can be subsequently deaminated to inosine by action of adenosine deaminase (ADA). ATP is coreleased with other neurotransmitters, including acetylcholine, and has been demonstrated that adenosine can control the release of acetylcholine. Cholinergic system is characterized by the action of acetylcholine (ACh) on muscarinic and nicotinic receptors. The level of this molecule is regulated by acetylcholinesterase (AChE), which catalyzes degradation of ACh into choline and acetate. Since there are few reports relating these enzyme activities and the action mechanism of benzodiazepines, the aim of this study was evaluated the in vitro and ex vivo effects of classical benzodiazepines, such as diazepam and midazolam, on NTPDase, ecto-5'nucleotidase, ADA, and AChE activities in zebrafish brain and gene expression pattern in treatments that induced changes in enzyme activity in the ex vivo experiments. In order to elucidate whether diazepam or midazolam has direct effects on these enzymes, we performed in vitro experiments. Diazepam, at 500 μM, promoted a decrease on ATP hydrolysis (66%), whereas this drug, at 10-500 μM, reduced ADP hydrolysis (40-54%, respectively). Midazolam also decreased ATP (16-71% for 10-500 μM, respectively) and ADP hydrolysis (48-73% for 250-500 μM, respectively), and ecto-ADA activity (26-27.5% for 10-500 μM, respectively). Diazepam and midazolam did not induce significant changes on ecto-5?-nucleotidase activity at the concentrations tested. Concerning to AChE activity, 500 μM diazepam promoted a decrease on ACh hydrolysis (19%), whereas midazolam, at 50-500 μM, reduced AChE activity (18-79%, respectively). For ex vivo experiments, diazepam or midazolam exposures did not alter NTPDase activities in zebrafish brain membranes. AMP hydrolysis was decreased in animals treated with of 0.5 and 1mg/L midazolam (31.5% and 36.1%, respectively) when compared to the control group. However, diazepam was unable to alter ecto-5 -nucleotidase. Both drugs significantly decreased the ecto-ADA activity, whereas diazepam and midazolam reduced the adenosine hydrolysis at a concentration of 1.25 mg/L (30.85%) and 1 mg/L (32.8%), respectively. Diazepam did not alter cytosolic-ADA activity; however, the exposure to 0.1 mg/L midazolam induced a significant increase in cytosolic-ADA (39.9%) when compared with the control group. The gene expression pattern demonstrated that the CD73 transcript levels were increased (41.7%) after treatment with 0.5 mg/L midazolam. Moreover, the changes caused by diazepam and midazolam in the ADA activity are not related to the transcriptional control. Concerning the cholinerg signaling, diazepam decreased ACh hydrolysis at 1.25 mg/L (30.7%) when compared to the control group. Similarly, the exposure to 0.5 mg/L midazolam also changed the enzymatic activity of AChE promoting an increase in the ACh hydrolysis (36.7%). It is possible to suggest that these drugs can induce a direct effect on the enzyme activities, since we observed a decreased on nucleotide and nucleoside hydrolysis after in vitro exposure. In addition, the alteration on AMP hydrolysis, ADA and AChE activities suggest a modulation of extracellular adenosine and ACh levels induced by benzodiazepine exposure. / F?rmacos benzodiazep?nicos, como diazepam e midazolam, s?o muito usados na pr?tica cl?nica para o tratamento da ansiedade, possuindo propriedades ansiol?ticas, hipn?ticas e anticonvulsivantes. O uso do zebrafish (Danio rerio) como modelo para avaliar mecanismos farmacol?gicos tem ganhado grande import?ncia devido ao r?pido desenvolvimento e alta sensibilidade a drogas que essa esp?cie possui. Estudos t?m demonstrado que par?metros comportamentais mostraram-se alterados em zebrafish ap?s tratamento com benzodiazep?nicos. Muitos sistemas de neurotransmiss?o foram identificados nessa esp?cie, incluindo os sistemas purin?rgico e colin?rgico. O sistema purin?rgico ? caracterizado pela a??o do ATP e adenosina (ADO) nos purinoreceptores P2 e P1, respectivamente. Os n?veis dessas mol?culas s?o regulados pela a??o das ectonucleotidases, especialmente as nucleos?deo trifosfato difosfoidrolases (NTPDases) e a ecto-5 -nucleotidase, que catalisam a hidr?lise do ATP a adenosina. A adenosina pode ser desaminada a inosina pela a??o da adenosina desaminase (ADA). O ATP ? coliberado com outros neurotransmissores, entre eles a acetilcolina, e tem sido demonstrado que a adenosina pode controlar a libera??o de acetilcolina. O sistema colin?rgico ? caracterizado pela a??o da acetilcolina (ACh) nos receptores muscar?nicos e nicot?nicos. O n?vel dessa mol?cula ? regulado pela acetilcolinesterase (AChE), que catalisa a degrada??o da ACh em colina e acetato. Uma vez que existem poucos relatos relacionando esses sistemas enzim?ticos e a a??o de f?rmacos benzodiazep?nicos, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito in vitro e ex vivo do tratamento com f?rmacos benzodiazep?nicos, tais como diazepam e midazolam, sobre a atividade das NTPDases, ecto-5'-nucleotidase, ADA and AChE no enc?falo de zebrafish e o padr?o de express?o g?nica nos tratamentos que induziram altera??es na atividade enzim?tica nos experimentos ex vivo. A fim de elucidar se o diazepam e o midazolam t?m efeitos diretos nessas enzimas, experimentos in vitro foram realizados. Na concentra??o de 500 μM, o diazepam diminuiu a hidr?lise de ATP (66%) e, nas concentra??es de 10-500 μM, este f?rmaco reduziu a hidr?lise de ADP (40-54%, respectivamente). O midazolam tamb?m diminuiu a hidr?lise do ATP (16-71% para 10-500 μM, respectivamente), ADP (48-73% para 250-500 μM, respectivamente) e a atividade da ecto-ADA (26-27,5% para 10-500 μM, respectivamente). Diazepam e midazolam n?o induziram altera??es significativas sobre a atividade da ecto-5?-nucleotidase nas concentra??es testadas. Com rela??o ? atividade da AChE, o diazepam, 500 μM, promoveu uma diminui??o na hidr?lise de ACh (19%) e o midazolam, nas concentra??es de 50-500 μM, reduziu a atividade da AChE (18-79%, respectivamente). Nos experimentos ex vivo, as exposi??es ao diazepam e midazolam n?o alteraram a atividade enzim?tica das NTPDases em membranas cerebrais de zebrafish. A hidr?lise do AMP diminuiu em animais tratados com 0.5 mg/L e 1 mg/L de midazolam (31.5% e 36.1%, respectivamente) quando comparados com o grupo controle. Entretanto, o diazepam foi incapaz de alterar a atividade da ecto-5 -nucleotidase. Ambos os f?rmacos diminu?ram significativamente a atividade da ecto-ADA, sendo que o diazepam e o midazolam reduziram a hidr?lise da adenosina na concentra??o de 1.25 mg/L (30.85%) e 1 mg/L (32.8%), respectivamente. O diazepam n?o alterou a atividade da ADA citos?lica, no entanto a exposi??o a 0.1 mg/L de midazolam induziu um significativo aumento na atividade dessa enzima (39.9%) quando comparado ao grupo controle. O padr?o de express?o g?nica demonstrou que os n?veis de transcritos do CD73 apresentaram-se reduzidos (41,7%) ap?s o tratamento com 0.5 mg/L de midazolam. Com rela??o a sinaliza??o colin?rgica, diazepam diminuiu a hidr?lise da ACh na concentra??o de 1.25 mg/L (30.7%) quando comparado ao grupo controle. Similarmente, a exposi??o ? concentra??o de 0.5 mg/L de midazolam tamb?m alterou a atividade enzim?tica da AChE, promovendo um aumento na hidr?lise da ACh (36.7%). ? poss?vel sugerir que essas drogas podem induzir um efeito direto na atividade enzim?tica, uma vez que foi observada uma diminui??o na hidr?lise de nucleot?deos e nucleos?deos ap?s a exposi??o in vitro. Al?m disso, as altera??es na hidr?lise do AMP e atividade da ADA e da AChE sugerem uma modula??o dos n?veis extracelulares de adenosina e acetilcolina induzidos pela exposi??o aos f?rmacos benzodiazep?nicos.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 448604.pdf: 1148296 bytes, checksum: ca8ff4b1f0199484ac8c3e8b70d970b8 (MD5) Previous issue date: 2013-03-05 / According to data from the World Health Organization (WHO), stress affects more than 90% of the world's population and is considered a global epidemy. Stress has become an integral part of human life and organisms are constantly subjected to stressful stimuli that change various physiological processes, representing a risk factor for many diseases, such as cancer, cardiovascular, metabolic, infectious and gastrointestinal deseases and depression. The zebrafish (Danio rerio) has many similarities with mammalian in terms of overall organization and the functioning of their stress regulatory systems. The zebrafish hypothalamic-pituitary-interrenal (HPI), analogous to the mammalian hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA), has been found in zebrafish and the activation of this pathway is essential for the maintenance of vital functions in response to stressful events. Despite extensive knowledge regarding stress responses in mammals, data on the relationship between chronic unpredictable stress and its effects on purinergic signaling is limited. Purinergic signaling is mediated by ATP and adenosine receptor activation through P2 and P1, respectively. The catabolism of extracellular ATP to adenosine is promoted by the ectonucleotidases, such as Ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-5 '-nucleotidases (E-5?NT). Adenosine is deaminated by adenosine deaminase (ADA) producing inosine. Thus, these enzymes control the levels of extracellular nucleotides and nucleosides, exerting an influence on purinergic signaling. Considering some models of stress can affect the signalling systems, the objective of this study was to verify whether the unpredictable chronic stress changes ectonucleotidases and adenosine deaminase activities in zebrafish brain. In addition, we analyzed the metabolism of ATP as well as the expression of genes related to ADA, ada1, ada2.1, ada2.2, adaL, adaasi and the effects of agonists and antagonists of adenosine receptors in an unpredictable chronic stress model in zebrafish. Our results demonstrated that there are no changes on ATP (P = 0.1499), ADP (P = 0.3615) and AMP (P = 0.8987) hydrolysis in zebrafish brain membranes submitted to unpredictable chronic stress. In contrast, ecto-ADA activity significantly decreased (26.8%; 8,164 ? 0.78 NH3 min &#8722; 1 mg&#8722; 1 of protein; p 0.05; n = 5 <) in brain membranes of animals exposed to the unpredictable chronic stress when compared to the control group (11.15 ? 2.16 NH3 min &#8722; 1 mg &#8722; 1 of protein; p 0.05; n = 5). However, the activity of cytosolic ADA was not changed after the unpredictable chronic stress. Quantitative analysis by RT-qPCR did not show significant changes after chronic unpredictable stress exposure on gene expression in the genes ada1, ada2.1, ada2.2, adaL, adaasi. ATP metabolism in brain membrane preparations of zebrafish in the control group and stressed was measured by high-performance liquid chromatography (HPLC) and showed a significant increase of adenosine in stressed animals. Considering adenosine A1 receptor agonists have an anxyolitic activity and the A2A receptor antagonists can exert neuroprotective effects, we investigated the effect of administration of an agonist of A1 receptor, N&#8310;-ciclopentiladenosine (CPA), and an antagonist of A2A receptors, (ZM241385) on behavioral parameters of animals submitted to unpredictable chronic stress to check a possible relationship between the adenosinergic system and the stress. As a result we showed that these compounds have not been able to reverse the anxiogenic effect caused by unpredictable chronic stress. Since adenosine has neuromodulatory and anxiolytic effects, changes in its levels could play a role in counteracting the stress, which could be related to a compensatory mechanism in order to restore the homeostasis. / De acordo com dados da Organiza??o Mundial de Sa?de (OMS), atualmente o estresse afeta mais de 90% da popula??o mundial, sendo considerado uma epidemia global. O estresse tornou-se parte integrante da vida humana e os organismos s?o constantemente submetidos a est?mulos estressantes que alteram v?rios processos fisiol?gicos, sendo um fator de risco para diversas patologias, como c?ncer, doen?as cardiovasculares, metab?licas, infecciosas, gastrointestinais e depress?o. O peixe-zebra (Danio rerio) tem muitas semelhan?as com mam?feros em termos de organiza??o geral e o funcionamento dos respectivos sistemas reguladores do estresse. O eixo hipot?lamo-pituit?ria-interrenal (HPI), um sistema an?logo ao eixo hipot?lamo-pituit?ria-adrenal (HPA), foi descrito em zebrafish e a ativa??o desta via ? essencial para a manuten??o das fun??es vitais como resposta a eventos estressantes. Apesar do amplo conhecimento das respostas do estresse em mam?feros, os dados sobre a rela??o entre o estresse cr?nico imprevis?vel e seus efeitos na sinaliza??o purin?rgica s?o limitados. A sinaliza??o purin?rgica ? mediada por ATP e adenosina por meio da ativa??o dos receptores P2 e P1, respectivamente. O catabolismo de ATP extracelular at? adenosina ? promovido pelas ectonucleotidases, como as Ecto-nucleos?deo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases) e Ecto-5 - nucleotidases (E-5?NT). A adenosina produzida pode ser desaminada pela adenosina desaminase (ADA), produzindo inosina. Assim, estas enzimas controlam os n?veis de nucleos?deos e nucleot?deos extracelulares, exercendo uma influ?ncia na sinaliza??o purin?rgica. Considerando que alguns modelos de estresse podem afetar os sistemas de sinaliza??o, o objetivo deste estudo foi verificar se o estresse cr?nico imprevis?vel altera as atividades ectonucleotid?sicas e adenosina desaminase em c?rebro de zebrafish. Al?m disso, analisamos o metabolismo do ATP, bem como a express?o de genes relacionados ? ADA, ada1, ada2.1, ada2.2, adaL, adaasi e os efeitos de agonistas e antagonistas de receptores de adenosina em zebrafish submetidos a um modelo de estresse cr?nico imprevis?vel. Nossos resultados demonstraram que n?o h? altera??es na hidr?lise de ATP (P = 0.1499), ADP (P = 0.3615) e AMP (P = 0.8987) em membranas cerebrais de zebrafish submetidos ao estresse cr?nico imprevis?vel. Em contraste, a atividade da ecto- ADA diminuiu significativamente (26,8%; 8.164 ? 0,78 NH3 min&#8722;1 mg&#8722;1 de prote?na; p < 0,05; n = 5) em membranas de c?rebro de animais expostos ao estresse cr?nico imprevis?vel quando comparado ao grupo controle (11.15 ? 2,16 NH3 min&#8722;1 mg&#8722;1 de prote?na; p < 0,05; n = 5). No entanto, a atividade da ADA citos?lica n?o foi alterada. A an?lise quantitativa por RT-qPCR n?o apresentou altera??es significativas ap?s a exposi??o do estresse cr?nico imprevis?vel na express?o g?nica nos genes ada1, ada2.1, ada2.2, adaL, adaasi. O metabolismo do ATP em prepara??es de membrana de c?rebro de zebrafish no grupo controle e estressado foi medido por cromatografia l?quida de alta efici?ncia (HPLC) e mostrou um aumento significativo de adenosina nos animais estressados. Considerando que os agonistas de receptores A1 t?m uma atividade ansiol?tica e os antagonistas dos receptores A2A podem exercer efeitos neuroprotetores, investigamos o efeito da administra??o de um agonista do receptor A1, N&#8310;-ciclopentiladenosina (CPA), e de um antagonista de receptores A2A, (ZM241385) em par?metros comportamentais de animais submetidos ao estresse cr?nico imprevis?vel, para verificar uma poss?vel rela??o entre o sistema adenosin?rgico e o estresse. Como resultado, observamos que esses compostos n?o foram capazes de reverter o efeito ansiog?nico causado pelo estresse cr?nico imprevis?vel. Uma vez que a adenosina tem efeitos neuromodulat?rios, as altera??es nos n?veis de adenosina podem desempenhar um papel nos mecanismos relacionados ao estresse, representando um mecanismo de compensa??o a fim de restaurar a homeostase.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2015-12-09T20:35:40Z No. of bitstreams: 1 476600 - Texto Completo.pdf: 18032134 bytes, checksum: 54f2aebaf2f0ddae096eb7241880ec72 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-09T20:35:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 476600 - Texto Completo.pdf: 18032134 bytes, checksum: 54f2aebaf2f0ddae096eb7241880ec72 (MD5) Previous issue date: 2015-06-10 / Diabetes Mellitus (DM) is a chronic disease that affects about 387 million people worldwide, being characterized as a heterogeneous group of metabolic disorders that have in common the symptom of hyperglycemia. The zebrafish (Danio rerio) has long been used in research to understand different diseases, due to characteristics shown by this species, as the genome and the description of the general organization and neuronal circuitry very similar to those observed in mammals and the presence of the main neurotransmitters, hormones, and receptors in this animal. Some metabolic disease models have already been developed using zebrafish, demonstrating that it is capable to reproduce important symptoms of human disorders. In this study, we characterized a hyperglycemia model in zebrafish and evaluated behavioral parameters and the effects on the purinergic and cholinergic systems under this condition. The hyperglycemia model was developed by immersion of adult zebrafish in 111 mM glucose for 14 days followed by 7 days of glucose washout. The protein glycation, the insulin sensitivity, the response to anti-diabetic drugs and the gene expression of insulin receptors and glucose transporters were evaluated. Our results showed that this model caused a rise in blood glucose levels, being able to reduce the response to insulin, increasing retinal protein glycation and the expression of mRNA levels of insulin receptors on skeletal muscle, in both groups of 111 mM glucose and after 7 days of glucose washout. Treatments with Glimepiride and Metformin were able to revert hyperglycemia. Studies have demonstrated that the cholinergic and purinergic systems are involved in the cognitive decrease mechanisms related to DM. The mnemonic capacity of the animals was assessed by inhibitory avoidance. Our results demonstrated that hyperglycemia was able to promote memory loss of the animals, which can be related to the increase of AChE activity. The therapy with galantamine, a AChE inhibitor, was able to reverse hiperglycemia-induced memory deficits. Our data also showed that hyperglycemia reduced the activity of hydrolysis of purine nucleotides (ATP, ADP and AMP) and increased the activity of adenosine deaminase (ADA), suggesting that these changes may be contributing to cognitive deterioration induced by DM. These findings may contribute to a better understanding of the signaling pathways involved in the cognitive impairment in DM and presenting alternative targets to the utilization of drugs that minimize the effects of hyperglycemia in the CNS. / O Diabetes Mellitus (DM) ? uma doen?a cr?nica que atinge cerca de 387 milh?es de pessoas no mundo, sendo caracterizado como um grupo heterog?neo de dist?rbios metab?licos que apresentam em comum o sintoma de hiperglicemia. O peixe-zebra (Danio rerio) tem sido muito utilizado na pesquisa para compreender diferentes doen?as, devido ?s caracter?sticas apresentadas por esta esp?cie, como o genoma e a descri??o da organiza??o geral e de circuitos neuronais muito semelhantes aos observados em mam?feros e a presen?a dos principais neurotransmissores, horm?nios e receptores. Alguns modelos de doen?as metab?licas j? foram desenvolvidos em peixe-zebra, demonstrando que este ? capaz de reproduzir sintomas importantes das disfun??es encontradas em humanos. Neste estudo, n?s caracterizamos um modelo de hiperglicemia em peixe-zebra e avaliamos par?metros comportamentais e os efeitos sobre os sistemas purin?rgico e colin?rgico sob esta condi??o. O modelo de hiperglicemia foi desenvolvido atrav?s da imers?o do peixezebra em 111 mM de glicose por 14 dias e 7 dias de washout. A glica??o de prote?nas, a sensibilidade ? insulina, a resposta a drogas anti-diab?ticas e a express?o g?nica de receptores de insulina e transportadores de glicose foram avaliadas. Nossos resultados demonstraram que este modelo provocou um aumento dos n?veis de glicose sangu?nea, sendo capaz de diminuir a resposta ? insulina, aumentar a glica??o de prote?nas da retina e a express?o dos n?veis de RNAm dos receptores de insulina no m?sculo esquel?tico, tanto no grupo de 111 mM de glicose como ap?s 7 dias de washout. Os tratamentos com glimepirida e metformina foram capazes de reverter a hiperglicemia. Estudos t?m demonstrado que os sistemas colin?rgico e purin?rgico est?o envolvidos nos mecanismos de decl?nio cognitivos relacionados ao DM. A capacidade mnem?nica dos animais foi avaliada atrav?s de esquiva inibit?ria. Nossos resultados demonstraram que a hiperglicemia foi capaz de promover preju?zos na mem?ria dos animais, o qual pode estar relacionado como aumento da atividade da AChE registrada em enc?falo de animais hiperglic?micos. O tratamento com galantamina, um inibidor da AChE, foi capaz de reverter os efeitos sobre a mem?ria causados pela hiperglicemia. Nossos dados tamb?m demonstraram que a hiperglicemia reduziu a atividade de hidr?lise de nucleot?deos da adenina (ATP, ADP e AMP) e aumentou a atividade da adenosina desaminase (ADA), sugerindo que as modifica??es causadas podem estar contribuindo para a piora cognitiva induzida pelo DM. Estes achados podem contribuir para um melhor entendimento das vias de sinaliza??o envolvidas nos mecanismos de a??o do DM e apresentarem alvosalternativos para a utiliza??o de f?rmacos que minimizem os efeitos da hiperglicemia sob o SNC.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2016-05-10T11:19:25Z No. of bitstreams: 1 TES_MARINA_PETERSEN_GEHRING_COMPLETO.pdf: 5818535 bytes, checksum: 5b089589ca820b17117fd0c8e9d1cc90 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-10T11:19:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TES_MARINA_PETERSEN_GEHRING_COMPLETO.pdf: 5818535 bytes, checksum: 5b089589ca820b17117fd0c8e9d1cc90 (MD5) Previous issue date: 2016-01-11 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Gliomas represent the most common class of malignant tumors of the central nervous system being the most aggressive, and lethal brain tumors in primary brain tumors. Among the treatments, radiation is one of the most used therapies, but the intrinsic radioresistance of these tumors remains a critical problem in the management of these patients. Currently it is known that the effect of radiation extends beyond the directly cytotoxicity caused in tumor cells. Radiation therapy appears to induce an immunogenic cell death that among the features is ATP release. The ATP can cause cytotoxicity via P2X7 receptor and also acts as a sign of damage activating the immune system. The ATP can be hydrolyzed by enzymes of the purinergic system, among them the ectonucleotidase CD39, to adenosine, which has an opposite effect to ATP, causing immunosuppression. The radiation-induced ATP release and the ability of this nucleotide in modulate immune responses raised the hypothesis about the purinergic signaling participation in the tumor and immune cells response to radiation. Therefore, this study investigated: i) the role of ectonucleotidase CD39/NTPDase1 in the radiation-induced immune response in gliomas, ii) the importance of ATP-P2X7 receptor in the gliomas response to radiotherapy. Using knockout mice for CD39/NTPDase1, we observed that the deletion of this enzyme combined with radiotherapy significantly reduced the immunosuppressive cells Tregs in the tumor and spleen, attenuated the infiltration of myeloid derived suppressor cells caused by radiation and increased CCR7 expression in splenic dendritic cells and macrophages, indicating the presence of freshly mobilized antigen presenting cells available to differentiate in immune-effector cells that sustain a more prolonged antigen-specific T-cell?mediated immune response. Thereby, showing that blocking the activity of CD39/NTPDase1 can control immunosuppressive mechanisms generated by the tumor and promises to improve the radiotherapy response. Furthermore, in this study we observed that radiation actives the P2X7 receptor and by silencing this receptor on the GL261 glioma cell line, we have shown that radiotherapy is less efficient in vivo when compared with mice injected with GL261 WT cells, which constitutively express the P2X7 receptor. We also showed that patients with glioma that overexpress the P2X7 receptor, showed a better response to radiotherapy, revealing the importance of the expression of this receptor on glioma cells as a useful marker to analyze the tumor sensitivity to radiation and a successful radiotherapy response. In summary, our data shed light on the purinergic signaling for modulating the radiotherapy response in gliomas. / Os gliomas representam a classe mais comum de tumores malignos do sistema nervoso central, sendo o tumor cerebral mais agressivo e letal entre os tumores cerebrais prim?rios. Dentre os tratamentos, a radia??o ? uma das terapias mais utilizadas, por?m a radiorresist?ncia intr?nseca destes tumores continua a ser um problema cr?tico na gest?o de destes pacientes. Atualmente, sabe-se que o efeito da radia??o se estende al?m da citotoxicidade direta causada nas c?lulas tumorais. A radioterapia parece induzir uma morte celular imunog?nica, que entre as caracter?sticas est? a libera??o de ATP. O ATP pode causar citotoxicidade atrav?s do receptor P2X7 e tamb?m atua como um sinal de dano celular ativando o sistema imune. O ATP pode ser hidrolisado por enzimas do sistema purin?rgico, dentre elas a ectonucleotidase CD39/NTPDase1, ? adenosina, que tem um efeito aposto ao ATP, causando imunossupress?o. A secre??o de ATP induzida pela radioterapia e a capacidade deste nucleot?deo em modular a resposta imune, levantou a hip?tese da participa??o da sinaliza??o purin?rgica na resposta de c?lulas tumorais ? radia??o e na resposta imune induzida pela radioterapia. Portanto, neste estudo visou-se investigar: i) o papel da ectonucleotidase CD39/NTPDase1 na resposta imune induzida pela radioterapia em gliomas, ii) a import?ncia da via ATP-receptor P2X7 na resposta de gliomas ? radioterapia. Atrav?s de camundongos knockout para a enzima CD39/NTPDase1, observamos que a dele??o desta enzima combinada com a radioterapia reduziu significativamente as c?lulas imunossupressoras Tregs no tumor e no ba?o, atenuou a infiltra??o de c?lulas mieloides supressoras causada pela radia??o, e aumentou a express?o de CCR7 em c?lulas dentr?ticas e macr?fagos localizados no ba?o, indicando a presen?a c?lulas apresentadoras de ant?geno rec?mmobilizadas e dispon?veis para se diferenciarem em c?lulas imunes efetoras que sustentam uma resposta imune mais prolongada mediada por c?lulas T ant?geno espec?ficas. Deste modo, mostrou-se que o bloqueio da atividade da CD39/NTPDase1 pode controlar mecanismos imunossupressores gerados pelo tumor e promete melhorar a resposta ? radioterapia. Al?m disso, neste estudo observou-se que a radioterapia ativa o receptor P2X7 e atrav?s do silenciamento deste receptor na linhagem de glioma GL261, demonstramos que a radioterapia foi pouco eficiente in vivo, quando comparado com camundongos injetados com a GL261 WT, que expressa constitutivamente o receptor P2X7. Tamb?m demonstramos que pacientes com glioma que expressaram mais o receptor P2X7, apresentaram uma melhor resposta a radioterapia, revelando a import?ncia da express?o deste receptor em c?lulas de glioma como um marcador ?til para analisar a sensibilidade tumoral ? radioterapia e para uma resposta bem-sucedida ? radioterapia. Em suma, nossos dados lan?am luz sobre a sinaliza??o purin?rgica para a modula??o da resposta ? radioterapia em gliomas.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2016-05-17T11:43:35Z No. of bitstreams: 1 DIS_FERNANDA_FERNANDES_CRUZ_COMPLETO.pdf: 1282066 bytes, checksum: 5b0d649de7173c518fd09040b6012a0b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T11:43:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_FERNANDA_FERNANDES_CRUZ_COMPLETO.pdf: 1282066 bytes, checksum: 5b0d649de7173c518fd09040b6012a0b (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 / Zebrafish (Danio rerio) is a bony fish originated in Pakistan and India with anatomical and physiological characteristics and its genome is homologous to the more developed organisms, which suggests that many genes involved in human diseases can be coincident to the zebrafish genome. Copper is a heavy metal involved in formation of ROS, responsible for the lipid peroxidation in the membrane, direct protein oxidation and cleavage of DNA and RNA molecules. Purines (ATP, ADP and adenosine) and pyrimidine (UTP and UDP) can act as extracellular signaling molecules, exerting different physiological effects when binding to purninergic receptors. There are two families of purinergic receptors: adenosine receptors or P1 (P1R), and P2 receptor (P2R). The P1R are a family of G protein-coupled receptors and are divided inA1, A2A, A2B, and A3 subtypes. Adenosine is the major ligand for P1R, and is involved in important physiological functions such as modulation of neurotransmitter release, synaptic plasticity, neuroprotection to ischemic events, hypoxia and oxidative stress. Studies suggest that drugs that interfere in adenosine signaling may weaken the protective mechanisms and lead to an exacerbation of the inflammatory response. Caffeine is the most widely consumed psychoactive substance in the world and is a nonselective antagonist of adenosine receptors. This study aimed to evaluate the effect of caffeine in copper-induced inflammation in zebrafish larvae. The animals were treated with copper at a concentration of 10 ?M and three different concentrations of caffeine (100 ?M, 500 ?M e 1 mM) to determine the survival rate and to define timepoints and concentrations for the following experiments. It was observed that high concentrations of caffeine combined with copper caused a significant decrease of larvae survival after 24 h of treatment. For the following experiments, we chose 4 and 24 h of exposure, 500 ?M caffeine and 10 ?M copper concentrations. After 4 h of treatment, caffeine was able to change the behavior parameters. It was shown that both copper and caffeine might have an anxiogenic effect on zebrafish larvae after 24 h exposure. For the evaluation of inflammatory profile, inflammation markers PGE2, COX-2, TNF, IL-6 and IL-10 were chosen. In 4 hours of exposure, PGE2 levels are increased in groups treated with copper and caffeine. Caffeine showed an additive effect on the PGE2 release. The gene expression of TNF, as well as COX-2 was increased by copper treatment, however, in treatments with caffeine there was a reduction of COX-2 gene expression. In 24 h of treatment, caffeine induced an increase in COX-2, TNF, IL-6 and decrease IL-10 expression. The treatment with copper and caffeine combined increased the expression of the four adenosine receptor subtypes, especially after 4 h of exposure. This may be a result of receptors blockade by caffeine, or a physiological response to inflammation induced by copper, since adenosine, in general, exerts an anti-inflammatory effect. Although caffeine markedly decreased animal survival when combined to copper, caffeine did not potentiate the inflammatory and behavioral effects induced by copper. Our results suggest that caffeine alone is able to exert inflammatory and anxiogenic actions in zebrafish larvae at the timepoints and concentrations assessed. / O zebrafish (Danio rerio) ? um peixe ?sseo origin?rio do Paquist?o e da ?ndia com caracter?sticas anat?micas e fisiol?gicas hom?logas aos organismos mais desenvolvidos. Possui o seu genoma mapeado, com homologia ao genoma humano, o que sugere que diversos genes envolvidos em doen?as humanas podem ser coincidentes ao do genoma do zebrafish. O cobre ? um metal pesado que est? envolvido na produ??o de esp?cies reativas de oxig?nio, respons?veis pela peroxida??o de l?pidios nas membranas, oxida??o direta de prote?nas, e clivagem de mol?culas de DNA e RNA. Purinas (ATP, ADP e adenosina) e pirimidinas (UTP e UDP) extracelulares podem atuar como mol?culas sinalizadoras end?genas exercendo diferentes efeitos fisiol?gicos. Para tais ligantes, existem duas fam?lias de receptores purin?rgicos: receptores de adenosina ou P1 (P1R), e receptores P2 (P2R). Os P1R t?m como ligante end?geno a adenosina, e s?o uma fam?lia de receptores metabotr?picos, acoplados ? prote?na G, e se dividem nos subtipos A1, A2A, A2B e A3. A sinaliza??o mediada pela adenosina est? envolvida em importantes fun??es fisiol?gicas, como a modula??o da libera??o de neurotransmissores, plasticidade sin?ptica, neuroprote??o em eventos isqu?micos, hip?xia e estresse oxidativo. Estudos sugerem que subst?ncias que interferem na sinaliza??o adenosin?rgica na hip?xia podem enfraquecer os mecanismos protetores, resultando no aumento da resposta inflamat?ria. A cafe?na (1,3,7 ? trimetilxantina) ? a subst?ncia psicoativa mais consumida no mundo e ? um antagonista n?o seletivo dos receptores de adenosina. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da cafe?na na inflama??o induzida por cobre em larvas de zebrafish. Os animais foram tratados com cobre na concentra??o de 10 ?M e com outras 3 concentra??es diferentes de cafe?na (100 ?M, 500 ?M e 1 mM). Foi observado, que altas concentra??es (500 ?M e 1 mM) de cafe?na juntamente com o cobre provocaram um aumento significativo na mortalidade das larvas ao final de 24 horas de tratamento. Para os experimentos seguintes, foram escolhidos os tempos 4 e 24 horas e a concentra??o de 500 ?M de cafe?na e 10 ?M de cobre. Em 4 horas de tratamento, a cafe?na foi capaz de alterar os par?metros de comportamento avaliados. Foi demonstrado que tanto o cobre quanto a cafe?na, podem exercer um efeito ansiog?nico nas larvas de zebrafish ap?s 24 horas. Para a avalia??o do perfil inflamat?rio, foram escolhidos os marcadores de inflama??o PGE2, COX-2, TNF, IL-6 e IL-10. Foi mostrado que em 4 horas de exposi??o h? um aumento dos n?veis de PGE2 nos grupos tratados com cobre e cafe?na, mostrando um efeito aditivo da cafe?na em rela??o ? inflama??o induzida por cobre. A express?o g?nica de TNF, bem como a de COX-2 foi aumentada pelo tratamento com cobre, por?m, nos tratamentos com cafe?na houve uma diminui??o da express?o g?nica de COX-2. Em 24 horas de tratamento, a cafe?na induziu um aumento na express?o de COX-2, TNF, IL-6 e diminui??o de IL-10. Os tratamentos com cobre e cafe?na aumentaram a express?o dos 4 subtipos de receptores de adenosina principalmente ap?s 4 horas de exposi??o. Isso pode ser devido ao bloqueio dos receptores pela cafe?na e por uma medida fisiol?gica de defesa em resposta ? inflama??o induzida pelo cobre, visto que a adenosina, de uma forma geral, exerce um efeito anti-inflamat?rio. Embora a cafe?na tenha induzido uma diminui??o significativa da sobrevida dos animais, quando adicionada ao tratamento com cobre, nos marcadores inflamat?rios e nos par?metros comportamentais estudados, n?o houve um efeito aditivo da cafe?na na inflama??o induzida pelo cobre. Nossos resultados sugerem que a cafe?na por si s? ? capaz de exercer uma a??o inflamat?ria e ansiog?nica em larvas de zebrafish nos tempos e concentra??es estudados.

Neste trabalho relata-se pela primeira vez a determinação de adenosina por um biossensor baseado em tirosinase. O biossensor foi desenvolvido mediante a modificação de um eletrodo de carbono impresso (SPE) com nanopartículas de ouro (AuNPs), tirosinase (Tyr) e Nafion, denominado biossensor Nafion/Tyr/AuNPs/SPE. As AuNPs sintetizadas possuem diâmetro médio de 15,0 ± 1,1 nm e sua função é melhorar a via de condução de elétrons entre a enzima e o eletrodo. Utilizou-se o aprisionamento com filme Nafion® para evitar a lixiviação enzimática da superfície do eletrodo. A tirosinase imobilizada apresentou boa atividade frente ao substrato catecol. Verificou-se que a adenosina atua como um inibidor do tipo não-competitivo. O biossensor é estável durante pelo menos 45 dias. Além disso, foi realizada a eletro-oxidação da adenosina para sua determinação. O biossensor apresenta sensibilidade superior em comparação com SPE, AuNPs/SPE e Nafion/AuNPs/SPE. As curvas de calibração revelaram duas faixas lineares para as concentrações de adenosina, de 1,0 × 10-5 mol L-1 até 5,0 × 10-5 mol L-1 e entre 6,0 × 10-5 mol L-1 e 1,2 × 10-4 mol L -1. O limite de detecção (3 × (desvio padrão + média dos brancos)/coeficiente angular da curva) foi de 7,0 × 10-7 mol L-1. / In this work we report for the first time the determination of adenosine by a biosensor based on tyrosinase. The biosensor was developed by modifying a screen-printed carbon electrode (SPE) with gold nanoparticles (AuNPs), tyrosinase (Tyr) and Nafion, denoted as Nafion/Tyr/AuNPs/SPE biosensor. The synthesized AuNPs have a mean diameter of 15.0 ± 1.1 nm and their function is to improve the electron conduction pathway between the enzyme and the electrode. The entrapment with Nafion® film was selected to prevent the enzyme lixiviation from the electrode surface. Immobilized tyrosinase showed good activity with the catechol substrate. It was found that adenosine acts as a non-competitive type inhibitor. The biosensor is stable for at least 45 days. In addition, the electro-oxidation of adenosine was performed for its determination. The biosensor has superior sensitivity compared to SPE, AuNPs/SPE and Nafion/AuNPs/SPE. Calibration curves revealed two linear ranges for adenosine concentrations of 1,010-5 mol L-1 up to 5,010-5 mol L-1 and from 6,010-5 mol L-1 to 1,210-4 mol L-1. The detection limit (3 × (standard deviation + mean of blanks)/slope of the curve) was 7,010-7 mol L-1.

Resumo não disponível

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2016-08-25T16:23:46Z No. of bitstreams: 1 DIS_LUIZA_REALI_NAZARIO_PARCIAL.pdf: 804114 bytes, checksum: d4d4d3525f9a5a4a62c1c8080197776f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-25T16:23:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_LUIZA_REALI_NAZARIO_PARCIAL.pdf: 804114 bytes, checksum: d4d4d3525f9a5a4a62c1c8080197776f (MD5) Previous issue date: 2016-03-21 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Funda??o de Amparo ? Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul - FAPERGS / The LPS mechanism of action is still not completely elucidated on vertebrates like fish, and indeed differs from higher vertebrates. In zebrafish, LPS is capable of increasing the recruitment of immune cells and the expression of genes related to the immune response. The purinergic system has a great relation to the regulation of the immune system and inflammatory responses. The nucleotide ATP is able to induce cytokine secretion, recruitment and differentiation of immune cells. ATP can be dephosphorylated sequentially generating adenosine. In the context of inflammation adenosine serves as an innate immunomodulatory molecule. The control of adenosine extracellular levels is performed by nucleoside transporters and ecto-5'-nucleotidase. The ecto-5'-nucelotidase is an ectonucleotidase with pacemaker role in the production of adenosine and is one of the focuses of this study. Considering the analysis of the input images approach to the study of inflammation context, it is known that in rodents the uptake of 18F-FDG, an analogue of glucose, is increased under inflammation, which generates a differential image. The micro Positron Emission Tomography/ Computed Tomography (?PET /CT) is used for research in small animals and take images using a radiopharmaceutical. The use of ?PET/CT contributes with information at the molecular, structural and functional level and allows too monitor the effect of drugs in physiological / pathological situations in the range of a small animal as the zebrafish. The technology ?PET/CT is relatively new and so far there are no published scientific studies applying radiopharmaceuticals in zebrafish. In this context, the aim of the project was to study the involvement of the enzyme ecto-5'-nucleotidase in the development of inflammation induced by LPS using the cytological, biochemical, molecular and image (?PET) in different tissues of adult zebrafish (Danio rerio). To induce inflammation in zebrafish, the animals were injected with a solution of LPS (10 ug/g body weight, i.p) after being subjected to anesthesia (tricaine 0.1 g/L). The animals were kept for 2 hours or 24 hours in this treatment. For confirmation of inflammation were analyzed the gene expression of specific markers (tnf-? and cox-2) in encephalon, heart, kidney and intestine and differential counts of cells of the immune system. The activity and expression of ecto-5'-nucleotidase enzyme was analyzed in the encephalon, heart, kidney and intestine of control and treated animals. To keep the animals in ?PET/CT was performed anesthetic concentration curve (tricaine - 0.1, 0.12, 0.15 g/L) and standardized an apparatus to keep the fish in the presence of water, but yet still. A curve of time after injection of 18F-FDG was performed to obtain images in ?PET/CT (0, 10, 20 and 30 min) for standardizing the radiation quantitation in a gamma counter (15, 30, 60 90 and 120 min). Exposure to the LPS was able to increase the tnf-? expression in nearly all tissues studied (heart, kidney and intestine) and cox-2 in the kidney. The number of active peripheral blood white cells was also increased, confirming the induction of the inflammatory response. Hydrolysis of AMP in animals injected with LPS was increased in the heart in 24 hpi [72% compared to control] with no change in gene expression of ecto-5'-nucleotidase. The gene expression of ecto-5'-nucleotidase was adjusted temporarily in the kidney and intestine without altering the enzyme activity. After patterning images with ?PET/ CT and quantitation radiation by gamma counter for each organ examined, 30 minutes was defined as the best time for the biodistribution of 18F-FDG. After acquiring inflamed animal ?PET images it was not identified changes in the uptake of 18F-FDG compared to the control. Tissue quantification radiation registered a decrease in bone samples in animals treated with LPS, while other tissues have not changed. These data indicate that zebrafish responds to LPS by altering gene expression of specific markers, especially in kidney, and activation of white blood cells. The inflammation appears to be accompanied by a fine adjustment tissue-specific expression and activity of ecto-5'-nucleotidase in response to the inflammatory process. Although inflammation has been confirmed, the registration images by ?PET and radiation determination in different tissues have not been able to register differences in metabolic activity in animals treated with LPS. However, standardization of these techniques provides an advance in the use of radiopharmaceuticals in small animals, such as zebrafish. / O mecanismo de a??o do LPS ainda n?o ? completamente elucidado em vertebrados como os peixes, e se diferencia dos vertebrados superiores. Em zebrafish, o LPS ? capaz de aumentar o recrutamento de c?lulas imunes e a express?o de genes relacionados com a resposta imune. O sistema purin?rgico tem uma grande rela??o com a regula??o do sistema imune e as respostas inflamat?rias. O ATP ? um nucleot?deo importante na secre??o de citocinas e no recrutamento e diferencia??o de c?lulas imunes, podendo ser sequencialmente desfosforilado gerando adenosina. No contexto da inflama??o, a adenosina atua como uma mol?cula imunomodulat?ria inata. Participam do controle dos n?veis extracelulares da adenosina, os transportadores de nucleos?deos e a ecto-5?-nucleotidase. A ecto-5?-nucleotidase ? uma enzima com papel de marcapasso na produ??o de adenosina e constitui um dos focos do presente estudo. Considerando a contribui??o da abordagem de an?lise de imagens no contexto do estudo da inflama??o, ? sabido que a capta??o do radiof?rmaco 18F-FDG, um an?logo da glicoseest? aumentada em roedores submetidos ? inflama??o, o que gera uma imagem diferenciada. O micro Tom?grafo por Emiss?o de P?sitron/Tomografia Computadorizada (?PET/CT) ? utilizado para pesquisas em animais de pequeno porte e obt?m imagens utilizando um radiof?rmaco. O uso da ?PET/CT contribui com informa??es a n?vel molecular, funcional e estrutural em tempo real e permite acompanhar o efeito de f?rmacos em situa??es fisiol?gicas/patol?gicas na escala de um animal diminuto como o zebrafish. A tecnologia do ?PET/CT ? relativamente nova e at? o momento n?o existem estudos cient?ficos publicados aplicando radiof?rmacos em zebrafish. Neste contexto, o objetivo do projeto foi estudar o envolvimento da enzima ecto-5?-nucleotidase no desenvolvimento de inflama??o induzida por LPS utilizando-se de par?metros citol?gicos, bioqu?micos, moleculares e de imagem por ?PET em diferentes tecidos de zebrafish adulto (Danio rerio). Para induzir inflama??o no zebrafish, os animais foram injetados com uma solu??o de LPS (10 ?g/g de peso corporal; i.p) ap?s terem sido submetidos ? anestesia (trica?na 0.1 g/L). Os animais permaneceram por 2 h ou 24 h neste tratamento. Para confirma??o da inflama??o foram analisadas a express?o g?nica de marcadores espec?ficos (tnf-? e cox-2) em enc?falo, cora??o, rim e intestino e contagem diferencial de c?lulas do sistema imune. A atividade e express?o da enzima ecto-5?-nucleotidase foi analisada no enc?falo, cora??o, rim e intestino dos animais controle e tratados. Para manter os animais no ?PET/CT foi realizada uma curva de concentra??o de anest?sico MS-222 (0.1, 0. 12, 0.15 g/L) e determinado um aparato para manter o peixe na presen?a de ?gua mas, ainda im?vel. Uma curva de tempo ap?s a inje??o de 18F-FDG foi realizada para a obten??o de imagens em ?PET/CT (0, 10, 20 e 30 min) e para a padroniza??o da quantifica??o de radia??o em um Gamma counter (15, 30, 60, 90 e 120 min). A exposi??o ao LPS foi capaz de aumentar a express?o de tnf-? em quase todos os tecidos estudados (cora??o, rim e intestino) e de cox-2 no rim. O n?mero de c?lulas brancas ativas do sangue perif?rico tamb?m foi aumentado, confirmando a indu??o da resposta inflamat?ria. A hidr?lise de AMP em animais injetados com LPS foi aumentada no cora??o em 24 hpi [72% em rela??o ao controle] com nenhuma altera??o na express?o g?nica da ecto-5?-nucleotidase. A express?o g?nica do ecto-5?-nucleotidase foi ajustada temporalmente no rim e intestino sem altera??o da atividade enzim?tica. Ap?s a padroniza??o de imagens com ?PET/CT e da quantifica??o de radia??o por Gamma counter para cada ?rg?o analisado, definiu-se 30 min como o melhor tempo para a biodistribui??o do 18F-FDG. Ap?s a aquisi??o de imagens em ?PET de animais inflamados n?o se identificou altera??es na capta??o do 18F-FDG comparado com o controle. A quantifica??o tecidual de radia??o registrou uma queda nas amostras de ossos nos animais tratados com LPS, embora os demais tecidos n?o tenham sido alterados. Estes dados indicam que o zebrafish responde ao LPS alterando express?o g?nica de marcadores espec?ficos, especialmente no rim e ativando c?lulas brancas do sangue. A inflama??o induzida parece estar acompanhada por um t?nue ajuste tecido-espec?fico da atividade e express?o da ecto-5?-nucleotidase em resposta ao processo inflamat?rio. Ainda que a inflama??o tenha sido confirmada, o registro de imagens por ?PET e a determina??o de radia??o nos diferentes tecidos n?o foram capazes de registrar diferen?as na atividade metab?lica em animais tratados com LPS. Entretanto, a padroniza??o destas t?cnicas oferece um avan?o no uso de radiof?rmacos em animais de pequeno porte, como o zebrafish.

Orientador: Fabio Ermínio Mingatto / Banca: Cézar Rangel Pestana / Banca: Guilherme de Paula Nogueira / Resumo: Abamectina (ABA), pertencente à família das avermectinas é utilizada mundialmente como parasiticida, porém a intoxicação por ABA pode prejudicar o funcionamento hepático. Existem substâncias que quando metabolizadas exercem atividade tóxica, afetando a função de importantes organelas como a mitocôndria, responsável por uma variedade de processos bioquímicos, como a produção de ATP e morte celular. O objetivo desse estudo foi caracterizar o mecanismo de toxicidade da ABA em hepatócitos isolados de ratos e avaliar se esse efeito é dependente do seu metabolismo. A toxicidade da ABA foi avaliada monitorando o consumo de oxigênio e o potencial de membrana mitocondrial, concentração intracelular de ATP, viabilidade celular por meio da liberação das enzimas ALT e AST, homeostase intracelular Ca2+, liberação de citocromo c, atividade da caspase 3 e morte celular por necrose. A ABA reduz a respiração celular, tanto em células energizadas com glutamato mais malato quanto com succinato. O metabolismo da ABA reduz sua toxicidade, uma vez que hepatócitos previamente incubados com proadifen apresentam maior sensibilidade ao composto, sendo isto observado pelo rápido decréscimo da formação do potencial de membrana mitocondrial acompanhado pelas reduções das concentrações de ATP, viabilidade celular e ruptura da homeostase intracelular de Ca2+ com estabelecimento de necrose. Nossos resultados indicam que a toxicidade da ABA diminui com a sua biotransformação, e sua ação tóxica está relacionada com a inibição da atividade mitocondrial, levando à diminuição da síntese de ATP seguida pela morte da célula / Abstract: Abamectin (ABA), which belongs to the family of avermectinas, used worldwide as a parasiticide, but the ABA poisoning can impair the functioning liver. There are substances which exert toxic activity when metabolized, thus affecting the function of important organelles such as mitochondria, responsible for a variety of biochemical processes, such as ATP production and cell death. The aim of this study was to characterize the mechanism of toxicity of ABA in isolated rat hepatocytes and to evaluate whether this effect is dependent on your metabolism. The toxicity of ABA was assessed by monitoring oxygen consumption and mitochondrial membrane potential, intracellular concentration of ATP, cell viability by releasing enzymes ALT and AST, homeostasis intracellular Ca2+, release of cytochrome c, activity of caspase 3 and cell death necrosis. The ABA reduces cellular respiration, both in cells energized with glutamate and succinate over malate. The metabolism of ABA reduces its toxicity, since hepatocytes pre-incubated with proadifen are more sensitive to the compound, this being observed by the formation of rapidly decreasing mitochondrial membrane potential accompanied by reductions in concentrations of ATP, cell viability and rupture of the intracellular homeostasis Ca2+ with the establishment of necrosis. Our results indicate that the toxicity decreases as the ABA its biotransformed and its toxic action is related to the inhibition of mitochondrial activity, leading to decreased synthesis of ATP followed by cell death / Mestre