Introdução: Estudos em animais e em humanos demonstram que o alto consumo de cafeína pode promover riscos e complicações obstétricas podendo resultar em eventos teratogênicos na prole, como alterações esqueléticas, retardo no crescimento intrauterino e baixo peso ao nascer e a partos prematuros. Embora a relação entre o consumo de cafeína durante a gravidez e seus efeitos tóxicos sobre o desenvolvimento embrionário venham sendo alvo de vários estudos, seus mecanismos ainda não estão totalmente esclarecidos. Objetivos: avaliar os efeitos da utilização crônica de cafeína no período gestacional e neonatal sobre o desenvolvimento da prole, reflexos motores, comportamentos, resposta nociceptiva, atividade e expressão em hipocampo da acetilcolinesterase e, atividade de ectonucleotidases em medula espinhal de ratos. Métodos: o ciclo estral das ratas com aproximadamente 90 dias (peso 200-300 g) foi avaliado por meio de esfregaço de lavado vaginal. Sendo a prenhez confirmada, as ratas foram divididas em 3 grupos experimentais: (1) controle; (2) cafeína; e (3) abstido de cafeína. As ratas controles recebiam somente água, as do grupo cafeína recebiam 0,3 g/L de solução de cafeína diluída em água e as abstidas recebiam a mesma solução até o 7º dia de vida pós-natal (P7) da prole, sendo após substituída por água. O dia do nascimento foi considerado P0, padronizou-se 8 machos por ninhada. O comportamento de endireitamento postural e resposta a geotáxia negativa foram avaliados do P1 até P14 e utilizados como parâmetros dos reflexos motores da prole. No final do tratamento (P14) foram avaliados: (1) o limiar nociceptivo, utilizando aparelho de tail-flick; (2) a atividade locomotora no campo aberto (3) a funcionalidade dos receptores de adenosina, por meio da administração de agonistas e antagonistas adenosinérgicos; (4) hidrólise de nucleotídeos em sinaptossomas de medula espinhal; e (5) a atividade e a expressão gênica da enzima acetilcolinesterase em hipocampo. Os dados foram expressos em Média+Erro Padrão da Média (EPM), e analisados utilizando ANOVA de uma via/Tukey e ANOVA de duas vias de medidas repetidas/Tukey de acordo com cada experimento, as diferenças foram consideradas significativas quando P<0,05. Resultados: os animais dos grupos cafeína e abstido apresentaram um atraso no desenvolvimento dos reflexos neurológicos ao longo dos 14 dias de vida quando comparados ao grupo controle. No campo aberto, os animais do grupo cafeína apresentaram diminuição no tempo total de locomoção e cruzamentos externos em relação ao controle. O grupo abstido aumentou cruzamentos internos e diminuiu rearing. No teste de tail-flick, não observou-se diferença entre os grupos. Apesar de não haver diferença entre os grupos na resposta nociceptiva basal no teste de tail-flick, quando avaliamos a funcionalidade dos receptores de adenosina do tipo A1, observou-se que o grupo cafeína teve sua resposta diminuída ao agonista adenosinérgico (CPA) e o grupo abstido apresentou este efeito parcialmente revertido, demonstrando não ser um efeito de longa duração. No entanto, não foram observadas diferenças entre os grupos nas atividades de NTPDases e de 5’nucleotidase. Adicionalmente, observamos uma diminuição significativa na atividade da acetilcolinesterase (AChE) em hipocampo dos animais cafeínados comparados aos controles sem diferenças em sua expressão gênica, sugerindo assim que a baixa atividade desta enzima esta relacionada a mudanças pós-traducionais. Conclusão: Nossos resultados demonstram que o uso de cafeína durante a gestação e lactação pode trazer prejuízos ao desenvolvimento da prole, salientando a importância da restrição de alimentos e preparações que contenham esta substancia durante estes períodos. / Introduction: Studies in animals and humans show that high consumption of caffeine can promote risks and obstetric complications may result in teratogenic events in the offspring, such as skeletal abnormalities, intrauterine growth retardation and low birth weight and premature births. Although the relationship between caffeine consumption during pregnancy and its toxic effects on embryonic development may be the target of several studies, its mechanisms are not fully understood. Objectives: the aim was to evaluate the effects of gestational chronic caffeine intake and neonatal offspring development, neurological reflexes, behavior, nociceptive response, acetylcholinesterase activity and expression in hippocampus and ectonucleotidases activity in spinal cord of rats. Methods: adult female Wistar rats were performed vaginal lavage to verify the estrous cycle. Mating was confirmed by sperm presence in vaginal smears. On the first day of pregnancy, rats were divided into three groups: (1) control, (2) caffeine and (3) washout. Control animals received only water; caffeine group received caffeine solution 0.3 g / L diluted with water and the washout group received the same caffeine solution until the 7th day (P7), which was replaced by water. The birth date was considered P0, animals were standardized at 8 male animals per group. The righting reflex (RR) and negative geotaxis (NG) behaviors were measured from P0 to P14 and were using as motor reflexes. At P14 were evaluated: (1) the nociceptive response by tail-flick latency (TFL); (2) locomotor activity by open field test (OF); (3) functionality of A1 adenosine receptors by agonist and an antagonist administration of DPCPX and CPA; (4) nucleotides and nucleoside hydrolysis by spinal cord synaptosomes and (5) acetylcholinesterase (AChE) activity and gene expression in hippocampus. Data were expressed as mean ± SEM and analyzed using one-way ANOVA / Tukey and repeated measures ANOVA/Tukey, values were considered significant if P<0.05. Results: caffeine and washout groups presented a delay in the development of neurological reflexes over the 14 days of life when compared to the control group. In the open field, caffeine group showed a decrease in the total time of locomotion and outer crossing in relation to control. The washout group presented increase in inner crossing and decrease in rearing behavior. In the tail-flick test, no difference was observed between groups. Although there is no difference between the groups in baseline nociceptive response in the tail-flick test, when evaluating the functionality of A1 adenosine receptors, caffeine group presented a decreased response to adenosinergic agonists (CPA) and the washout group presented partially reversed of this effect, demonstrating it is not a long duration effect. However, no differences were observed between groups in the activities of NTPDase and 5'nucleotidase. Additionally, we observed a significant decrease in the activity of acetylcholinesterase in hippocampus of caffeine group compared to controls without differences in their gene expression, suggesting that the low activity of this enzyme is related to post-translational changes. Conclusion: Our results demonstrate that caffeine intake during pregnancy and lactation can bring harm to the offspring developing. Therefore, it becomes increasingly important restriction of food and caffeine-containing preparations during the embryonic period.

O ATP pode influenciar diversos processos fisiológicos através dos receptores P1 e P2, controlando as concentrações de ATP e adenosina extracelulares. O ATP pode modular a liberação e/ou ligação de outros neurotransmissores. No SNC, a adenosina e guanosina atuam como importantes neuromoduladores com efeitos inibitórios sobre a atividade neuronal. A inativação da sinalização do ATP é mediada pela ação das ecto-nucleotidases. Além dos seus papéis fisiológicos, as ações extracelulares das purinas podem ser relevantes para a patogênese e a atenuação de doenças cerebrais agudas e crônicas. Epilepsia é uma doença neurológica crônica caracterizada por crises recorrentes que são expressas na forma de convulsões acompanhadas pela modificação dos circuitos límbicos e freqüentemente apresenta características neurodegenerativas. A doença de Parkinson é caracterizada por uma neurodegeneração progressiva na substantia nigra pars compacta com subseqüente redução no conteúdo de dopamina estriatal. Encefalopatia diabética é uma reconhecida complicação do diabetes não tratado, resultando em um comprometimento cognitivo acompanhado de uma modificação da função hipocampal. Nesta tese, nós observamos: i) na epilepsia, nós demonstramos um aumento nas atividades das ecto-nucleotidases e das nucleotidases solúveis em fatias hipocampais e líquor após o modelo do abrasamento com PTZ, com distinta influência nos níveis dos nucleotídeos, nucleosídeos e oxipurinas e também nos níveis de RNAm das NTPDases de hipocampo. No modelo agudo, houve um aumento nos níveis de glicose e lactato extracelulares. Além disso, houve uma diminuição na captação de [14C]-2-deoxi-D-glicose e nos níveis de glicogênio hipocampais 10 minutos após a convulsão, retornando aos níveis normais 30 minutos após a convulsão; ii) na doença de Parkinson, nossos resultados reforçam a hipótese de que as mudanças no sistema adenosinérgico contribuem para a progressão da neurodegeneração na doença de Parkinson. Além disso, pela primeira vez, as mudanças no “sistema guanosinérgico” podem também ser mediadores na progressão desta doença; e iii) no diabetes, nosso estudo oferece evidências demonstrando que o sistema de sinalização do ATP está comprometido no hipocampo de ratos tratados com STZ, um modelo experimental de diabetes mellitus tipo 1. Estas modificações podem levar a alterações na modulação da neurotransmissão e gliotransmissão, podendo contribuir para um progressivo comprometimento cognitivo induzido pelo diabetes. / ATP may influence several physiological processes P1 and P2 receptors-mediated by controlling extracellular concentrations of ATP and adenosine. ATP may modulate the release and/or influence other neurotransmitters either by acting through its own receptors or by altering the neurotransmitter receptors. In the CNS, adenosine and guanosine act both as important neuromodulators with major inhibitory effects on neuronal activity. The inactivation of ATP signaling is mediated by the action of ecto-nucleotidases. Besides their physiological roles, purine-mediated extracellular actions may be relevant to the pathogenesis and/or alleviation of acute and chronic brain disorders. Epilepsy is a chronic neurologic disorder characterized by recurrent seizures that have a behavioral expression in the form of convulsions accompanied by a modification of limbic circuits and the frequent presence of neurodegenerative features. Parkinson’s disease is characterized by a progressive neurodegeneration in the substantia nigra pars compacta with a subsequent reduction in the striatal dopamine content. Diabetic encephalopathy is a recognized complication of untreated diabetes resulting in a progressive cognitive impairment accompanied by modification of hippocampal function. In this thesis, we observed: i) in epilepsy, we demonstrated an enhancement of ecto- and soluble nucleotidase activities in hippocampal brain slices and CSF after PTZ-kindling model, with distinct influence on the levels of nucleotides, nucleosides and oxypurines and also hippocampal NTPDases mRNA levels. Animals that presented tonic-clonic seizure had CSF glucose and lactate levels increased. Moreover, the hippocampal [14C]-2-deoxy-D-glucose uptake and glycogen content decreases at 10 min after seizure and returned to control levels at 30 minutes; ii) in Parkinson’s disease, our results reinforce the hypothesis that changes in the adenosinergic system contribute to the progression of neurodegeneration in Parkinson’s disease and point to the possibility of using the ectonucleotidases as targets for therapy. In addition, this is the first time, in our knowledge, that changes in the “guanosinergic system” might also be considered as mediators of the progression of this disease; and iii) in diabetes, our study provides evidence showing that the ATP signaling system is compromised in the hippocampus of STZ-treated rats, an experimental model of type 1 diabetes mellitus. These modifications could lead to alterations in the modulation of neurotransmission and gliotransmission, which may contribute to the diabetes-induced progressive cognitive impairment.

O ATP extracelular modula a atividade sináptica do SNC através de receptores purinérgicos do tipo P1 e P2. Os purinoreceptores do tipo P1 (A1, A2A, A2B e A3) são mais eficientemente ativados por adenosina, enquanto que os purinoreceptores P2 são ativados por ATP. Os níveis da ATP e adenosina na fenda sináptica são controlados pela ação de uma cascata de enzimas chamadas ectonucleotidases. Dentre outros membros, essa família de enzimas é composta pelas ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases), ectonucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPPs) e pela Ecto-5'- nucleotidase. Todos esses membros possuem funções específicas em uma variedade de situações fisiológicas, como por exemplo, o desenvolvimento cerebral e a cognição, ou parecem exercer algum papel na patofisiologia de doenças do SNC, tais como a epilepsia. Portanto, no presente estudo foi investigado (1) o mapeamento ontogenético das E-NPPs em diferentes regiões cerebrais, (2)a localização das E-NTPDases e E-5'-nucleotidase a nível sináptico e subsináptico em hipocampo e estriado de ratos, (3)a participação das E-NTPDases e E-5'-nucleotidase nos mecanismos neuroquímicos envolvidos no déficit cognitivo causado por convulsão neonatal em ratos adultos e (4) se o tratamento crônico com antagonistas não seletivos (cafeína) ou seletivos (KW6002) dos receptores A2A pode previnir os déficits de memória causados por convulsão neonatal em ratos adultos. Nossos resultados mostram uma ampla expressão relativa das E-NPPs durante todo o período de desenvolvimento cerebral. Além disso, as E-NTPDases e a E-5'-nucleotidase estão predominantemente localizadas nas sinapses, possuindo diferentes localizações pré e pós- sinápticas e diferentes associações glutamatérgicas e GABAérgicas. Nossos resultados também evidenciam que a hidrólise de ATP se encontra aumentada em ratos adultos que apresentaram déficit cognitivo após convulsão neonatal e que o consumo crônico de antagonistas dos receptores A2A (cafeína e KW6002) pode previnir o déficit cognitivo causado por crises epilépticas no período neonatal. Em resumo, essa tese mostra pela primeira vez a localização subsináptica das ectonucleotidases e correlaciona o sistema purinérgico com a maturação cerebral e com os déficits cognitivos induzidos por convulsão neonatal. Além disso, nossos resultados evidenciam que o consumo crônico de cafeína pode ser um provável agente profilático na prevenção de disfunções de memória na vida adulta associadas às crises convulsivas neonatais. / Extracellular ATP modulates the synaptic activity through P1 and P2 purinoceptors. Adenosine activates preferentially P1 receptors (A1, A2A, A2B, and A3) and ATP activates preferentially P2. The levels of ATP and adenosine in the synaptic cleft are controlled by the action of an enzyme cascade named ectonucleotidases. Besides other members, this enzyme family is constituted by ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase), ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP) and Ecto-5'- nucleotidase. All these members have specific physiological functions in brain development and cognition or seem to have some role in the patophysiology of brain disorders, such as epilepsy. Therefore, in the present study, we have investigated (1) the expression mapping of E-NPPs in different brain regions during development, (2) the synaptic and subsynaptic localization of ENTPDases and E-5'-nucleotidase in hippocampus and striatum of rats, (3) the participation of E-NTPDases and E-5'-nucleotidase in the neurochemical mechanisms of memory dysfunction induced by neonatal seizure in adult rats, and (4) if the chronic intake of nonselective (caffeine) or selective (KW-6002) antagonists of A2A could prevent the cognitive impairment caused by convulsion in early life. Our results showed a wild relative expression of E-NPPs during brain development. In addition, E-NTPDases and E-5'-nucleotidase are predominantly localized in synapses, with different pre and post-localization and different glutamatergic and GABAergic associations. Our results also showed an enhanced ATP hydrolysis in adult rats with memory impairment induced by neonatal convulsion and a prevention of this kind of memory dysfunction by the chronic intake of A2A receptors antagonists (caffeine and KW-6002). In summary, this study showed the first evidence of subsynaptic localization of ectonucleotidases and correlates the purinergic system with brain maturation and with the memory impairment induced by one single seizure in early life. Besides, our results pointed to the chronic intake of caffeine as a possible prophylactic agent for the prevention of cognitive dysfunction in adulthood induced by a single seizure in the neonatal period.

Trichomonas vaginalis é o protozoário flagelado que parasita o trato urogenital humano causando a tricomonose, doença sexualmente transmissível (DST) de origem não viral mais comum no mundo. Durante a infecção a aquisição de nutrientes, como nucleotídeos púricos, pirimidínicos e ferro é essencial à sobrevivência do parasito. T. vaginalis não sintetiza de novo purinas e pirimidinas, dependendo de vias de salvação para aquisição destas moléculas. O ferro desempenha um papel crucial na patogenicidade da tricomonose, influenciando a expressão de múltiplos genes envolvidos na virulência. Nucleotídeos extracelulares, especialmente o ATP, são liberados em situações de estresse, anoxia ou injúria, atuando como sinalizadores pró-inflamatórios ao sistema imune. As enzimas NTPDase e ecto-5'-nucleotidase degradam ATP à adenosina, esta com ação anti-inflamatória. A enzima adenosina deaminase (ADA) degrada adenosina à inosina. A presença desta cadeia enzimática em T. vaginalis sugere a modulação das concentrações nucleotídeos/nucleosídeos durante a inflamação. A atividade da ADA foi caracterizada em T. vaginalis, porém há poucos relatos sobre a participação desta enzima na sobrevivência do parasito, bem como, a localização celular e o efeito de nutrientes essenciais na atividade enzimática e na expressão gênica. O estudo da localização da ADA em T. vaginalis foi realizado, indicando a presença da enzima na membrana celular e no citoplasma do trofozoíto. Avaliando-se o perfil da ADA de diferentes isolados de T. vaginalis em uma condição de limitação de soro bovino, o qual representa a fonte de adenosina aos trofozoítos, não se observou diferenças significativas na deaminação da adenosina à inosina. Na avaliação do efeito de diferentes fontes de ferro ou a privação deste cátion na atividade e na expressão gênica da ADA foi possível verificar uma diminuição da atividade e um aumento na expressão gênica após a privação do ferro, reforçando a hipótese que este elemento pode modular a atividade das enzimas envolvidas na sinalização purinérgica. Os resultados obtidos nesta dissertação permitem a avaliação de importantes aspectos da ADA, contribuindo para o melhor entendimento do sistema purinérgico em T. vaginalis e seu papel no estabelecimento e manutenção da infecção e consequente sobrevivência do parasito. / Trichomonas vaginalis is a flagellate protozoan that parasitizes the urogenital human tract causing trichomonosis, the non-viral sexually transmitted disease (STD) most common in the world. During infection the acquisition of nutrients such as purine and pyrimidine nucleotides, and iron is essential to the parasite survival. T. vaginalis lacks de novo purines and pyrimidines synthesis depending on the salvation pathway for the acquisition of these molecules. Iron plays a crucial role in trichomonosis pathogenesis, influencing the expression of multiple genes involved in virulence. Extracellular nucleotides, especially ATP, are released during stress, injury or anoxia, acting as a pro-inflammatory signaling to the immune system. The enzymes NTPDase and ecto-5'-nucleotidase degrade ATP to adenosine with anti-inflammatory action. The adenosine deaminase (ADA) enzyme degrades adenosine to inosine. The presence of this enzymatic chain in T. vaginalis suggests the modulation of nucleotides/nucleosides concentrations during inflammation. The ADA activity was characterized in T. vaginalis, but there are few reports on the participation of this enzyme in the parasite survival, as well as the cellular localization and the effect of essential nutrients on enzyme activity and gene expression. The study of ADA localization in T. vaginalis was performed, indicating the presence of the enzyme on trophozoite cell membrane and cytoplasm. Evaluating the ADA profile in different T. vaginalis isolates in bovine serum limitation condition, which is the source of adenosine for the trophozoites, no significant differences were observed in the deamination of adenosine to inosine. Regarding the effect of different iron sources or iron deprivation in activity and gene expression of ADA, it was observed a decrease in activity and an increase in gene expression after iron deprivation, reinforcing the hypothesis that this element can modulate the activity of enzymes involved in the purinergic signaling. The results obtained in this study allow the assessment of important aspects of ADA, contributing to a better understanding of the purinergic system in T. vaginalis and its role in the establishment and maintenance of infection and consequent survival of the parasite.

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T16:52:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marin_RodrigoMiguel_D.pdf: 1749179 bytes, checksum: 025af214a1c78761be008c2a30ea5596 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A adenosina quinase tem um papel crítico no controle da disponibilidade tecidual de adenosina. Sua inibição provoca aumento da concentração local de adenosina, que, por sua vez, exerce efeitos em múltiplos aspectos da função celular. O desenvolvimento de bloqueadores farmacológicos da atividade da adenosina quinase tem, portanto, amplo potencial de aplicação terapêutica. O presente estudo foi planejado para caracterizar os efeitos inibitórios de derivados de 4-anilinoquinazolinas, DMA - cloridrato de 6,7-dimetóxi-4-N-(N,N¿-3¿-dimetilfenil)aminoquinazolina e PD153035 - Cloridrato de 6,7-dimetóxi-4-N-(3¿-bromofenil) aminoquinazolina na atividade da adenosina quinase, bem como sua ação sistêmica sobre a concentração de adenosina em órgãos e tecidos. Para avaliar a hipótese de inibição da adenosina quinase pelos compostos 4-anilinoquinazolínicos foram feitos ensaios in vitro com adenosina quinase recombinante (~42 kDa) clonada de fígado de camundongos. O ensaio para avaliar a atividade e a cinética da adenosina quinase recombinante constou de determinação do consumo de adenosina, obtido através de medidas da concentração de adenosina no meio com técnica de HPLC. Os estudos iniciais de cinética enzimática foram realizados sob condições saturantes, em realação ao substrato ATP, adicionado-se concentrações variadas de adenosina ao meio de reação Nestas condições a reação foi ajustada ao modelo de Michaelis-Menten e os parâmetros Km (Constante de dissociação que caracteriza a especificidade do substrato pela enzima) e Vmax (Velocidade máxima da reação enzimática sob concentrações saturantes de substrato) utilizados para análise da cinética. Considerando-se o consumo de adenosina, os valores de Km e Vmax da adenosina quinase foram de 2,5 ± 0,28 µM e 38 ± 1,26 nmols /min/µg de proteína, respectivamente. Experimentos realizados com o inibidor clássico de adenosina quinase, 5-Iodotubercidina, produziram inibição com IC50 de 100nM. Em seguida foram feitos experimentos in vitro para verificar os efeitos inibitórios dos compostos 4-anilinoquinazolínicos DMA e PD153035 na atividade da adenosina quinase. A avaliação da cinética enzimática na presença de várias concentrações de DMA e PD153035 permitiu confirmar a atividade inibitória desses compostos na adenosina quinase recombinante. Os valores de IC50 (a concentração do inibidor que exibe a metade do efeito inibitório máximo) foram de 0,8 nM e 1,2 pM para o PD153035 e DMA, respectivamente. Os valores de Ki (Constante de inibição) calculados com base nos valores de IC50 através da equação de Cheng-Prusoff foram estimados em 0,24 pM e 160 pM, para o DMA e o PD153035, respectivamente. Confirmada a hipótese de que os compostos 4-anilinoquinazolínicos inibem a atividade da adenosina quinase in vitro, realizamos experimentos in vivo para avaliar se o DMA aumenta a disponibilidade de adenosina em coração, fígado e cérebro de ratos, bem como em corações isolados de ratos, em preparações de Langendorff. As dosagens de adenosina tecidual foram obtidas através de método baseado em HPLC. A análise revelou um aumento médio de 47% e 30% nos níveis de adenosina no coração e fígado, respectivamente, de ratos tratados por gavagem com DMA em relação aos controles. Nos experimentos de corações isolados, a análise das amostras mostrou um aumento médio de 64% da concentração de adenosina nos corações perfundidos com o composto em relação aos controles. Conclusões: Com base nos achados do presente estudo podemos concluir que 1) a adenosina quinase recombinante apresenta atividade enzimática in vitro; 2) os compostos derivados de 4-anilinoquinazolinas DMA e PD153035 inibem a atividade da adenosina quinase recombinante em baixas concentrações, sugerindo um efeito específico e 3) a administração sistêmica de DMA provocou aumento da disponibilidade de adenosina em tecidos e em órgão isolado de ratos, possivelmente em decorrência de inibição da atividade de adenosina quinase tecidual. Tendo em vista a importância dos efeitos da adenosina sobre o sistema biológico e a confirmação da potência e seletividade de compostos 4-anilinoquinazolínicos como inibidores de adenosina quinase, pode-se sugerir o potencial uso terapêutico desses compostos em doenças, cuja origem esteja relacionada com alterações da concentração de adenosina celular / Abstract: Adenosine kinase has a critical role in the control of bioavailability of tissue adenosine. Its inhibition increases the local concentration of adenosine that affects several aspects of cellular functions. The development of pharmacological agents with adenosine kinase inhibitory properties has attracted interest as a promising strategy for therapeutic application. The aim of the present work was to characterize the inhibition effects of 4-anilinoquinazolines derivatives, DMA ¿ -N-(N,N-3'-dimethylphenylamino) -6,7-dimethoxyquinazoline hydrochloride and PD153035 - -N-(3'-bromophenylamino) -6,7- dimethoxyquinazoline hydrochloride on adenosine kinase activity as well as its systemic actions on adenosine levels in tissues. To evaluate the hypothesis of adenosine kinase inhibition by 4-anilinoquinazoline compounds, we performed in vitro assays with recombinant adenosine kinase cloned from mouse liver (~42 KDa). The activity and enzymatic kinetic assay of recombinant adenosine kinase involved monitoring adenosine levels in the reaction mixture by HPLC. Adenosine kinase activity was assayed using saturated concentration of ATP and different concentrations of adenosine. Under these conditions, the reaction was adjusted for the Michaellis-Menten model and kinetics parameters (Km and Vmax) were determined. Considering the adenosine contents, the Km and Vmax values were 2.5 ± 0.28 µM and 38.0 ± 1.26 nmols /min/µg of protein, respectively. Different concentrations of the standard inhibitor 5-iodotubercidin were used and the IC50 value obtained was 100 nM. In vitro enzymatic reactions were carried out to confirm DMA and PD153035 inhibitory effects on adenosine kinase activity. The kinetic reaction evaluation in presence of different DMA and PD153035 concentrations confirmed the inhibitory activity of these compounds on adenosine kinase. The IC50 values determined by the non-linear curve fitting program PRISM were 0.8 nM and 1.2 pM for PD153035 and DMA, respectively. The Cheng-Prusoff equation was used to calculate the Ki values from IC50 values, and they were estimated at 160.0 pM and 0.24 pM for PD153035 and DMA, respectively. We confirmed the hypothesis that the 4-anilinoquinazoline compounds have in vitro inhibitory effects on adenosine kinase activity. Then, we performed in vivo experiments to evaluate if DMA increases the adenosine levels in rat tissues such as heart, brain and liver as well as in the Langendorff preparations of isolated rat heart. An HPLC-based method was used to detect and quantify purine nucleoside adenosine and nucleosides derivatives in rat tissue samples. Adenosine levels in the heart and liver of rats treated with DMA increased average of 47% and 30%, respectively, relative to controls. In experiments using isolated hearts, the sample analysis showed an average 64% increase of adenosine concentrations in the rat hearts perfused with DMA relative to control. Conclusions: We conclude that 1) recombinant adenosine quinase presents enzymatic activity in vitro, 2) 4-anilinoquinazoline derivatives PD153035 and DMA inhibit the activity of recombinant adenosine quinase at low concentrations, suggesting a specific effect and 3) the systemic administration of DMA increases adenosine levels in tissues and isolated rat hearts, possibly due to inhibition of adenosine quinase activity. Considering the importance of adenosine effects on biological systems and adenosine kinase inhibition by 4-anilinoquinazoline compounds, a potential therapeutic use of these compounds in diseases related to cellular alterations of the adenosine levels is suggested. / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Esta tese está organizada basicamente em quatro capítulos. O Capítulo I aborda as linhas gerais do presente trabalho, onde o sistema nervoso é caracterizado por um mosaico de redes neurais altamente organizadas, as quais promovem o controle e a manutenção das atividades vitais do corpo humano. Redes neurais geneticamente enfraquecidas podem predispor os indivíduos a desenvolver diversas patologias. Moléculas neuromodulatórias podem atuar fortalecendo estas redes, colaborando com o controle destas doenças. O objetivo geral deste trabalho é estudar a ação de duas moléculas neuromodulatórias endógenas, a adenosina e a co-chaperona BAG-2, sobre redes neurais específicas associadas à hipertensão essencial e à doença de Azheimer, contribuindo, assim, para o melhor entendimento, controle e prevenção destas patologias. O Capítulo II analisa os possíveis efeitos da adenosina sobre o controle neural da pressão arterial associado à patologia da hipertensão essencial, especificamente no núcleo do trato solitário (NTS) de ratos normotensos (WKY) e espontaneamente hipertensos (SHR). O primeiro artigo científico do presente trabalho (Capítulo II) demonstra que os receptores A1 de adenosina, além de estarem distribuídos de forma heterogênea dentro do NTS estão aumentados em ratos hipertensos quando comparados a ratos normotensos. Esta diferença parece preceder o desenvolvimento da hipertensão nestes animais. O segundo artigo científico (Capítulo II) descreve que os receptores A1 de adenosina são capazes de aumentar tanto o número como a afinidade dos receptores alfa2-adrenérgicos dentro de núcleos específicos do NTS. Esta ação modulatória é diferenciada em ratos hipertensos quando comparados a ratos normotensos, sugerindo uma importante alteração associada à hipertensão nestes animais. No terceiro artigo científico (Capítulo II) foi observado que a ação modulatória desencadeada pelos receptores A1 de adenosina sobre os receptores alfa2-adrenérgicos é dependente de fosfolipase C (PLC) e parece, também, ser diferenciada em ratos hipertensos quando comparados a ratos normotensos. Neste contexto, os resultados destes três trabalhos sugerem que a ativação dos receptores A1 de adenosina, em certas condições, poderia estar sensibilizando sistemas hipotensores dentro de subnúcleos específicos do NTS através dos receptores alfa2-adrenérgicos utilizando fosfolipase C como mensageiro intracelular. Este mecanismo poderia estar associado ao desenvolvimento da hipertensão essencial. O Capítulo III analisa os possíveis efeitos da co-chaperona BAG-2 sobre a proteína Tau. Agregados desta proteína são uma das características histopatológicas marcantes encontradas no encéfalo de pacientes com mal de Alzheimer. Foi demonstrado no presente trabalho um elegante mecanismo de degradação da proteína Tau fosforilada, uma isoforma considerada tóxica para o ambiente intracelular, através da co-chaperona BAG-2. Esta molécula tem a capacidade de inibir a atividade da chaperona CHIP, uma ligase de ubiquitina, impossibilitando a ubiquitinação e conseqüente degradação da proteína Tau pela via proteossomo ubiquitina-dependente. Foi observado que a proteína BAG-2 se associa fisicamente à proteína Tau, alterando a via de degradação ubiquitina-dependente para uma via não muito usual, ubiquitina-independente. A supressão da proteína BAG-2 leva a um aumento nos níveis de Tau em neurônios e sua superexpressão, uma diminuição. Foi observado, também, que a supressão da proteína BAG-2 pode levar a formação de agregados filamentosos, sugerindo que o efeito modulatório da proteína BAG-2 poderia estar relacionado com a remoção dos agregados intracelulares encontrados em pacientes com a doença de Alzheimer. Concluindo, BAG-2 poderia ser um importante alvo farmacológico para o tratamento desta patologia. Por fim, o capítulo IV encerra o presente trabalho com considerações finais importantes para o estudo, prevenção e controle de patologias multifatoriais como a hipertensão essencial e a doença de Alzheimer. Este estudo sugere que a adenosina e a co-chaperona BAG-2 poderiam ser alvos farmacológicos interessantes, que em conjunto com outras subtâncias, poderiam colaborar com o fortalecimento de redes neurais geneticamente enfraquecidas as quais predispõem os indivíduos a desenvolver tais patologias / Adenosine has been shown to modulate cardiovascular control at the levels of the nucleus tractus solitarii (NTS). This study shows the distribution and density of adenosine A1 receptor within the nucleus tractus solitarii (NTS) of Wistar Kyoto (WKY) and spontaneously hypertensive (SHR) rats from birth to adulthood (1,15,30 and 90 day-old). [3H]DPCPX was used as a ligant for in vitro autoradiography. The NTS shows heterogeneous distribution of adenosine A1 receptor in dorsomedial/dorsolateral, subpostremal and medial/intermediate subnuclei. Adenosine A1 receptor decrease in dorsomedial/dorsolateral according to rostral-caudal levels of 15, 30 and 90 day-old WKY and SHR rats. On the other hand, those receptors increase in subpostremal according to rostral-caudal levels of 30 and 90 days old WKY, and of 15, 30 and 90 day-old SHR. Furthermore, adenosine A1 receptors are increased in SHR as compared with WKY in dorsomedial/dorsolateral of 30 and 90 day-old rats and in subpostremal of 15, 30 and 90 day-old rats. Surprisingly, even in 15 days old SHR rats when hypertension is not yet apparent, [3H]DPCPX values were increased. Finally, adenosine A1 receptors increase from 1 to 30 day-old rats. Medial/intermediate did not show any changes in adenosine A1 receptors according rostral-caudal levels, age or strain. In summary, our result highlights the importance of A1 adenosine system regarding the neural control of blood pressure and the development of hypertension. Adenosine is known to modulate neuronal activity within the nucleus tractus solitarii (NTS). The modulatory effect of adenosine A1 receptors on alpha2-adrenoceptors was evaluated by quantitative radioautography within NTS subnuclei and by neuronal culture using normotensive (WKY) and hypertensive (SHR) rats. Radioautography was used to perform saturation experiment in order to obtain alpha2-adrenoceptors binding parameters (Bmax, KD) in the presence of 3 concentrations of CPA, an adenosine A1 receptor agonist. Neuronal culture was performed to confirm radioautoraphic results. [3H]RX821002, an alpha2-adrenoceptor antagonist, was used as a ligand for both approaches. Dorsomedial/dorsolateral subnucleus of WKY showed an increase in Bmax values (21%) induced by 10nM of CPA. However, subpostremal subnucleus showed a decrease in KD, values (24%) induced by 10nM of CPA. SHR showed the same pattern of changes within the same nuclei as compared with WKY; however the modulatory effect of CPA was induced by 1nM (increased Bmax, 17%; decreased KD, 26%). Cell culture confirmed these results, since 10-[5M and 10[-7M of CPA promoted an increase in [[3[H]RX821002 binding of WKY (53%) and SHR cells (48%), respectively. DPCPX, an adenosine A1 receptor antagonist, was used to block the modulatory effect promoted by CPA on alpha2-adrenoceptors binding. In conclusion, our study show, for the first time, a specific cross talk between adenosine A1 receptors increasing the binding of alpha2-adrenoceptors within the NTS, which might be important to understand the complex autonomic response induced by adenosine within the NTS. In addition, changes in the interaction between receptors might be relevant to understand the development of hypertension. Adenosine acts at many sites to modulate neuronal activity. The nucleus tractus solitarii (NTS) is known as a major brain site in cardiovascular control. Previous studies from our group have shown the adenosine A1 receptors increase the binding of alpha2-adrenoceptors within the NTS, suggesting the important role of adenosine in cardiovascular control. The aim of the present study is to evaluate the intracellular signaling responsible for such process using brainstem cell culture of Wistar (WR) rats by means of binding assay. 8 different concentration of CPA (10[-4 to 10[-11), an A1 adenosine agonist, were used to modulate [[3[H]RX821002 binding, an alpha2-adrenoceptor antagonist. DPCPX, an A1 adenosine antagonist, was used to block the modulatory effect of CPA on [3VH]RX821002 binding. 10-5M of CPA promote an increase in [[3H]RX821002 binding. The intracellular cascade involved in such modulatory process were evaluated using different intracellular signaling molecules inhibitors and two queletors [SQ22536, an adenylyl cyclase (AC) inhibitor, U-73122, an phospholipase C (PLC) inhibitor, Xestospongin C, an IP3 receptor inhibitor, Ro318220, an protein kinase calcium dependent (PKC), BAPTA, an intracellular calcium quelator, EGTA, an extracelular calcium quelator]. U-73122, Xestospongin C, Ro3326 and BAPTA were capable to inhibit the effect promoted by adenosine A1 receptor on [3H]RX821002 binding suggesting a modulation PLC, PKC, IP3 and Ca2+ dependent pathway. In conclusion, our study show, for the first time, that adenosine A1 receptor modulates the alpha2-adrenoceptors through a non-canonical phospholipase C dependent pathway. This result might be important to understand the adenosine role within the NTS in cardiovascular control. Tau inclusions are a prominent feature of many neurodegenerative diseases including Alzheimer\'s disease. Their presence suggests a failure in Tau degradation. The components of a Tau protein triage system consisting of CHIP/Hsc70 and other chaperones and co-chaperones have begun to emerge. However, the site of triage and the master regulatory elements have not yet been described. We have discovered an elegant mechanism of Tau degradation involving the co-chaperone BAG-2. BAG-2 binds to CHIP inhibiting its activity as an ubiquitine ligase preventing Tau ubiquitination. Tau bound to the microtubule and recruits BAG-2 where it clears Tau through an ubiquitin-independent proteossoma 20S dependent pathway. BAG-2 acts on Tau at precisely the site where it undergoes phosphorylation-dependent binding to the microtubule, more importantly, where it becomes vulnerable to misfolding and aggregation. Under conditions of proteasomal 26S blockade, Tau undergoes caspase mediated degradation. BAG-2 represents a critical point in clearing Tau that is prone to assembling into filaments. The suppression of BAG-2 leads to increased phosphorilated tau in neurons and its over-expression decreases phosphorilated tau.

INTRODUÇÃO: Exercícios físicos são utilizados como terapia nãofarmacológica para o tratamento da hipertensão arterial e o treinamento físico (TF) por natação é reconhecido por produzir remodelamento cardíaco em animais experimentais. Entretanto, a ação vasodilatadora da adenosina (ado) resultante do exercício físico como prevenção e tratamento da hipertensão é pouco explorada. OBJETIVO: Avaliar remodelamento cardíaco e papel da adenosina na distribuição do fluxo sanguíneo para o miocárdio após treinamento físico em SHR. MÉTODO: 28 SHR machos babies e adultos foram submetidos ao TF aeróbio de natação, durante 10 semanas (5x/sem - 1h/dia). Foram utilizados protocolos de microesferas coloridas para avaliar fluxo sanguíneo, técnicas de morfologia para avaliar hipertrofia cardíaca e análises bioquímicas para verificar atividade de enzimas envolvidas na formação de adenosina. RESULTADOS: TF por natação atenuou a evolução da HA em SHR babies (S: 145±2; T: 140±2 mmHg), promoveu bradicardia de repouso em SHR adultos (S: 340±4; T: 321±6 bpm) e desenvolveu HC nos dois grupos (TB: 12%; TA: 10%). Na condição basal, o TF aumentou o FS coronário em SHR babies (S: 4745±2145; T: 6970±2374 mi/coração) e maior resposta vasodilatadora à infusão de adenosina foi observada (S: 18946±6685; T: 25045±7031 mi/coração). Nesse grupo o TF promoveu maior atividade da enzima 5-nucleotidase, levando à maior formação de adenosina (S: 0.45±0.09; T: 1.01±0.05). CONCLUSÃO: O TF de natação, além de desenvolver HC e apresentar maior hidrólise de AMP, promoveu aumento no FS coronário, sendo mostrado que desempenha um importante papel na regulação da hipertensão / ABSTRACT: Exercise training (ET) has been used as non-pharmacological therapy for hypertension treatment and the swimming physical training is recognized for yield cardiac remodeling in experiments. However, little is known on the effects of adenosine (Ado) resulting from ET as hypertension prevention and treatment. OBJECTIVE: To evaluate cardiac remodeling and the role of adenosine in cardiac blood flow distribution (BF) to the myocardium after aerobic ET on SHR. METHODS: 28 male SHR, babies and adults, were submitted to swimming training protocol during 10 weeks (5 times a week 1 h a day). Colored micro spheres protocols were used to evaluate blood flow, morphological techniques were used to evaluate cardiac hypertrophy and biochemical analysis were performed to verify enzyme activity in the adenosine formation. RESULTS: ET attenuated the evolution of hypertension in babies SHR group (S: 145±2; T: 140±2 mmHg), HR was lower in adults SHR (S: 340±4; T: 321±6 bpm) and CH increased in both groups (TB: 12%; TA: 10%). At basal condition, BF was increased in trained babies (S: 4745±2145; T: 6970±2374 mi/heart) and higher vasodilatation response were observed due to adenosine infusion (S: 18946±6685; T: 25045±7031 mi/heart). In this group, the ET promoted a higher 5- nucleotidase enzyme activity leading to a higher adenosine formation (S: 0.45±0.09; T: 1.01±0.05). CONCLUSION: The swimming training developed CH as well as increased adenosine formation, leading to higher coronary blood flow, being demonstrated its important role in hypertension regulation

Orientador: Marta Cristina Teixeira Duarte / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-26T04:57:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Matsumura_LauraYumeRodrigues_M.pdf: 1312693 bytes, checksum: 7afc440e71f8e63ffdb4e0f57d78115f (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As leveduras causam deterioração de uma grande variedade de produtos alimentícios e nas indústrias de bebidas, além de serem resistentes a muito conservantes químicos. Os óleos essenciais e extratos de plantas têm surgido como alternativas seguras para substituir conservantes sintéticos. Contudo, os mecanismos de ação de óleos essenciais sobre micro-organismos são complexos e não estão completamente elucidados. Neste trabalho, foi investigada a ação de 14 óleos essenciais e 2 extratos diclorometânicos provenientes de plantas medicinais e aromáticas pertencentes à CPMA (Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas) do CPQBA/UNICAMP sobre leveduras do gênero Candida e sobre Pichia guilliermondii de importância em alimentos. Foi determinada a concentração mínima inibitória (MIC) e os efeitos sobre a lise da membrana celular, sobre os carboidratos de reserva trealose e glicogênio, sobre a depleção de ATP e sobre a biossíntese de ergosterol. Os resultados demonstraram que o óleo essencial de Cinnamomum burmanni foi o que apresentou melhor potencial para controle das leveduras, sendo o cinamaldeído e o acetato de cinamila os compostos majoritários presentes neste óleo. A investigação dos possíveis mecanismos de ação do óleo essencial de C. burmanni sobre Candida albicans ATCC 10231 demonstrou que este afetou a viabilidade da levedura a partir da concentração de 0,5 mg/mL (5MIC), e ocasionou a lise da membrana celular, havendo liberação de proteínas e lipídios para o meio extracelular, além de depleção de ATP. No caso dos carboidratos de reserva, os resultados demonstraram que o óleo essencial de C. burmanni ocasionou acúmulo de trealose, possivelmente pelo estresse ocasionado às células. Nenhum efeito foi observado sobre a reserva de glicogênio e sobre a inibição da síntese de ergosterol. Os resultados indicam a ação inibitória do óleo essencial de C. burmanni e mostram que este apresenta potencial para controle de leveduras de importância em alimentos / Abstract: Yeasts cause deterioration of a wide variety of food and drink industries, besides being very resistant to chemical preservatives. Essential oils and plant extracts have emerged as safe alternatives to synthetic preservatives. However, the mechanisms of action of essential oils on microorganisms are complex and not fully elucidated. In this work, was investigated the action of 14 essential oils and 2 dichloromethane extracts from medicinal and aromatic plants belonging to the Collection of Medicinal and Aromatic Plants - CPMA at CPQBA/ UNICAMP on Candida species and Pichia guilliermondii of importance in foods. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined and the effects of the essential oil on the cell membrane lysis, the carbohydrate reserves trehalose and glycogen, depletion of ATP and ergosterol biosynthesis were evaluated. The results showed that the essential oil from Cinnamomum burmanni presented the best potential to control the Candida spp. being the cinnamaldehyde and cinnamyl acetate the major compounds present in this oil. The investigation of the possible mechanisms of action of the C. burmanni essential oil on Candida albicans ATCC 10231 showed that the oil affected the viability of the yeast from 0.5 mg/mL (5MIC), and caused lysis of the cell membrane, with release of proteins and lipids into the extracellular environment, as well as ATP depletion. In the case of carbohydrate reserves, the results showed that the essential oil of C. burmanni caused accumulation of trehalose, possibly due to the cellular stress. No effect was observed on the synthesis of glycogen and ergosterol. The results indicate the inhibitory action of the essential oil from C. burmanni and show its potential to control yeasts of importance in foods / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestra em Ciência de Alimentos

Orientador: Alberto Vazquez Saa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matemática, Estatística e Computação Científica / Made available in DSpace on 2018-08-21T14:37:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Siqueira_KellenManoela_M.pdf: 18530292 bytes, checksum: b14fcd17f860e0698970af4213e1e126 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O ATP (adenosina tri-fosfato) é uma molécula chave para a fisiologia, atuando como fonte de energia para diversos processos celulares. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: ATP (adenosine triphosphate acts as an "energy currency" providing energy to several physiological processes. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Matematica Aplicada / Mestre em Matemática Aplicada

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sporotrichosis is a subcutaneous fungal infection of evolution subacute or chronic, inflammatory lesions characterized by pyogranulomatous aspect, caused by the dimorphic fungus Sporothrix schenckii. Adenosine deaminase (ADA) is a key enzyme in the purine metabolism, promoting the deamination of adenosine, an important anti-inflammatory molecule. The increase in ADA activity has been demonstrated in several inflammatory conditions, however, no data in the literature associated with this fungal infection. The objective of this study was to evaluate the activity of serum ADA (S-ADA) and lymphocytes (L-ADA) of rats infected with S. schenckii. We used seventy-eight rats divided into two groups. In the first experiment, rats were infected subcutaneously and in the second experiment, infected intraperitoneally. Blood samples for hematologic evaluation and activities of S-ADA and ADA-L were performed on days 15, 30 and 40 post-infection (PI) to assess disease progression. In experiment II, was observed in an acute decrease in activity of S-ADA and L-ADA (p <0.05), suggesting a compensatory mechanism in the body's attempt to protect the host from excessive tissue damage. Chronicity of the disease the rats in the experiment I and II at 30 days PI, showed an increased activity of L-ADA (p <0.05), promoting an inflammatory response in an attempt to combat the spread of the agent. Thus, it is suggested that infection with S. schenckii alters the activities of S-ADA experimentally infected rats, demonstrating the involvement of this enzyme in the pathogenesis of sporotrichosis. / A esporotricose é uma infecção micótica subcutânea de evolução subaguda ou crônica, caracterizada por lesões inflamatórias de aspecto piogranulomatoso, causada pelo fungo dimórfico Sporothrix schenckii. A adenosina desaminase (ADA) é uma enzima chave no metabolismo das purinas, promovendo a desaminação da adenosina uma importante molécula anti-inflamatória. O aumento na atividade da ADA tem sido demonstrado em várias condições inflamatórias, porém, não existem dados na literatura associados com esta infecção micótica. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade da ADA no soro (S-ADA) e nos linfócitos (L-ADA) de ratos infectados por S. schenckii. Foram utilizados setenta e oito ratos distribuídos em dois grupos. No experimento I, os ratos foram infectados por via subcutânea e no experimento II, infectados por via intraperitoneal. A coleta de sangue para a avaliação hematológica e atividades da S-ADA e L-ADA foram realizadas nos dias 15, 30 e 40 pós-infecção (PI), para avaliar a evolução da doença. No experimento II, foi observada na fase aguda uma diminuição na atividade da S-ADA e L-ADA (p<0.05), sugerindo um mecanismo compensatório do organismo na tentativa de proteger o hospedeiro da lesão tecidual excessiva. Com a cronicidade da enfermidade os ratos do experimento I e II aos 30 dias PI, apresentaram um aumento na atividade da L-ADA (p<0.05), promovendo uma resposta inflamatória na tentativa de combater a proliferação do agente. Assim, sugere-se que a infecção pelo S. schenckii altera as atividades da S-ADA e L-ADA de ratos infectados experimentalmente, demonstrando o envolvimento desta enzima na patogênese da esporotricose.