Submitted by Claudia Rocha (claudia.rocha@udesc.br) on 2018-02-09T15:57:35Z No. of bitstreams: 1 PGCA16MA198.pdf: 1520008 bytes, checksum: fd1d41fa0d4c2a913a8dc6becde2a619 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-09T15:57:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA16MA198.pdf: 1520008 bytes, checksum: fd1d41fa0d4c2a913a8dc6becde2a619 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Capes / Neotropical deer are poorly studied species, particularly those belonging to the genus Mazama because of the access difficulty to these animals. The conservation status of Mazama nana is not well known and their main threats are poaching, habitat destruction and exposure to domestic animal diseases. Among the important diseases in cervids, haemorrhagic syndromes are very common and lead to a high rate of morbidity and mortality. Diseases leading to signs of widespread bleeding are known as haemorrhagic diseases and in deer, there are three causative viral agents currently recognized: an adenovirus (Adenoviral haemorrhagic disease virus) and two orbiviruses (Bluetongue disease virus, BTV, and Epizootic haemorrhagic disease virus, EHDV). The Bela Vista Biological Refuge of Itaipu Binacional has been successfully reproducing the species Mazama nana, popularly known as the brazilian dwarf brocket deer, since 1990. While the death of animals with compatible signs with bleeding disorders has been occurring ever since, the etiological agent has not yet been identified. Thus, this project aimed to identify the viral agent that has been causing haemorrhagic disease in the herd of Brazilian dwarf brocket deer from the Bela Vista Biological Refuge. Therefore, we evaluated autopsy samples, including liver, heart, lymph nodes and esophagus as well blood from 32 live animals in the search for viral genetic material, using namely the RT-PCR test for BTV, semi-nested RT-PCR for EHDV and the conventional PCR for adenovirus. In addition, we applied the Agar Gel Immunodiffusion technique (AGID) for detecting antibodies against BTV. Four samples, belonging from animals that died with haemorrhagic disease signs, were positive for RT-PCR test against BTV, and from this material, it was possible to isolate and serotype the virus. At the end of the study, we identified three serotypes thus far unknown in Brazil, the 14 BTV3, BTV14 and BTV18 plus a serotype not yet identified. The prevalence of seropositive animals to BTV was 3.12%. All semi-nested RT-PCR tests for EHDV and conventional PCR for AHDV had negative results. Therefore, we concluded that the BTV is the causative agent of the haemorrhagic disease of the brazilian dwarf brocket deers from the Bela Vista Biological Refuge and at least three serotypes are involved in the epidemiology of the disease / Os cervídeos neotropicais são pouco estudados, particularmente as espécies pertencentes ao gênero Mazama, em razão da dificuldade de acesso aos animais silvestres e suas amostras. O status de conservação da espécie Mazama nana não está bem definido. As principais ameaças a esses animais são a caça ilegal, a destruição de seu habitat e a proximidade a animais domésticos, que podem introduzir doenças comuns em populações de ruminantes silvestres. Dentre as doenças importantes em cervídeos, as síndromes hemorrágicas são muito frequentes e levam a um alto índice de morbidade e mortalidade. As doenças que provocam sinais e quadro de hemorragia generalizada em cervídeos são conhecidas pelo nome genérico de doenças hemorrágicas, e são três os agentes virais reconhecidos atualmente: um adenovírus (vírus da doença hemorrágica por adenovírus) e dois orbivirus, (o vírus da língua azul BTV e o vírus da doença epizoótica hemorrágica EHDV). O Refúgio Biológico Bela Vista da Itaipu Binacional vem reproduzindo com sucesso a espécie Mazama nana desde 1990, conhecida popularmente como veado-bororó-do-sul, porém, fazendo uma revisão histórica, percebe-se que desde que a criação foi iniciada, ocorreram mortes de cervídeos com sinais compatíveis com as doenças hemorrágicas. Entretanto, o agente etiológico nunca foi identificado. O presente projeto teve por objetivo identificar o agente viral que tem causado a doença hemorrágica no plantel de veados-bororó-do-sul do Refúgio Biológico Bela Vista, situado no município de Foz do Iguaçu, Paraná. Foram avaliadas amostras obtidas por meio de 12 necropsia, incluindo fragmentos de fígado, coração, linfonodos e esôfago, além de amostras de sangue de 32 animais vivos para a pesquisa de material genético viral pelo teste de RT-PCR em tempo real para o vírus da língua azul e semi-nested RT-PCR para o vírus da doença epizoótica hemorrágica, além de PCR convencional para o adenovírus de cervídeos. A técnica de IDGA foi utilizada para a pesquisa de anticorpos contra o vírus da língua azul. Quatro amostras, provenientes de animais que vieram a óbito com sinais de doença hemorrágica, foram positivas para o teste de RTq-PCR contra língua azul (BTV), e a partir desse material foi possível isolar e sorotipificar o vírus. Ao final do estudo, foram identificados três sorotipos até então desconhecidos em território brasileiro, o BTV3, BTV14 e BTV18. A prevalência de animais soropositivos para BTV foi de 3,12%. Todos os testes de semi-nested RT-PCR para o vírus da doença epizoótica hemorrágica (EHDV) e de PCR convencional para adenovírus tiveram resultados negativos. Com este estudo foi possível determinar que o BTV é o agente causador da doença hemorrágica no plantel de veados-bororós-do-sul do Refúgio Biológico Bela Vista e que pelo menos três sorotipos estão envolvidos na epidemiologia da doença

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:01:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ana_teixeira_ioc_dout_2014.pdf: 2210367 bytes, checksum: 5beb9168ee6e8a292a1d6f9e977c6f99 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os fômites desempenham um papel importante na disseminação de diferentes patógenos, em ambientes hospitalares. Atualmente, o Programa Nacional de Controle de Infecção Hospitalar (PCIH) dispõe sobre a obrigatoriedade dos hospitais manterem uma Comissão de Controle de Infecções Hospitalares (CCIH) para execução do controle das infecções adquiridas durante as hospitalizações. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar o papel de vírus gastroentéricos, não incluído nestas normas, como potenciais marcadores biológicos de contaminação hospitalar. Com este propósito foram realizados estudos para demonstrar a disseminação e a infecciosidade de rotavírus da espécie A (RVA) e adenovírus humanos (HAdV) em superfícies e fômites de unidades de tratamentos intensivos (UTI) adulto e neonatal e enfermaria pediátrica da rede privada e pública. O primeiro estudo realizado em uma UTI de adultos detectou HAdV em 44,7% (63/141) dos fômites investigados com carga viral variando entre 2,48 x 101 e 2,1 x 103 cópias genômicas por mililitro (gc/mL), incluindo uma contaminação mista com HAdV e RVA. Pode-se observar uma diminuição significativa no percentual de detecção de HAdV (p <0,05) a partir de intervenções realizadas no processo de limpeza e desinfecção da UTI de adultos da rede privada. Embora a detecção de HAdV tenha sido significativamente maior (p <0,05) que RVA nos primeiros dois meses do estudo, os RVA apresentaram uma maior carga viral Tanto os HAdV quanto os RVA coletados dos fômites hospitalares puderam ser isolados em cultura celular, indicando que os vírus permanecem infecciosos nessas superfícies, apesar dos processos de desinfecção utilizados. Os dados referentes às unidades hospitalares infantis da rede pública revelaram uma maior taxa de detecção de HAdV [26,6% (128/480)] quando comparada com RVA [3,4% (16/480)] (p <0,001). Na unidade de terapia intensiva neonatal, 4,5% (7/156) das amostras foram positivas. Na enfermaria pediátrica, 42,3% foram positivas (137/324), sendo 4,3% (14/324) RVA positivas e 38% (123/324) HAdV positivas. Realizou-se uma avaliação da metodologia utilizada, determinando a recuperação de vírus a partir de superfícies porosas (fórmica porosa e emborrachado) e não porosas (fórmica lisa). A metodologia de amostragem por swab utilizada para coleta das amostras a partir dos fômites foi avaliada e a análise por PCR quantitativa (qPCR) revelou uma eficiência de recuperação variável, entre 0,6 e 77% de acordo com os vírus e as superfícies testadas. PP7 e MNV-1 foram recuperados em 100% das superfícies (P e NP) contaminadas artificialmente e indicou o MNV-1 como potencial controle interno para o monitoramento de todas as etapas da metodologia utilizada Concluindo, os resultados apontam os HAdV como potenciais marcadores de contaminação hospitalar, uma vez que: i) as superfícies analisadas apresentaram uma maior contaminação por estes vírus; ii) foi comprovada a infecciosidade destas amostras; iii) esses vírus podem ser isolados mais facilmente em culturas celulares. O monitoramento de fômites hospitalares mostra-se fundamental para demonstrar a dispersão dos vírus no ambiente hospitalar, podendo contribuir de forma mais eficaz na avaliação da qualidade microbiológica dos ambientes hospitalares, na elucidação de surtos hospitalares e, principalmente, na tomada de medidas eficazes para a prevenção e tratamento de doentes / Hospital fomites can play an important role in the spread of pathogens such as gastroenteric virus. Currently, the National Program of Hospital Infection Control requires hospitals to maintain a Committee of Nosocomial Infection Control for preventing infections acquired during hospitalization. In this context, the aim of this study was to evaluate the role of gastroenteric viruses as potential biomarkers of hospital contamination. For this purpose studies were performed to demonstrate the spread and infectivity of rotavirus species A (RVA) and human adenoviruses (HAdV) on surfaces and fomites of two hospitals: one private and one public, including adult, neonatal-Intensive care units (ICU) and pediatric ward. The first study conducted in an adult ICU, detected HAdV in 44.7% (63/141) of investigated fomites, with the viral load ranging from 2.48 x 101 to 2.1 x 103 genomic copies per milliliter (gc/mL), including a mixed contamination with HAdV and RVA. Furthermore, it can be observed a significant decrease in the percentage of detection of HAdV (p <0.05) from the cleaning and disinfection interventions of the adult ICU, similar to that previously observed for RVA. Although the detection of HAdV was significantly higher (p <0.05) than the RVA at the first two months of the study, the RVA showed a higher viral load. Both the RVA as HAdV collected from hospital fomites could be isolated in cell culture, indicating that those viruses remain infectious at this surfaces despite the disinfection processes used. Data regarding pediatric's public hospitals revealed a higher detection rate of HAdV [26.6% (128/480)] compared to RVA [3.4% (16/480)] (p <0.001). Only 4.5% (7/156) of the samples were positive in the neonatal intensive care unit. In the pediatric ward, 42.3% were positive (137/324), 4.3% (14/324) RVA positive samples and 38% (123/324) HAdV positive samples. Additionally, it was performed an evaluation of the methodology used in this study, determining the recovery of virus from porous surfaces (porous formica and rubber) and nonporous (nonporous formica) using murine norovirus 1 (MNV-1) and bacteriophage PP7 as internal process controls. The swab sampling methodology used for collecting samples from fomites was evaluated, quantitative PCR (qPCR) showed variable recovery efficiency, between 0.6 and 77% according to viruses and surfaces tested. PP7 and MNV-1 were recovered in 100% of the artificially contaminated surfaces (P and NP), and the MNV-1 was indicated as a potential internal control to monitor all stages of the methodology. In conclusion, the results indicate the HAdV as potential markers of nosocomial infection, since: i) the studied surfaces showed greater HAdV contamination; ii) the infectivity of these samples was proven; iii) these viruses can be more easily isolated in cell cultures. Therefore, the monitoring of hospital fomites proven to be crucial and helps to enhance the dispersion of the virus in the hospital environment, and could contribute more effectively in the evaluation of the microbiological quality of the hospital environment, at the elucidation of hospital outbreaks, and especially in the measured of prevention and treatment of patients.

O presente estudo foi realizado com o objetivo de identificar genomas de vírus em fezes de lobos marinhos sul-americanos (Arctocephalus australis) e lobos marinhos subantárticos (Arctocephalus tropicalis), duas espécies de pinípedes encontradas no litoral do Rio Grande do Sul. Embora já existam estudos sobre esse tema em outras espécies de pinípedes, nas espécies aqui trabalhadas o tema permanece inexplorado. Amostras de fezes foram obtidas de vinte e um lobos marinhos sul-americanos e dois lobos marinhos subantárticos encontrados no litoral rio-grandense com indícios de morte recente, durante os meses de Junho e Julho de 2012. Através de técnicas de PCR e sequenciamento buscou-se identificar genomas de circovírus, adenovírus, morbilivírus, calicivírus e coronavírus. A amplificação de um fragmento do gene rep permitiu a identificação de prováveis circovírus em amostras de seis lobos marinhos sul-americanos. Análises filogenéticas revelaram que três dos seis segmentos são sugestivos de prováveis membros do gênero Cyclovirus. Os genes amplificados de outras duas amostras provavelmente correspondem a membros do gênero Circovirus. Uma das amostras deu origem a um segmento gênico que não apresenta similaridade com nenhum gênero já proposto da família Circoviridae. Além disso, foi possível detectar também fragmentos de genomas de adenovírus em duas amostras; estes apresentam alto grau de similaridade de nucleotídeos com amostras de adenovírus humano tipo C. Nenhum fragmento genômico indicativo da presença de morbilivírus, calicivírus ou coronavírus foi encontrado. Os resultados aqui obtidos sugerem a presença de circovírus, ciclovírus e adenovírus em populações de lobos marinhos encontrados na costa do Rio Grande do Sul. Estes achados reforçam a necessidade da ampliação do conhecimento a respeito da ocorrência de infecções virais nestas espécies. / This study was conducted with the objective of identifying genomes of viruses in feces of south american fur seals (Arctocephalus australis) and subantarctic fur seals (Arctocephalus tropicalis), two species of pinnipeds found on the coast of Rio Grande do Sul. Although there are studies about this topic in other species of pinnipeds, it remains unexplored in these two species. Stool samples were obtained from twenty-one south american fur seals and two subantarctic fur seals found in Rio Grande do Sul coastline with evidences of recent death, during the months of June and July 2012. PCR and sequencing techniques were utilized to identify circovirus, adenovirus, morbillivirus, calicivirus and coronavirus genomes. The amplification of a rep gene fragment allowed the identification of supposed circoviruses in samples of six south american fur seals. Phylogenetic analysis revealed that three of the six segments are suggestive of probable members of the genus Cyclovirus. The amplified genes from two other samples probably correspond to members of the genus Circovirus. One of the samples gave rise to a gene segment that has no similarity with any genera already proposed of the Circoviridae family. Furthermore, it was also possible to detect fragments of adenovirus genomes in two samples: these have a high degree of nucleotide similarity with a human adenovirus type C genomic fragment. No indication of the presence of morbillivirus, calicivirus and coronavirus genomes was found. The work reported here provide evidence for the occurrence of circoviruses, cicloviruses and adenoviruses in fur seal populations found in Rio Grande do Sul. These findings reinforce the need to expand the knowledge about the occurrence of viral infections in these species.

O presente estudo foi realizado com o objetivo de identificar genomas de vírus em fezes de lobos marinhos sul-americanos (Arctocephalus australis) e lobos marinhos subantárticos (Arctocephalus tropicalis), duas espécies de pinípedes encontradas no litoral do Rio Grande do Sul. Embora já existam estudos sobre esse tema em outras espécies de pinípedes, nas espécies aqui trabalhadas o tema permanece inexplorado. Amostras de fezes foram obtidas de vinte e um lobos marinhos sul-americanos e dois lobos marinhos subantárticos encontrados no litoral rio-grandense com indícios de morte recente, durante os meses de Junho e Julho de 2012. Através de técnicas de PCR e sequenciamento buscou-se identificar genomas de circovírus, adenovírus, morbilivírus, calicivírus e coronavírus. A amplificação de um fragmento do gene rep permitiu a identificação de prováveis circovírus em amostras de seis lobos marinhos sul-americanos. Análises filogenéticas revelaram que três dos seis segmentos são sugestivos de prováveis membros do gênero Cyclovirus. Os genes amplificados de outras duas amostras provavelmente correspondem a membros do gênero Circovirus. Uma das amostras deu origem a um segmento gênico que não apresenta similaridade com nenhum gênero já proposto da família Circoviridae. Além disso, foi possível detectar também fragmentos de genomas de adenovírus em duas amostras; estes apresentam alto grau de similaridade de nucleotídeos com amostras de adenovírus humano tipo C. Nenhum fragmento genômico indicativo da presença de morbilivírus, calicivírus ou coronavírus foi encontrado. Os resultados aqui obtidos sugerem a presença de circovírus, ciclovírus e adenovírus em populações de lobos marinhos encontrados na costa do Rio Grande do Sul. Estes achados reforçam a necessidade da ampliação do conhecimento a respeito da ocorrência de infecções virais nestas espécies. / This study was conducted with the objective of identifying genomes of viruses in feces of south american fur seals (Arctocephalus australis) and subantarctic fur seals (Arctocephalus tropicalis), two species of pinnipeds found on the coast of Rio Grande do Sul. Although there are studies about this topic in other species of pinnipeds, it remains unexplored in these two species. Stool samples were obtained from twenty-one south american fur seals and two subantarctic fur seals found in Rio Grande do Sul coastline with evidences of recent death, during the months of June and July 2012. PCR and sequencing techniques were utilized to identify circovirus, adenovirus, morbillivirus, calicivirus and coronavirus genomes. The amplification of a rep gene fragment allowed the identification of supposed circoviruses in samples of six south american fur seals. Phylogenetic analysis revealed that three of the six segments are suggestive of probable members of the genus Cyclovirus. The amplified genes from two other samples probably correspond to members of the genus Circovirus. One of the samples gave rise to a gene segment that has no similarity with any genera already proposed of the Circoviridae family. Furthermore, it was also possible to detect fragments of adenovirus genomes in two samples: these have a high degree of nucleotide similarity with a human adenovirus type C genomic fragment. No indication of the presence of morbillivirus, calicivirus and coronavirus genomes was found. The work reported here provide evidence for the occurrence of circoviruses, cicloviruses and adenoviruses in fur seal populations found in Rio Grande do Sul. These findings reinforce the need to expand the knowledge about the occurrence of viral infections in these species.

O presente estudo foi realizado com o objetivo de identificar genomas de vírus em fezes de lobos marinhos sul-americanos (Arctocephalus australis) e lobos marinhos subantárticos (Arctocephalus tropicalis), duas espécies de pinípedes encontradas no litoral do Rio Grande do Sul. Embora já existam estudos sobre esse tema em outras espécies de pinípedes, nas espécies aqui trabalhadas o tema permanece inexplorado. Amostras de fezes foram obtidas de vinte e um lobos marinhos sul-americanos e dois lobos marinhos subantárticos encontrados no litoral rio-grandense com indícios de morte recente, durante os meses de Junho e Julho de 2012. Através de técnicas de PCR e sequenciamento buscou-se identificar genomas de circovírus, adenovírus, morbilivírus, calicivírus e coronavírus. A amplificação de um fragmento do gene rep permitiu a identificação de prováveis circovírus em amostras de seis lobos marinhos sul-americanos. Análises filogenéticas revelaram que três dos seis segmentos são sugestivos de prováveis membros do gênero Cyclovirus. Os genes amplificados de outras duas amostras provavelmente correspondem a membros do gênero Circovirus. Uma das amostras deu origem a um segmento gênico que não apresenta similaridade com nenhum gênero já proposto da família Circoviridae. Além disso, foi possível detectar também fragmentos de genomas de adenovírus em duas amostras; estes apresentam alto grau de similaridade de nucleotídeos com amostras de adenovírus humano tipo C. Nenhum fragmento genômico indicativo da presença de morbilivírus, calicivírus ou coronavírus foi encontrado. Os resultados aqui obtidos sugerem a presença de circovírus, ciclovírus e adenovírus em populações de lobos marinhos encontrados na costa do Rio Grande do Sul. Estes achados reforçam a necessidade da ampliação do conhecimento a respeito da ocorrência de infecções virais nestas espécies. / This study was conducted with the objective of identifying genomes of viruses in feces of south american fur seals (Arctocephalus australis) and subantarctic fur seals (Arctocephalus tropicalis), two species of pinnipeds found on the coast of Rio Grande do Sul. Although there are studies about this topic in other species of pinnipeds, it remains unexplored in these two species. Stool samples were obtained from twenty-one south american fur seals and two subantarctic fur seals found in Rio Grande do Sul coastline with evidences of recent death, during the months of June and July 2012. PCR and sequencing techniques were utilized to identify circovirus, adenovirus, morbillivirus, calicivirus and coronavirus genomes. The amplification of a rep gene fragment allowed the identification of supposed circoviruses in samples of six south american fur seals. Phylogenetic analysis revealed that three of the six segments are suggestive of probable members of the genus Cyclovirus. The amplified genes from two other samples probably correspond to members of the genus Circovirus. One of the samples gave rise to a gene segment that has no similarity with any genera already proposed of the Circoviridae family. Furthermore, it was also possible to detect fragments of adenovirus genomes in two samples: these have a high degree of nucleotide similarity with a human adenovirus type C genomic fragment. No indication of the presence of morbillivirus, calicivirus and coronavirus genomes was found. The work reported here provide evidence for the occurrence of circoviruses, cicloviruses and adenoviruses in fur seal populations found in Rio Grande do Sul. These findings reinforce the need to expand the knowledge about the occurrence of viral infections in these species.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2017-07-03T12:16:28Z No. of bitstreams: 2 Tese - Ana Carla Peixoto Guissoni - 2015.pdf: 3062686 bytes, checksum: d470d2e61cd6d74d52b862bd1e76f0c9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-07-10T11:37:21Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Ana Carla Peixoto Guissoni - 2015.pdf: 3062686 bytes, checksum: d470d2e61cd6d74d52b862bd1e76f0c9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-10T11:37:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Ana Carla Peixoto Guissoni - 2015.pdf: 3062686 bytes, checksum: d470d2e61cd6d74d52b862bd1e76f0c9 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2015-08-06 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Human adenovirus (HAdVs) are causative agents of different clinical syndromes such as gastroenteritis, respiratory diseases, eye diseases and cystitis. Adenovirus infection can modify the cellular homeostasis through the interaction with the host cell by inducing proteins of several metabolic pathways. The resulting knowledge of this virus-cell interaction may aid the elucidation of the pathogenic mechanisms caused by adenovirus and the host response against viral infection. To study this interaction, a methodology that has been widely used is proteomics, a tool used in this study, which aimed to identify induced proteins due to viral infection. In this context, we used cells A-549 infected with human adenovirus of type F, serotype 40 (HAdV-40). Infected cells and non-infected cells were used for the osmotic lysis, which were quantified by the Bradford method and then digested with trypsin. Peptides were separated on the LC system in two dimensions. The ionization of the peptides was performed by nano-eletronspray source and through analysis of ToF-MSE system aiming the protein identification. A sum of 336 proteins were identified, 206 of them induced and 130 suppressed by the infection with HAdV-40. The main pathways affected by viral infection were: energy, cellular organization, stress response and apoptosis. It was observed alteration of cell metabolism with increase of the glycolytic pathway, β-oxidation and respiratory chain. Also, the results suggest cytoskeleton reorganization and apoptosis induction. The data can to contribute knowledge about adenovirus pathogenesis considering the proteins related to distinct metabolic pathways induced by viral infection. / Adenovírus humano (HAdVs) são agentes causadores de diversas síndromes clínicas como gastroenterite, doenças respiratórias, oculares e cistite. A infecção por adenovírus pode levar a alterações na homeostase celular a partir da interação com a célula hospedeira pela indução de proteínas de diversas vias metabólicas. O conhecimento resultante desta interação vírus-célula pode auxiliar na elucidação da patogenia destes vírus e na resposta do hospedeiro contra a infecção viral. Para o estudo desta interação, uma metodologia que tem sido bastante utilizada é a proteômica, ferramenta esta usada no presente estudo, que tem como finalidade a identificação de proteínas induzidas a partir da infecção viral. Foram utilizadas células A-549 infectadas por adenovírus humano da espécie F, sorotipo 40 (HAdV-40). Para o procedimento, a partir de células infectadas e controles, procedeu-se à extração de proteínas por lise osmótica, as quais foram quantificadas pelo método de Bradford e a seguir digeridas com tripsina. Os peptídeos foram separados em sistema de cromatografia líquida em duas dimensões. A ionização dos peptídeos foi realizada em fonte nano-eletronspray e a análise destes através do sistema ToF-MSE, possibilitanto a identificação das proteínas. Foram identificadas 336 proteínas, sendo 206 induzidas pela infecção por HAdV-40 e 130 reprimidas. As principais vias afetadas pela infecção viral foram: energia, organização celular, resposta ao estresse e apoptose. Observou-se alteração do metabolismo da célula com o aumento da via glicolítica, β-oxidação e da cadeia respiratória. Além disso, os resultados sugerem reorganização do citoesqueleto e indução de apoptose. Esses dados podem contribuir para o conhecimento da patogenia dos adenovírus considerando as proteínas relacionadas com vias metabólicas distintas induzidas pela infecção viral.

Para verificar a permissividade de células de origem hematopoiéticas à infecção por HAdV-41, foram infectados PBMC e IEL de voluntários. Os ensaios foram comparados com células HEK-293 infectadas. Foram analisadas as expressões dos genes virais E1A, E1B (55K), E3 (14K), VARNA, hexon e fibra curta (FC) e do gene celular GAPDH. O mRNA foi detectado por RT-PCR em tempo real e a produção de proteínas foi visualizada por IFI. Em HEK-293, a transcrição dos genes E1A, E1B e E3 iniciou-se às 11h p.i, hexon,às 13h pi.,VARNA e FC às 14h p.i. Em PBMC a transcrição de E1A, E1B e VARNA iniciou-se 17h p.i e a expressão dos genes hexon e fibra curta foi detectada 18h p.i e 20 h p.i. respectivamente. O nível de expressão dos genes virais em HEK-293 foi quase 200 vezes maior em relação à PBMC. Os IELs também mostraram-se permissivos à infecção pelo HAdV-41 como mostrado pela expressão dos genes virais. Essa é a primeira evidência de que este vírus possa infectar tais células. Os resultados obtidos ajudam a elucidar os mecanismos de interação do vírus com a célula-hospedeira. / In order to verify the permissiveness of hematopoietic cells to HAdV-41 infection, PBMC and IEL from volunteers were infected. The infection assays were compared with infected HEK -293 cells. We analysed the E1A, E1B (55K), E3 (14K), VARNA, hexon and short fiber (SF) viral gene expression and GAPDH cellular gene expression. The mRNA were detected by real time PCR and the viral protein synthesis were detected by IIF. In HEK-293 cells E1A, E1B and E3 gene expression were detected 11h p.i Hexon gene expression was detected at 13h p.i, while VARNA and SF were detected 14h p.i In PBMC, E1A, E1B and VARNA gene expression were detected 17h p.i and the hexon and SF were detected 18h p.i and 20h p.i, respectively. The viral gene expression level in infected HEK-293 cells was 200 fold higher than infected PBMC. The IEL also were permissive to HAdV-41 infection showed by viral gene expressions. This is the first evidence that HAdV-41 is able to infect these cells types. These results helps to understand the virus-cell interaction mechanisms.

Os vírus entéricos humanos são encontrados no esgoto e em subprodutos dos processos de tratamento. Recentemente vem sendo recomendados como indicadores de qualidade microbiológica em normas da legislação brasileira e também nas de outros países, mas ainda com parâmetros a definir. O objetivo do estudo é a avaliação e a comparação entre métodos clássicos e moleculares aplicados à detecção de vírus entéricos em amostras de água de reúso e de lodo, visando subsidiar a legislação brasileira. Ensaios de semeadura experimental de protótipos de rotavírus e de adenovírus foram realizados nas matrizes ambientais e os vírus detectados por métodos clássicos (cultivo celular e reação de imunoperoxidase) e moleculares (PCR/nested-PCR, RT-PCR e ICC-PCR), determinando-se os limites de detecção de cada método para cada matriz. A pesquisa de rotavírus e adenovírus presentes naturalmente em 25 amostras de água de reúso e em 25 de lodo possibilitou a comparação dos métodos propostos. O ICC-PCR mostrou ser o método mais factível a ser aplicado na área de saneamento. / Human enteric viruses are common contaminants of raw sewage and subproducts of sewage treatment processes. In recent years, those viruses were recommend as new microbiological indicators in different matrices in Brazilian legislation and others countries, although some questions should be elucidated. At present, the aim was to evaluate and compare the efficiencies of standard and molecular virological methods for detection of human enteric viruses in sludge and reclaimed water samples. Rotavirus and adenovirus were experimentally spiked in the proposed matrices and virus recovery and detection limits established for each method and matrice. Viruses naturally presented in 25 samples of sludge and 25 samples of reclaimed water were assayed by all methods and results evaluated and compared for statistical significance. From all methods evaluated, ICC-PCR showed to be the most suitable for virus surveillance in sludge and reclaimed water.

A glicoproteína gp120 do HIV apresenta domínios conservados, dentre os quais está o C4. Este domínio está envolvido no reconhecimento da molécula CD4 na superfície das células alvo, e anticorpos dirigidos contra ele neutralizam o vírus. Em trabalho anterior, este domínio foi introduzido dentro da região globular da proteína fibra do adenovírus. Como a fibra adenoviral é estimulante do sistema imune, decidimos testar a capacidade de indução de anticorpos anti-C4 por essa proteína modificada. Assim, foram construídos vetores plasmídicos e adenovirais portando o gene da região globular da fibra adenoviral contendo o domínio C4, que usados na imunização de camundongos induziram anticorpos capazes de reconhecer a proteína gp120. Também construímos um vetor baculoviral expressando essa proteína híbrida, que purificada por HPLC, foi utilizada para imunizar camundongos que também produziram anticorpos capazes de reconhecer a proteína gp120. Nossos dados sugerem que a região globular da fibra adenoviral é uma boa plataforma para a exposição de epítopos de imunização. / HIV glycoprotein gp120 has conserved domains, one of them being the C4 domain. This region is involved in the recognition of the CD4 marker in target cells and antibodies that recognize this domain can block HIV infection. Previously, the C4 domain was introduced in the adenovirus fiber knob. As the adenovirus fiber stimulates de immune system, we decided to test the production of anti-C4 antibodies by this hybrid protein. We constructed plasmid and adenovirus vectors carrying the fiber knob modified with the C4 domain. Immunization of mice with these vectors showed the production of specific antibodies that recognized de gp120 glycoprotein. Also, we constructed a baculovirus vector expressing the hybrid protein, which was purified by HPLC. Mice immunized with this protein also produced antibodies capable of recognizing gp120. Our data suggest that the fiber knob is a good carrier protein for epitope immunization.

O P. vivax é a segunda espécie mais prevalente causadora de malária no mundo. Medidas de controle ineficientes exigem o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção, como vacinas, novas drogas e novos inseticidas. O objetivo geral do trabalho foi gerar uma formulação vacinal universal com proteínas e adenovírus recombinantes capazes de induzir anticorpos contra as diferentes formas alélicas da proteína circumsporozoíta (CSP) do P. vivax. As proteínas foram produzidas em E. coli e purificadas por cromatografia de afinidade e troca iônica. A obtenção destas proteínas nos permitiu testar qual seria a melhor formulação vacinal para a indução de anticorpos contra as três formas alélicas da proteína CSP de P. vivax (PvCSP). Anticorpos específicos reconheceram esporozoítas do P. vivax por imunofluorescência. Por fim testamos o uso de dois adenovírus recombinantes, um símio e um humano, deficientes em replicação, expressando as três regiões imunodominantes da proteína PvCSP em fusão. Estes foram capazes de induzir resposta imune específica contra as proteínas PvCSP sendo testados em esquema de prime-boost heterólogo, onde camundongos foram primados com os adenovírus e nas doses-reforço receberam a mistura com as três proteínas recombinantes. / The Plasmodium vivax is the second most prevalent species of malaria in the world. Inefficient measures of control used today demand the development of new strategies for prevention, as vaccines, new drugs and new insecticides. The central objective of this thesis was to generate a universal vaccine formulation with proteins and recombinant adenoviral vectors representing the different allelic forms of the circumsporozoite protein (CSP) of the P. vivax. The recombinant proteins were expressed in E. coli and purified. These proteins allowed us to test which would be the best vaccine formulation for the induction of antibodies against the three allelic forms of CSP. The specific antibodies also recognized P. vivax sporozoites by immunofluorescence. Finally we test the use of two recombinant adenoviral vectors, a simian and a human, both replication deficient, expressing a protein containing the repeat regions of the CSP in fusion. These adenoviral vectors induced specific immune response against CSP and were successfully used in an immunization regimen of heterologous prime and boost where in the first dose the mice received recombinant adenoviral vector and in the subsequent doses, the mixture with three recombinant proteins.