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L‟épissage alternatif est un mécanisme de régulation de l‟expression des gènes ayant pris une importance croissante dans l‟étude du vivant. Si des méthodes existent pour déterminer les gènes qui y sont soumis, peu d‟outils sont disponibles pour suivre ces événements d‟épissage in vivo au cours du développement. Pourtant, la caractérisation des régulations sous-jacentes à ces évènements et la détermination des facteurs impliqués sont dépendantes de stratégies fiables pour les visualiser dans des conditions physiologiques.Nous avons développé un système adapté à l‟étude d‟événements d‟épissage basé sur un rapporteur fluorescent bicolore. Nous l‟avons appliqué à cinq gènes de l‟organisme modèle Caenorhabditis elegans et avons suivi leur épissage in vivo.Parmi les différents gènes suivis, deux d‟entre eux suivaient un modèle d‟épissage potentiellement stochastique, un autre une absence d‟épissage alternatif détectable. Les deux derniers gènes présentent un profil d‟épissage spécifique à certain types cellulaires mais ont un effet toxique sur l‟organisme lorsque nous les avons exprimés à partir de concatémères extrachromosomiques. Pour remédier à cela, nous avons choisi de mettre en place une méthode simplifiée d‟insertion en simple copie des rapporteurs utilisant le CRISPR-Cas.Nos résultats indiquent que le système rapporteur fonctionne avec succès. Cependant, il peut encore être amélioré pour se rapprocher des taux physiologiques de transcription grâce à une insertion en simple copie dans le génome de l‟organisme. Nous avons également révélé un événement sous le contrôle de régulations spatiales, temporelles et conditionnelles. De plus, nous avons créé une série de constructions capables de déterminer les éléments en cis impliqués dans la régulation du gène top-1. / Alternative splicing is a regulatory mechanism of gene expression which is increasingly studied in Life Science. Methods exist to study this mechanism but specific tools to follow each alternative splicing event in a spatio-temporal manner are lacking. Yet, the characterization of the regulation and the elements that determines them depends on valide strategies for visualising them in physiological conditions.We have developped a dual-fluorescent reporter-based system in order to follow alternative splicing event regulation in vivo. It has been applied to five different genes in the model organism Caenorhabditis elegans. Among the genes followed, two follow a potentially stochastic scheme, one show no visible sign of alternative splicing. The last display tissue specific splicing patterns but developed a toxic effect in the animal when expressed from a multicopy extrachromosomal array. To remediate this problem, we decided to develop a method that allows for simpler single copy insertion of fluorescent reporter using CRISPR-Cas.Our results indicates that the dual-fluorescent reporter works well. However, this system can be upgraded by getting close to physiological rates of transcription allowed by single-copy insertion in the genome of C.elegans. We also discovered an alternatiove splicing event which follows a spatial, temporal and conditionnal regulation. Moreover, we constructed a set of different reporter to unravel the regulation observed in the gene top-1.

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Le cœur humain est un organe composé de différents types cellulaires tels que les cardiomyocytes, les fibroblastes, les muscles lisses et les cellules endothéliales. Ces cellules se diversifient grâce à des mécanismes moléculaires spécifiques en acquérant leurs propriétés fonctionnelles spécifiques. L’embryon de Drosophile est un modèle simple et adapté pour étudier la diversification des cellules cardiaques et leurs propriétés spécifiques. Le but du projet est d’améliorer notre connaissance sur les acteurs moléculaires qui contrôlent la diversification des cellules cardiaques. Pour atteindre cet objectif nous avons appliqué la méthode TRAP-rc ("rare cell Translation Ribosome Affinity Purification") suivie du séquençage ARN pour identifier les ARN messagers en cours de traduction spécifiques des cellules cardiaques Tin et Lb (Tin CBs et Lb CBs) à deux stades de développement corrélés avec la morphogenèse du cœur embryonnaire. Dans une première analyse focalisée sur l'analyse des données issues des TRAP-Seq sur cellules Tin nous avons mis en évidence que CAP et MSP-300 sont impliqués dans la migration des cardioblasts pendant la fermeture du cœur. En parallèle, nous avons également identifié deux autres gènes impliqués dans la morphogenèse, kon-tiki et dGrip qui semblent contrôler la cohésion des CBs au cours de la migration. En outre, nous avons trouvé qu'au stade 16, environ 60% des gènes enrichis sont communs entre les populations Tin et Lb. Parmi ces gènes, Src42, sqa et flr participent à la régulation du cytosquelette d'actine et nos analyses ont permis de démontrer qu'ils avaient également des fonctions dans la morphogenèse cardiaque. Nous avons également identifié des groupes de gènes plus spécifiques à chacune des populations ciblées. Une catégorie fonctionnelle fortement associée à la population Lb, comprend les gènes qui régulent l'épissage des ARN messagers et certains de ces gènes semblent être requis au cours de la morphogenèse cardiaque. Enfin, nous avons comparé nos données de TRAP-seq cardiaque avec des données de TRAP-Seq issues du muscle somatique (de l'équipe), et ainsi identifié près de 90 gènes qui présentent des isoformes protéiques spécifiques à chaque tissu notamment impliquées dans la formation de l'unité contractile sarcomérique. Ceci suggère que des mécanismes d'épissage spécifiques sont mis en place dans différents types cellulaires pour moduler les fonctions de certaines protéines musculaires. A travers ce projet, nous avons identifié de nouveaux acteurs généraux de la migration collective des cardioblastes au cours de la fermeture du cœur mais également de nouveaux gènes potentiellement impliqués dans l’acquisition des propriétés spécifiques dessous populations cardiaques Tin et Lb et de tissus musculaires distincts. Nous espérons que les données générées permettront dans le futur de mieux comprendre les mécanismes de la cardiogenèse des vertébrés ainsi que l’étiologie de maladies cardiaques. / Cardiac cells diversification is required for the formation of a functional heart. Human heart is a multi-lineage organ that develops through progressive diversification of progenitors derived from different heart fields. This process is underlined by numerous changes in the expression of a repertory of genes that allow cells to acquire their own identity and functions. The Drosophila embryo is a relatively simple model to study the diversification of cardiac cells and their properties. The goal of this project is to identify the repertories of genes that control the formation of different types of cardiac cells. To reach this objective we applied Translation Ribosome Affinity Purification (TRAP) method followed by RNA sequencing in order to identify mRNA engaged in translation specific to two cardiac cell types (Tinman (Tin) and Labybird (Lb) expressing cells), at two different time windows. We obtained a list of enriched genes for the different types of cardiac cells and time points. In a first part, we focused our attention on the Tindatasets and found that two genes, CAP and Msp300, are involved in cardioblasts migration during the heart closure. Then we identified two other candidate genes kontiki and dGrip that seem to contribute to maintain cohesion between CBs during heartmorphogenesis. Moreover by comparing our spatial datasets, we found that for the same time point, around 60% of Tin CBs enriched genes are common with Lb CBs enriched population and within this group we identified evolutionary conserved genes such as Src42, flr and sqa known to be involved in the cytoskeleton organization and in the actinpolymerization and depolymerisation. Our premiminary analyses show that they seem to be required for correct cardiac morphogenesis. We also identified sets of genes more specific for each cardiac cell population. Indeed, Lb CBs datasets show that in early stage there is the enrichment of genes mostly involved in transcriptional regulation and RNA splicing and some of these genes (prp8 and prp38) are involved in cardiac development. In parallel, we compared our TRAP-Seq dataset in the cardiac system with the TRAP-seqon muscle cells, and identified close to 90 genes that present cardiac or muscular specific isoforms. It is known that the alternative splicing, by increasing proteins diversity, contributes to the acquisition of specific cell properties. Furthermore, some cardiomyopathies are associated to defects in the alternative splicing of genes encoding sarcomeric proteins that we found in our dataset such as Tropomyosin and Zasp52. With this project, we have identified new actors of collective cardioblast migration and a set of genes with potential role in the acquisition of individual properties of Tin and Lbcardiac cells or of specific type of muscle tissue. We hope that our data could provide new insights into the genetic control of vertebrate cardiogenesis and into etiology of cardiac diseases.

Vysoce výkonné sekvenční technologie produkují obrovské množství dat, která mohou odhalit nové geny, identifikovat splice varianty a kvantifikovat genovou expresi v celém genomu. Objem a složitost dat z RNA-seq experimentů vyžadují škálovatelné metody matematické analýzy založené na robustníchstatistických modelech. Je náročné navrhnout integrované pracovní postupy, které zahrnují různé postupy analýzy. Konkrétně jsou to srovnávací testy transkriptů, které jsou komplikovány několika zdroji variability měření a představují řadu statistických problémů. V tomto výzkumu byla sestavena integrovaná transkripční profilová pipeline k produkci nových reprodukovatelných kódů pro získání biologicky interpretovovatelných výsledků. Počínaje anotací údajů RNA-seq a hodnocení kvality je navržen soubor kódů, který slouží pro vizualizaci hodnocení kvality, potřebné pro zajištění RNA-Seq experimentu s analýzou dat. Dále je provedena komplexní diferenciální analýza genových expresí, která poskytuje popisné metody pro testované RNA-Seq data. Pro implementaci analýzy alternativního sestřihu a diferenciálních exonů jsme zlepšili výkon DEXSeq definováním otevřeného čtecího rámce exonového regionu, který se používá alternativně. Dále je popsána nová metodologie pro analýzu diferenciálně exprimované dlouhé nekódující RNA nalezením funkční korelace této RNA se sousedícími diferenciálně exprimovanými geny kódujícími proteiny. Takto je získán jasnější pohled na regulační mechanismus a poskytnuta hypotéza o úloze dlouhé nekódující RNA v regulaci genové exprese.

Background: Genome-wide association studies (GWAs) have identified almost one hundred genetic loci associated with variances in human blood lipid phenotypes including very low-density lipoprotein cholesterol, low-density lipoprotein cholesterol, high-density lipoprotein cholesterol, total cholesterol and triglycerides. Nevertheless the revealed loci only explain a small fraction of heritability and therefore a subtile phenotype of cholesterol homoestasis was examined in our study for the very first time. Methods and Results: Using a multi-stage approach of a GWA, firstly, a genome-wide analysis (Affymetrix 500K GeneChip) for serum lanosterol and serum total cholesterol using LC-MS/MS was conducted in 1495 participants of the KORA-S3/F3 cohort with subsequent replication in two additional independent samples of the the KORA-S3/F3 cohort (n = 1157) and CARLA cohort (n = 1760). Two genetic variants, SNP rs7703051 and rs17562686, in the HMGCR locus were significantly associated with serum lanosterol and showed similar effects of elevated serum lanosterol for each minor allele (combined n = 4412: p = 1,4 x 10-10, +7,1% and p = 4,3 x 10-6, +7,8%). Furthermore, rs7703051 showed a nominal statistical significance to serum cholesterol (p = 0,04). A combined analysis of both SNPs demonstrated that observed associations of rs17562686 can be partly explained by LD with rs7703051 being the primary polymorphism in that study. Nevertheless, rs17562686 shows consistent independent effects on serum lanosterol, thus being associated to a lipid phenotype for the very first time. The following SNP-fine mapping of the HMGCR locus was carried out in the CARLA cohort with subsequent validation in the LE-Heart cohort (n = 1895). The recently published SNP rs3846662 being in tight LD with rs7703051 could be associated with variances of serum lanosterol in both cohorts and functional in vivo studies of gen expression using qRT-PCR assays demonstrated a highly significant association of higher expression of alternatively spliced HMGCR mRNA lacking exon 13 with homozygosity for the rs3846662 major allele in 51 human liver samples (p < 0,01) and 958 human PBMCs (p = 2,1 x 10-7). The overall HMGCR gen expression was not affected. Further investigation of in vivo HMG-CoA reductase enzyme activity in both human samples (n = 48 and n = 55) using anionic exchange column chromatography and scintillation counting of [3-14C]-HMG-CoA and [5-3H]-mevalonolacton did not show any significant results. In addition there was not any association in the LE-Heart cohort between these SNPs and the development of CAD. Finally, rs7703051 could be replicated for already published total cholesterol (combined n = 4412) and rs3846662 for LDL-cholesterol (LE-Heart n = 1895). Since fine mapping in CARLA showed several SNPs throughout the HMGCR locus being in LD with rs17562686 we performed a DNA sequencing of the extended 5´-HMGCR promotor region in six human liver samples. A unknown SNP was discovered in the promotor but could not be associated with any of the examined phenotypes mentioned above. The minor allele of SNP rs5909 situated next to the stop codon and being in high LD with rs17562686 was associated with elevated serum lanosterol and slightly reduced HMGCR gen expression, but further studies including the above mentioned as well as measurement of 3’-UTR transcript lengths using qRT-PCR assays did not produce significant results. Conclusion: The phenotype serum lanosterol could be associated with genetic polymorphisms (e.g. rs7703051) in the HMGCR locus. Therefore already published associations of HMGCR with total cholesterol and LDL-cholesterol can be explained by variances of cholesterol homeostasis. The SNP rs17562686 could be associated with a phenotype of human blood lipids for the very first time. Subsequent gen expression analyses demonstrated a highly significant association of rs3846662 with variant patterns of HMGCR alternative splicing. A significant effect of alternatively spliced protein on enzyme activity and a association of these SNPs with CAD could not be shown.

Les progrès des technologies de séquençage ont joué un rôle important dans le diagnostic moléculaire des maladies rares, telles que les myopathies et les dystrophies musculaires. Cependant, plusieurs patients atteints de maladies neuromusculaires restent sans diagnostic. Ceci est dû à la grande hétérogénéité clinique et génétique ainsi qu'au caractère hautement polymorphique des gènes associés à ces troubles. L'interprétation des données génétiques est un grand défi et les tests génétiques aboutissent souvent à l'identification de variants de signification inconnue (VUSs). Plusieurs de ces variants peuvent perturber l'épissage normal de l'ARN ou affecter l'expression des gènes. À cet égard, nous proposons une approche bio-informatique. Notre objectif est de mettre en place un pipeline identifiant et caractérisant des variants d'intérêt dans un contexte pathologique. Afin de déterminer si les variants ont un impact fonctionnel, notre pipeline se concentre sur l'épissage alternatif ainsi que sur l'intégration des données génomiques et transcriptomiques. Nous émettons l'hypothèse qu'une partie des patients sans diagnostic pour leur maladie neuromusculaire s'explique par des variants introniques jouant un rôle régulateur ou affectant l'épissage et l'abondance de l'ARNm. Cette approche multi-omique permet de déterminer si les variants ont un impact fonctionnel. Pour ce faire, nous avons réalisé un séquençage de l'ARN et de l'ADN à partir de biopsies musculaires de quatre patients. Les données ont été alignées et annotées avec différents scores de pathogénicité. Les événements d'épissage sont analysés par SpliceAI et rMATS. L'analyse des gènes différentiellement exprimés a été réalisée par l'outil LPEseq. Les CNVs et les expansions de répétitions ont été analysés avec CNVkit et ExpansionHunter. Plusieurs scripts maison filtrent et intègrent les données ARN et ADN. Pour l'instant, un total de huit variants pathogéniques sont proposés pour nos patients, mais des investigations supplémentaires sont nécessaires. Les variants recherchés sont rares et nécessitent donc un pipeline cohérent et efficace. Ce projet apportera un bénéfice significatif pour les patients en leur permettant d'obtenir un diagnostic et ainsi d'avoir accès à un meilleur suivi clinique. / Advances in sequencing technologies have played an important role in the molecular diagnosis of rare diseases, such as myopathies and muscular dystrophies. However, several patients with these neuromuscular diseases remain undiagnosed. This is due to the great clinical and genetic heterogeneity as well as the highly polymorphic nature of the genes associated with myopathies and muscular dystrophies. The interpretation of genetic data is a great challenge and genetic testing often results in the identification of variants of uncertain significances (VUSs). Many of these variants can disrupt normal RNA splicing or affect gene expression. In this regard, we propose a bioinformatics approach. Our aim is to put in place a pipeline identifying and characterizing variants of interest in a pathological context. To determine if the variants have a functional impact, our pipeline focuses on alternative splicing as well as the integration of genomic and transcriptomic data. We hypothesize that a portion of patients without a diagnosis for their neuromuscular disorder is explained by intronic variants having a regulatory role or affecting mRNA splicing and abundance. This multi-omics approach will make it possible to determine whether the variants have a functional impact. To do so, we performed RNA and DNA sequencing using muscle biopsies from four patients. Data was aligned and annotated with different pathogenicity scores. Splicing events are analyzed by SpliceAI and rMATS. The analysis of the differentially expressed genes was carried out by the LPEseq tool. CNVs and repeat expansion were analyzed with CNVkit and ExpansionHunter. Several in-house scripts filter and integrate RNA and DNA data. For now, a total of eight pathogenic variants are proposed for our patients, but further investigations are needed. The variants sought are rare and therefore require a coherent and efficient pipeline to facilitate their characterization. This project will have a significant benefit for patients by allowing them to obtain a diagnosis and thus have access to better clinical follow-up.

L’hypothyroïdie congénitale (HC), qui se traduit par une insuffisance d’hormone thyroïdienne (HT) à la naissance, est la maladie endocrinienne congénitale la plus fréquente avec une prévalence d’un cas sur 2,500 naissances vivantes. Non-traitée, cette insuffisance peut entrainer un retard de développement sévère, surtout au niveau cognitif. L’HC est le plus souvent due à un défaut lors du développement de la thyroïde (dysgénésie thyroïdienne (DT)) ou lors de la production des hormones thyroïdiennes (dyshormonogenèse (D)). La majorité des cas d’HC par dysgénésie thyroïdienne (HCDT) ont une ectopie, soit une glande mal positionnée. Contrairement aux dyshormonogenèses, qui s’expliquent fréquemment par des mutations dans les gènes responsables de la production des HT, selon un modèle autosomique récessif, les causes de l’HCDT demeurent largement inconnues. Certains arguments sont en faveur d’une prédisposition génétique (le risque relatif chez les parents de premier degré est de 40 fois supérieur à celui de la population générale) mais l’HCDT ne suit pas un modèle Mendélien: 98 % des cas sont sporadiques et 92 % des jumeaux monozygotiques sont discordants pour l’HCDT. De ce fait, nous avons suggéré une hypothèse de double-hit pour expliquer les HCDT, hypothèse combinant une prédisposition germinale (héritée ou de novo) à un évènement somatique (génétique ou épigénétique). Par le passé, nous avons étudié l’évènement somatique, mais nous n’avions pas encore étudié la prédisposition germinale. Le séquençage d’exome complet peut permettre d’identifier la cause génétique dans des formes familiales d’HC, mais aussi déterminer si les cas avec une HCDT isolée sont enrichis en variants délétères, tel qu’observé chez des patients avec une malformation cardiaque congénitale, patients qui partagent des caractéristiques similaires avec ceux atteints d’HCDT. De plus, cette technique pourrait permettre d’identifier de nouveaux gènes de prédisposition associés à l’HCDT. D’une part, nous avons séquencé l’exome d’un trio (parent-enfant) afin d’identifier la cause de l’HC dans une famille avec plusieurs enfants sévèrement atteints d’HC. D’autre part, nous avons comparé les données d’exome d’une cohorte de cas avec une HCDT isolée (HCDT non syndromique, HCDT-NS) à celles d’une cohorte contrôle, à l’aide d’une approche biaisée (gene-based burden) et non biaisée (gènes candidats). Finalement, nous avons développé le modèle de poisson-zèbre afin de pouvoir valider, in vivo, l’implication de potentiels gènes candidats, dans le développement thyroïdien. L’analyse de l’exome du trio a révélé un variant dans le gène TSHR qui co-ségrégait parfaitement avec le phénotype, et les études de minigène ont permis de montrer que ce variant intronique loin des sites d’épissage traditionnels introduisait un pseudo-exon dans la séquence du TSHR, créant ainsi un récepteur tronqué et inactif. L’analyse par comparaison de cohorte (cas-contrôle) a montré que les cas avec une HCDT-NS n’ont pas davantage de variants rares délétères comparé aux contrôles. De plus, après correction, le gene-based burden n’a pas identifié de gène candidat. Par contre, des variants rares pathogéniques ou probablement pathogéniques dans des gènes liés à l’hypothyroïdie congénitale ont été identifiés chez 42% des cas. Les études réalisées chez le poisson-zèbre sur un gène candidat, IKBKE, identifié par une analyse préliminaire de l’exome dans la cohorte de cas, confirme que les vaisseaux sanguins sont importants pour le bon positionnement de la glande thyroïde chez le poisson-zèbre, mais ne permet pas d’établir le rôle d’IKBKE dans la migration thyroïdienne. Nous avons d’abord montré que l’exome est une bonne technique pour identifier la cause de l’HC dans une famille avec plusieurs enfants atteints. Toutefois, une connaissance approfondie de la maladie et des isoformes du gène d’intérêt s’est avérée essentielle afin de bien analyser les données d’exome. Ensuite, nos résultats suggèrent que les cas avec une HCDT-NS n’ont pas davantage de variants délétères que les contrôles et que l’exome complet n’est pas suffisant pour identifier des gènes de prédisposition. Le séquençage du génome est peut-être nécessaire pour trouver une prédisposition génétique à l’HCDT-NS. Par contre, il est aussi possible que la génétique ne joue pas un rôle majeur dans les dysgénésies thyroïdiennes. Finalement, nous avons validé que le poisson-zèbre est un bon modèle pour étudier le développement de la thyroïde. / Congenital hypothyroidism (CH) is a disorder with a prevalence of one in 2,500 live births. CH can lead to severe intellectual disability if left untreated. It is most commonly caused by a defect during thyroid development (thyroid dysgenesis), which results in an ectopic gland in the majority of cases. A defect in thyroid hormone production (dyshormonogenesis) is the second most common cause of CH. In contrast to dyshormonogenesis, which generally has an identified cause and follows a Mendelian mode of inheritance, the cause of CHTD remains mostly unknown. CHTD is generally sporadic (98%) and has a high discordance rate (92%) between monozygotic twins. However, first-degree relatives are affected more often than by chance alone (40x) and there is an ethnic and female predominance. We thus hypothesized that CHTD is a disorder caused by two events, one germinal (a necessary but not sufficient predisposing factor) becoming pathogenic only if a second genetic or epigenetic event occurs at the somatic level. Whole exome sequencing (WES) can allow for identification of the genetic cause of CHTD in familial forms, but may also reveal if non-syndromic CHTD (NS-CHTD) cases are enriched in rare protein-altering variant, as seen in congenital heart malformations, a developmental defect that shares several characteristics with CHTD. Moreover, it might also identify new predisposing genes. First, we performed WES on a trio (parent-child) in a family with several siblings affected with severe CH. Second, we compared WES data of a NS-CHTD cohort with data from a control cohort, using a gene-based burden (unbiased) approach and a candidate gene (biased) approach to evaluate whether WES analysis allows to identify new predisposing genes in a well-characterized cohort. Finally, we developed the zebrafish model to test the roles of candidate genes, that will be identified by WES, in thyroid development. We first identified a variant in TSHR that segregated perfectly with the phenotype in the family with CHTD and a mini gene assay showed that this deep intronic variant induced a pseudo-exon, leading to a truncated protein missing the transmembrane domain, thus an inactive TSH receptor. Next, we found that NS-CHTD cases are not enriched in rare protein-altering variants and gene-base burden analysis did not identify novel candidate genes. However, WES data revealed pathogenic or likely pathogenic variants in CH-related genes in 42% of the NS-CHTD cases. Finally, zebrafish is a good model to study thyroid development and our results on IKBKE confirm the importance of vessels in thyroid positioning, but not its role in thyroid migration. First, we showed that WES analysis is a good tool to identify the causative variant in a family with several siblings affected by CH. However, the interpretation of the exome analysis required knowledge of the expression of the relevant isoforms and of the biology of the disease. Second, while a gene-based burden test, using WES data from a well-characterised NS-CHTD cohort, did not identified new predisposing genes, it identified pathogenic or likely pathogenic variants in 42% of the NS-CHTD cases. Whole genome sequencing might be required to identify the genetic causes in NS-CHTD. However, our result may indicate that genetics does not play a major role in thyroid dysgenesis. Finally, we have established that zebrafish is a good model to study thyroid development and may help, in the future, identify pathways implicated in this process.

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