Made available in DSpace on 2014-06-12T18:03:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3688_1.pdf: 1907498 bytes, checksum: 101a9bcd7d206849add625965525a3c3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os tripanossomatídeos são protozoários que causam manifestações clínicas de impacto mundial e possuem características bioquímicas peculiares que os diferem dos demais eucariotos. Sua expressão gênica é regulada em nível pós-transcricional, provavelmente no estágio de iniciação da síntese protéica. A tradução cap-dependente é iniciada através da ligação do fator de iniciação eIF4E, pertencente ao complexo eIF4F, ao cap presente na extremidade 5 dos mRNAs. Foram identificados múltiplos homólogos do fator EIF4E nestes parasitas, que provavelmente estão associados ao seu complexo ciclo de vida. Neste trabalho, nós buscamos entender como ocorre a expressão de quatro homólogos deste fator (EIF4E1-4) durante o ciclo de vida de Leishmania amazonensis. Para tal, foram realizadas curvas a fim de se obter as três principais formas evolutivas do parasita. Todos os homólogos estão presentes ao longo da curva e os EIF4E2-4 apresentam múltiplas isoformas, sugerindo modificações pós-traducionais por fosforilação. Destes, as isoformas dos EIF4E3 e 4 apresentaram expressão constrastante que não interferem com sua localização subcelular, citoplasmática. A ausência de soro fetal bovino no meio induziu uma desfosforilação prematura do EIF4E4 e uma hiperfosforilação do EIF4E3, associados à falta de crescimento celular. EIF4E3 desfosforilado e EIF4E4 fosforilado estão associados a uma maior atividade de tradução. A presença de um inibidor de transcrição influenciou no padrão de expressão dos dois homólogos, porém um inibidor de tradução afetou apenas o EIF4E3. Estes resultados indicam que os homólogos de eIF4E atuam de forma distinta na célula e que a fosforilação deve ter um papel significante na regulação destes fatores em Leishmania e na regulação da síntese de proteínas como um todo

Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:11:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Conte_FabioFrangiotti_M.pdf: 8161172 bytes, checksum: ff9bc4f07d1c0552b0c3a7af62e238c2 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Os telômeros são complexos de DNA e proteínas que protegem os cromossomos eucarióticos da degradação e fusão terminais, garantindo a estabilidade genômica. As seqüências teloméricas são ricas em guaninas e na maioria dos eucariotos terminam em uma protrusão 3' simples fita denominada de "3'G-overhang". As seqüências adjacentes aos telômeros constituem a região subtelomérica, a qual em Leishmania spp., diferentemente de Trypanosoma cruzi, T. brucei e Plasmodium falciparum, não contém genes que codificam antígenos de superfície. Fu & Barker (1998) caracterizaram essa região em diferentes espécies do gênero Leishmania e verificaram que a mesma possui blocos de uma sequência de 100 pb conhecida como "Leishmania Conserved Telomere Associated Sequences" (LCT AS), a qual aparece flanqueada por repetições teloméricas. Há dois blocos de seqüências conservadas (CSBl e CSB2) que fazem parte das LCTAS e que têm diferente organização e número de cópias na região subtelomérica (Fu & Barker, 1998). Devido ao alto grau de conservação das seqüências desses elementos, sugere-se que estes desempenhem função importante no processo de segregação dos cromossomos e que possam conter sítios para ligação de proteínas do complexo telomérico. O intuito principal deste projeto de Mestrado foi estudar a organização genômica de seqüências da região teloméricalsubtelomérica de Leishmania amazonensis. A partir dos resultados dos "Southem blottings" e dos ensaios de cinética de digestão com a exonuclease Bal31 foi possível estimar que os Fragmentos de Restrição Terminais (TRF "Terminal Restriction Fragments") de L. amazonensis possuem aproximadamente 3,3 kb e que o tamanho médio dos telômeros varia de 0,2 a 1,0 kb. Além disso, as hibridizações com as seqüências CSBl e CSB2 das LCTAS revelaram que esses domínios aparecem como blocos de 0,2 a 1,6 kb, flanqueados por sítios HaeIII, e que CSB 1 e CSB2 encontram-se em menor número de cópias em relação à seqüência telomérica. Demonstrou-se também que há sítios HinjI presentes nas regiões subteloméricas da maioria dos cromossomos, assim como sítios AfaI em posição distal e próximos ao término dos cromossomos. Utilizando-se "Southem blotting" não denaturante, estimou-se o tamanho e a seqüência da protrusão "3'G-overhang" dos cromossomos de L. amazonensis. Essa estrutura possui 2: 12 nucleotídeos e difere das outras espécies do gênero Leishmania por apenas três nucleotídeos na extremidade 3' . Para confirmar os resultados acima, realizou-se a hibridização com as seqüências telomérica e subteloméricas dos cromossomos de L. amazonensis separados por PFGE. Os cromossomos foram separados em 25 bandas coradas com brometo de etídeo com pesos moleculares variando de 0,35 2: 3,0 Mb. Todas as bandas hibridizaram com as seqüências telomérica e subtelomérica, indicando que as mesmas são moléculas lineares. Os experimentos de PFGE em segunda dimensão foram usados com o objetivo de se analisar a organização dessas seqüências nos cromossomos e demonstraram que a maioria dos telômeros de L. amazonensis são polimórficos em tamanho. Um modelo hipotético para essa organização foi proposto. Os ensaios de "Electrophoretic Mobility Shift Assay" (EMSA) e "UV cross-linking" foram utilizados para identificar proteínas formadoras de complexos com os elementos subteloméricos conservados e com a repetição telomérica na forma de dupla-fita. Resultados preliminares demonstraram a existência de três complexos DNA-proteína denominados LaCIF para "Leishmania CSB2 Interacting Factor" e LaTAFI-2 para "Leishmania Telomere Associated Factor 1 and 2". Todos os complexos foram formados com proteínas presentes em extratos S1OO e nuclear e com sondas na forma de dupla-fita. Nenhum complexo foi formado quando se utilizou a seqüência CSB 1 como sonda. Os resultados obtidos neste projeto, apesar de preliminares, poderão contribuir para uma maior compreensão sobre a organização estrutural e sobre a composição da cromatina na região teloméricalsubtelomérica de L. amazonensis, o principal agente etiológico da leishmaniose cutânea e cutâneo-difusa no Brasil / Abstract: Telomeres are protein-DNA complexes that protect eukaryotic chromosomes from degradation and end fusions, ensuring genomic stability. The telomeric sequences are guanine-rich and in most eukaryotes telomeres end as "3'G-overhangs". The subtelomeric region is adjacent to telomeres and in Leishmania spp., unlike Trypanosoma cruzi, T. brucei and Plasmodium falciparum, does not contain sequences encoding for surface antigens. Fu & Barker (1998) have characterized this region in different species ofthe genus Leishmania and verified that it is formed by blocks of 100 bp sequences named "Leishmania Conserved Telomere Associated Sequences" (LCTAS). LCTAS are flanqued by telomeric repeats and contain two conserved sequence elements, CSB 1 and CSB2, which differ in organization and distribution (Fu & Barker, 1998). Due to the high degree of sequence conservation between CSBl and CSB2 the authors sugested that these subtelomeric domains may play important role in the process of chromosome segregation and that they could harbor binding sites for telomeric proteins. The main goal of this project was to study the genomic organization of telomeric/subtelomeric sequences of Leishmania amazonensis. From the results obtained with Southem blottings and exonuclease Bal31 treatment it was possible to estimate that the length of Terminal Restriction Fragments (TRF) of L. amazonensis is about 3.3 kb and that telomeres range in size from 0.2 to 1.0 kb. Using the same approaches it was also possible to observe that CSB 1 and CSB2 subtelomeric elements are organized as segments of 0.2 to 1.6 kb, flanqued by HaeIlI sites, and that they are present in lower copy number than the telomeric sequence. It was also possible to demonstrated most of Leishmania amazonensis chromosomes contain HinjI and AfaI sites at subtelomeric positions and that AfaI sites are located at a more distal position in relation to the center of the chromosome. Using non-denaturing Southem blotting it was possible to estimate the sequence and size of the 3' G-overhang in L. amazonensis chromosomes. These structures are about _ 12 nucleotides long and differ from other species of Leishmania by only three nucleotides at the 3' end. To confirm the above results, L. amazonensis chromosomes were separated by Pulsed Field Gel Electrophoresis and hibridized with telomeric and subtelomeric sequences. The results showed that, under our standard conditions, all L. amazonensis chromosomes can be separated in a unique gel as 25 ethidium-bromide bands whose molecular weights vary from 0.35 - _ 3.0 Mb. All ofthese bands hybridized with the telomeric and subtelomeric sequences, indicating that they are linear molecules. PFGE in second dimension was used to analyse the organization of these sequences at the chromosome leveI and demonstrated that most of L. amazonensis telomeres are polimorfic in size. A hypothetical model for this organization was proposed. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) and UV cross-linking were used to identify protein forming-complexes with the conserved subtelomeric elements and with the telomeric repeat in double-stranded formo Pre1iminary results demonstrated the existence of three protein-DNA complexes named LaCIF for "Leishmania CSB2 Interacting Factor" and LaTAFI-2 for "Leishmania Telomere Associated Factor 1 and 2". AlI complexes were formed with proteins present in S100 and nuclear extracts and with the oligoprobes in double-stranded form. No complex was formed when the assays were done with CSB 1 as the oligoprobe. The results obtained in the present work, although in part preliminary, will contribute to a better understand of the estructural organization of the chromosome terminus and the composition of the chromatin in the telomeric/subtelomeric region of L. amazonensis, the main ethiologic agent of cutaneous leishmaniasis in Brazil / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Leishmania amazonensis é um parasito endêmico no Brasil, que ao infectar humanos, pode causar a leishmaniose cutânea. Cerca de 12 milhões de pessoas estão infectadas com parasitos do gênero Leishmania em 98 países, e anualmente, 350 milhões de indivíduos estão em risco de contrair esta doença. Enquanto o papel da imunidade adaptativa já foi extensivamente investigado, em modelos de infecção com Leishmania spp., os mecanismos de alguns receptores da imunidade inata, e principalmente dos citosólicos, como é o caso do AIM2, permanecem obscuros. Recentemente, o nosso grupo descreveu a importância do inflamassoma de NLRP3 no controle da infecção por L. amazonensis, o qual é mediado pela produção de óxido nítrico dependente da sinalização de IL-1R. Neste trabalho, foi demonstrado que a deficiência para IL-1R confere uma maior susceptibilidade a este parasito do que a deficiência para NLRP3. Sugerindo que outros inflamassomas, que operam via IL- 1R, possam estar envolvidos na resposta contra este patógeno. Dentre estes, o AIM2 destacase como sendo um receptor de DNA citosólico que mediante a sua ativação promove a secreção de citocinas pro-inflamatórias e piroptose. Neste contexto, nós demonstramos que o AIM2 promove o controle da infecção in vitro por L. amazonensis em macrófagos, e que estas células requerem este sensor de DNA para a secreção de IL-1?, expressão da enzima NOS2 e produção de óxido nítrico. Adicionalmente, também observamos que AIM2 promove resistência à infecção por L. amazonensis in vivo, contribuindo para o desenvolvimento de uma resposta Th1. Por fim, também demonstramos que o inflamassoma de AIM2 atua na produção de IL-1? e IL-1?, por células dendríticas, assim como na expressão de CD86 e CD40 e na secreção de IL-12 por estas células. Desta forma, foi demonstrado neste trabalho que o AIM2, ao ativar células da imunidade inata e adaptativa, promove o controle direto ou indireto da infecção por L. amazonensis. / Leishmania amazonensis is an endemic parasite in Brazil that can cause the cutaneous leishmaniasis in humans. Annually, around 12 million people are infected with Leishmania spp. parasites, in 98 countries. In addition, 350 million of individuals are on risk to develop this disease. While the role of the adaptive immune response was already extensively evaluated, on models of infection with Leishmania spp., the mechanisms of some innate immune receptors, and mainly the cytosolic ones, such as AIM2, remain unclear. Recently, our group described the importance of the NLRP3 inflammasome to the control of L. amazonensis mediated by NO, which is dependent of the IL-1R signaling. In this work, it was also reported that the Il-1r deficiency displayed a higher susceptibility to L. amazonensis infection in comparison to Nlrp3-deficient mice. Suggesting that other inflammasomes, which may operate through IL-1R, might be involved in the response to this pathogen. Among these, the AIM2 highlights as a cytosolic DNA sensor, which, after its activation, promotes the secretion of proinflammatory cytokines and pyroptosis. On this context, we demonstrated that AIM2 promotes the in vitro control of L. amazonensis in macrophages, and that these cells require this DNA sensor for the IL-1? secretion, NOS2 expression and NO production. In addition, we also observed that AIM2 promotes the in vivo resistance to L. amazonensis infection, contributing for the development of a Th1 response. Finally, we also demonstrated that AIM2 acts on the production of IL-1? and IL-1?, by dendritic cells, as well as on the CD86 and CD40 expression and IL-12 secretion by these cells. Therefore, in this work, we showed that the AIM2, leading to the activation of innate and adaptive immune cells, promotes the direct or indirect control of L. amazonensis infection.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-11-30T20:45:01Z No. of bitstreams: 1 José Geraldo Bomfim Lima Efeito da autofagia... 2009.pdf: 32365208 bytes, checksum: 34504be1e8f6483c263480600d8e1880 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-30T20:45:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 José Geraldo Bomfim Lima Efeito da autofagia... 2009.pdf: 32365208 bytes, checksum: 34504be1e8f6483c263480600d8e1880 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A autofagia vem sendo alvo de estudos que demonstram sua participação em infecções por diversos patógenos intracelulares. A depender do patógeno, a autofagia pode facilitar a sobrevivência intracelular do patógeno ou pode funcionar como controle da infecção pela célula hospedeira. Pouco se sabe sobre a participação da autofagia na infecção por Leishmania. Foi demonstrado que o vacúolo parasitóforo induzido por L mexicana adquire nutrientes citosólicos por microautofagia. Além disso, recentemente foi demonstrado que a indução de autofagia promove aumento da carga parasitária de L. amazonensis em macrófagos infectados. Esses dados sugerem a participação do processo autofágico no estabelecimento da infecção por Leishmania, como um mecanismo que favorece a sobrevivência intracelular do parasito. Assim, o objetivo desse estudo foi determinar a influência da autofagia na infecção, in vitro, de macrófagos de camundongos CBA/J por L. amazonensis. Macrófagos foram induzidos à autofagia por duas formas, fisiológica ou farmacológica, após ou antes da infecção por L. amazonensis ou exposição a partículas de levedo ou zimosan. O percentual de infecção e de fagocitose foi estimado. Os resultados mostram que a indução de autofagia, após a infecção, não altera o percentual de macrófagos infectados, mas promove o aumento na carga parasitária de macrófagos infectados por L. amazonensis. Além disso, a prévia indução de autofagia promove a inibição da capacidade fagocítica do macrófago murino. Estudos adicionais serão realizados no intuito de esclarecer os mecanismos pelos quais a indução de autofagia favorece a infecção por L. amazonensis e altera a capacidade fagocítica do macrófago murino / Recently, studies to delineate the participation of autophagy in intracellular pathogen infections have been performed. Dependent on pathogen infection, autophagy can facilitate microorganism intracellular survival or can control pathogen infection by host cell. Few works evaluated the role of autophagy in Leishmania infection. Recently, it was demonstrated that L mexicana-'mduced parasitophorous vacuoles acquire cytosolic nutrients by microautophagy. Additionally, it was also demonstrated that autophagy promotes enhancement of L. amazonensis burden on infected cells. Taken together, these data suggest the involvement of autophagic process on Leishmania infection, as a mechanism that favors parasite survival. The present work intent to determine the influence of autophagy in L. amazonensis infection of CBA/J macrophages in vitro. Autophagy was induced after and before L. amazonensis infection or particle addition to macrophage cultures. The percentage of infection and particle phagocytosis was estimated. The results show that autophagy induction after infection does not influence the percentage of L. a/rjazonens/s-infected cells, but enhances L. amazonensis burden on infected cells. In addition, previous autophagy induction inhibited macrophage phagocytic capacity. Further studies will be performed to understand the mechanisms involved in autophagy effect on L. amazonensis infection and on macrophage phagocytic capacity.

Leishmania amazonensis é um parasito endêmico no Brasil, que ao infectar humanos, pode causar a leishmaniose cutânea. Cerca de 12 milhões de pessoas estão infectadas com parasitos do gênero Leishmania em 98 países, e anualmente, 350 milhões de indivíduos estão em risco de contrair esta doença. Enquanto o papel da imunidade adaptativa já foi extensivamente investigado, em modelos de infecção com Leishmania spp., os mecanismos de alguns receptores da imunidade inata, e principalmente dos citosólicos, como é o caso do AIM2, permanecem obscuros. Recentemente, o nosso grupo descreveu a importância do inflamassoma de NLRP3 no controle da infecção por L. amazonensis, o qual é mediado pela produção de óxido nítrico dependente da sinalização de IL-1R. Neste trabalho, foi demonstrado que a deficiência para IL-1R confere uma maior susceptibilidade a este parasito do que a deficiência para NLRP3. Sugerindo que outros inflamassomas, que operam via IL- 1R, possam estar envolvidos na resposta contra este patógeno. Dentre estes, o AIM2 destacase como sendo um receptor de DNA citosólico que mediante a sua ativação promove a secreção de citocinas pro-inflamatórias e piroptose. Neste contexto, nós demonstramos que o AIM2 promove o controle da infecção in vitro por L. amazonensis em macrófagos, e que estas células requerem este sensor de DNA para a secreção de IL-1?, expressão da enzima NOS2 e produção de óxido nítrico. Adicionalmente, também observamos que AIM2 promove resistência à infecção por L. amazonensis in vivo, contribuindo para o desenvolvimento de uma resposta Th1. Por fim, também demonstramos que o inflamassoma de AIM2 atua na produção de IL-1? e IL-1?, por células dendríticas, assim como na expressão de CD86 e CD40 e na secreção de IL-12 por estas células. Desta forma, foi demonstrado neste trabalho que o AIM2, ao ativar células da imunidade inata e adaptativa, promove o controle direto ou indireto da infecção por L. amazonensis. / Leishmania amazonensis is an endemic parasite in Brazil that can cause the cutaneous leishmaniasis in humans. Annually, around 12 million people are infected with Leishmania spp. parasites, in 98 countries. In addition, 350 million of individuals are on risk to develop this disease. While the role of the adaptive immune response was already extensively evaluated, on models of infection with Leishmania spp., the mechanisms of some innate immune receptors, and mainly the cytosolic ones, such as AIM2, remain unclear. Recently, our group described the importance of the NLRP3 inflammasome to the control of L. amazonensis mediated by NO, which is dependent of the IL-1R signaling. In this work, it was also reported that the Il-1r deficiency displayed a higher susceptibility to L. amazonensis infection in comparison to Nlrp3-deficient mice. Suggesting that other inflammasomes, which may operate through IL-1R, might be involved in the response to this pathogen. Among these, the AIM2 highlights as a cytosolic DNA sensor, which, after its activation, promotes the secretion of proinflammatory cytokines and pyroptosis. On this context, we demonstrated that AIM2 promotes the in vitro control of L. amazonensis in macrophages, and that these cells require this DNA sensor for the IL-1? secretion, NOS2 expression and NO production. In addition, we also observed that AIM2 promotes the in vivo resistance to L. amazonensis infection, contributing for the development of a Th1 response. Finally, we also demonstrated that AIM2 acts on the production of IL-1? and IL-1?, by dendritic cells, as well as on the CD86 and CD40 expression and IL-12 secretion by these cells. Therefore, in this work, we showed that the AIM2, leading to the activation of innate and adaptive immune cells, promotes the direct or indirect control of L. amazonensis infection.

Orientador: Selma Giorgio / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T12:41:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cyrino_LarissaTavares_M.pdf: 2371187 bytes, checksum: 4a8ffd61bdea2150bc5ecd919622747a (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A autofagia é o principal mecanismo celular de degradação de proteínas e organelas citoplasmáticas. Este processo biológico vem sendo considerado importante no combate aos microrganismos durante processos infecciosos, eliminando-os e ativando respostas imunes inatas e adaptativas. A leishmaniose é um grupo de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania, que parasitam macrófagos e células dendríticas e é responsável pelo aparecimento de lesões cutâneas simples, lesões mucosas e leishmaniose visceral. O conhecimento dos fatores do hospedeiro e das espécies de Leishmania que influenciam a patogênese dos vários tipos de leishmaniose é limitado e pouco se sabe sobre o papel da autofagia nesta doença. O objetivo geral deste trabalho foi avaliar o processo autofágico durante a infecção de macrófagos com L. amazonensis. O monitoramento da autofagia por western blotting (detecção de LC3, proteína marcadora de autofagia), por microscopia eletrônica de transmissão, e pela detecção de atividade lisossomal (LysoTracker® Red) indicou que a infecção causada por L. amazonensis induz autofagia tanto em macrófagos de linhagem tumoral quanto em macrófagos primários de camundongos de diferentes linhagens. Nossos dados também indicam que o aumento do índice de infecção está relacionado ao aumento da autofagia nesses macrófagos e que a indução de autofagia por starvation (inanição) aumenta a porcentagem de infecção com L. amazonensis em macrófagos derivados de medula óssea de camundongos BALB/c. Por outro lado, a indução de autofagia não altera o índice de infecção de macrófagos derivados de medula óssea de camundongos C57BL/6, indicando que a linhagem de camundongos de origem dos macrófagos interfere no desfecho da infecção. Juntos, nossos resultados indicam que a autofagia apresenta um papel importante na infecção causada por L. amazonensis e abre novas perspectivas para o estudo desse processo biológico durante a infecção causada por outras espécies de Leishmania / Abstract: Autophagy is the primary mechanism of degradation of cellular proteins and organelles. This biological process has been considered important in fighting microorganisms during the infectious processes, eliminating them and activating innate and adaptive immune responses. Leishmaniasis is a group of diseases caused by protozoa of the genus Leishmania, which parasitize macrophages and dendritic cells, and it is responsible for the appearance of simple skin lesions, mucosal and visceral leishmaniasis, The knowledge of host factors and the Leishmania species that influence the pathogenesis of many types of leishmaniasis is limited and little is known about the role of autophagy in this disease. The general aim of this study was to evaluate the autophagic process during infection of macrophages with L. amazonensis. The monitoring of autophagy by western blotting (to detect LC3, a protein marker of autophagy), by Transmission Electron Microscopy, and by lysosomal activity detection (by using Lysotracker® Red) indicated that the infection caused by L. amazonensis induces autophagy in both tumor macrophage lineage and in primary macrophages from mice of different strains. Our data also indicate that the increase in the rate of infection is related to the increase of autophagy in these macrophages and that induction of autophagy by starvation increases the percentage of bone marrow-derived macrophages from BALB / c mice with L. amazonensis after three days of culture. On the other hand, the induction of autophagy does not change the infection rate of bone marrow -derived macrophages from C57BL / 6 mice, indicating that the mice strain interfere in the outcome of infection of macrophages. Together, our results indicate that autophagy has an important role in infection caused by L. amazonensis and creates new perspectives to the study of this biological processes during infection caused by other species of Leishmania / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-11-06T18:32:25Z No. of bitstreams: 1 Natalia Machado Tavares Avaliação dos mecanismos de controle da infecção...pdf: 5207322 bytes, checksum: 2d216124e5d301463a0d412a4be8ca4f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-06T18:32:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Natalia Machado Tavares Avaliação dos mecanismos de controle da infecção...pdf: 5207322 bytes, checksum: 2d216124e5d301463a0d412a4be8ca4f (MD5) Previous issue date: 2013 / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina da Bahia. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / As Leishmanioses compõem um complexo de doenças causadas pelo parasito protozoário do gênero Leishmania. Os neutrófilos são rapidamente recrutados para o local da infecção, capturando parasitos na pele, e são a principal fonte de leucotrieno B4(LTB4), um mediador lipídico pró- nflamatório. Porém, o papel do LTB4 no controle da infecção por Leishmania amazonensis em neutrófilos humanos tem sido pouco investigado. Neste estudo, foi demonstrado que L. amazonensis ou seu lipofosfoglicano (LPG) induziram ativação dos neutrófilos com liberação dos conteúdos granulares e produção de LTB4. Observamos também que este mediador lipídico está envolvido na eliminação de Leishmania dentro do neutrófilo por regular a degranulação e produção de radicais livres de oxigênio (ROS). A infecção por L. amazonensis também induziu um rápido aumento na expressão de TLR2 e TLR4. Porém, apenas TLR2 é internalizado após 3horas e sua expressão é parcialmente dependente de LTB4. Zileuton, o inibidor farmacológico da 5-lipoxigenase (5-­‐LO), e portanto, inibidor da produção de LTB4, reduziu a capacidade leishmanicida e fagocitose dos neutrófilos. Também demonstramos que NFkB é a principal cascata de sinalização responsável pelo mecanismo leishmanicida induzido por LTB4. Tais mecanismos induzidos por LTB4 são, provavelmente, mediados pelo seu receptor endógeno, PPARα. Estes achados revelam o papel essencial do LTB4 na regulação da fagocitose de L.amazonensis por neutrófilos humanos pela internalização de TLR2. Esta via leva à eliminação da L. amazonensis por mecanismos dependentes de LTB4. / Leishmaniasis is a complex of diseases caused by a protozoan parasite from the Leishmania genus. Neutrophils are rapidly recruited to the site of Leishmania infection and play an active role by capturing parasites in the skin. They are known as the main source of leukotriene B 4 (LTB4), a potent pro-­‐inflammatory lipid mediator. However, the role of LTB4 in the control of Leishmania amazonensis infection by human neutrophils has not yet been investigated. In this study, we demonstrated that L. amazonensis or its lipophosphoglycan (LPG) induced neutrophil activation with release of granules content and LTB4 production. We found that this lipid mediator is involved in Leishmania killing inside the neutrophil through the regulation of enzymes granules release and ROS production. L. amazonensis infection also induced a rapid increase of TLR2 and TLR4 expression. However, only TLR2 is internalized at later time point and its expression is partially LTB4-­‐dependent. Zileuton, the pharmacological inhibitor of 5-­‐lipoxigenase (5-­‐LO) and therefore, inhibitor of LTB4 production, decreased killing ability and phagocytosis in L. amazonensis-­‐infected neutrophil. We confirmed that NFkB is the main signaling cascade responsible for the leishmanicidal mechanism induced by LTB4. These effectors mechanisms triggered by LTB4 are probably mediated through its endogenous receptor, PPARα. Our findings reveal the essential role of LTB4 in regulating L. amazonensis phagocytosis by human neutrophils through TLR2 internalization. This pathway leads to L. amazonensis elimination also by LTB4-­‐ dependent mechanisms.

Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-13T22:26:00Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_InfluênciaManutençãoLeishmania.PDF: 347399 bytes, checksum: 25dc8ca820f87dc97fb24a9b64724315 (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-15T16:03:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_InfluênciaManutençãoLeishmania.PDF: 347399 bytes, checksum: 25dc8ca820f87dc97fb24a9b64724315 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-15T16:03:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_InfluênciaManutençãoLeishmania.PDF: 347399 bytes, checksum: 25dc8ca820f87dc97fb24a9b64724315 (MD5) Previous issue date: 2008 / Parasitos pertencentes ao gênero Leishmania quando são mantidos em cultura por passagens sucessivas apresentam redução na infecciosidade. As cepas infectantes dos parasitos possuem maior atividade ecto-nucleotidásica do que as não infectantes. Para avaliar a existência de correlação entre o tempo de manutenção em cultura, a infecciosidade e a hidrólise de nucleotídeos em Leishmania amazonensis o parasito citado foi mantido em cultura por passagens sucessivas. Os parasitos mantidos em cultura por poucas passagens (p<15) apresentaram maior hidrólise dos nucleotídeos ATP, ADP e AMP e maior porcentagem de formas infectantes quando comparados com aqueles mantidos em cultura por várias passagens (p>100). Para avaliar o curso da infecção causada por passagens diferentes do parasito, os camundongos C57BL/6 foram inoculados na pata com formas promastigotas totais ou metacíclicas. O curso da infecção foi acompanhado por um período de oito semanas. Os camundongos inoculados com os parasitos mantidos em cultura por poucas passagens desenvolveram lesões maiores e produziram IFN- em menor quantidade quando comparados com o grupo de animais que recebeu o inóculo dos parasitos mantidos em cultura por várias passagens. Não foi verificada a produção de IL-4. O re-isolamento de parasitos, dos animais inoculados com os parasitos mantidos em cultura por várias passagens, mostra que apenas uma passagem pelo hospedeiro vertebrado não alterou a atividade ecto-nucleotidásica. O observado indica que a manutenção dos parasitos em cultura pode selecionar aqueles que apresentam reduzida atividade ecto-nucleotidásica. O tratamento dos parasitos mantidos em cultura por poucas passagens com adenosina causou alteração no metabolismo de nucleotídeos e na infecciosidade dos mesmos. Os dados sugerem a existência de correlação entre o tempo de manutenção em cultura, a infecciosidade e a atividade ecto-nucleotidásica em L. amazonensis. _______________________________________________________________________________ / ABSTRACT: It is usually accepted that maintenance of Leishmania parasites in culture leads to a decrease in the parasite’s ability to cause infection in the vertebrate host. Previous work from our laboratory suggests that the infectivity of different Leishmania species correlates with the level of ecto-nucleotidasic activity. Studies from other laboratories, also demonstrated that no infectivity strains of Leishmania amazonensis have decreased apirasic activity. Based on these evidences, the present study evaluated the correlation between the maintenance of L. amazonensis in culture for several passages (>100), the ecto-nucleotidasic activity, its infectivity and the immune response induced by the infection in C57BL/6 mice. Our results show that long term culture of L. amazonensis not only leads to decreased metacyclogenesis but, more importantly, that these parasites present reduced ecto-nucleotidasic activity. This decreased infectivity is associated with a decrease in IFN-g production by lymph node and spleen cells. Furthermore, re-isolation of long term cultured parasites from lesions of infected mice did not recover the level of ectonucleotidasic activity. Finally, we show that treatment of L. amazonensis promastigote cultures with adenosine leads to a decreased ability to hydrolyze extracellular ATP and ADP and that infection by these parasites resulted in decreased lesion development. Our results reinforce the hypothesis that infectivity by Leishmania parasites is, at least, partially dependent on the activity of ecto-nucleotidases.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-12T14:41:00Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Carina Helena da Silva.pdf: 1754766 bytes, checksum: 65f8ac225735636a23fd7d8a68633a7a (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T14:41:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Carina Helena da Silva.pdf: 1754766 bytes, checksum: 65f8ac225735636a23fd7d8a68633a7a (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / CAPES / As leishmanioses são doenças endêmicas que constituem sérios problemas de saúde pública podendo levar a uma extensa mortalidade e morbidade. São classificadas em leishmanioses tegumentar (LT), e visceral (LV),provocadas por protozoários do gênero Leishmania e no Brasil as principais espécies envolvidas em sua propagação são a Leishmania amazonensis e a Leishmania chagasi para LT e LV respectivamente. Antimoniais pentavalentes são as drogas de primeira escolha, no entanto a recidiva devido à resistência dos parasitas, e os efeitos colaterais, ocasionadospela elevada toxicidade destes medicamentos tem revelado a necessidade da busca pelo tratamento adequado das leishmanioses. Cramoll 1,4, uma lectina extraída das sementes de Cratylia mollis, uma planta forrageira da família das Leguminoseae encontrada no sertão do Nordeste brasileiro, em estudos anteriores tem demonstrado o seu perfil biotecnológico, como propriedades antimicrobiana, antitumoral e antiparasitária. Diante das importantes aplicações biológicas de Cramoll 1,4 a presente pesquisa teve por objetivo analisar os mecanismos de ação desta lectina sobre L. amazonensis e L.chagasi. Os seguintes testes foram realizados: Atividade leishmanicida, análise da citotoxidade, produção de Óxido Nítrico e análise em microscopia eletrônica de transmissão. A atividade leishmanicidada de Cramoll 1,4 foi determinada através da IC50, que revelou a grande efetividade da lectina para as formas promastigotas das duas espécies de Leishmania. Cramoll 1,4 não apresentou citotoxidade frente às células de mamíferos, possuindo alto grau de seletividade para os promastigotas. A lectina induziu a síntese de Óxido Nítrico (molécula importantíssima para a resposta imunológica às infecções causadas por Leishmanias) por macrófagos, mostrando seu perfil imunomodulatório. A análise por microscopia eletrônica de transmissão revelou alterações severas causadas nos parasitas após tratamentos com Cramoll 1,4, como mudanças na morfologia, surgimento de vacúolos e desintegração das membranas celular e nuclear. Estas alterações são compatíveis com a perda de viabilidade e morte celular. Nossos resultados sugerem a Lectina Cramoll 1,4 como agente promissor no desenvolvimento de novo fármaco para o tratamento das leishmanioses visceral e tegumentar.

Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T16:01:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandez_MaribelFernandez_D.pdf: 2528780 bytes, checksum: f2c8b7a6e63a773b6160e0d483156743 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Os terminais dos cromossomos de Leishmania (Leishmania) amazonensis contêm repetições teloméricas mantidas pela enzima telomerase da seqüência 5'-TTAGGG-3', a qual é conservada também em outros tripanosomatídeos e outros eucariotos. Utilizando-se frações protéicas purificadas a partir de extratos S100 e nuclear, foi possível se detectar atividade de telomerase e três complexos proteína-DNA que se associam in vitro com seqüências teloméricas ricas em G do parasita. A atividade de telomerase de L. (L.) amazonensis foi detectada por ensaio TRAP ("Telomeric Repeat Amplification Protocol") e apresenta características comuns às telomerases já descritas em outros tripanosomatídeos. Os complexos proteína-DNA foram identificados por EMSA ("Electrophoretic Mobility Shift Assays") e ensaios de "UV cross-linking" e denominados LaGT1-3 (Leishmania amazonensis G-strand telomeric protein 1-3). Eles não são formados: i) com DNA telomérico na forma de dupla fita e com fita rica em C, ii) em experimentos de competição específica usando oligonucleotídeos de seqüências de DNA telomérico, ou iii) após o tratamento enzimático com proteinase K. LaGT1 foi o complexo mais específico, o qual é formado com todas as seqüências de DNA telomérico (Tel1-6, Tel30 e Tel36) e não se associa à seqüência telomérica de Tetrahymena. As proteínas que formam os três complexos associam-se com uma seqüência de RNA telomérico rica em G e um complexo similar a LaGT1 é formado com DNA telomérico na forma de dupla fita contendo uma projeção 3' simples fita terminal. A estimativa das constantes de dissociação (Kd) do complexo LaGT1 associado a seqüência telomérica na forma de DNA e dos complexos LaGT2 e LaGT3 associados a seqüências teloméricas na forma de DNA ou RNA, demonstra que estes se encontram na ordem de nM, característica comum a proteínas que ligam DNA na forma de simples fita. Os componentes protéicos dos complexos LaGT2 e LaGT3 foram purificados por cromatografia de afinidade e identificados após renaturação, como bandas de ~35 kDa e ~52 kDa, respectivamente. O componente protéico de < 15 kDa de LaGT1 foi purificado em gel como um complexo irradiado com luz UV de ~18-20 kDa. Os componentes protéicos de LaGT2 e LaGT3 e o complexo irradiado LaGT1 foram digeridos em gel com tripsina e os peptídeos trípticos resultantes foram analisados por espectrometria de massa utilizando-se as técnicas: "Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight" (MALDI-TOF) e "Liquid Chromatography Electrospray Ionization tandem Mass Spectrometry" (LC/ESIMS/MS), a análise dos espectros demonstrou que o componente protéico de ~35 kDa de LaGT2 é homólogo da proteína Rbp38 de Leishmania spp. enquanto, o componente protéico de ~52 kDa de LaGT3 é similar à subunidade 1 da proteína de replicação A (Rpa-1) de Leishmania spp. O componente protéico de < 15 kDa de LaGT1 provavelmente uma proteína de L. (L.) amazonensis que ainda não foi identificada. A identificação das proteínas por espectrometria de massa, possibilitou a clonagem dos genes que codificam às mesmas. Neste trabalho apresentamos a caracterização parcial do gene que codifica o componente protéico do complexo LaGT3: subunidade 1 da proteína de replicação A de L. (L.) amazonensis (LaRpa-1). A análise da sua organização genômica demonstrou que o mesmo encontra-se provavelmente em baixo número de cópias ou em cópia única no genoma do parasita e que ele se localiza em uma banda cromossômica de ~0,8 Mb. Foi realizada também a análise conformacional parcial da interação entre a proteína nativa renaturada LaRpa-1 e o DNA telomérico rico em G de L. (L.) amazonensis (oligonucleotídeo Tel6) por espectroscopia de fluorescência mostrando-se um aumento da intensidade da fluorescência quando ocorre essa interação / Abstract: The chromosomal ends of Leishmania (Leishmania) amazonensis contain conserved 5'- TTAGGG-3' telomeric repeats, that are maintained by telomerase. Using Telomeric Repeat Amplification Protocol (TR AP) we detected telomerase activity in protein fractions purified from S100 and nuclear extracts. Protein complexes that associate in vitro with telomeric DNA sequences, LaGT1-3 (Leishmania amazonensis G-strand telomeric protein), were identified and characterized by electrophoretic mobility shift assays (EMSA) and UV cross-linking using protein fractions purified from S100 and nuclear extracts. The three complexes did not form i) with double strand DNA (dsDNA) and the C-rich telomeric strand, ii) in competition assays using specific telomeric DNA oligonucleotides, or iii) after pre-treatment with proteinase K. LaGT1 was the most specific, it is formed with all DNA telomeric sequences (Tel1-6, Tel30 and Tel36) and did not bind a Tetrahymena telomeric sequence. All three LaGTs associated with an RNA sequence cognate to the telomeric G-rich strand and a complex similar to LaGT1 is formed with a dsDNA bearing a 3' G-overhang tail. The dissociation constants (Kd) for LaGT1 complexed with telomeric DNA sequence, and for LaGT2-3 complexed with telomeric DNA and RNA sequences were in the nM range. The protein components of LaGT2 and LaGT3 were purified by affinity chromatography and identified, after renaturation, as ~35 kDa and ~52 kDa bands, respectively. The < 15 kDa protein component of LaGT1 was gel-purified as a UV crosslinked complex of ~18-20 kDa. LaGT2 and LaGT3 protein bands and the irradiated LaGT1 complex were digested by trypsin and the resulting peptides were analysed by mass espectrometry techniques: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF) and by Liquid Chromatography Electrospray Ionization tandem Mass Spectrometry (LC/ESI-MS/MS). The fingerprint analysis showed that the ~35 kDa protein component of LaGT2 was homologous to the Leishmania spp. Rbp38 protein, whereas the ~52 kDa component of LaGT3 was similar to the putative subunit 1 of replication protein A of Leishmania spp. and the < 15 kDa protein component of LaGT1 was probably a novel Leishmania protein. The gene encoding the protein-forming complexe LaGT3 (LaRpa-1) were cloning and parcially caracterized, the genomic organization analysis of LaRPA-1 gene showed that it is present probably in low copy number or a single copy and was mapped on a chromosome of ~0,8 Mb. The partial conformational analysis of the interaction between nativeLaRpa-1 and the telomeric G-rich DNA (Tel6) was performed using fluorescence spectroscopy, this analysis showed an increase of the fluorescence when the interaction occurs / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular