A leishmaniose é causada por tripanossomatídeos do gênero Leishmania que infectam preferencialmente macrófagos. Vários factores influenciam a forma e a severidade da doença: a espécies de Leishmania e a resposta imune do hospedeiro. Considerando a importância da ativação dos macrófagos na infecção, o potencial papel de CD100 na modulação da ativação dos macrófagos e os nossos dados anteriores de que CD100 solúvel (sCD100) aumenta a infectividade pelo parasita, pretendemos caracterizar os efeitos do CD100 na infecção por Leishmania (L.) amazonensis. Descobrimos que ambos, promastigotas e amastigotas, são mais infecciosos na presença de sCD100 e que o receptor CD72 é o responsável pelo aumento da infecção. Experimentos in vitro indicaram índice de infecção similares entre macrófagos nocautes para CD100 e selvagens, mas curiosamente, os animais nocautes infectados desenvolveram lesões significativamente menores do que os selvagens, sugerindo que sCD100 presente em outras células pode influenciar a formação da lesão. / Leishmaniasis is caused by trypanosomes of the genus Leishmania that preferentially infect macrophages. Several factors influence the form and severity of the disease: the species of Leishmania and the host immune response. Considering the importance of the activation of macrophages in infection, potential role of CD100 in the modulation of macrophage activation and our previous data that CD100 soluble (sCD100) increase the infectivity of the parasite, we intend to characterize the effect of CD100 in infection with Leishmania (L.) amazonensis. We found that both promastigotes and amastigotes, are most infectious in the presence of sCD100 and the CD72 receptor is responsible for the increased infection. In vitro experiments indicated similar infection rate of macrophages to CD100 knockouts and wild type, but interestingly, the infected knockout animals developed significantly smaller lesions than wild type suggesting that sCD100 present in other cells may influence lesion formation.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:15:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009 - Aline Rodrigues Bernardo.pdf: 1109499 bytes, checksum: 4b0f2adb9ceeb43406ffa4f7d20978ba (MD5) Previous issue date: 2009-02-09 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / The production of specific antibody (IgY) in chickens (Gallus gallus domesticus) and its purification from the yolk of the egg is attracting the interest of the scientific community due to the numerous advantages of the IgG of mammals. Low cost, high volume production, recognition proteins highly conserved in mammals, in addition to preventing the suffering and death of animals for experimentation, are the main advantages. The aim of our study was to develop, standardize and deploy the technology IgY for aviaries production of antibodies with aim to obtain IGY-specific forms to promastigotes of Leishmania (Leishmania) amazonensis. Initially, matching was performed by two methods of precipitation and the comparison between them, to obtain the pure IgY from the yolk of egg white obtained in trade. The method of purification employing polietienoglicol (PEG-6000) was able to extract IgY with purity comparable to commercial standard IgY (Sigma) and more than obtained by the method with 25% ammonium sulfate. Later, chickens were inoculated with three doses of inactivated antigen (promastigotes forms of L. amazonensis) mixed with incomplete Freund's adjuvant, at 0, 14 and 21 days, IM route. High yield of total and specific IgY was obtained, as determined by the methods of Bradford and ELISA, respectively. The IgY antibodies showed high specificity (indirect immunofluorescence), sensitivity and avidity (ELISA) for promastigotes forms of L. amazonensis, from the second immunization. The level of IgY-specific antibodies remained high until the end of the analysis, around 56 days. Based on the results we can conclude that the "Technology IgY" allows to obtain antibodies with high specificity and sensitivity, in ethics, can be used successfully in various fields of science. / A produ??o de anticorpo espec?fico (IgY) em galinhas (Gallus gallus domesticus) e sua purifica??o a partir da gema do ovo vem atraindo o interesse da comunidade cient?fica devido as in?meras vantagens sobre os anticorpos IgG de mam?feros. Baixo custo, produ??o em quantidades elevada, reconhecimento de prote?nas altamente conservadas de mam?feros, al?m de se evitar o sofrimento e morte de animais de experimenta??o, s?o as principais vantagens. O objetivo geral de nosso estudo foi desenvolver, padronizar e implantar a Tecnologia IgY para produ??o de anticorpos avi?rios, tendo como meta a obten??o de IgY-espec?fica para formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis. Inicialmente, foi realizada adequa??o de dois m?todos de precipita??o e a compara??o entre eles, visando a obten??o da IgY pura a partir da gema de ovos brancos adquiridos no com?rcio. O m?todo de purifica??o empregando polietienoglicol (PEG-6000) foi capaz de extrair IgY com pureza compar?vel ao padr?o IgY comercial (Sigma) e superior a obtida pelo m?todo com sulfato de am?nio 25%. Posteriormente, galinhas foram inoculadas com tr?s doses de ant?geno inativado (formas promastigotas de L. amazonensis) misturados com adjuvante incompleto de Freund, nos tempos 0, 14 e 21 dias, por via intramuscular. Elevado rendimento da IgY total e espec?fica foi obtido, sendo determinado atrav?s dos m?todos de Bradford e ELISA, respectivamente. Os anticorpos IgY apresentaram elevada especificidade (Imunofluoresc?ncia indireta), sensibilidade e avidez (ELISA) para formas promastigotas de L. amazonensis, a partir da segunda imuniza??o. O n?vel de anticorpos IgY-espec?ficos permaneceu elevado at? o final da an?lise, por volta do 56? dia. Com base nos resultados obtidos podemos concluir que a Tecnologia IgY possibilita a obten??o de anticorpos com alta especificidade e sensibilidade, de forma ?tica, podendo ser utilizada com sucesso em diversos campo da ci?ncia.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / Com o intuito de obter informações sobre a expressão de lipídeos de formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis, parasitas foram analisados durante o crescimento logarítmico e estacionário quanto à composição de glicolipídeos e fosfolipídeos. Em paralelo, dois anticorpos monoclonais (mAbs), denominados LST-1 e LST-2, foram produzidos, caracterizados e utilizados neste estudo. A expressão de fosfolipídeos em promastigotas durante o crescimento logarítmico e estacionário foi analisada por cromatografia em camada delgada de alta resolução (HPTLC). O extrato lipídico total de promastigotas de L. (L.) amazonensis apresenta fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS), fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), Liso-PI e inositol fosforilceramida (IPC), este último caracterizado por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa, contendo esfingosina (d18:1) e ácidos graxos, principalmente ácido esteárico (C18:0) e ácido palmítico (C16:0). Enquanto as proporções molares de IPC, PS, PE, Liso-PI aumentaram com o decorrer do tempo de cultura, as proporções molares de PI e PC diminuíram. O perfil cromatográfico dos glicolipídeos se manteve constante durante o crescimento logarítmico e estacionário. Os mAbs LST-1 e LST-2 foram produzidos contra a fração enriquecida em glicolipídeos e IPC de formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. Os dois anticorpos pertencem a classe IgM. O mAb LST-1, por imunocoloração de placas de HPTLC, reconhece um componente lipídico acídico, eluído da coluna de DEAE-Sephadex com acetato de sódio 0,2 M, que apresenta migração cromatográfica característica de IPC, o qual é resistente à hidrólise alcalina e é corado com reagente de Dittmer-Lester. Já, o mAb LST-2 foi reativo com a fração de glicolipídeos não retida na coluna de DEAE-Sephadex, e visibilizada nas placas de HPTLC com orcinol/H2SO4. Por IFI, os dois mAbs mostraram alta reatividade com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. O tratamento dos parasitas com isopropranol:hexano:água (IPA:Hex:água) (55:20:25; v/v/v) aboliu a reatividade, indicando que os antígenos reconhecidos pelos mAbs estão presentes somente na fração lipídica. LST-1 não foi reativo com parasitas vivos, sugerindo que o IPC está críptico na membrana, sendo talvez expresso somente no folheto interno da membrana plasmática. Já, o mAb LST-2 apresentou forte reatividade com promastigotas vivos, aglutinando-os, indicando que os glicolipídeos reconhecidos por LST-2 encontram-se na superfície do parasita. Por imunofluorescência indireta com LST-1 e LST-2 verificou-se que amastigotas isoladas de lesão não são reconhecidos pelos mAbs, e por outro lado, forte fluorescência foi detectada com amastigotas axênicos. Por cromatografia em placas de HPTLC, de extratos lipídicos purificados de amastigotas, verificou-se que os amastigotas isolados de lesão de animais infectados por L. (L.) amazonensis, apresentam diferentes perfis cromatográficos de glicolipídeos e fosfolipídeos em relação aos promastigotas e aos amastigotas axênicos. Enquanto os amastigotas isolados de lesão são ricos em glicoesfingolipídeos, os amastigotas axênicos e promastigotas apresentam glicoinositolfosfolipídeos (GIPLs) reconhecidos pelo mAb LST- 2 e IPC reconhecido pelo mAb LST-1. O mAb LST-1 apresentou reatividade com formas promastigotas de todas as espécies de Leishmania analisadas, e também com formas epimastigotas de T. cruzi. Nestes parasitas, foi observado que LST-1 reconhece especificamente IPC, sendo o resíduo de inositol e a ceramida essenciais para a reatividade do mAb LST-1. Já, o mAb LST-2, por imunofluorescência indireta, apresentou forte marcação somente com formas promastigotas ou amastigotas axênicos de L. (L.) amazonenis, reconhecendo 4 componentes glicolipídicos denominados bandas a, b, c, e d, que correspondem a GIPLs. A porção carboidrato é fundamental para a reatividade do mAb LST-2. Analisando-se macrófagos infectados com promastigotas de L. (L.) amazonensis, verificou-se por imunofluorescência indireta com o mAb LST-2, que os promastigotas durante a adesão/infecção de macrófagos, secretam ou transferem para os macrófagos os antígenos glicolipídicos, reconhecidos pelo mAb LST-2. Forte fluorescência na superfície de macrófagos infectados é observada já na primeira hora de infecção, e com o decorrer da infecção (até 4 horas) observa-se, somente nos macrófagos infectados, pequenas vesículas fluorescentes, que não correspondem a fagossomos contendo os parasitas. Assim, nesta tese, foi demonstrado que amastigotas isolados de lesão em relação a amastigotas axênicas e promastigotas de L. (L.) amazonensis apresentam padrões distintos de glico(fosfolipídeos). Enquanto amastigotas isoladas de lesão expressam GSLs, amastigotas axênicas e promastigotas expressam IPC e GIPLs, sendo que estes últimos sendo liberados pelo promastigota durante a infecção de macrófagos. / In order to obtain information about the lipid expression of promastigote forms of Leishmania (Leishmania) amazonensis, the parasites lipid composition profile was analyzed during log and stationary phase. Two monoclonal antibodies (mAb) termed LST-1 and LST-2 were produced, characterized and used in this study. Promastigote phospholipid expression on log and stationary growth phases were analyzed by high performance thin layer chromatography (HPTLC). At either phase the total lipid extract of L. (L.) amazonensis promastigotes presents phosphatidylinostol (PI), phosphatidylserine (PS), phosphatidylcholine (PC) phosphatidylethanolamine (PE), Lyso- PI and inositol phosphorylceramide (IPC). IPC was characterized by GC/MS, and it was detected sphingosine (d18:1) and fatty acids, mainly palmitic acid (C16:0), and stearic acid (C18:0). It was noted that the molar proportions of IPC, PS, PE and Lyso-PI increased during the culture time, while the percentage of PI and PC decreased. Unlikely, the glycolipid chromatographic profile did not change during the promastigotes growth at log and stationary phases. The mAbs LST-1 and LST-2 were produced against a glycolipid and IPC enriched fraction purified from promastigote forms of L. (L.) amazonensis. Both antibodies are IgM. By HPTLC immunostaining it was demonstrated that mAb LST-1 recognized an acidic lipid component, eluted with 0.2 M of sodium acetate from DEAE-Sephadex column. The LST-1 reactive component presents: i) chromatographic migration characteristic of IPC, ii) is resistant to alkaline hydrolysis; iii) is stained with Dittmer-Lester reagent. On the other hand, the mAb LST-2 was reactive with the glycolipid fraction not retained in DEAE-Sephadex column, and this fraction was visualized on HPTLC by primuline and orcinol/H2SO4 staining. By indirect immunofluorescence, both antibodies showed high reactivity with L. (L.) amazonensis promastigotes. Parasites delipidation with isopropanol:hexane:water (55:20:25; v/v/v), abolished the mAbs reactivity, indicating that the antigens recognized by LST-1 and LST-2 are present exclusively in the lipid fraction. MAb LST-1 did not react with non-fixed parasites, suggesting that IPC is cryptic in the membrane, and maybe localized only in the inner leaf of plasma membrane. Contrasting, mAb LST-2, showed a strong reactivity with live L. (L.) amazonensis promastigotes, also parasite agglutination was observed, indicating that the glycolipids recognized by LST-2 are in parasite surface. By indirect immunofluorescence with LST-1 and LST-2 no reactivity was observed with amastigotes isolated from L. (L.) amazonensis infected hamsters, conversely axenic amastigotes showed a strong fluorescence with both mAbs. By HPTLC it was verified that the lipid fractions of promastigotes, axenic amastigotes and amastigotes isolated from footpad lesions, presented distinct glycolipids and phospholipids profiles. Amastigotes isolated from lesions are rich in glycosphingolipids, whereas axenic amastigotes and promastigotes present glycoinositolphospholipids (GIPLs) recognized by LST-2, and IPC recognized by mAb LST-1. The LST-1 antibody recognized promastigotes from all species of analyzed, and also T. cruzi epimastigotes. It was determined that LST-1 recognizes specifically IPC in these parasites, and it was established that the inositol residue and the ceramide are essential for LST-1 reactivity. By indirect immunofluorescence with mAb LST-2 a strong labeling of only L. (L.) amazonensis promastigotes and axenic amastigotes was observed. LST-2 recognizes 4 glycolipid components termed a, b, c and d, which correspond to GIPLs. It was demonstrated that the carbohydrate moiety is fundamental for LST-2 reactivity. L. (L.) amazonensis promastigotes infected macrophages showed by indirect immunofluorescence, that promastigotes during the macrophage adhesion/infection, secrete or transfer GIPLs recognized by mAb LST-2 to the macrophage. Strong fluorescence in infected macrophage was observed in the first hours of infection. During the next hours of infection (up to 4 hours) also small fluorescent vesicles were observed in the infected macrophages, which did not correspond to phagossomes containing parasites. Thus, these studies describe distinct (glyco)phospholipid profile in lesion amastigotes, axenic amastigotes and promastigotes, and GIPLs vesicles formation during macrophage infection by promastigotes. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-11-19T18:30:11Z No. of bitstreams: 1 karen_s_charret_ioc_bp_0055_2011.pdf: 28875915 bytes, checksum: 38bf86603dba71d83a48b9e25560c47f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-19T18:30:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 karen_s_charret_ioc_bp_0055_2011.pdf: 28875915 bytes, checksum: 38bf86603dba71d83a48b9e25560c47f (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / Atualmente, não há vacina eficaz e o controle das leishmanioses depende principalmente da quimioterapia. Recentemente, novos compostos sintéticos os derivados carbohidrazidas pirazolocas apresentaram atividade em Leishmania amazonensis in vitro e quando testadas em modelo experimental murino de infecção de L. amazonensis mostraram eum efeito um efeito terapêutico significativo. Um estudo com compostos intermediários da síntesedas carbohidrazidas poderia ser interessante, pois estes possuem uma potencial atividade leishmanicida e ajudaria a cmpreender os mecanismos de ação dos compostos finais. Por outro lado, é necessário conhcer o comportamento do sistema imune frente a estes compostos na infecção por leishmaniose.Os compostos precursores naão foram ativos em formas promastigotas de L. amazonensis. No entanto, todos os compostos apresentaram atividade sobre formas de amastigotas e sem citotoxicidade em célula de mamíferos. Aqui, foi sugerida a contribuição farmacofórica do anel N-heteroaromático para a atividade leishmanicida e do grupamento hidrazina para o composto intermediário. Além disso, foi mostrado que todos os componentes podem induzir um aumento da produção de óxido nitrico em macrófagos estimulados ou não. Em camundongos CBA infectados com L amazonensis e tratados por via oral com os derivados carbohidrazidas, o estudo histopatológico rervelou que mudanças na derme foram correlacionadas com o tamanho macroscópico da lesão. Camundongos CBA infectados e tratados tinham lesões cutâneas menores, e as estruturas da epiderme e derme tinham níveis mais baixos de infiltrtado inflamatório, comparadas com as de camundongos controles infectados e não tratados. Também foi observado um infiltrado inflamatório misto contendo linfócitos e neutrófilos. Além disso, expressão de IL-4 RNAm foi menor no grupo tratado.. Um aumento dos níveis de anticorpos das subclasses específicas anti-Leishmania IgG2a e IgG3 foi observado nos grupos tratados com as pirozol carbohidrazidas exercem efeitos terapêuticos significativos, podendo agir diretamente sobre o parasito e/ou sobre as células dos sistemas imune do hospedeiro.. / Currently, there is no effective vaccine and control of leishmanioses depends mainly on the chemotherapy. Recently, new synthetic carbohidrazidas derivatives pirazolocas compounds showed activity on Leishmania amazonensis when tested in vitro and in experimental murine model of infection of l. amazonensis showed a significant therapeutic effect effect. A study of intermediate compounds síntesedas carbohidrazidas could be interesting, as these have a potential activity leishmanicida and help cmpreender the mechanisms of action of compounds. On the other hand, it is necessary to know the behavior of the immune system against these compounds in leishmaniasis infection.The precursor compounds are active in ways does promastigotas of l. amazonensis. However, all compounds showed activity on amastigote forms and without cytotoxicity in mammalian cell. Here, it was suggested the contribution farmacofórica of the ring N-heteroaromatic compound for leishmanicida and activity of hydrazine to the intermediate grouping. In addition, it was shown that all components can induce an increase in nitric oxide production in macrophages stimulated or not. In CBA mice infected with l. amazonensis and treated orally with carbohidrazidas derivatives, the histopathologic study rervelou that changes in the DermIS were correlated with the macroscopic size of the lesion. CBA mice infected and treated tin

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T19:58:00Z No. of bitstreams: 1 Eduardo_regis_tese_doutorado_FINAL_total.pdf: 9624685 bytes, checksum: ea18ab165120397862060c5181e22f91 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T19:58:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Eduardo_regis_tese_doutorado_FINAL_total.pdf: 9624685 bytes, checksum: ea18ab165120397862060c5181e22f91 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os parasitos do gênero Leishmania são protozoários que se replicam em macrófagos após a infecção do hospedeiro vertebrado pelo vetor flebotomíneo. O controle da infecção depende basicamente do desenvolvimento de uma robusta resposta do tipo Th1 específica contra o parasito, e a IL-27 já foi descrita como uma citocina capaz de participar nos estágios inciais do comprometimento para Th1. Nesta tese, investigamos a função direta de IL-27 na interação macrófago/L.amazonensis, e observamos que esta citocina é expressa por macrófagos infectados pela L.amazonensis de maneira depentende de PKR e interferons do tipo I. Curiosamente, pacientes infectados por diversas espécies de Leishmania apresentam níveis menores de IL-27 no soro/plasma quando comparados aos controles. Ainda, a IL-27 promove a replicação de L.amazonensis tanto em macrófagos humanos quanto murinos. Buscando mapear as vias de sinalização envolvidas no aumento parasitário mediado pela IL-27, demonstramos que a IL-27 é capaz de induzir a ativação/fosforilação de PKR em macrófagos, e que o bloqueio desta enzima e até a deleção gênica, anulam o crescimento intracelular da Leishmania promovido pela IL-27. Ainda, demonstramos que a indução de IL-10 pela IL-27 é fortemente regulada pela PKR. Bloqueamos o receptor de IL-10 na superfície de macrófagos infectados pela Leishmania e observamos que esta citocina é a mediadora do aumento de L.amazonensis promovido pela IL-27. Finalmente, como IL-27 diminui a replicação do HIV-1, nós analisamos o papel desta citocina na co-infecção HIV-1/Leishmania através da exposição de macrófagos albergando estes patógenos à IL-27. Nós encontramos que esta interleucina não parece modular o crescimento parasitário neste modelo. Em conclusão, demonstramos que a IL-27 é um fator indutor do crescimento de L.amazonensis em macrófagos e parece contribuir significativamente na biologia deste parasito. / Leishmania is a protozoan parasite that replicates within macrophages after vertebrate infection by the sandfly vector. The infection control basically depends on the robust development of a specific Th1 response against the parasite, and Interleukin (IL)- 27 has been described as a cytokine able to participate in the early steps of Th1 commitment. Here, we addressed the function of IL-27 on the interplay between macrophages and L. amazonensis, and we observed that this cytokine is expressed by macrohpages infected by L.amazonensis and that expression is dependent on PKR and type I interferons. Curiously, patients harboring a variety of Leishmania species present lower levels of IL-27 in plasma/serum when compared to healthy individuals.Trying to map the signaling pathway involved in the IL-27-mediated Leishmania growth enhancement, we demonstrated that IL-27 is able to induce Protein Kinase R (PKR) activation/phosphorilation in macrophages, and that enzyme blockage, or even gene deletion, abrogates the intracellular Leishmania enhancement driven by IL-27. In addition, we showed that IL-10-induction by IL-27 is strongly regulated by PKR. We blocked IL-10 receptor on the surface of Leishmania-infected macrophages and we described that IL-10 is the critical mediator of IL-27-mediated L. amazonensis augmentation. To finish, IL-27 is known to diminish HIV-1 replication, thus, in order to investigate the role of this cytokine in HIV-1/Leishmania co-infection, we exposed macrophages harboring both pathogens to IL-27 and found that this interleukin does not seem to modulate parasite growth in this model. In conclusion, we found that IL-27 is an inducer of L.amazonensis growth inside macrophages and contributes with this parasite biology.

Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:53:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SiqueiraNeto_JairLagede_D.pdf: 2960762 bytes, checksum: 91f4b8aed472a4d4c93cf040e8c534e7 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A leishmaniose é uma parasitose humana emergente e ainda não controlada, causada por protozoários pertencentes ao gênero Leishmania. Atualmente, a doença atinge mais de 12 milhões de pessoas, não existindo ainda métodos eficientes para seu controle e erradicação. Por estas razões a Organização Mundial da Saúde classifica a leishmaniose como doença de categoria I e incentiva o desenvolvimento de novos métodos para controlar a doença para buscar novos alvos para drogas contra parasita. No presente trabalho, estudou-se as proteínas LaRBP38 e LaRPA-1 previamente identificadas por se associarem in vitro com a simples-fita telomérica rica em ¿G¿ de L. amazonensis. Os telomeros são extremidades físicas dos cromossomos de eucariotos, formados por complexos nucleoproteicos. São responsáveis por conferir estabilidade aos cromossomos, envitando a degradação pela maquina de reparo celular e a fusão entre extremidades cromossomais. Instabilidades no telômero causam normalmente danos irreparáveis à célula podendo levar à senescência e morte celular. As proteínas que se mantém complexadas ao telômero são responsáveis por mantê-lo funcioal. Cada proteína desempenha um papel importante, seja na proteção, processo replicativo ou manutenção da estabilidade estrutural do telômero, sendo portanto, alvos potenciais para o desenvolvimento de terapias antiparasitárias. A proteína RPA é conservada em toda escala evolutiva e cumpre importantes papéis nas maquinarias de replicação, recombinação e reparo do DNA genômico ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Leishmaniasis is an emerging and non-controlled human disease, caused by protozoan belonging to the Leishmania genera. More than 12 million people are infected and there are no efficient methods for the controlling or eradication of the disease. For those reasons, the World Health Organization classifies leishmaniasis as category I disease and encourages the development of new methods to control the disease and to find new targets for drugs against the parasite. In the present work, we studied the proteins LaRBP38 and LaRPA-1, prior identifield by in vitro assays as proteins that associates with the Leishmania amazonensis G-rich single-stranded telomeric DNA. Telomeres are the physical ends of eukaryote chromosomes formed by proteins and DNA complexes. They are responsible for the chromosome stability, avoiding degradation by the rapair machinery end-to-end fusion. Telomere instability may cause irreversible damage in the cell, leading to senescence and cell death. The proteins that interact with the telomeres are responsible for the functional dynamics of theses structures. Each protein has an important role in the protection, replication process or in the stability maintenance. Therefore, telomeric protein could be considered good targets for the development of new therapies. RPA is an evolutionary conserved protein and plays important roles in replication, recombination and repair machineries. At the telomeres, RPA recruits telomerase, the protein responsible for telomeric elengation ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Parasitos do gênero Leishmania causam um espectro de doenças chamadas de leishmaniose. Para compreender de melhor forma a imunobiologia da Leishmania, o estudo de outras células envolvidas no processo de infecção do parasito se torna importante. As células B-1 são encontradas principalmente nas cavidades peritoneal e pleural, tendo como característica a capacidade de se diferenciar em células fagocíticas. Este trabalho teve como objetivo avaliar o papel das células B-1 na infecção por L. (L.) amazonensis. Os resultados mostraram que, assim como os macrófagos, os B-1CDPs são infectados pelo mecanismo de fagocitose e permitem a multiplicação da Leishmania no seu interior. Além disso, os vacúolos parasitóforos formados nos B-1CDPs apresentaram ser maiores do que dos macrófagos. Portanto, os dados com B1CDPs sugerem que estas células podem possuir um papel relevante na infecção por L. (L.) amazonensis, podendo ser considerados células hospedeiras importantes durante a infecção devido à incapacidade de responder de maneira eficaz para a eliminação dos parasitos. / The genus Leishmania parasites cause a spectrum of diseases called leishmaniasis. To better understand the immunobiology of Leishmania, the study of other cells involved in parasite infection process becomes important. The B-1 cells are found predominantly in the peritoneal and pleural cavities, whose feature consist on an ability to differentiate into phagocytic cells. This study aimed to evaluate the role of B-1 cells in the infection by L. (L.) amazonensis. The results showed that, like macrophages, B-1CDPs are infected by a mechanism of phagocytosis and allow the multiplication of Leishmania within. Furthermore, the parasitophorous vacuoles in the B-1CDPs showed to be larger than those formed in the macrophages. Therefore, B1CDPs can have an important role in infection by L. (L.) amazonensis and can be considered important host cells during infection due to inability to respond effectively to the elimination of parasites.

A capacidade de sobrevivência da Leishmânia no interior de células especializadas na destruição de patógenos deve-se à capacidade do parasito de burlar a propriedade microbicida pela produção de moléculas denominadas fatores de virulência. Dentre as proteínas diferencialmente expressas em um estudo prévio de nosso laboratório, encontramos isoformas da OPB, uma serino peptidase e da CPX, proteína antioxidante. De fato, promastigotas de L. (L.) major deficientes em OPB apresentaram significante redução na infecção e sobrevivência em macrófagos in vitro e lesões de evolução mais lenta no modelo murino de infecção na pata. De forma análoga, promastigotas de L. (L.) donovani superexpressoras de CPX apresentaram maior carga parasitária em macrófagos in vitro. Considerando essas informações e a importância da L. (L.) amazonensis na epidemiologia da leishmaniose no Brasil, nosso objetivo é analisar a importância da OPB e CPX na virulência desta espécie utilizando parasitas superexpressores e proteínas solúveis em modelos murinos de infecção in vitro e in vivo. / The survivability of Leishmania within specialized cells in the destruction of pathogens due to the parasite\'s ability to circumvent the microbicidal property for the production of molecules called virulence factors. Among the proteins differentially expressed in a previous study from our laboratory, we found isoforms of OPB, a peptidase serine and CPX, antioxidant protein. Indeed, promastigotes of L. (L.) Major disabled in OPB showed a significant reduction in infection and survival in macrophages in vitro and slower evolution of lesions in a murine model of infection in the leg. Similarly, promastigotes of L. (L.) Donovani overexpressors CPX showed higher parasite load in macrophages in vitro. Given this information and the importance of L. (L.) amazonensis in the epidemiology of leishmaniasis in Brazil, our goal is to analyze the importance of OPB and CPX virulence of this species using overexpressors parasites and soluble proteins in murine models of infection in vitro and in alive.

As leishmanias são parasitas intracelulares obrigatórios que utilizam fagócitos (em especial os macrófagos), para sua sobrevivência e propagação. Estes parasitas são interiorizados via interação com diversos receptores da superfície celular, como o receptor CR3 (MAC-1; CD18/CD11b), componente da família das 2-integrinas. As B2-integrinas são importantes em diferentes mecanismos imunológicos, como a adesão e migração de células, fagocitose e modulação de vias de sinalização intracelulares. Estudos demonstram que a molécula CD18 (constituinte de todas as B2-integrinas) está envolvida na resposta imune na leishmaniose experimental, mas há controvérsias quanto a sua importância na defesa contra esta infecção. Leucotrienos e prostaglandinas são mediadores lipídicos envolvidos em diversos mecanismos da resposta imune inata e adaptativa. Na leishmaniose, os leucotrienos são considerados cruciais para a defesa do organismo por induzir mecanismos efetores celulares, como fagocitose e atividade microbicida. Por outro lado, as prostaglandinas (em especial PGE2) exercem efeito imunossupressor sobre estes mecanismos, podendo favorecer o desenvolvimento da doença. Entretanto, não há conhecimento sobre a relação entre a expressão das B2-integrinas e a produção destes mediadores lipídicos na leishmaniose e a importância destas moléculas na resposta imune contra esta infecção. Assim, o objetivo desta tese foi investigar o efeito da redução da expressão das B2-integrinas na produção de citocinas, quimiocinas e de medidores lipídicos, em modelo de infecção experimental por L. amazonensis. Para isso, camundongos da linhagem C57BL/6 selvagens (WT) e com baixa expressão de CD18 (CD18 Low), foram infectados com promastigotas de L. amazonensis na pata posterior, e o desenvolvimento da infecção foi acompanhado por 5 e 8 semanas após a inoculação. Com base nos resultados obtidos, os animais CD18 Low apresentaram maior carga parasitária nas patas, em comparação com os camundongos selvagens. Além disso, a maior suscetibilidade dos camundongos CD18 Low foi independente da produção de NO e de IL-10 e da redução de IL-12 mediada por IL-4. Estes animais também apresentaram reduzida produção de IFN-gama. Além disso, os camundongos CD18 Low tiveram alterações na produção de LTB4 e de PGE2 ,as quais podem ter reduzido as respostas efetoras das células no sítio da infecção. Também demonstramos que a migração de neutrófilos e de eosinófilos para o sítio de infecção ocorreu de modo independente da expressão de CD18. O maior edema e recrutamento de eosinófilos nas patas dos camundongos CD18 Low foi independente da produção de MCP-1 e parcialmente dependente de RANTES. Entretanto, a produção de LTC4 pareceu ter sido o principal responsável por estes efeitos, em conjunto com PGD2. Deste modo, nossos resultados mostram que a baixa expressão de CD18 favorece o desenvolvimento da infecção por L. amazonensis. / Leishmania are obligate intracellular parasites that use phagocytes (especially macrophages) for their survival and propagation. These parasites are internalized through interaction with several receptors of cellular surface, such as the CR3 receptor (Mac-1; CD18/CD11b), component of the B2-integrins family. B2- integrins are involved in important immune mechanisms, such as cell adhesion, cell migration, phagocytosis and modulation of intracellular signaling pathways. Studies have shown that the CD18 molecule (component of all B2-integrins), is involved in the immune response in experimental leishmaniasis, but its importance in the host defense against this infection is still controversial. Leukotrienes and prostaglandins are lipid mediators involved in various mechanisms of innate and adaptive immune response. In leishmaniasis, leukotrienes are considered critical for the host defense, once it induces cellular effector mechanisms such as phagocytosis and microbicide activity. On the other hand, prostaglandins (in particular PGE2), lead to immunosuppressive effects on these mechanisms and may favor development of disease. However, it is unknown whether there is an interaction between the B2 integrins expression and the production of these mediators in leishmaniasis and the role of these molecules in host defense against this disease. Thus, the aim of this thesis was to verify the effect of reduced expression of B2-integrins in cytokines, chemokines and lipid mediators production, in experimental model of L. amazonensis infection. For this purpose, wild type mice (WT) and mice with reduced CD18 expression (CD18Low) from C57BL/6 strain were infected with L. amazonensis promastigotes in the hind footpad. The development of the infection was assessed for 5 and 8 weeks after inoculation. Our results showed that the CD18Low mice had higher parasite load in footpad, compared to wild-type mice. Moreover, the higher susceptibility of CD18Low mice was independent of NO and IL-10 production and independent of IL-12 reduction mediated by IL-4. These mice also showed reduced IFN- gamma production. CD18Low mice had alterations in LTB4 and PGE2 levels in site of infection, which may have altered the effector cell responses. We also demonstrated that the migration of neutrophils and eosinophils to the site of infection was CD18-independent. Moreover, the higher edema and eosinophils recruitment in CD18Low mice was MCP-1-independent and partially dependent of RANTES. However, LTC4 production seemed to be the main factor for edema and migration of eosinophils, together with PGD2. Thus, our results show that the reduction on CD18 expression favors the development of L. amazonensis infection.

Aedes aegypti é importante vetor de patógeno causador de doença como dengue, febre amarela, febre Chikungunya e Zika. A fêmea realiza repasto sanguíneo a fim de adquirir nutriente para o desenvolvimento dos ovos. Neste contexto, a saliva possui papel fundamental, representando o elo entre o artrópode hematófago, seu hospedeiro vertebrado e o potencial patógeno a ser transmitido. Nessa saliva encontra-se um coquetel farmacológico com diversas atividades biológicas, como a presença de peptídeos antimicrobianos e moléculas com funções imunomoduladoras sobre células do hospedeiro vertebrado, com especial atenção aos macrófagos. Como os macrófagos também estão envolvidos nos mecanismos efetores da resposta contra protozoários do gênero Leishmania e a leishmaniose apresenta-se como uma doença de caráter zoonótico de grande relevância em saúde pública, o objetivo deste trabalho foi de avaliar o efeito do extrato de glândula salivar (EGS) de A. aegypti em infecções por Leishmania. Nossos resultados mostraram aumento da infecção in vivo e in vitro na presença do EGS, sugerindo fortemente que o EGS de A. aegypti é capaz de aumentar a infecção por Leishmania. / Aedes aegypti is an important vector of disease-causing pathogens such as dengue, yellow fever, Chikungunya and Zika fever. The mosquito female takes a blood meal in order to develop the eggs. In this context, a saliva plays a key role, representing the link between the hematophagous arthropod, its vertebrate host and the potential pathogen to be transmitted. During the evolutionary process, these insects developed a salivary cocktail with an arsenal of molecules presenting several immunomodulatory properties in host cells, such as macrophages. As macrophages are also involved in the mechanisms of response against protozoa of the genus Leishmania and leishmaniasis is a zoonotic disease of great relevance in public health, the aim of this work is to evaluate the effect of salivary gland extract (SGE) of A. aegypti in Leishmania infections. Our results showed increased infection, in vivo and in vitro, in the presence of SGE, strongly suggesting that A. aegypti EGS is able to increase infection by Leishmania.