Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-08T13:35:45Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1367389 bytes, checksum: 70492033540e8808b1cc0349fd4d1a1a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-08T13:35:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1367389 bytes, checksum: 70492033540e8808b1cc0349fd4d1a1a (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Leishmaniasis is a group of diseases caused by protozoa of the genus Leishmania, transmitted by insects phlebotomines. The recommended treatments for leishmaniasis are very toxic and unsatisfactory. Therefore, it is urgent to find new anti-Leishmania drugs that are more effective against the parasite and exhibit low toxicity to the host. Thus, this study sought to synthesize, characterize and evaluate the anti-Leishmania potential novel 2- amino-thiophenes. Thirty-two 2-amino thiophenes indole derivatives were studied by our research group. The synthesis of compounds showed a yield ranging from 31.7% (TN7-6) to 96.4% (TN6-4). In addition, the fusion ranged between of 150 ° C (TN5) and 295ºC (TN6-4). All compounds showed antipromastigota activity obtained with different IC50 values, ranging from the 2.07 - 1067 μg/ml. None of tiofenicos indole derivatives showed cytotoxicity to erythrocytes of human origin, compared to the referenced drugs. Among compounds with anti-Leishmania activity, TN8-7 substance was selected to proceed with the studies due to its high selectivity index (SI> 193.2). It was observed that L. amazonensis strains resistant to trivalent antimony continued with the same levels of sensitivity to TN8-7 presented by crops sensitive to antimony. Additionally, it was observed that the anti-Leishmania TN8-7 activity is associated with DNA fragmentation of promastigotes of the parasite. Therefore, the results of this study suggest that indole 2-amino thiophenes derivatives are promising molecules and possible drug candidates for the therapy of leishmaniasis. / As leishmanioses são um conjunto de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania, transmitida por insetos flebotomíneos. Os tratamentos recomendados para as leishmanioses são muito tóxicos e pouco satisfatórios, portanto se faz urgente a necessidade de encontrar novas drogas anti-Leishmania que sejam mais eficazes contra o parasito e que apresentem baixa toxicidade para o hospedeiro. Logo, este trabalho buscou sintetizar e caracterizar e avaliar o potencial anti-Leishmania de novos derivados 2-amino-tiofenos. Foram estudados 32 derivados 2-amino tiofenos indólicos por nosso grupo de pesquisa. A síntese dos compostos apresentou um rendimento variando de 31,7% (TN7-6) a 96,4% (TN6-4). Além disso, a faixa de fusão variou entre 150ºC (TN5) e 295ºC (TN6-4). Todos os compostos apresentaram atividade antipromastigota, sendo obtido diferentes valores de IC50, variando de 2,07 a 1067 μg/ml. Nenhum dos derivados tiofênicos indólicos apresentou citotoxicidade para hemácias de origem humana, comparados as drogas de referência. Dentre os compostos com atividade anti-Leishmania, a substância TN8-7 foi selecionada para prosseguir com os estudos, devido ao seu alto índice de seletividade (IS > 193,2). Foi observado que cepas de L. amazonensis resistentes ao antimônio trivalente continuaram com os mesmos níveis de sensibilidade ao TN8-7 apresentado pelas culturas sensíveis ao antimônio. Adicionalmente foi observado que atividade anti-Leishmania do TN8-7 está associada à fragmentação do DNA das formas promastigotas do parasito. Portanto, os resultados do presente estudo sugerem que os derivados 2-amino tiofenos indólicos são moléculas promissoras e possíveis candidatos a fármacos para a terapêutica das leishmanioses.

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1082163 bytes, checksum: 6015c927f35c9baea1ec1c536ac57b01 (MD5) Previous issue date: 2014-05-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Leishmaniasis are diseases caused by different species of parasites in the genus Leishmania. Isogenous mice are widely used in the investigation of immunopathological processes associated with these diseases. However, there are few studies of experimental leishmaniasis with heterogeneous mice with a diverted genetic makeup are few. This work evaluated the behavior of heterogeneous Swiss mice infected with the species L. (V.) braziliensis and/or L. (L.) amazonensis. Initially, the Swiss mice were infected in the paw with the promastigote stage of L. braziliensis and L. amazonensis singly; the progression of the wound was monitored for nine weeks, and the parasitic load and the levels of the cytokines IFN-γ, TFN-α, and NO were measured. After six and seventeen weeks, the Swiss mice previously coinfected with L. braziliensis were infected in the other paw with L. amazonensis; The progression of the infection was analyzed. At the eighth or ninth weeks following the double infection, the parasitic load, the levels of cytokine IFN-γ, TNF-α, and NO in cells of the spleen and the popliteal lymph node were determined. Infected mice with L. braziliensis developed a small wound at the site of infection (0,26 ± 0,05 mm). However, the infection remained unaltered without traces of progression and without detection of parasites in the spleen, but showed an increase in the levels of IFN-γ in cells of the spleen. Conversely, the Swiss mice infected with L. amazonensis developed wounds with continuous and progressive growth, with the presence of parasites in the spleen in spite of a significant increase in the synthesis of IFN-γ. With respect to doubly infected animals, the wound in the site of the infection by L. amazonensis also presented a progressive growth. However, from the second week the wounds in these animals were significantly smaller than the wounds in the animals infected only with L. amazonensis. In the eighth week of assessment, a difference in the size of the wound (2,54 ± 0,57 mm) between these last two groups of animals was observed. This decrease in the wounds size correlated with increased levels of IFN- γ and NO in the spleen cells in the animals doubly infected. With the obtained results, it can be concluded that Swiss mice develop a phenotype of susceptibility to infection by L. amazonensis. Moreover, the previous infection with L. braziliensis confers a partial protection against L. amazonensis associated with a large production of IFN-γ. / As leishmanioses são doenças causadas por diferentes espécies de parasitos do gênero Leishmania. Camundongos isogênicos são amplamente utilizados na investigação dos processos imunopatológicos associados a essas enfermidades. Contudo, poucos são os estudos de leishmaniose experimental com camundongos que possuem uma constituição genética variada, os denominados heterogênicos. No presente trabalho foi investigado o comportamento de camundongos Suíços (heterogênicos) infectados com as espécies L. (V.) braziliensis e/ou L. (L.) amazonensis. Inicialmente, os camundongos Suíços foram infectados na pata com formas promastigotas de L. braziliensis e L. amazonensis isoladamente; a evolução da lesão foi monitorada por nove semanas, e foram determinadas a carga parasitária e os níveis das citocinas IFN-γ, TNF-α e do NO. Posteriormente, camundongos Suíços foram previamente infectados com L. braziliensis, e após seis ou dezessete semanas de infecção, foram coinfectados na outra pata com L. amazonensis; analisando a evolução da lesão e após oito ou nove semanas de coinfecção, foram determinadas a carga parasitária, os níveis de IFN-γ e de NO pelas células do baço e do linfonodo poplíteo. Os camundongos infectados com L. braziliensis desenvolveram uma pequena lesão no sítio de infecção (0,26 ± 0,05 mm), permanecendo de forma inalterada, sem indícios de evolução, sem a detecção de parasitos no baço e apresentando um aumento nos níveis de IFN-γ pelas células do baço. De modo diferente, os camundongos Suíços infectados com L. amazonensis desenvolveram lesões com crescimento progressivo e contínuo, com a detecção de parasitos no baço, apesar de também aumentarem significativamente a síntese de IFN-γ. Nos animais coinfectados, a lesão no sítio de infecção por L. amazonensis também apresentou um crescimento progressivo. Contudo, a partir da segunda semana de infecção, as lesões nestes animais foram significativamente menores do que as lesões dos animais infectados apenas com L. amazonensis. Na oitava semana de avaliação foi observada uma diferença no tamanho da lesão entre esses dois últimos grupos de animais de 2,54 ± 0,57 mm. A diminuição da lesão foi correlacionada com o aumento dos níveis de IFN-γ e de NO por células do baço desses animais coinfectados. Diante dos resultados obtidos, pode-se concluir que camundongos Suíços desenvolvem um fenótipo de resistência à infecção por L. braziliensis e um fenótipo de susceptibilidade à infecção por L. amazonensis. Adicionalmente, a infecção prévia com L. braziliensis confere proteção parcial a uma posterior infecção com L. amazonensis, associada a uma maior síntese de IFN-γ.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:21:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4637140 bytes, checksum: f9c50e9a2115f5a805442d163ed54f1e (MD5) Previous issue date: 2012-12-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Morita-Baylis-Hillman Adducts (MBHA) is a class of molecules studied by our research group on synthetic, theoretical and bioactivity aspects. In this work, we present Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR) models involving 32 aromatic MBHA. Initially, the most stable conformations of thirty-two MBHA were investigated by theoretical methods, which were used to construct models. For this study, were obtained potential energy curves using AM1 semi-empirical method, considering rotational degrees of freedom (sigma bonds). From these curves, the less energy conformation to each molecule was selected and optimized at B3LYP/6- 31+G(d) level, considering solvent effects through Polarizable Continuum Model (PCM). Proton Nuclear Magnetic Ressonance data are in agreement with the conformational study. Intramolecular Hydrogen Bonds (IHB) are presents in the most of the studied compounds, according to structural characterization and QTAIM calculations. Curiously, compounds that showed hydrogen bonds involving the nitro and hydroxyl groups have the best values of biological activity (IC50). An explanation is based on redox mechanism of action of nitrocompounds. NBO (Natural Bond Orbital) charges and LUKO (Lowest Unoccupied Kohn-Sham Orbitals) analysis at the ortho-nitro group are in agreement with these analyses. Considering quantum calculations and structural observations, four descriptors were selected a priori and submitted to a QSAR study using PLS (Partial Least Squares) and MLR (Multiple Linear Regression) modeling. A second QSAR approach was made from the another set of descriptors obtained through the online platform E-DRAGON, which were submitted to a variable selection method. The quality parameters obtained for models indicate that both are robust and predictive. / Os Adutos de Morita-Baylis-Hillman (AMBH) compreendem uma classe de moléculas investigadas por nosso grupo de pesquisas nos aspectos sintéticos, teóricos e de bioatividade. Neste trabalho, apresentamos modelos de Relação Quantitativa entre a Estrutura Química e a Atividade Leishmanicida (QSAR) envolvendo 32 AMBH aromáticos. Deste modo, inicialmente foram investigadas as conformações mais estáveis de cada composto através de métodos teóricos, as quais foram utilizadas na construção dos modelos. Foram obtidas curvas de energia potencial utilizando o método semi-empírico AM1, considerando graus de liberdade rotacionais (ligações sigma). A partir destas curvas, a conformação de menor energia para cada molécula foi selecionada e otimizada ao nível B3LYP/6-31+G(d), considerando os efeitos do solvente aquoso usando PCM ( Polarizable Continuum Model ). Dados espectroscópicos de Ressonância Magnética Nuclear de prótons corroboraram o estudo conformacional. Ligações de Hidrogênio Intramoleculares (LHI) se mostraram presentes na maioria das moléculas estudadas, conforme caracterização estrutural e cálculos QTAIM ( Quantum Theory Atoms in Molecules ). Curiosamente, os compostos que apresentaram Ligações de Hidrogênio envolvendo o grupo nitro (NO2) e a hidroxila (OH) possuem melhores valores de atividade biológica (menor IC50). Uma explicação está baseada no mecanismo de ação redox de nitrocompostos. Observação das cargas NBO ( Natural Bond Orbitals ) e análise dos orbitais de fronteira LUKO ( Lowest Unoccupied Kohn-Sham Orbitals ) ao nível do grupo orto-nitro estão de acordo com estas análises. Considerando os cálculos quânticos, bem como observações estruturais, quatro descritores foram selecionados a priori e submetidos a um estudo QSAR ( Quantitative Structure- Activity Relationships ) utilizando modelagem PLS ( Partial Least Squares ) e MLR ( Multiple Linear Regression ). Uma segunda abordagem QSAR foi realizada a partir de outro conjunto de descritores obtidos através da plataforma online E-DRAGON, os quais foram submetidos ao método de seleção de variáveis OPS ( Ordered Predictor Selection ). Os parâmetros de qualidade obtidos para os modelos indicam que ambos são robustos e preditivos.

Orientadores: Maria Isabel Nogueira Cano, Carlos Henrique Inacio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T19:46:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lira_CristinaBragadeBrito_D.pdf: 9068778 bytes, checksum: 7561201fa37b1109dc7803fb6173aad0 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A leishmaniose é uma doença parasitária que foi considerada pela Organização Mundial de Saúde como uma doença de Categoria 1, pois para a mesma não existem formas de controle, diagnóstico ou terapia eficientes. Os parasitas do gênero Leishmania (família Trypanosomatidae) são agentes etiológicos da leishmaniose e possuem cromossomos lineares com extremidades teloméricas. Os telômeros são complexos nucleoproteicos essenciais para manuntenção da estabilidade do genoma e viabilidade celular. Devido à importância das proteínas teloméricas na manutenção dessas estruturas, elas têm sido considerados bons alvos para a terapia anticâncer e antiparasitária. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi identificar proteínas que se associam aos telômeros de Leishmania amazonensis. Três metodologias diferentes foram utilizadas para antigir este objetivo: (i) purificação de proteínas teloméricas a partir de extratos de L. amazonensis, (ii) busca no banco de dados de Leishmania por proteínas homólogas que apresentassem domínios de ligação ao DNA do tipo Myb, e (iii) seleção genética em levedura (sistema mono-híbrido). A purificação de proteínas teloméricas a partir de extratos nucleares de L. amazonensis resultou no isolamento da proteína LaRbp38. Ensaios in vitro de interação proteína-DNA e ensaios in vivo (imunoprecipitação de cromatina) comprovaram a interação de LaRbp38 com DNA telomérico, DNA rico em GT e DNA do cinetoplasto. LaRbp38 pode ser considerada um bom alvo para a terapia antiparasitária pois é uma proteína exclusiva de tripanosomatídeos e seu homólogo em T. brucei é essencial para a sobrevivência do parasita. Para dar início a experimentos de caracterização da estrutura dessa proteína, LaRbp38 foi expressa em bactérias. Como a proteína permaneceu na fração insolúvel, experimentos preliminares de renovelamento foram feitos mostrando que a proteína necessita da presença de DNA, ou de moléculas análogas, para se renovelar in vitro. As buscas no banco de dados de L. major resultaram no descobrimento de uma lista de proteínas que apresentam domínio de ligação ao DNA do tipo Myb. Uma proteína foi escolhida e sua homóloga em L. amazonensis foi denominada LaTBP1. O domínio Myb de LaTBP1 se localiza na porção central da proteína e apresenta alta similaridade de seqüência com domínios Myb encontrados em fatores de transcrição to tipo TFIIIB, proto-oncogene c-MYB e membros da família de proteínas teloméricas Rap1p. Ensaios de interação proteína-DNA e de imunoprecipitação de cromatina confirmaram que LaTBP1 interage tanto com o DNA telomérico quanto com DNAs ricos em GT. Prefências por estes dois tipos de DNAs são apresentadas pelas proteínas teloméricas Rap1, Taz1 e TEBP1, descritas em leveduras e eucariotos superiores. A utilização do sistema mono-híbrido para identificação de proteínas teloméricas de Leishmania resultou em uma lista de proteínas candidatas. A possível função telomérica das mesmas foi inferida com base na homologia de seqüência com proteínas já descritas e em testes de interação proteína-DNA in vitro utilizando-se extratos das leveduras recombinantes. Apesar desses resultados serem promissores, análises mais detalhadas são necessárias para confirmar estas interações. Concluindo, as três metodologias se mostraram eficazes para a identificação de proteínas teloméricas e a utilização das mesmas resultou na identificação de diversas proteínas teloméricas, algumas delas ainda hipotéticas / Abstract: Leishmaniasis is a parasitic disease that was classified by World Health Organization as a Category 1 disease because there are no effective control programs or therapeutics to this disease. Parasites from the Leishmania genus are the ethiologic agents of leishmaniasis and they possess linear chromosomes with telomeric ends. Telomeres are nucleoprotein specialized nucleoprotein complexes essential for maintaining chromosomal stability and cell viability. Since telomeric proteins are essential for the maintenance of telomeres, they could be considered good targets for anticancer and antiparasitic drugs. Therefore, the goal of this work was to identify Leishmania amazonensis proteins that interact with the telomeric DNA. Three methodologies were used the achive this goal: (i) purification of telomeric proteins from nuclear extracts of L. amazonensis, (ii) Leishmania genome database mining for protein containing a Myb-like domain, and (iii) use of One-hybrid system (Clontech). The search for telomeric proteins in nuclear extracts of L. amazonensis resulted in the identification of LaRbp38. EMSA and immunoprecipitation assays were used to attest LaRbp38 binding to telomeric, GT-rich and kinetoplast DNAs, both in vitro and in vivo. LaRbp38 could be considered a good drug target for antiparasitic therapy since it is exclusive of trypanosomatids and itshomologue in T. brucei is essential for parasite survival. In order to characterize structurally this protein, LaRbp38 was expressed in bacteria. The protein was present in the insoluble fraction of the bacterial lysate. Therefore, preliminary experiments of refolding were done. LaRbp38 seems to need DNA, or analog molecules, in order to correctly refold in vitro. Data-mining in the L. major genome resulted on a list of proteins bearing a Myb-like domain. One protein was chosen and its L. amazonensis homologue was termed LaTBP1. LaTBP1 Myb-like domain is centrally localized and shares sequence similarities with Myb-like domains found on transcription factors TFIIIB and c-MYB, and with the RAP1 telomeric proteins. Competition and chromatin immunoprecipitation assays confirmed the specificity of LaTBP1 for telomeric and GT-rich DNAs. This binding specifities are also found on the telomeric proteins Rap1, Taz1 and TEBP1, described in yeast and higher eukaryotes. A list of proteins with a putative telomeric function was generated after the use of the Onehybrid system. Sequence analysis (search for homologues in other organisms) and EMSA, done with protein extract of recombinant yeast, were used to infer a telomeric function for the proteins found by this methodology. Although the results are encouraging, detailed analysis are necessary to validate the interactions. In conclusion, the three methodologies were usefull for the identification of telomeric proteins. This work resulted in the identification of several telomeric candidate proteins / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Introdução: ao longo da história da leishmaniose tegumentar (LT), o comprometimento do tecido ósseo foi pouco estudado, principalmente na forma clínica difusa (LCD). Os estudos que abordaram o tema concentraram-se nas observações clínicas, estudos radiográficos e na visão paleopatológica, numa tentativa de explicar as lesões ósseas que alguns indivíduos com LT apresentavam. A literatura sobre infecção óssea cita como agente causador de osteomielite no homem, principalmente, bactérias e fungos. Objetivo: estudar as alterações ósseas na leishmaniose cutânea difusa (LCD), através da cintilografia óssea trifásica, radiografias e histopatológico. Métodos: o presente estudo analisa a associação entre a Leishmania (Leishmania) amazonensis e as alterações ósseas em oito pacientes com LCD, procedentes de diversos pólos de produção da doença (LT) no Estado do Maranhão. Foram realizados, nesta investigação, dois estudos: observacional em humanos, utilizando exames de imagens (cintilografia óssea trifásica e radiografias) e histopatológico do tecido ósseo (Hematoxilina- Eosina, Imunohistoquímica, Ziehl-Neelsen e Gomori-Grocott); e um estudo experimental de infecção óssea crônica produzida pela Leishmania, em camundongos BALB/c, através do histopatológico (Hematoxilina-Eosina). Resultados: a análise clínica mostrou a presença de deformidades nas extremidades distais dos membros superiores e inferiores em 50% dos casos, com limitação funcional associadas às lesões cutâneas. Nos estudos de imagens, a cintilografia mostrou hipercaptação na fase tardia em várias áreas de uma mesma região, caracterizando processos inflamatórios múltiplos no tecido ósseo em todos os pacientes. A radiografia demonstrou características de reabsorção óssea parcial das falanges distais dos dedos das mãos e pés, bilateral em seis pacientes. Revelou, também, lesões líticas nas falanges proximais das mãos em dois pacientes. O exame histopatológico demonstrou a presença de um quadro de osteomielite crônica em quatro pacientes, sendo detectado a Leishmania. Foi realizada pesquisa para micobactérias e fungos no tecido ósseo, que foram negativas. O modelo experimental caracterizou um quadro de infecção óssea crônica, demonstrando o comprometimento do tecido cartilaginoso secundariamente. Conclusões: todos os pacientes apresentaram algum tipo de comprometimento ósseo. As deformidades localizaram-se nas extremidades distais em seis pacientes. A cintilografia óssea e a radiografia foram importantes na localização e no seguimento das lesões ósseas. Através do exame histopatológico ficou evidente a relação entre a L.(L.) amazonensis e infecção óssea, caracterizando um quadro de osteomielite crônica. Portanto, fica a proposta de modificação da classificação etiológica da osteomiielite crônica, incluindo o protozoário, Leishmania (L) amazonensis , como agente causador / Introduction: Since the early history of Cutaneous Leishmaniasis (CL), there are few studies on the bone involvement in CL, mainly related to the Cutaneous Diffuse Leishmaniasis (CDL). The studies were mainly related to the clinical observation, radiographical aspects and the paleopathological view, on the attempt to explain the bone lesions found in some individuals with CL. The literature on bone infection reports the bacteria and fungi as agents of osteomyelitis in man. Objective: to study the bone changes in Cutaneous Diffuse Leishmaniasis (CDL), through the scintilography, radiography and histopatological aspects. Methods: the study analyzed the association of the Leishmania (Leishmania) amazonensis and the bone changes in eight patients with CDL, from eight endemic poles of the disease in the State of Maranhão. Two studies were carried out: human observations using images exams such as scintilography, radiography and histopathology of the bone tissue using the Hematoxilin - Eosine, Ziehl Neelsen and the Gomori-Grocott stain and also by immunohistochemistry. An experimental study of chronic bone infection induced by the Leishmania in BALB/c mice, were carried out analyzed through the histopathology (Hematoxylin-Eosin). Results: the clinical analysis showed deformity in the upper and inferior extremities in 50% of the cases, with functional limitation. On the studies of images, the scintilography showed hipercaptation on the late phase, in different areas of the same region, characterizing multiples inflammation in the bone of all patients. The radiography demonstrated characteristics of bone partial reabsortion of the feet and hands, bilateral in six patients. Lithic changes were also detected in fingers, of two patients. The histopathology showed chronic osteomyelitis in four patients, with detection of the Leishmania ( L.) amazonensis parasite. The research for mycobacteria and fungi in the bone tissue were negatives. The experimental model showed chronic infection of the bone tissue, demonstrating that the cartilage was secondarily involved. Conclusion: all patients presented some type of bone changes. The deformities were located in the extremities in six patients. The scintilography of the bone and radiography were important for localization and follow up of the bone lesions. The histopathological exams showed the relationship between Leishmania (L) amazonensis and bone infection, characterizing chronic osteomyetitis. We proposed that the Leishmania (L) amazonensis should be included as agent of chronic osteomyelitis

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-06-09T21:26:35Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kelly de Souza Fernandes - 2016: 2715711 bytes, checksum: a2c065301e1443bb424fa23c738e43d2 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-06-10T13:24:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Kelly de Souza Fernandes - 2016: 2715711 bytes, checksum: a2c065301e1443bb424fa23c738e43d2 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-10T13:24:18Z (GMT). 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Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy of a spin-labeled lipid (5-DOXIL stearate) and a thiol-specific spin label (4-maleimido-TEMPO) in the membrane of axenic amastigotes of L.(Leishmania) amazonensis and peritoneal macrophages from Balb/c mice showed that MT causes significant increase in membrane dynamics at similar concentrations that inhibit parasite growth or are cytotoxic to macrophage. Although these alterations can be detected using a spin-labeled lipid, our experimental results indicated that MT interacts predominantly with the protein component of the membrane. Using a method for the rapid incorporation of MT into the membrane, these effects were measured immediately after treatment. Cytotoxicity, estimated via microscopic counting of living and dead cells, indicated ~80% parasites and macrophages death at the concentration of MT at which EPR spectroscopy detected a significant change in membrane dynamics. Cell viability, analyzed using the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide tetrazolium) reduction assay, showed that 50% inhibitory concentration (IC50) of MT depends on the cell concentration used in the assay. This dependence was analyzed using a theoretical equation involving biophysical parameters such as the partition coefficient of watermembrane and MT concentrations on the membrane and in the aqueous medium. The data showed that cells more sensitive to MT are respectively: erythrocytes, Leishmania promastigotes and Leishmania amastigotes and macrophage. The IC50 value of MT for 4 x 107 parasites/mL was 24,35 M. For the same cell concentration, a significant alteration was detected in the membrane lipid fluidity of parasites to 15 M of MT. The EPR spectra of spinlabeled membrane-bound proteins were consistent with more expanded and solvent exposed protein conformations, suggesting a detergent-like action, with a possible formation of micelle-like structures around polypeptide chains. / A Miltefosina (MT) é um alquilfosfolipídio originalmente desenvolvido para o tratamento de câncer de mama e outros tumores sólidos. Atualmente é utilizada no tratamento da leishmaniose, uma doença infecto-parasitária causada pelo protozoário do gênero Leishmania, sendo o primeiro fármaco de uso oral aprovado para tal fim. No entanto, seu mecanismo de ação ainda é pouco conhecido. A espectroscopia de Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) de um marcador de spin lipídico (5-DOXIL estearato) e outro específico de grupo tiol (4-maleimido-TEMPO) na membrana de amastigotas axênicas de L. (Leishmania) amazonensis e de macrófagos extraídos de peritônio de camundongos BALB/c, mostrou que a MT causa um aumento significativo na dinâmica destas membranas para concentrações similares àquelas que inibem o crescimento do parasito ou que são citotóxicas ao macrófago. Embora essas alterações possam ser detectadas usando um marcador de spin lipídico, nossos resultados experimentais indicaram que a MT interage predominantemente com a componente proteica da membrana. Utilizando um método para incorporação rápida da MT na membrana, esses efeitos foram medidos imediatamente após o tratamento. Ensaios de citotoxicidade, estimada via contagem microscópica de células vivas e mortas, indicaram que ~80% dos parasitos e dos macrófagos estão mortos na concentração de MT no qual a espectroscopia de RPE detectou uma mudança significativa na dinâmica da membrana. A viabilidade celular, quantificada pela redução do sal MTT ((3-4,5- Dimetiltiazol-2yl)-2,5 difenil brometo de tetrazolina), mostrou que a concentração de MT que inibe 50% da proliferação celular (IC50) depende da concentração celular usada no ensaio. Esta dependência foi analisada utilizando uma equação teórica envolvendo parâmetros biofísicos tais como o coeficiente de partição membrana-água e concentrações de MT na membrana e no meio aquoso. Os dados mostraram que as células mais sensíveis à MT são respectivamente: eritrócitos, formas promastigotas e amastigotas da Leishmania e macrófagos. O valor do IC50 da MT para 4 x 107 parasitos/mL foi de 24,35 M. Para esta mesma concentração de células, foi detectada uma alteração significativa na fluidez lipídica da membrana dos parasitos com 15 M de MT. Os espectros de RPE do marcador de spin ligados a proteínas da membrana foram consistentes com as conformações mais expandidas e dinâmicas das proteínas expostas no solvente, sugerindo uma ação semelhante à de detergente, com uma possível formação de estruturas tipo micelas em volta das cadeias polipeptídicas.

Made available in DSpace on 2016-08-17T15:00:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Raquel Silva Fonteles.pdf: 595737 bytes, checksum: 1cef131034266e95108a1695a3835c0b (MD5) Previous issue date: 2009-02-12 / In this study we examined, whether L. whitmani is susceptible to experimental infection by L. brasiliensis, causing Cutaneous and Mucocutaneous Leishmaniasis, and L. amazonensis, causing Diffuse Cutaneous Leishmaniasis. L. whitmani individuals were collected to establish a colony free from these parasites. Mice were experimentally infected with L. brasiliensis or L. amazonensis parasites. Female of this L. whitmani colony were permitted to feed on mice exhibiting clinical signs of the disease. Phlebotominae infected with parasites were detected by amplifying a Leishmania 120 bp specific kinetoblast DNA by means of PCR. The L. whitmani infection rate for Leishmania brasiliensis and Leishmania amazonensis was 65.2% and 47.4%, respectively and confirmed that the vector is susceptible to experimental L. brasiliensis and L. amazonensis infection. Comparison of the infection rates revealed statistically significant differences. The high L. whitmani infection rate together with epidemiological and entomological studies, verified that L. whitmani is responsible for L. brasiliensis infection. Remarkably, here we report for the first time that L. whitmani is vulnerable to experimental L. amazonensis infection and may be a vector of this pathogen and the distributor for Diffuse Cutaneous Leishmaniasis. / Este estudo teve como objetivo a análise da suscetibilidade experimental de Lutzomyia whitmani para infecção com Leishmania brasiliensis causadora da Leishmaniose Cutânea e Cutâneo-Mucosa e Leishmania amazonensis causadora da Leishmaniose Cutânea Difusa. Para isso, uma colônia de L. whitmani foi estabelecida com a finalidade de fornecer espécimes livres destes parasitas que foram submetidos à alimentação em camundongos experimentalmente infectados com L. brasiliensis e L. amazonensis. A infecção com parasita foi detectada a partir da amplificação por PCR de fragmentos de 120 pb de DNA cinetoplasto do gênero Leishmania sp. As taxas de infecção encontradas foram de 65,2% e 47,4% para L. brasiliensis e L. amazonensis, respectivamente, sendo, portanto, L. whitmani suscetível à infecção experimental por estas espécies de Leishmania. A comparação entre as taxas de infecção mostrou diferenças significativas. Assim, concluímos que a alta taxa de infecção desse vetor com L. brasiliensis associados à estudos epidemiológicos e entomológicos podem responsabilizá-lo pela transmissão da Leishmaniose Cutânea e Cutâneo-Mucosa. Notavelmente, pela primeira vez foi detectado que este flebotomíneo é suscetível à infecção experimental por L. amazonensis podendo ser um vetor para transmissão desse patógeno e dispersor da Leishmaniose Cutânea Difusa.

Nós investigamos os efeitos da saliva de Lutzomyia longipalpis capturados no campo e colonizados em laboratório, na evolução da lesão e imunomodulação da infecção por Leishmania (Leishmania) amazonensis, uma espécie que é endêmica na América do Sul, onde causa Leishmaniose Cutânea, Leishmaniose Cutânea Disseminada Bordeline e Leishmaniose Cutânea Difusa Anérgica, com conseqüências graves aos pacientes. Com o intuito de comparar o efeito dos dois tipos de extrato de glândula salivar, camundongos C57BL/6 foram inoculados subcutaneamente no coxim plantar das patas traseiras e nas orelhas com 106 formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis na presença de extrato de glândula salivar de vetores de captura e de colônia. O tamanho da lesão foi significantemente menor nos camundongos infectados com extrato de glândula salivar de vetores capturados, o que também determinou uma infiltração menos proeminente de macrófagos nas lesões e uma resposta Th2 mais branda quando comparada com aqueles inoculados com extrato de glândula salivar de vetores colonizados. Recentemente, foi mostradas diferenças nos compostos protéicos das glândulas salivares que poderiam parcialmente justificar a expressão da lesão. Portanto, nossos achados ressaltam que a extrato de glândula salivar de flebótomos provavelmente não desempenha um papel importante na exacerbação da infecção por Leishmania já que a transmissão natural do parasito ocorre através de vetores selvagens e não através de vetores colonizados em laboratório / We investigated the effects of Lutzomyia longipalpis saliva of vectors captured in the field and colonized in laboratory on the lesion evolution and immunomodulation of the infection by Leishmania (Leishmania) amazonensis, a species that is endemic in South America where it causes cutaneous leishmaniasis, borderline disseminated cutaneous leishmaniasis and anergic diffuse cutaneous leishmaniasis, with devastating consequences to the patients. In order to compare the effect of both salivas, C57BL/6 mice were inoculated subcutaneously into the hind footpads or into the ear dermis with 106 promastigotes in the presence of salivary gland homogenate from wildcaught and lab-colonized vectors. Lesion size was significantly lower in the mice infected with saliva from wild-caught sandflies that also determined a less prominent infiltration of macrophages in the lesions and a weaker Th2 response in comparison with those co-inoculated with colonized saliva. Recently, differences were shown in the protein compounds in the salivary glands that could partially account for the lesion size outcome. In conclusion, our findings highlight that phlebotomine saliva probably does not play an important role in the exacerbation of Leishmania infection as the natural parasite transmission occurs through wild and not laboratory colonized vectors.

L. (L.) amazonensis (La) e L. (V.) braziliensis (Lb) podem causar um espectro de manifestações clínicas e imunopatológicas no homem, sendo La responsável pela forma anérgica difusa e Lb pela forma mucocutânea da doença, formas polares e de elevada gravidade. Neste sentido, o objetivo do presente estudo foi avaliar os aspectos da resposta imune celular no ponto de inoculação e no linfonodo de drenagem de camundongos BALB/c inoculados no coxim plantar com 106 promastigotas de La e Lb. A evolução da lesão foi avaliada semanalmente sendo que na 4ª e 8ª semana PI biópsias do ponto de inoculação foram coletadas para determinação da densidade de células dendríticas (CD207+ e CD11c+), linfócitos T CD4+ e CD8+ e células iNOS+ por imunoistoquímica, e o linfonodo de drenagem para caracterização de subpopulações de células dendríticas e de linfócitos T CD4 e CD8 por citometria de fluxo. Células de linfonodo de drenagem foram cultivadas, com estímulo homólogo, para quantificação de citocinas (IL-4, IL- 10 e IFN-g) e nitrito nos sobrenadantes. A infecção por La levou à progressão da doença, com aumento do tamanho da lesão e da carga parasitária tanto na pele quanto no linfonodo de drenagem, enquanto que a infecção por Lb mostrou um discreto aumento da lesão entre a 6ª e 7ª semana PI com posterior regressão e redução da carga parasitária na pele e no linfonodo de drenagem. Aumento do número de células dendríticas dérmicas e de Langerhans foi observado na pele de camundongos inoculados com La na 4ª semana PI, juntamente com o aumento no número de células de Langerhans nos linfonodos de drenagem. Resposta imune celular preferencial de células T CD4+ foi observada tanto na pele quanto no linfonodo de camundongos inoculados com La, que mostrou ser predominantemente do tipo Th2 com a produção aumentada de IL-10 e IL-4. Já a infecção por Lb levou ao aumento na expressão de células dendríticas dérmicas e Langerhans na pele dos animais inoculados com Lb somente na 8ª semana PI, assim como aumento do número de células dendríticas dérmicas no linfonodo. A resposta imune celular foi caracterizada por células T CD4+ e CD8+ em pele e linfonodo dos animais infectados com Lb, vinculada a um perfil Th1 com a produção preferencial de IFN-g e altos níveis de NO. Aumento no número de células T regulatórias foi observado na infecção por Lb, que mostrou correlação direta com o número de linfócitos T CD4+ produtores de IL-10. Assim, a infecção por La foi relacionada à suscetibilidade, enquanto que a infecção por Lb foi relacionada à resistência do hospedeiro vertebrado. Estes resultados evidenciam não só o papel do parasita na modulação da resposta imune do hospedeiro como também das células dendríticas à infecção por Leishmania / L. (L.) amazonensis (La) and L. (V.) braziliensis (Lb) are responsible for a spectrum of clinical and immunopathological manifestations in humans, La is able to cause anergic diffuse leishmaniasis and Lb mucocutaneous leishmaniasis, polar forms with high severity. In this way, the aim of the present study was to evaluate aspects of the cellular immune response in the site of infection and in the draining lymph node of BALB/c mice inoculated in the hind footpad with 106 promastigotes of La and Lb. The evolution of the lesion size was evaluated weekly and in the 4th and 8th week PI biopsies from the site of infection were collected to determine the density of dendritic cells (CD207+ and CD11c+), CD4+ and CD8+ T cells and iNOS+ cells by immunohistochemistry, and the draining lymph node to characterize subsets of dendritic cells and CD4+ and CD8+ T cells by flow citometry. The draining lymph nodes cells were cultured with specific antigen to determine the cytokines (IL-4, IL-10 e IFN-g), and the nitric oxide in the supernatants. The infection caused by La led to the progression of disease with increase on lesion size and parasite load in the skin and draining lymph node, while Lb infection showed a discrete increase on the lesion size between 6th and 7th week PI with late regression and reduction in the skin as well as lymph node parasite load. An increase on the number of dermal dendritic and Langerhans cells were observed in the skin of BALB/c mice infected with La at 4th week PI together with an increase of Langerhans cells in the draining lymph node. The preferential CD4+ T cell immune response was observed in skin and lymph node of mice infected with La, which showed to be rather Th2 with an increase on the levels of IL-4 and IL-10. However, Lb infection led an increase of dermal dendritic cells and Langerhans cells in the skin only at 8th week PI, as well as an increase in the dermal dendritic cells in lymph node. The cellular immune response were characterized by CD4+ and CD8+ T cells in the skin and draining lymph node of mice infected with Lb, which was related to a Th1 immune response with production of high levels of IFN-g and nitric oxide. An increase of Regulatory T cells was observed in Lb infection, which showed the positive correlation with the IL-10 producing CD4+ T cells. So, the La infection was related to the susceptibility, while Lb infection was related to the resistance in the vertebrate host. These results emphasize the role of the parasite in the modulation of the host immune response to Leishmania infection

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas e imunopatológicas resultante da interação entre as diferentes espécies de Leishmania e os mecanismos de resposta imune do hospedeiro. Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) amazonensis são as espécies de maior potencial patogênico para o homem e de importância médica no Brasil. As células TCD4, quando ativadas por antígenos via MHC II podem se diferenciar em linhagens de células efetoras como Th1, Th2, Th17 e células T reguladoras (Treg). IL-23 é indispensável para as funções efetoras e manutenção de células Th17. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de Foxp3, IL-17 e IL-23 em lesões cutâneas de pacientes com diferentes formas clínicas da LTA. Biópsias parafinadas de 44 pacientes foram submetidas à imunoistoquímica, sendo 6 casos de leishmaniose cutânea anérgica difusa (LCADIDRM-) e leishmaniose cutânea disseminada borderline (LCDBIDRM-), ambas causadas por L.(L) amazonensis e 16 casos de leishmaniose cutânea localizada (LCLIDRM+) também causada por L.(L.) amazonensis; 9 casos de LCLIDRM+, 2 casos de LCDBIDRM- e 5 casos de leishmaniose cutâneo-mucosa (LCMIDRM+), todos causados por L.(V.) braziliensis. A densidade de células Tregs Foxp3+ no espectro clínico da LTA mostrou um aumento progressivo partindo das formas centrais LCL causadas por L.(V.) braziliensis (170mm2) e L.(L) amazonensis (140mm2) para as formas polares, LCADIDRM- (289mm2) e LCDBIDRM- (183mm2) causada por L.(L) amazonensis, LCDBIDRM- (189mm2) e LCMIDRM+, causadas por L.(V.) braziliensis (158mm2). A comparação entre as densidades de células IL-17+ nas diferentes formas clínicas da LTA mostrou um perfil semelhante também com um aumento progressivo da expressão de IL-17 partindo das formas centrais LCLIDRM+ causadas por L.(V.) braziliensis (232mm2) e L.(L) amazonensis (197mm2) em direção as formas polares, LCADIDRM- (470mm2) e LCDBIDRM- (340mm2) causada por L.(L.) amazonensis, LCDBIDRM- (431mm2) e LCMIDRM+ (372mm2) causada por L.(V.) braziliensis. A densidade de células IL-23+ mostrou perfil similar ao de IL-17 como no espectro de doença causada por L. (V.) braziliensis ou L. (L.) amazonensis: LCADIDRM- (687mm2), LCDBIDRM- (518mm2) e LCLIDRM+ (348mm2) por L.(L.) amazonensis, LCLIDRM+ (457mm2), LCDBIDRM- (609mm2) e LCMIDRM+ (568mm2) L. (V.) braziliensis. Diante dos nossos achados, observa-se que as células Foxp3+, IL-17+ e IL-23+ desempenham um papel importante na imunopatogênese das diferentes formas clínicas da LTA causadas por L. (V.) braziliensis ou L. (L.) amazonensis, caracterizada por uma resposta imune polarizada de diferente expressão patológica / The American cutaneous leishmaniasis (ACL) presents a wide spectrum of clinical and immunopathological manifestations resulting from the interaction between the different species of Leishmania and the mechanisms of the host immune response. Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) amazonensis are the species with the largest pathogenic potential for humans and medical importance in Brazil. The CD4+ T cells can be differentiated into effector cell lines as Th1, Th2, Th17 and regulatory T cells (Treg). IL-23 is essential for effector functions and maintenance of Th17 cells, that produces IL-17. The aim of this study was to evaluate the expression of Foxp3, IL-17 and IL-23 in cutaneous lesions of patients with different clinical forms of ACL. Paraffin embedded biopsies from 44 patients were submitted to immunohistochemistry, there were 6 cases of anergic diffuse cutaneous leishmaniasis (ADCLDTH-) and borderline disseminated cutaneous leishmaniasis (BDCLDTH-) both caused by L. (L.) amazonensis 16 cases of cutaneous leishmaniasis (LCLDTH+) caused by L. (L.) amazonensis, 9 cases of LCLDTH+, 2 cases of BDCLDTH- and 5 cases of mucocutaneous leishmaniasis (MCLDTH+) all caused by L. (V.) braziliensis. The density of Treg Foxp3+ cells in the clinical spectrum of ACL showed a progressive increase starting from the central forms LCLDTH+ caused by L. (V.) braziliensis (170mm2) and L. (L) amazonensis (140mm2) towards the polar forms ADCLDTH- (289mm2). The intermediate clinical forms BDCLDTH- (183mm2) caused by L. (L) amazonensis and BDCLDTH-(189mm2) by L. (V.) braziliensis as well as, MCLDTH+(158mm2) did not present any significant differences. The comparison between the densities of IL-17+ cells in different clinical forms of ACL showed progressive increasing starting from the central forms LCLDTH+ caused by L. (V.) braziliensis (232mm2) and L. (L) amazonensis (197mm2) towards the polar forms, ADCLDTH-(470mm2) and BDCLDTH-(340mm2) caused by L. (L.) amazonensis BDCLDTH- (431mm2) and MCLDTH+ (372mm2) caused by L. (V.) braziliensis. The density of IL-23+ cells showed a similar profile to that of IL-17 at the disease spectrum caused by L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis: ADCLDTH-(687mm2) BDCLDTH-(518mm2) and LCLDTH+ (348mm2) by L. (L.) amazonensis; LCLDTH+ (457mm2) LCDBDTH-(609mm2) and MCLDTH+ (568mm2) L. (V.) braziliensis. In view of our findings, we notice that the Foxp3+, IL-17+ and IL-23+ cells play an important role in the immunopathogenesis of different clinical forms of ACL caused by L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis, characterized by an immune polarized response with different pathological expression