Considerando a importância do perfil do macrófago na infecção por Leishmania e o potencial papel de CD100 na modulação da ativação do m<font face=\"Symbol\">j, postulamos que essa molécula pode afetar a infectividade dessa célula por este parasita. Portanto, analisou-se e comparou-se a expressão de CD100 em diferentes tipos de m<font face=\"Symbol\">j (BALB/c e C57BL/6) e seus efeitos em termos de ativação e infecção com L. amazonensis. Avaliamos a expressão de CD100 e observamos que m<font face=\"Symbol\">js peritoneais de BALB/c expressam mais CD100 do que os de C57BL/6 e que esta expressão diminui ao longo da infecção. M<font face=\"Symbol\">j de BALB/c pré-tratados com sCD100 antes da infecção tem maior índice no tempo de 4h e quando em contato com o sCD100 antes, durante e após a infecção, o índice aumenta em 4 e 24h. Em m<font face=\"Symbol\">j de C57BL/6 pré-tratados com sCD100 ou no período de infecção, o índice aumenta em 4h. Quando permanecem durante todo o tempo em contato com o sCD100 o índice aumenta nos períodos de 4 e 24h. Concluímos que o CD100 pode estar relacionado com a modulação da infecção, e que a infecção afeta a expressão dessa molécula pelo m<font face=\"Symbol\">j. / Considering the importance of m<font face=\"Symbol\">j in Leishmania´s infection and the potential role of CD100 in the modulation of m<font face=\"Symbol\">j activation, we postulated that this molecule may affect m<font face=\"Symbol\">j infectivity. Therefore, we analyzed and compared the expression of CD100 on different types of m<font face=\"Symbol\">j (BALB/c and C57BL/6) and their effects in terms of m<font face=\"Symbol\">j activation and infectivity by L. amazonensis. We analyzed the expression of CD100 and the results suggest that m<font face=\"Symbol\">j from BALB/c express more CD100 than C57BL/6 and this expression decrease along the infection. M<font face=\"Symbol\">j from BALB/c pre-treated with sCD100 have augmented infection rates in 4h and in contact with the sCD100 before, during and after infection, increase rates in periods of 4 and 24h. In m<font face=\"Symbol\">j from C57BL/6 pre-treated with sCD100 or infection period, the rates increase in 4h. When macrophages remained in contact with sCD100 throughout the infection, rates increase after 4 and 24h. We can therefore conclude that CD100 may be related to modulation of Leishmania´s infection and that the infection itself affects CD100 expression in m<font face=\"Symbol\">j.

L. (L.) amazonensis (La) e L. (V.) braziliensis (Lb) podem causar um espectro de manifestações clínicas e imunopatológicas no homem, sendo La responsável pela forma anérgica difusa e Lb pela forma mucocutânea da doença, formas polares e de elevada gravidade. Neste sentido, o objetivo do presente estudo foi avaliar os aspectos da resposta imune celular no ponto de inoculação e no linfonodo de drenagem de camundongos BALB/c inoculados no coxim plantar com 106 promastigotas de La e Lb. A evolução da lesão foi avaliada semanalmente sendo que na 4ª e 8ª semana PI biópsias do ponto de inoculação foram coletadas para determinação da densidade de células dendríticas (CD207+ e CD11c+), linfócitos T CD4+ e CD8+ e células iNOS+ por imunoistoquímica, e o linfonodo de drenagem para caracterização de subpopulações de células dendríticas e de linfócitos T CD4 e CD8 por citometria de fluxo. Células de linfonodo de drenagem foram cultivadas, com estímulo homólogo, para quantificação de citocinas (IL-4, IL- 10 e IFN-g) e nitrito nos sobrenadantes. A infecção por La levou à progressão da doença, com aumento do tamanho da lesão e da carga parasitária tanto na pele quanto no linfonodo de drenagem, enquanto que a infecção por Lb mostrou um discreto aumento da lesão entre a 6ª e 7ª semana PI com posterior regressão e redução da carga parasitária na pele e no linfonodo de drenagem. Aumento do número de células dendríticas dérmicas e de Langerhans foi observado na pele de camundongos inoculados com La na 4ª semana PI, juntamente com o aumento no número de células de Langerhans nos linfonodos de drenagem. Resposta imune celular preferencial de células T CD4+ foi observada tanto na pele quanto no linfonodo de camundongos inoculados com La, que mostrou ser predominantemente do tipo Th2 com a produção aumentada de IL-10 e IL-4. Já a infecção por Lb levou ao aumento na expressão de células dendríticas dérmicas e Langerhans na pele dos animais inoculados com Lb somente na 8ª semana PI, assim como aumento do número de células dendríticas dérmicas no linfonodo. A resposta imune celular foi caracterizada por células T CD4+ e CD8+ em pele e linfonodo dos animais infectados com Lb, vinculada a um perfil Th1 com a produção preferencial de IFN-g e altos níveis de NO. Aumento no número de células T regulatórias foi observado na infecção por Lb, que mostrou correlação direta com o número de linfócitos T CD4+ produtores de IL-10. Assim, a infecção por La foi relacionada à suscetibilidade, enquanto que a infecção por Lb foi relacionada à resistência do hospedeiro vertebrado. Estes resultados evidenciam não só o papel do parasita na modulação da resposta imune do hospedeiro como também das células dendríticas à infecção por Leishmania / L. (L.) amazonensis (La) and L. (V.) braziliensis (Lb) are responsible for a spectrum of clinical and immunopathological manifestations in humans, La is able to cause anergic diffuse leishmaniasis and Lb mucocutaneous leishmaniasis, polar forms with high severity. In this way, the aim of the present study was to evaluate aspects of the cellular immune response in the site of infection and in the draining lymph node of BALB/c mice inoculated in the hind footpad with 106 promastigotes of La and Lb. The evolution of the lesion size was evaluated weekly and in the 4th and 8th week PI biopsies from the site of infection were collected to determine the density of dendritic cells (CD207+ and CD11c+), CD4+ and CD8+ T cells and iNOS+ cells by immunohistochemistry, and the draining lymph node to characterize subsets of dendritic cells and CD4+ and CD8+ T cells by flow citometry. The draining lymph nodes cells were cultured with specific antigen to determine the cytokines (IL-4, IL-10 e IFN-g), and the nitric oxide in the supernatants. The infection caused by La led to the progression of disease with increase on lesion size and parasite load in the skin and draining lymph node, while Lb infection showed a discrete increase on the lesion size between 6th and 7th week PI with late regression and reduction in the skin as well as lymph node parasite load. An increase on the number of dermal dendritic and Langerhans cells were observed in the skin of BALB/c mice infected with La at 4th week PI together with an increase of Langerhans cells in the draining lymph node. The preferential CD4+ T cell immune response was observed in skin and lymph node of mice infected with La, which showed to be rather Th2 with an increase on the levels of IL-4 and IL-10. However, Lb infection led an increase of dermal dendritic cells and Langerhans cells in the skin only at 8th week PI, as well as an increase in the dermal dendritic cells in lymph node. The cellular immune response were characterized by CD4+ and CD8+ T cells in the skin and draining lymph node of mice infected with Lb, which was related to a Th1 immune response with production of high levels of IFN-g and nitric oxide. An increase of Regulatory T cells was observed in Lb infection, which showed the positive correlation with the IL-10 producing CD4+ T cells. So, the La infection was related to the susceptibility, while Lb infection was related to the resistance in the vertebrate host. These results emphasize the role of the parasite in the modulation of the host immune response to Leishmania infection

Introdução: ao longo da história da leishmaniose tegumentar (LT), o comprometimento do tecido ósseo foi pouco estudado, principalmente na forma clínica difusa (LCD). Os estudos que abordaram o tema concentraram-se nas observações clínicas, estudos radiográficos e na visão paleopatológica, numa tentativa de explicar as lesões ósseas que alguns indivíduos com LT apresentavam. A literatura sobre infecção óssea cita como agente causador de osteomielite no homem, principalmente, bactérias e fungos. Objetivo: estudar as alterações ósseas na leishmaniose cutânea difusa (LCD), através da cintilografia óssea trifásica, radiografias e histopatológico. Métodos: o presente estudo analisa a associação entre a Leishmania (Leishmania) amazonensis e as alterações ósseas em oito pacientes com LCD, procedentes de diversos pólos de produção da doença (LT) no Estado do Maranhão. Foram realizados, nesta investigação, dois estudos: observacional em humanos, utilizando exames de imagens (cintilografia óssea trifásica e radiografias) e histopatológico do tecido ósseo (Hematoxilina- Eosina, Imunohistoquímica, Ziehl-Neelsen e Gomori-Grocott); e um estudo experimental de infecção óssea crônica produzida pela Leishmania, em camundongos BALB/c, através do histopatológico (Hematoxilina-Eosina). Resultados: a análise clínica mostrou a presença de deformidades nas extremidades distais dos membros superiores e inferiores em 50% dos casos, com limitação funcional associadas às lesões cutâneas. Nos estudos de imagens, a cintilografia mostrou hipercaptação na fase tardia em várias áreas de uma mesma região, caracterizando processos inflamatórios múltiplos no tecido ósseo em todos os pacientes. A radiografia demonstrou características de reabsorção óssea parcial das falanges distais dos dedos das mãos e pés, bilateral em seis pacientes. Revelou, também, lesões líticas nas falanges proximais das mãos em dois pacientes. O exame histopatológico demonstrou a presença de um quadro de osteomielite crônica em quatro pacientes, sendo detectado a Leishmania. Foi realizada pesquisa para micobactérias e fungos no tecido ósseo, que foram negativas. O modelo experimental caracterizou um quadro de infecção óssea crônica, demonstrando o comprometimento do tecido cartilaginoso secundariamente. Conclusões: todos os pacientes apresentaram algum tipo de comprometimento ósseo. As deformidades localizaram-se nas extremidades distais em seis pacientes. A cintilografia óssea e a radiografia foram importantes na localização e no seguimento das lesões ósseas. Através do exame histopatológico ficou evidente a relação entre a L.(L.) amazonensis e infecção óssea, caracterizando um quadro de osteomielite crônica. Portanto, fica a proposta de modificação da classificação etiológica da osteomiielite crônica, incluindo o protozoário, Leishmania (L) amazonensis , como agente causador / Introduction: Since the early history of Cutaneous Leishmaniasis (CL), there are few studies on the bone involvement in CL, mainly related to the Cutaneous Diffuse Leishmaniasis (CDL). The studies were mainly related to the clinical observation, radiographical aspects and the paleopathological view, on the attempt to explain the bone lesions found in some individuals with CL. The literature on bone infection reports the bacteria and fungi as agents of osteomyelitis in man. Objective: to study the bone changes in Cutaneous Diffuse Leishmaniasis (CDL), through the scintilography, radiography and histopatological aspects. Methods: the study analyzed the association of the Leishmania (Leishmania) amazonensis and the bone changes in eight patients with CDL, from eight endemic poles of the disease in the State of Maranhão. Two studies were carried out: human observations using images exams such as scintilography, radiography and histopathology of the bone tissue using the Hematoxilin - Eosine, Ziehl Neelsen and the Gomori-Grocott stain and also by immunohistochemistry. An experimental study of chronic bone infection induced by the Leishmania in BALB/c mice, were carried out analyzed through the histopathology (Hematoxylin-Eosin). Results: the clinical analysis showed deformity in the upper and inferior extremities in 50% of the cases, with functional limitation. On the studies of images, the scintilography showed hipercaptation on the late phase, in different areas of the same region, characterizing multiples inflammation in the bone of all patients. The radiography demonstrated characteristics of bone partial reabsortion of the feet and hands, bilateral in six patients. Lithic changes were also detected in fingers, of two patients. The histopathology showed chronic osteomyelitis in four patients, with detection of the Leishmania ( L.) amazonensis parasite. The research for mycobacteria and fungi in the bone tissue were negatives. The experimental model showed chronic infection of the bone tissue, demonstrating that the cartilage was secondarily involved. Conclusion: all patients presented some type of bone changes. The deformities were located in the extremities in six patients. The scintilography of the bone and radiography were important for localization and follow up of the bone lesions. The histopathological exams showed the relationship between Leishmania (L) amazonensis and bone infection, characterizing chronic osteomyetitis. We proposed that the Leishmania (L) amazonensis should be included as agent of chronic osteomyelitis

Nós investigamos os efeitos da saliva de Lutzomyia longipalpis capturados no campo e colonizados em laboratório, na evolução da lesão e imunomodulação da infecção por Leishmania (Leishmania) amazonensis, uma espécie que é endêmica na América do Sul, onde causa Leishmaniose Cutânea, Leishmaniose Cutânea Disseminada Bordeline e Leishmaniose Cutânea Difusa Anérgica, com conseqüências graves aos pacientes. Com o intuito de comparar o efeito dos dois tipos de extrato de glândula salivar, camundongos C57BL/6 foram inoculados subcutaneamente no coxim plantar das patas traseiras e nas orelhas com 106 formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis na presença de extrato de glândula salivar de vetores de captura e de colônia. O tamanho da lesão foi significantemente menor nos camundongos infectados com extrato de glândula salivar de vetores capturados, o que também determinou uma infiltração menos proeminente de macrófagos nas lesões e uma resposta Th2 mais branda quando comparada com aqueles inoculados com extrato de glândula salivar de vetores colonizados. Recentemente, foi mostradas diferenças nos compostos protéicos das glândulas salivares que poderiam parcialmente justificar a expressão da lesão. Portanto, nossos achados ressaltam que a extrato de glândula salivar de flebótomos provavelmente não desempenha um papel importante na exacerbação da infecção por Leishmania já que a transmissão natural do parasito ocorre através de vetores selvagens e não através de vetores colonizados em laboratório / We investigated the effects of Lutzomyia longipalpis saliva of vectors captured in the field and colonized in laboratory on the lesion evolution and immunomodulation of the infection by Leishmania (Leishmania) amazonensis, a species that is endemic in South America where it causes cutaneous leishmaniasis, borderline disseminated cutaneous leishmaniasis and anergic diffuse cutaneous leishmaniasis, with devastating consequences to the patients. In order to compare the effect of both salivas, C57BL/6 mice were inoculated subcutaneously into the hind footpads or into the ear dermis with 106 promastigotes in the presence of salivary gland homogenate from wildcaught and lab-colonized vectors. Lesion size was significantly lower in the mice infected with saliva from wild-caught sandflies that also determined a less prominent infiltration of macrophages in the lesions and a weaker Th2 response in comparison with those co-inoculated with colonized saliva. Recently, differences were shown in the protein compounds in the salivary glands that could partially account for the lesion size outcome. In conclusion, our findings highlight that phlebotomine saliva probably does not play an important role in the exacerbation of Leishmania infection as the natural parasite transmission occurs through wild and not laboratory colonized vectors.

Submitted by Daniella Santos (daniella.santos@ufma.br) on 2017-08-29T16:11:39Z No. of bitstreams: 1 MayaraSilva.pdf: 2720807 bytes, checksum: 1a7eeabdd7df89c4b7c0690e8136cb51 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T16:11:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MayaraSilva.pdf: 2720807 bytes, checksum: 1a7eeabdd7df89c4b7c0690e8136cb51 (MD5) Previous issue date: 2017-03-28 / CNPq / CAPES / FAPEMA / There is an increasing interest to find new products with therapeutic potential to the treatment of leishmaniasis, due the high toxicity and resistance of the majority of available treatments. Our aim was to formulate, characterise and evaluate the antiLeishmania amazonensis activity of babassu loaded poly(lactic-co-glycolic acid) – PLGA microparticles. The PLGA microparticles were loaded with the aqueous extract of babassu mesocarp (MMP) and evaluated for size, zeta potential, drug content, encapsulation efficiency in comparison to unloaded microparticles (CMP). The antiLeishmania effect was evaluated to promastigotes forms or to amastigotes in Balb/c macrophage cells infected with Leishmania amazonensis. Following macrophage treatment with MMP the percent of infected cells was determined by Giemsa staining and compared with cells treated with CMP or with free babassu extract (MESO). To find the potential mechanisms of the activity of MMPs, TNF -α, IL-6, IL-10, hydrogen peroxide, arginase and accumulated nitrite in the culture supernatants of the treated and untreated cells were also measured by ELISA, and by colorimetric assays, respectivelly. The size range of the microparticles was between 3 and 6,4 μm with an average zeta potential of −25 mV and encapsulation efficiency of 45%. The antiLeishmania activity of babassu-loaded microparticles was 10-fold higher than MESO. MMP showed an overall bioavailability and hence were more effective in eliminating intracellular parasites than the other formulations. Babassu microparticles also reduced the ex vivo parasite infectivity and this effect seems to be directly related to a polarization of macrophages to the M1 phenotype with an increased production of nitric oxide, hydrogen peroxide and TNF-α. Interestingly, this overexpression of TNF-α didn’t impair cell viability, suggesting the anti-apoptotic effects of the MMP in infected macrophages. These findings indicate that babassu load microparticles may be useful for targeting for new drugs, due to the immunomodulatory effects of polarization to M1 macrophages, infected with L. amazonensis, and further provide motivations for future studies on human cels in vitro and in animal models of leishmaniasis in vivo. / A bioprospecção de produtos com potencial terapêutico no tratamento da leishmaniose tem despertado crescente interesse, pois as drogas atualmente utilizadas apresentam elevada toxicidade e, muitas vezes, os protozoários são resistentes, sobretudo nos tratamentos prolongados. Na perspectiva de desenvolver uma nova formulação com ação anti-Leishmania avaliou-se a atividade do extrato aquoso do mesocarpo de babaçu (Attalea speciosa Mart) encapsulado em micropartículas biodegradáveis de PLGA [poly(lactic-co-glycolic acid]. Inicialmente, foi realizado o estudo morfométrico e funcional das micropartículas. Em seguida foi avaliada a atividade anti-Leishmania por ação sobre as formas promastigotas, comparando os efeitos das micropartículas de PLGA carregadas com extrato do mesocarpo de babaçu (MMP) com o extrato livre (Meso) e com micropartículas sem o mesocarpo, utilizadas como controle negativo (CMP). Também avaliamos os efeitos de MMP em culturas de macrófagos peritoneais, de camundongos Balb/c, infectados ou não com formas amastigotas de Leishmania amazonensis. Os seguintes parâmetros foram investigados nos sobrenadantes das culturas de macrófagos: quantificação das citocinas IL-10, IL-6 e TNF-α por ELISA, detecção de peróxido de hidrogênio, óxido nítrico e atividade da arginase. Foi determinada a taxa de infecção e o percentual de células infectadas. O mesocarpo de babaçu apresentou forteinteração com antígenos de L. amazonensis. A caracterização das micropartículas mostrou que as MMP apresentaram diâmetro e potencial zeta compatíveis com as micropartículas controle (CMP) e a eficiencia de encapsulamento do extrato foi de 45%. As MMPs foram mais ativamente fagocitadas do que o extrato de babaçu livre, ocasionando aumento de 25% no índice fagocítico, após 24 horas de incubação. Além de baixa toxicidade para macrófagos peritoneais, o encapsulamento do mesocarpo de babaçu potenciou em quase 10 vezes a ação anti-Leishmania para as formas promastigotas de Leishmania amazonensis, quando comparado ao extrato livre. O tratamento com MMP reduziu o número de amastigotas e a taxa de infecção de macrófagos peritoneais, possivelmente por seu efeito imunomodulador na polarização de macrófagos para o fenótipo M1, resultando no aumento de TNF-α e óxido nítrico e na inibição da produção de IL-10. Concluímos que o microencapsulamento do mesocarpo de babaçu melhorou a ação anti-Leishmania do extrato, mas manteve o seu efeito imunomodulador o que contribuiu para o melhor efeito tanto sobre os protozoários como para as células infectadas, evitando a morte das células por necrose ou apoptose. Os dados em conjunto indicam que as micropartículas MMP podem ser fortes candidatas ao desenvolvimento de novos produtos, devido aos seus efeitos imunomoduladores na polarização de macrófagos infectados com L. amazonensis para um perfil M1 e, adicionalmente, estimulam novos estudos quanto ao seus efeitos sobre células humanas in vitro e em modelo animal da leishmaniose in vivo.

Considerando a importância do perfil do macrófago na infecção por Leishmania e o potencial papel de CD100 na modulação da ativação do m<font face=\"Symbol\">j, postulamos que essa molécula pode afetar a infectividade dessa célula por este parasita. Portanto, analisou-se e comparou-se a expressão de CD100 em diferentes tipos de m<font face=\"Symbol\">j (BALB/c e C57BL/6) e seus efeitos em termos de ativação e infecção com L. amazonensis. Avaliamos a expressão de CD100 e observamos que m<font face=\"Symbol\">js peritoneais de BALB/c expressam mais CD100 do que os de C57BL/6 e que esta expressão diminui ao longo da infecção. M<font face=\"Symbol\">j de BALB/c pré-tratados com sCD100 antes da infecção tem maior índice no tempo de 4h e quando em contato com o sCD100 antes, durante e após a infecção, o índice aumenta em 4 e 24h. Em m<font face=\"Symbol\">j de C57BL/6 pré-tratados com sCD100 ou no período de infecção, o índice aumenta em 4h. Quando permanecem durante todo o tempo em contato com o sCD100 o índice aumenta nos períodos de 4 e 24h. Concluímos que o CD100 pode estar relacionado com a modulação da infecção, e que a infecção afeta a expressão dessa molécula pelo m<font face=\"Symbol\">j. / Considering the importance of m<font face=\"Symbol\">j in Leishmania´s infection and the potential role of CD100 in the modulation of m<font face=\"Symbol\">j activation, we postulated that this molecule may affect m<font face=\"Symbol\">j infectivity. Therefore, we analyzed and compared the expression of CD100 on different types of m<font face=\"Symbol\">j (BALB/c and C57BL/6) and their effects in terms of m<font face=\"Symbol\">j activation and infectivity by L. amazonensis. We analyzed the expression of CD100 and the results suggest that m<font face=\"Symbol\">j from BALB/c express more CD100 than C57BL/6 and this expression decrease along the infection. M<font face=\"Symbol\">j from BALB/c pre-treated with sCD100 have augmented infection rates in 4h and in contact with the sCD100 before, during and after infection, increase rates in periods of 4 and 24h. In m<font face=\"Symbol\">j from C57BL/6 pre-treated with sCD100 or infection period, the rates increase in 4h. When macrophages remained in contact with sCD100 throughout the infection, rates increase after 4 and 24h. We can therefore conclude that CD100 may be related to modulation of Leishmania´s infection and that the infection itself affects CD100 expression in m<font face=\"Symbol\">j.

A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) representa um sério problema de saúde pública. No Brasil muitas espécies são reconhecidas como patogênicas para o homem, portanto o diagnóstico diferencial é necessário para compreender o perfil epimemiológico da LTA em áreas endêmicas. Com o objetivo de identificar espécies de Leishmania utilizando ferramentas moleculares, cinquenta e três biópsias de pele de pacientes com LTA, fixadas em formalina e incluídas em parafina dos Estados do Pará (N=33) e Maranhão (20) foram submetidos a diferentes protocolos da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para a identificação dos agentes causadores. Biopsias foram desparafinizadas e o DNA foi extraído usando o protocolo de fenol-clorofórmio, quantificado e submetido a reações de PCR, com base na sequência de nucleotídeos codificadora do RNA que compõe a subunidade menor do ribossomo (SSUrDNA) e da enzima Glicose 6-Fosfato Desidrogenase (G6PD). O alvo G6PD foi utilizado tanto em reações de PCR convencional (cPCR), como de PCR quantitativo (qPCR). As reações de cPCR e Nested PCR SSUrDNA apresentaram resultado positivo para o gênero Leishmania em 40 (83,3%) das amostras submetidas. Vinte e sete desses produtos de PCR foram sequenciados, sendo 17 identificados como L.(L.) amazonensis e 10 como L.(Viannia) sp. A cPCR G6PD identificou 9 amostras como L.(V.) braziliensis , sendo 7 do Maranhão (36%) e 2 do Pará (6%). O DNA de L.(Viannia) sp. foi quantificado em quatro amostras do Maranhão através da reação de qPCR G6PD, mesmo esse alvo sendo de cópia única. Esses resultados indicam que sequências especificas de Leishmania sp. presentes em múltiplas cópias devem ser escolhidas para a aplicação de cPCR em DNA provindo de amostras parafinadas,uma vez que é freqüente casos de LTA com baixo parasitismo e consequentemente, pequenas concentrações de DNA. E ainda a cPCR SSUrDNA pode ser um bom alvo para estudos diagnósticos e epidemiológicos.A qPCR G6PD permitiu a detecção, identificação e quantificação de L. (Viannia) sp. em uma única etapa de amplificação em quatro amostras que presentaram resultados positivos somente na Nested ou Semi-Nested PCR, demonstrando uma maior sensibilidade oferecida pela q PCR / American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) presents a serious problem of public healthy. In Brazil many species are recognized as pathogenic to humans, therefore differential diagnostic is necessary to understand the epidemiological profile of ACL in endemic areas. Fifty-three paraffinembedded skin biopsies of ACL patients from Pará (N=33) and Maranhão (20) States, were submitted to different protocols of polymerase chain reaction (PCR) for identification of their causative agents. Biopsies were deparaffinized and DNA were extracted using phenol-chloroform, quantified and submitted to PCR reaction, using small subunit coding sequence (SSUrDNA) and enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD). The target of G6PD was used both in conventional PCR reactions (cPCR) and quantitative PCR (qPCR). The reactions of cPCR and Nested PCR SSUrDNA showed positive result for the genus Leishmania in 40 (83.3%) of the samples. Twenty-seven positive samples were submitted to sequencing and 10 were identified as L. (Viannia) sp. and 17 as L. (L.) amazonensis. The G6PD PCR identified 9 samples as L. (V.) braziliensis, 2 from Pará (6%) and 7 from Maranhão (35%).Four samples were quantified in G6PD qPCR, even this is a single copy. These results indicate that specific sequences from Leishmania sp. present in multiple copies should be chosen in relation to those from unique copies in paraffin-embedded tissues, once is frequent cases of ACL with low parasitism, consequently small DNA concentrations and that SSUrDNA can be a good target to diagnostic and epidemiologic studies of ACL. The qPCR allowed the detection and identification of L. (Viannia) sp. in a single round of amplification in four samples that when showed positive results only in the Nested or Semi Nested cPCR suggesting a higher sensitivity offered by qPCR

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-11-06T14:31:55Z No. of bitstreams: 1 Jaqueline Franca Costa Aspectos imunopatogênicos da leishmaniose cutanêa...pdf: 1509776 bytes, checksum: 2d3824cc711f84d908e61378ac3d4a8c (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-06T14:31:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jaqueline Franca Costa Aspectos imunopatogênicos da leishmaniose cutanêa...pdf: 1509776 bytes, checksum: 2d3824cc711f84d908e61378ac3d4a8c (MD5) Previous issue date: 2013 / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina da Bahia. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A progressão crônica da LCD é atribuída à falta da imunidade mediada por células específica para antígeno de Leishmania e predominância de uma resposta do tipo Th2. Neste sentido, tanto fatores do parasita quanto do hospedeiro podem atuar na desativação da resposta imune favorecendo a replicação da Leishmania. Inicialmente avaliamos o papel da exposição de fosfatidilserina na infecção de macrófagos murinos com Leishmania amazonensis isolados de pacientes com LCD. Para isso, macrófagos peritoneais de camundongos F1(BALB/c x C57BL/6) foram infectados com os diferentes isolados obtidos de pacientes com LCD e LCL. Os isolados obtidos de pacientes com LCD apresentaram maior expressão de PS do que os isolados de pacientes com LCL após 24 horas de infecção. Em seguida, avaliamos a infectividade dos diferentes isolados. As amastigotas de pacientes com LCD apresentaram maior porcentagem de macrófagos infectados e índice de infecção, quando comparados com amastigotas de pacientes com LCL. Quanto ao mecanismo, o grupo infectado com os isolados de pacientes com LCD apresentou um aumento na relação TGF-β/TNF-α e IL-10/TNF-α em relação ao grupo LCL. A análise de correlação revelou que a porcentagem de macrófagos infectados, o índice de infecção, os índices de TGF-β/TNF-α e IL-10/TNF-α, bem como o tamanho dos vacúolos estão diretamente associados a maior exposição de PS. Além disso, o número de lesões e o tempo de doença dos pacientes com LCD também estão associados á exposição de PS. O reconhecimento de PS tem como consequência a produção de TGF, IL-10, IL-4 e PGE2, que ativam a via da enzima arginase e consequentemente a produção de poliaminas. Por isso buscamos investigar a participação de tais mediadores em pacientes com LCD. Os níveis da arginase I, ODC e TGF-β no plasma de pacientes com LCD estava elevados quando comparado com os pacientes com LCL ou o controle saudável da área endêmica. Por outro lado, os níveis de TNF-α, IL-12, MCP-1 e CXCL-10 estavam reduzidos no plasma de pacientes com LCD comparado aos pacientes com LCL. Os níveis de arginase apresentaram correlação positiva com ODC, TGF-β e PGE e correlação negativa com TNF-α, IL-12, MCP-1 e CXCL-10. A produção da arginase e ODC também foi avaliada nas lesões dos pacientes através de imunohistoquímica. As lesões dos pacientes com LCD apresentaram uma marcação mais intensa e difusa do que as de LCL. Além disso, a expressão da cicloxigenase 2 também estava aumentada nas lesões de LCD. A expressão do mRNA das enzimas fosfolipase A2, COX-2, prostaglandina sintase, espermina e espermidina sintase apresentaram uma relação positiva com a enzima arginase, indicando que esta interfere diretamente no metabolismo dos mediadores lipídicos e na via de síntese das poliaminas. A inibição das enzimas arginase e ODC com nor-NOHA e DFMO, respectivamente, reduziu a carga parasitária de macrófagos humanos infectados com L. amazonensis após 72 h de infecção. Além disso, os inibidores reduziram a produção de TGF e PGE2 no sobrenadante das culturas. Em conjunto, nossos dados sugerem que a liberação local e sistêmica de prostaglandinas e poliaminas associadas à via da arginase em pacientes com LCD deve estar associada com a inabilidade em montar uma resposta imune eficiente contra a infecção por Leishmania proporcionando um ambiente favorável para a replicação do parasita e disseminação da doença. Nossos resultados mostram também que este ambiente imunossuprimido pode ser induzido pela exposição de PS na superfície de L. amazonensis deflagrando uma resposta anti-inflamatória nos pacientes com LCD. / The chronic progression of DCL is attributed to the lack of specific cell-mediated immunity to Leishmania antigen and predominance of a Th2-type response. In this sense, both factors of the parasite and the host can act in the deactivation of immune response, favoring parasite replication. Initially we evaluate the role of phosphatidylserine exposure in murine macrophages infected with L. amazonensis isolated from patients with DCL. First, peritoneal macrophages of mice F1 (BALB/c x C57BL/6) were infected with different isolates from patients with DCL and LCL. The DCL isolates showed higher PS expression than the LCL isolates after 24 hours of infection.. The DCL-amastigotes patients showed a higher percentage of infected macrophages and the infectivity index when compared with patients with LCL- amastigotes. Regarding the mechanism, the group infected with isolates from patients with LCD showed an increase in TGF/TNF and IL-10/TNF when compared with LCL group. Correlation analysis revealed that the percentage of infected macrophages, the infectivity index, the rate of TGF/TNF and IL-10/TNF as well as the size of the vacuoles are directly associated with higher PS exposure. Moreover, the number of lesions and disease duration of DCL patients are also associated with PS exposure. Recognition of PS results in the production of TGF, IL-10, IL-4 and PGE2, molecules with anti-inflammatory role that activate the enzyme arginase and consequently the polyamines production. Therefore, we investigated the involvement of these mediators in patients with DCL. The plasma of DCL patients showed high levels of arginase, ODC and TGF compared to the LCL patients or healthy control from endemic area. On the other hand, the levels of TNF, IL-12, MCP-1 and CXCL-10 were reduced in the DCL patients plasma compared to patients with LCL. Arginase levels were positively correlated with ODC, TGF and PGE and negatively correlated with TNF, IL-12, MCP-1 and CXCL-10. The production of arginase and ODC was also evaluated in the lesions of patients by immunohistochemistry. The DCL lesions showed a more intense and diffuse staining than LCL lesions. Furthermore, the expression of cyclooxygenase-2 was also increased in lesions of DCL. The mRNA expression of the enzymes phospholipase A2, COX-2, prostaglandin synthase, spermine synthase and spermidine synthase showed a positive relationship with the arginase enzyme, indicating that it directly interferes with the metabolism of lipid mediators and in synthesis of polyamines. The inhibition of the enzyme arginase and ODC with nor-NOHA and DFMO, respectively, reduced the parasite load of L. amazonensis human infected macrophages 72 h after infection. Moreover, NOHA and DFMO reduced TGF and PGE2 production in the supernatant of cultures. Together, local and systemic release of prostaglandins, arginase and polyamines pathways in DCL should be associated with the inability of these patients to mount effective immune response against infection by Leishmania providing a favorable environment for replication and spread of the parasite disease. Our results also show that this immunosuppressed environment can be induced by PS exposure on the L. amazonensis surface triggering anti-inflammatory response in DCL patients.

Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-08T12:54:48Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1516121 bytes, checksum: 772d5ba3351de06ed346dc46430f7188 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-08T12:54:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1516121 bytes, checksum: 772d5ba3351de06ed346dc46430f7188 (MD5) Previous issue date: 2016-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The first-line drugs in Brazil for leishimaniasis treatment is the pentavalent antimonial, considered a prodrug because it is converted in trivalent (SbIII) during the treatment which presents many limitations, including the rising of the resistant parasite. Seeking to understand of these resistance effects in Leishmania (L.) amazonensis, promastigotes forms were cultured in glowing concentrations of SbIII then 2 mutants were selected, SbIII 1 and SbIII2 that gain resistance, respectively, 15,8 and 22,5 times bigger than wild cultures'. The morphological analysis show significant diferences in mutant's form and size when compared with the wild ones, once it has a long and slender cell body and with a long flagellum, while the majority mutants, with a resistance level 6,42 (SbIII 1) and 5,62 (SbIII 2) times bigger, presented a rounded cell body, with long flagellum. Curiously, when the mutants obtain a resistance level 15,8 (SbIII 1) e 22,5 (SbIII 2) times bigger, the morphological diference diminishes. The resistance phenotype to the SbIII manifested itself also in the amastigote like derived of both mutants. The SbIII 2 mutant presented a more stable profile of resistance than SbIII 1 one's when cultured in the absence of the drug, which denote diferences in the resistance mechanism. There was not observed cross-resistance to Amphotericin B. The promastigote forms of both mutants showed theirselves significantly more resistant to lysis throught the complement system, compared to the wild one's, sugesting that the parameter to the resistance to the antimonials and virulance might be correlated in Leishmania (L.) amazonensis. / A droga de primeira escolha para o tratamento das leishmanioses no Brasil é um antimonial pentavalente, considerado uma pró-droga por ser convertido na forma trivalente (SbIII) durante o tratamento, o qual apresenta várias limitações, incluindo o crescente surgimento de parasitos resistentes. Buscando compreender os efeitos desta resistência em Leishmania (L.) amazonensis, formas promastigotas foram cultivadas em concentrações crescentes de SbIII e selecionados dois mutantes, SbIII 1 e SbIII 2, que adquiriram, respectivamente, um nível de resistência 15,8 e 22,5 vezes maior que o apresentado pelas culturas selvagens. A análise morfológica mostrou diferenças significantivas no tamanho e formato dos mutantes em relação ao tipo selvagem, visto que estas apresentaram corpo celular alongado, delgado e com flagelo longo, enquanto que a maioria dos mutantes, com um nível de resistência 6,42 (SbIII 1) e 5,62 (SbIII 2) vezes maior, apresentaram um corpo celular arredondado, com flagelo alongado. Curiosamente, quando os mutantes adquiriram um nível de resistência 15,8 (SbIII 1) e 22,5 (SbIII 2) vezes maior, esta diferença morfológica diminuiu. O fenótipo de resistência ao SbIII se manifestou também nas formas amastigotas axênicas derivadas dos dois mutantes. O mutante SbIII 2 apresentou um perfil de resistência mais estável que o SbIII 1 quando cultivado na ausência da droga, o que pode indicar diferenças nos mecanismos de resistência. Não foi observada resistência cruzada com o fármaco Anfotericina B. As formas promastigotas dos dois mutantes mostraram-se significativamente mais resistentes à lise pelo sistema complemento, comparado aos selvagens, sugerindo que os parâmetros resistência a antimoniais e virulência podem estar correlacionados em Leishmania (L.) amazonensis.

Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-08T13:15:26Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 5193646 bytes, checksum: 62212dade111b2d7405b6107b2b692aa (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-08T13:15:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 5193646 bytes, checksum: 62212dade111b2d7405b6107b2b692aa (MD5) Previous issue date: 2016-06-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Leishmaniasis is a group of diseases caused by protozoa of the genus Leishmania, transmitted by sand flies insects. As recommended treatments are toxic and not very satisfactory, it is necessary to find new drugs more effective against the parasite and that have low toxicity to the host. In this context, this study aimed to synthesize, structurally elucidate and evaluate the anti-Leishmania potential novel hybrids thiophenics-acridines front of promastigotes of Leishmania (L.) amazonensis. In this study, we evaluated 23 compounds, of which 14 were derived hybrids. The synthesis of compounds had a yield from 47.7% (ACT06) to 88% (ACT05) to ACT series, and ACS series from 44.8% (ACS05) to 94.9% (ACS02). All compounds of ACS series showed antipromastigote activity (IC50 values from 3.9 to 30.9 μg/mL). Differently, hybrids of ACT series no showed antiparasitic activity. None of the derivatives showed cytotoxicity to erythrocytes of human origin, as compared to reference drug. The compounds with improved activity, ACS01 and ACS02 (IC50 3.9 and 4.6 μg/mL; SI 205.1 and 173.9 respectively) were selected to proceed with the investigation. ACS01 and ACS02 were effective against strains resistant trivalent antimony in the same way as in sensitive strains. Furthermore, the activity of ACS01is not associated with parasite DNA fragmentation, but ACS01 and ACS02 showed a binding constant of 104 M-1, demonstrating their DNA intercalation capacity. Thus, these results suggest that the derivatives of the ACS series are possible drug candidates for the therapy of leishmaniasis. / As leishmanioses são um conjunto de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania, transmitidas por insetos flebotomíneos. Como os tratamentos recomendados são tóxicos e pouco satisfatórios, faz-se necessário encontrar novas drogas, mais eficazes contra o parasito e que tenham baixa toxicidade para o hospedeiro. Neste contexto, este trabalho buscou sintetizar, elucidar estruturalmente, e avaliar o potencial anti-Leishmania de novos derivados híbridos tiofênicos-acridínicos frente às formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis. Neste estudo, foram avaliados 23 compostos, dos quais 14 derivados são híbridos. A síntese dos compostos apresentou rendimento de 47,7% (ACT06) a 88% (ACT05) para série ACT, e na ACS de 44,8% (ACS05) a 94,9% (ACS02). Todos os compostos da série ACS apresentaram atividade antipromastigota (IC50 de 3,9 a 30,9 μg/mL). De modo diferente, os derivados da série ACT não apresentaram atividade antiparasitária. Nenhum dos derivados apresentou citotoxicidade para hemácias de origem humana, comparados às drogas de referência. Os compostos com melhor atividade, ACS01 e ACS02 (IC50 = 3,9 e 4,6 μg/mL; IS = 205,1 e 173,9 respectivamente) foram selecionados para prosseguir com a investigação. ACS01 e ACS02 foram eficazes contra cepas resistentes ao antimonial trivalente da mesma forma que nas culturas sensíveis. Além do mais, a atividade do ACS01 não está associada à fragmentação do DNA do parasito, porém ACS01 e ACS02 apresentaram uma constante de ligação de 104 M-1, demonstrando sua capacidade de intercalação ao DNA. Assim, estes resultados sugerem que os derivados da série ACS são possíveis candidatos a fármacos para a terapêutica das leishmanioses.