Neste trabalho estudou-se a adição nucleofílica de aminas secundárias cíclicas (pirrolidina, piperidina e morfolina) e a-aminoácidos (L-prolina e derivados) a alcinos ativados. Em todos os casos obteve-se sempre o aduto de Michael com estereoquímica E independente do alcino ser substituído ou não e das condições reacionais. Este fato evidencia uma adição do tipo sin, cujos possíveis estados de transição são discutidos. As reações de Michael foram sempre realizadas em condições brandas com rendimentos moderados a bons.Foram estudadas várias alternativas para a conversão de compostos enaminocarbonílios derivados da L-prolina a esqueletos do tipo cetopirrolizidínicos substituídos, possíveis precursores de alcalóides da classe das hiacintacinas. As tentativas de anelação direta dos compostos enaminoésteres, tanto em condições térmicas ou de adição-eliminação quanto em reações tandem não lograram sucesso. Estudou-se então condições redutivas (hidrogenação ou adição de hidreto) para obtenção de compostos do tipo aminodiésteres, substratos em ciclização do tipo Dieckmann. Testou-se tanto condições próticas (ROH / RONa) quanto apróticas (LDA, LHMDS), em diferentes solventes e catalisadores e, em todos os casos, obteve-se ou a recuperação do produto de partida ou sua degradação.Construiu-se desta forma intermediários avançados com potencial aplicação na síntese de alcalóides da família das hiacintacinas de forma curta e eficiente.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This paper presents a synthetic strategy for the preparation of two series of novel 1,6-disubstituted Ethyl 2-(1,4,5,6-tetrahydropyridin-3-yl)-2-oxoacetate from the reaction of the cyclic enone ethyl 2-(6-ethoxy-5 ,6-dihydro-4H-pyran-3-yl)-2-oxoacetate and aryl amines as precursors, following an ANRORC type mechanism. The substituents of the amines are the flowing: C6H5, C6H4-4-Cl, 3-Cl-C6H4,-C6H3 3,4-Cl 2,4-Cl-C6H3 3-F-C6H4, 2-F-C6H4 3-Me-C6H4, 2-OMe-C6H4, 4-Br-C6H4. The ethyl 1-aryl-6-arylamino-2-(1,4,5,6-tetrahydropyridin-3-yl)-2-oxoacetate were synthesized in a simple procedure, using room temperature and 24 h as the reaction condition. The products from this series were obtained with satisfactory yields between 45-93% and the purification thereof was performed by recrystallization. To obtain the Ethyl 1-amino-6-ethoxy-2-(1,4,5,6-tetrahydropyridin-3-yl)-2-oxoacetate the ethyl 2-(1,4,5,6-tetrahydropyridin-3-yl)-2-oxoacetate was reacted withan equivalent of primary amine in ethanol and an equivalent of pyridine was required. The reaction was refluxed for 48h. Purification of this series of compounds was accomplished by eluting the compound through a chromatographic column. The products were obtained in good yields ranging from 66-86%. / Este trabalho apresenta uma estratégia sintética para a preparação de duas séries inéditas de 2-(1,4,5,6-tetraidropiridin-3-il)-2-oxoacetato de etila 1,6-dissubstituídas à partir da enona cíclica 2-(6-etóxi-5,6-diidro-4H-piran-3-il)-2-oxoacetato de etila e aril aminas como precursores, através de um único passo reacional. Essas aminas possuem diferentes substituintes, sendo eles: C6H5, 4-Cl-C6H4, 3-Cl-C6H4, 3,4-Cl-C6H3, 2,4-Cl-C6H3, 3-F-C6H4, 2-F-C6H4, 3-Me-C6H4, 2-OMe-C6H4, 4-Br-C6H4. As 1-aril-6-arilamino-2-(1,4,5,6-tetraidropiridin-3-il)-2-oxoacetato de etila, foram sintetizadas de maneira simples, utilizando temperatura ambiente e 24h como condição reacional. Os produtos dessa série foram obtidos com rendimentos satisfatórios, entre 45-93% e a purificação dos mesmos foi feita através de recristalização. Para obtenção das 1-aril-6-etóxi-2-(1,4,5,6-tetraidropiridin-3-il)-2-oxoacetato de etila, foi necessário o uso equimolar de piridina como reagente no decorrer de todo o processo reacional, contando ainda com temperatura de refluxo e um período de 48h. A purificação dos compostos desta série foi efetuada de forma eficiente, sendo realizada através da eluição dos compostos através de uma coluna cromatográfica. Os produtos foram obtidos com bons rendimentos, variando entre 66-86%. Todos os produtos sintetizados neste trabalho foram obtidos com alto grau de pureza e identificados por Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio, Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13, Espectrometria de Massa, Análise elementar e Massa de alta resolução.

Orientador: Áulus Cavalieri Carciofi / Banca: Áureo Evangelista Santana / Banca: Ricardo Souza Vasconcellos / Banca: Lilian Rose Marques de Sá / Banca: Márcio Antonio Brunetto / Resumo: As possíveis diferenças que acometem cães de diferentes idades ainda são pouco estudadas e descritas para esta espécie. O presente estudo avaliou e comparou a composição da microbiota nas fezes e seus produtos de fermentação, aspectos histológicos da mucosa intestinal e a imunidade de cães filhotes, adultos e velhos. Para tal, 30 cães beagle foram divididos igualmente em três grupos: o grupo filhotes (GF), composto por filhotes do desmame aos 10 meses de idade; o grupo adultos (GA), composto por cães adultos entre cinco e seis anos e o grupo velhos (GV), composto por cães velhos entre 10 e 13 anos. Os animais receberam a mesma dieta e nenhum outro tipo de intervenção por 30 dias e após este período amostras de fezes frescas foram colhidas para a mensuração de: pH, determinação da concentração de lactato, ácidos graxos de cadeia curta e ramificada, amônia, indol, fenol, aminas, imunoglobulina A e composição da microbiota. Também foi adquirida amostra de sangue periférico para quantificação das populações linfocitárias CD4+CD5+, CD5+, CD8+CD5+, e CD21+ por citometria de fluxo, sendo esta analisada em cinco idades (45, 66, 87, 105 e 300 dias) do GF e a média destas avaliações comparada com GA e GV. Após esta análise, foi realizado teste de hipersensibilidade cutânea tardia e ao final destes, os animais foram anestesiados e submetidos a procedimento endoscópico para coleta de fragmentos do estômago e intestinos delgado e grosso para análise histológica dos mesmos. Considerou-se como significativos valores de P≤0,05 e como tendência valores de P<0,1. Observou-se que o GF apresentou maior número de Bifidobacterium spp. e Cluster IV. GV apresentou indicativo de menor atividade sacarolítica bacteriana observada pela menor concentração de acetato, propionato, butirato e ácidos graxos voláteis totais o que... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Possible differences that may occur in dogs of different ages have been little studied and described in this specie. The aim of this study was to evaluate and compare the composition of microbiota and some fermentation products in the feces, histological aspects of intestinal mucosa and immunity of puppies, adults and senior dogs. To perform this, 30 beagle dogs were divided into three groups: Puppy group (GF), composed of puppies from weaning to 10 months old, Adult group (GA), composed of adult dogs between five and six years and Old group (GV), composed of old dogs between 10 and 13 years. Animals received the same diet and no other intervention for 30 days, and after this period, fresh fecal samples were collected for measurement of pH, determining the concentration of lactate, short and branched chain fatty acids, ammonia, indol, phenols, amines, immunoglobulin A and composition of the microbiota. It was also acquired a peripheral blood sample for quantification of lymphocyte populations CD4+CD5+, CD5+, CD8+CD5+, and CD21+ by flow cytometry, which was analyzed in five ages of GF (45, 66, 87, 105 and 300 days) and the average of these evaluations compared with GA and GV. After this analysis was performed the delayed type hypersensitivity test and by the end of this, animals were anesthetized and submitted to an endoscopic procedure for collecting fragments of stomach and small and large intestines for histological analysis. P values ≤0.05 was considered significant and P values <0.1 as a trend. GF showed greater number of Bifidobacterium spp. and Cluster IV. GV presented an indication of reduced bacterial saccharolytic activity observed by the lower concentration of acetate, propionate, butyrate, and total volatile fatty acids which resulted in higher pH in the feces of this group. GF showed... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Marcio José Tiera / Banca: Mário Sergio Galhiane / Banca: Elói da Silva Feitosa / Resumo: O presente estudo teve como objetivo principal a síntese e caracterização de derivados hemocompatíveis de quitosana e sua utilização na preparação de nanopartículas para terapia gênica não-viral. O trabalho foi realizado em duas etapas, sendo a primeira a obtenção dos derivados, seguido de estudos da interação com o plasmídeo VR 1412 (pDNA) que expressa a β-galactosidase. A primeira etapa de síntese envolve a modificação de quitosana pela introdução de grupos amino, seguido pela ligação de cadeias de polietilenoglicol (PEG). Os derivados foram caracterizados por espectrometria de ressonância magnética nuclear de hidrogênio, potenciometria e viscosidade. Os estudos da interação foram realizados utilizando as técnicas de fluorescência, eletroforese em gel de agarose, espalhamento de luz dinâmica e citotoxicidade. O trabalho foi conduzido de forma comparativa, avaliando as mudanças estruturais e seus efeitos na força de interação e estabilidade das nanopartículas / Abstract: The current study aimed at the synthesis and characterization of hemocompatible chitosan derivatives and their use in the preparation of nanoparticles for non-viral gene therapy. The project was carried out in two steps, first the synthesis and characterization of the derivatives, followed by studies of the interaction between the chitosan derivatives and the VR1412 plasmid (pDNA), that expresses the β-galactosidase protein. The first step of synthesis was the modification of chitosan by introducing tertiary amino groups, followed by attaching the polyethyleneglycol (PEG) to the chitosan backbone. The study of the interaction between the chitosan derivatives and the pDNA was carried out using the fluorescence, electrophoresis in agarose gel, and light scattering techniques. The study was performed in order to evaluate the effect of structural changes of the chitosan backbone on the strength of interaction and stability of the nanoparticles / Mestre

Made available in DSpace on 2014-04-02T02:01:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000456126-Texto+Completo-0.pdf: 4635087 bytes, checksum: 35e00a2825acb60a04e5085333af1dd5 (MD5) Previous issue date: 2014 / The carbon capture and storage technologies are listed among the important strategies for reducing the CO2 emissions and mitigate climate change in a fossil fuel–dependant world. Among CO2 capture techniques, chemical absorption process which uses aqueous amines solutions has been extensively studied and used in the industry for decades. However, this process has a number of drawbacks. In order to deal with the great number of drawbacks caused by amines, recently, mixtures of aqueous amine solutions and ILs (Ionic Liquids) have been appointed as potencial solvents for CO2 capture, because allow to combine the properties and benefits of ILs with gas absorption capacity of aqueous amine solutions. In this work, carbon steel corrosion behavior in mixtures of aqueous amines solutions (MEA or MDEA) and 1-Butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate [bmim] [BF4] in typical conditions of temperature and pressure of CO2 capture process (45 °C and 27 bar) was investigated. The corrosion rate was determined by weight loss measurements. The chemical composition, morphology and characteristics of the corrosion product scales formed on the surface of steel were analyzed by using surface techniques (SEM and EDS).The properties of the corrosion product scales were also evaluated by potentiodynamic polarization technique. The CO2 absorption was measured at 45 °C and pressures from 1 to 27 bar using a Magnetic Suspension Balance (MSB). The results showed that the addition of 10 % of [bmim] [BF4] in weight at the aqueous amine solutions can provide a feasible and efficiently opportunity for CO2 capture, because in MEA (M0), a considerably decrease of 72% on the corrosion rate was observed and the CO2 absorption values were close to the ones obtained for MDEA (MD0), whereas for MDEA (MD0), the addition of 10 % of [bmim] [BF4] did not change considerably the CO2 absorption and also the corrosion rate decreased (26%). / Tecnologias de captura e armazenamento de carbono são apontadas como uma das principais tecnologias para reduzir as emissões de CO2 e mitigar o efeito das mudanças climáticas. Entre as técnicas de captura de CO2, o processo de absorção química que utilizam as soluções aquosas de aminas tem sido extensivamente estudado e utilizado por décadas. No entanto, estes processos apresentam uma série de inconvenientes. A fim de lidar com estes inconvenientes, recentemente, misturas de soluções de amina aquosas e LIs (Líquidos Iônicos) tem sido apontado como solventes potenciais para captura, pois permitem combinar as propriedades e os benefícios de LIs com capacidade de absorção de gás das soluções aquosas de amina. Neste trabalho foi investigado o comportamento de corrosão do aço carbono em misturas de soluções aquosas de aminas (MEA ou MDEA) e [bmim] [BF4] em condições típicas de pressão e temperatura (45 °C e 27 bar) empregadas em plantas de captura de CO2, bem como o efeito da adição de LIs em soluções aquosas de aminas sobre a capacidade de absorção do CO2. A taxa de corrosão foi determinada por medidas de perda de massa.A composição química, a morfologia e as características dos filmes de produtos de corrosão formados foram analisados usando técnicas de superfície (MEV e EDS). As propriedades dos filmes de produtos de corrosão também foram avaliadas pela técnica de polarização potenciodinâmica. A absorção de CO2 foi medida a 45 ° C e pressões de 1-27 bar, usando uma balança de suspensão magnética (MSB). Os resultados mostraram que a adição de 10% de [bmim] [BF4] em massa nas soluções aquosas de aminas pode proporcionar um solvente viável e eficiente para a captura, pois na MEA (M0) foi observado uma redução considerável na taxa de corrosão (72%) e os valores de absorção de CO2 ficaram próximos aos obtido para MDEA (MD0), enquanto que para MDEA (MD0), a adição de 10 % de [bmim] [BF4] não alterou consideravelmente a absorção de CO2 e também proporcionou a redução de 26% na taxas de corrosão.

O processo de destilação do petróleo bruto é geralmente sujeito à atividade corrosiva dos equipamentos pelos ácidos, naturalmente presentes no petróleo. Este problema da corrosão pode ser atenuado pela adição de misturas de aminas neutralizantes que são inibidores da corrosão. Porém, esta adição significa um custo adicional ao processamento de petróleo. Para reduzir este custo direto da injeção de aminas o presente trabalho tem como objetivo aplicar a minimização do custo de misturas de aminas, utilizando dois diferentes métodos numéricos de otimização. Para isto foi utilizado um software desenvolvido no Laboratório Virtual de Predição de Propriedades (LVPP), onde os seguintes parâmetros operacionais são levados em consideração: temperatura de formação de sal, temperatura de orvalho do vapor d’água e pH do condensado da mistura. Esses parâmetros operacionais foram calculados e utilizados como restrições de desigualdade em otimizações com os métodos de Nelder-Mead (NM) e enxame de partículas (PSO). A escolha desses dois métodos numéricos foi devido a apresentarem características diferentes de busca do ótimo da função objetivo. O método NM apresenta caráter de busca local e o método PSO caráter de busca global. Assim, as duas restrições de desigualdade de otimização aplicadas foram: 1) o pH do condensado da mistura deve ser maior ou igual ao valor ótimo de 6,5; 2) a temperatura de formação de sal deve ser menor que temperatura do ponto de orvalho do vapor d’água. Quatro diferentes casos foram estudados, com estimativas iniciais das misturas escolhidas para satisfazer os itens 1) e 2). Os parâmetros operacionais calculados para as misturas de aminas apresentaram valores de pH abaixo dos valores considerados aceitáveis. Isso exigiu a implementação de uma condição de pH que aumentasse seu valor até a condição satisfatória, conforme restrição 1). A outra condição referente a restrição 2) foi satisfeita no cálculo das misturas para todos os casos estudados, exceto para o caso 2, de modo que a água na fase líquida arraste os sais potencialmente formados. Caso essa condição não fosse cumprida ocorreria a precipitação desses sais incrustando à superfície interna das tubulações e equipamentos, ocasionando um ataque corrosivo. As otimizações dos custos das misturas foram calculadas utilizando-se os próprios dados das misturas, com as condições dos itens 1) e 2) satisfeitas, como estimativa inicial. Para todos casos estudados, o método PSO foi capaz de obter resultados com custos menores que a metade do valor obtido com o método NM. / Crude distillation equipment is usually subject to the corrosive activity of acids. This problem can be mitigated by the addition of amines. With the addition of amines to this process a cost is generated, therefore to reduce this cost of neutralizing the amines the present work applies two different optimization methods, Nelder-Mead (NM) and Particle Swarm Optimization (PSO). This was accomplished using an in house software, developed in the Virtual Laboratory of Property Prediction (LVPP), where the following operating conditions are taken into account: salt formation temperature, condensation temperature of the water and pH of the condensate of the mixture. The operational parameters were calculated and used as inequality constraints in optimizations with both Nelder-Mead (NM) and a particle swarm optimization (PSO) methods. Two inequality constraints were considered: 1) The condensate pH of the mixture should be higher or equal than 6.5; 2) The salt temperature should be less than the dew temperature of water vapor. Four different cases were studied, throught estimates initials of the mixtures to satisfy items 1) and 2). It has been found that the operating parameters calculated for several amine mixtures produced pH values below the one considered optimal. This required the implementation of a pH condition that would increase its value up to the condition satisfactory, in accordance with restriction 1). The other condition concerning restriction 2) was satisfied in the calculation of the mixtures for all studied cases, except to case 2, through which the water in the liquid phase entrains the salts formed. If this condition were not met, the precipitation of salts would occur on the internal surface of pipes and equipments, causing a corrosive attack. The cost optimizations of the amine mixtures were calculated using their own data, with the constraints of items 1) and 2) satisfied by an initial estimate. Of all the cases studied, the PSO method obtained results with costs lower than half values obtained with the NM method.

Neste trabalho foram sintetizadas seis novas aminas lipofílicas fluorescentes contendo cadeias alquílicas de diferentes tamanhos, derivadas de compostos heterocíclicos do tipo 2-(2'-hidroxifenil)benzazólicos. Suas estruturas foram confirmadas através das técnicas de Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e Carbono, bem como Espectroscopia de Absorção na região do Infravermelho e Espectrometria de Massas de Alta Resolução. As moléculas sintetizadas foram incorporadas em lipossomas compostos por fosfatidilcolina (PC) da lecitina de soja e lipossomas de PC contendo o anfifílico glicoconjugado (C22PEG900GlcNAc), em proporção de 1:1. Ambos foram obtidos pelo método de evaporação em fase reversa. A caracterização destes se deu por experimentos de potencial zeta (PZ) e espalhamento de luz dinâmico (DLS). Os lipossomas apresentaram altos valores de potencial zeta, mesmo após um período de 30 dias mantidos à temperatura ambiente, sugerindo que estes sistemas apresentam estabilidade coloidal contra processos de agregação. Análises feitas por DLS indicaram que os lipossomas apresentam um diâmetro de 100 nm, tanto na ausência como na presença das moléculas sintetizadas. Foi realizado o estudo fotofísico das aminas em solventes orgânicos e em solução de tampão fosfato salino (pH 7,2), através de medidas de absorção na região do UV–Vis e emissão de fluorescência. Além disso, através de estudo fotofísico, foi avaliada a inserção das aminas nos lipossomas. O coeficiente de partição das moléculas nos lipossomas foi determinado e os altos valores apresentados indicam alta lipofilicidade das mesmas, além disso, através destas medidas foi verificado que estas tendem à saturação com o aumento da cadeia alifática indicando maior afinidade pelo ambiente hidrofóbico do sistema estudado. Foi avaliada a interação dos lipossomas de PC contendo o anfifílico glicoconjugado (C22PEG900GlcNAc) com a lectina WGA, tanto na ausência como na presença das aminas. Testes de interação das aminas com albumina sérica bovina indicaram alta interação através de um mecanismo de supressão de fluorescência estático. / In this work six new benzazolic based fluorescent lipophilic amines presenting alkyl chains of different sizes were synthesized. Their structures were confirmed by classical spectroscopic techniques, as well as, High Resolution Mass Spectrometry. The photophysical study of the amines was carried out in organic solvents and in phosphate buffered saline solution (pH 7.2), by absorption measurements in the UV–Vis region and fluorescence emission. These compounds present absorption in the UV–region and emission in the visible region of the spectra. The synthesized molecules were incorporated into liposomes composed of phosphatidylcholine (PC) from soy lecithin and PC liposomes containing the amphiphilic glycoconjugate (C22PEG900GlcNAc), in a ratio of 1:1 (w/w). Both were obtained by the reverse phase evaporation method. The liposomes were characterized by zeta potential (PZ) and dynamic light scattering (DLS). The liposomes presented high values of zeta potential suggesting that these systems present colloidal stability against aggregation processes. DLS data indicated that the liposomes have a diameter of 100 nm. In addition, the insertion of the amines into the liposomes was evaluated by fluorescence emission spectroscopy. The coefficient of partition of the molecules in the liposomes was also determined. The high values indicated high lipophilicity of the synthesized compounds. The interaction of liposomes PC containing the glycoconjugate C22PEG900GlcNAc with WGA, both in the absence and presence of the amines, was evaluated. Overall, the synthesized compounds showed potential application staining liposomes and as optical sensor for BSA in solution through a static fluorescence suppression mechanism.

Neste trabalho estudou-se a adição nucleofílica de aminas secundárias cíclicas (pirrolidina, piperidina e morfolina) e a-aminoácidos (L-prolina e derivados) a alcinos ativados. Em todos os casos obteve-se sempre o aduto de Michael com estereoquímica E independente do alcino ser substituído ou não e das condições reacionais. Este fato evidencia uma adição do tipo sin, cujos possíveis estados de transição são discutidos. As reações de Michael foram sempre realizadas em condições brandas com rendimentos moderados a bons.Foram estudadas várias alternativas para a conversão de compostos enaminocarbonílios derivados da L-prolina a esqueletos do tipo cetopirrolizidínicos substituídos, possíveis precursores de alcalóides da classe das hiacintacinas. As tentativas de anelação direta dos compostos enaminoésteres, tanto em condições térmicas ou de adição-eliminação quanto em reações tandem não lograram sucesso. Estudou-se então condições redutivas (hidrogenação ou adição de hidreto) para obtenção de compostos do tipo aminodiésteres, substratos em ciclização do tipo Dieckmann. Testou-se tanto condições próticas (ROH / RONa) quanto apróticas (LDA, LHMDS), em diferentes solventes e catalisadores e, em todos os casos, obteve-se ou a recuperação do produto de partida ou sua degradação.Construiu-se desta forma intermediários avançados com potencial aplicação na síntese de alcalóides da família das hiacintacinas de forma curta e eficiente.

Orientadores: Sonia Maria Alves Bueno, Everson Alves Miranda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-14T01:27:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bresolin_IaraRochaAntunesPereira_M.pdf: 5778906 bytes, checksum: fdc379e439c53f0a541cc811f65e2be1 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Nos últimos tempos têm-se estudado plantas como biorreatores para a produção de proteínas recombinantes de interesse industrial e farmacêutico. Quando comparadas a outros sistemas de expressão, as plantas apresentam algumas vantagens, como a realização de modificações pós traducionais, baixo custo de produção, baixos riscos de contaminação por patógenos humanos, possibilidade das proteínas serem acumuladas em órgãos específicos que podem gerar maior estabilidade das mesmas. Visando a obtenção de conhecimento de base para posterior aplicação na purificação de proteínas recombinantes produzidas em plantas transgênicas, realizaram-se estudos de purificação por cromatografia negativa em Sepharose-TREN de proteínas contendo ampla faixa de pI (IgG humana), pI ácidos (HSA e BSA) e pI alcalinos (aprotinina e lisozima), adicionadas artificialmente ("spiking") a extrato de soja. Na cromatografia negativa, a proteína alvo é recuperada na fração não retida, enquanto as proteínas do extrato de soja permanecem adsorvidas na matriz. Visando maximizar a adsorção de proteínas do extrato de soja, avaliaram-se diferentes sistemas tamponantes, sendo que 2,8% das proteínas alimentadas foram detectadas na etapa de lavagem, quando se utilizou MES 25 mmol/L pH 6,5. Adicionandose IgG humana na forma de "spiking" ao extrato de soja na concentração de 1,0 mg/mL, recuperou-se 38% na lavagem com pureza de 86% e fator de purificação de 4,6. Por meio de experimentos de curva de ruptura, determinou-se a capacidade dinâmica de Sepharose- TREN como sendo 25,4 mg/mL de gel a uma vazão de 0,5 mL/min. Para proteínas de valores de pI ácidos, houve adsorção total das proteínas alimentadas enquanto que proteínas de pI alcalinos foram parcialmente adsorvidas, indicando que as interações que predominam entre o adsorvente Sepharose-TREN e proteínas são de natureza eletrostática. Para efeitos de comparação foram realizados experimentos de IMAC com íons Ni(II) e Cu(II) imobilizados em Sepharose-TREN alimentando-se extrato de soja com "spiking" de IgG humana. Resultados mostraram que a IgG apresentou pureza similar, porém com menor recuperação que em cromatografia negativa em Sepharose-TREN. Experimentos em Sepharose-DEAE foram realizados alimentando-se extrato de soja com "spiking" de IgG humana, possibilitando a adsorção de proteínas do extrato de soja e a purificação de IgG, porém com menor recuperação de IgG na lavagem quando comparado a Sepharose-TREN. / Abstract: In recent years, plants have been studied as bioreactors for the production of recombinant proteins with industrial and pharmaceutical interest. When compared to other expression systems, plants have several advantages, such as the possibility of posttranlationals modification, low production cost, low risk of contamination by human pathogens, and the accumulation of proteins in specific organs that can generate greater protein stability. Bioseparation is a key step in the bioprocessing of plant material used as biorreactors and chromatography a key unit operation in the bioseparation train. Negative chromatography - a chromatography in which the target protein is recovered in the nonretained fractions while impurities remain adsorbed in the matrix - allows product recovery in one step. Aiming to obtain the basic knowledge for further application in the purification of recombinant proteins produced in transgenic plants, in this work we evaluated the use of negative chromatography on Sepharose-TREN with spiking of proteins of wide pI range (human IgG), high pI (HSA and BSA) and low pI (aprotinin and lysozyme) added in soybean extract. Experiments using MES 25 mmol/L pH 6.5 as adsorption buffer, 2.8% of the total protein fed was found in flowthrough fractions. Adding 1.0 mg/mL of human IgG in soybean extracts, 38% of total protein was recovered in the washing step with 86% purity and purification factor of 4.6. Breakthrough curves showed that Sepharose-TREN presented a dynamic capacity of 25.4 mg of total protein per milliliter of gel at a flow rate of 0.5 mL/min. Total protein adsorption was achieved when proteins of low pI were used while proteins of high pI were partially adsorbed, showing that the interactions between the adsorbent and TREN-Sepharose proteins are electrostatic. Sepharose-TREN was used as chelating ligand in IMAC with immobilized Ni(II) and Cu(II). Experiments with soybean extract spiked with IgG as feedstream solution resulted in similar purity but a lower IgG recovery than those with Sepharose-TREN in negative chromatography. Classic ion exchanger Sepharose-DEAE adsorbed the native soybean proteins while IgG was recovered in nonretained fractions with similar purity but lower recovery than when using Sepharose-TREN. / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Lucia Regina Durrant / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-15T18:41:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dias_ElisangelaFrancisconGuimaro_D.pdf: 1126460 bytes, checksum: 218340ed688851cd46f637d8f8b3cd16 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Azocorantes são compostos aromáticos com um ou mais grupos azo (-N=N-). São os maiores e a mais importante classe de corantes sintéticos usados em aplicações industriais. Eles são considerados compostos xenobióticos recalcitrantes aos processos de biodegradação, e a presença destes azocorantes nos ecossistemas aquáticos é a causa de sérios problemas ambientais e relacionados com a saúde. Neste trabalho, a habilidade em degradar azocorantes de 62 linhagens bacterianas previamente isoladas de efluente industrial foi investigada. A seleção das linhagens foi realizada através de testes de descoloração visual em meio líquido com azocorantes suplementados com diferentes fontes de carbono. O processo de descoloração foi realizado sob condições microaerofílicas ou estáticas até que nenhuma cor fosse observada, seguido de agitação para promover a biodegradação dos metabólitos produzidos. A descoloração e a biodegradação dos azocorantes bem como dos metabólitos produzidos foram monitoradas por análises de UV-vis, Carbono Orgânico Total (COT), Espectroscopia no Infravermelho com Transformadas de Fourier (FTIV) e Cromatografía Líquida de Alta Eficiência e Espectrometria de Massa (CLAE-EM). A atividade de enzimas oxidativas (peroxidase, lacase and tirosinase) foram analisadas para verificar se estas estavam envolvidas no metabolismo de biodegradação dos azocorantes. Análises de toxicidade foram realizadas antes e após a degradação dos azocorantes utilizando o organismo teste Daphnia magna.As aminas aromáticas geradas da biodegradação dos azocorantes foram testadas com o propósito de obter a polimerização. A enzima lacase de Myceliophthora Thermophila foi usada para catalizar reações de acoplamento entre as aminas aromáticas produzidas. As análises de UV-vis mostraram que os corantes foram descoloridos (80%) em condições microaerofílicas ou estáticas. Não houve nenhuma mudança significativa na cor, no estágio aeróbio seguinte. O tempo de descoloração mostrou relação com o meio de cultura utilizado e com a estrutura química dos corantes. Os corantes monoazo foram descoloridos entre 8 a 120 hs. Os diazo e os triazo foram descoloridos após 120 e 168 hs. As linhagens bacterianas descoloriram os corantes somente quando o meio foi suplementado com glicose e piruvato ou extrato de levedura. Na ausência destes compostos, as culturas foram incapazes de descolorir, indicando um requerimento obrigatório de uma fonte suplementar de carbono para alcançar a descoloração. Resultados mostraram que, quando o meio foi incubado em condições microaerofílicas ou estáticas a redução no COT (Carbono Orgânico Total) foi menor do que em condições aeróbias, onde 70% de redução foi observado. A presença de altas concentrações de aminas aromáticas em condições microaerofílicas ou estáticas confirma que houve redução das ligações azo. Porém, houve a confirmação da oxidação destas aminas no estágio aeróbio, indicando que um proceso oxidativo foi responsável pela biodegradação dos metabólitos. Foi observada atividade de tirosinase para na linhagem de Brevibacterium sp, sugerindo o papel desta enzima no processo de descoloração dos azocorantes, não sendo observada atividade de lacase e peroxidase. Nas análises de Espectroscopia no Infravermelho com Transformadas de Fourier (FTIV) após condições microaerofílicas ou estáticas foram observadas bandas em regiões atribuidas a grupamentos amina. Estas bandas desapareceram no estágio aeróbio e foram observadas novas bandas nas regiões associadas com ácido carboxílicos e íons NH3+, confirmando mineralização parcial dos produtos de degradação dos azocorantes, bem como dos metabólitos do meio de cultura. Os metabólitos produzidos pela biodegradação do azocorante RR 198 foram analisados por CLAEEM, para tentar identificar alguns metabólitos desconhecidos. Entre os possíveis compostos produzidos da biodegradação do RR198, 4-cloro-N-o-toluil-1,3,5-triazina-2-amino; sódio 4-aminonaftaleno-2-sulfonado e 3,6 -dimetil-7-(o-toluildiazenil) naftaleno-1-amino, tiveram razoável semelhança com os metabólitos aromáticos encontrados na amostra. Após condições aeróbias, a intensidade dos íons presentes nestes metabólitos foram reduzidos. Estes resultados também foram confirmados pelas análises de FTIV e poderia ser explicado pela diminuição dos compostos aromáticos gerados nas condições microaerofílicas ou estáticas. Foi observado que após um longo período de tempo, a lacase catalizou a polimerização das aminas aromáticas presentes nas soluções descoloridas. Os produtos gerados precipitaram e adquiriram cor, como confirmado pelas análises de UV-Vis. Os tamanhos das partículas foram significativamente maiores após o tratamento com lacase, como mostra as análises de Espectroscopia de Correlação de Fótons. Todas as linhagens bacterianas usadas neste estudo foram capazes de descolorir e degradar os azocorantes em condições microaerofílicas ou estáticas. Em condições aeróbias, ocorreu parcial mineralização dos produtos de degradação dos azocorantes, bem como dos metabólitos do meio, como confirmado para o organismo teste Daphnia magna e Carbono Orgânico Total (COT). Após o estudo, estas bactérias foram identificadas através de análises de sequência de rDNA 16S como Staphylococcus arlettae, Klebsiella sp, Microbacterium sp, Leucobacter albus e Brevibacterium sp / Abstract: Azo dyes, which are aromatic compounds with one or more azo (-N=N-) groups, are the most important and largest class of synthetic dyes used in commercial applications. They are considered as xenobiotic compounds that are very recalcitrant to biodegradation processes. The presence of these dyes in the aqueous ecosystem are a cause of serious environmental and health concerns. In this work, the ability of 62 bacterial strains previously isolated from an industrial activated sludge process treating effluent containing azo dyes was investigated. The selection was undertaken, through visual decolorization, in liquid media with azo dyes supplemented with diferent carbon sources. Decolorization process was performed under microaerophilic or static conditions until no color was observed. The medium was then aerated to promote the biodegradation of the metabolites produced. The azo dyes decolorization and biodegradation and the aromatic amines produced were monitored by UV-Vis, Total Organic Carbon (TOC), Fourier Transformed Infra Red (FTIR) and High Performence Liquid Chromatography (HPLC- MS). Activity of the oxidoreductase enzymes (peroxidase, laccase and tyrosinase) was evaluated in cultures of the bacterial isolates. Acute toxicity tests with Daphnia magna (Crustacea, Cladocera) were carried out after and before microaerobic or static and aerobic conditions. The aromatic amines generated from the biodegradation of the azo dyes were tested for their ability to undergoing polymerization using a laccase from M. thermophila to catalyze the coupling reactions of the aromatic amines. The decolorization time showed a relationship with the culture medium and chemical structure of the dyes. The monoazo dyes were decolourized within 8 to 120 h. The diazo and triazo were decolourized required 120 to168 h, approximately. UV-Vis analysis showed complete decolorization (>80%) in the microaerophilic or static conditions. No significant color changes were detected in the following aerobic stage. However the bacterial strains could only decolourize the dyes effectively when the medium was supplemented with glucose and pyruvate or yeast extract. In the absence of these compounds, the cultures were unable to decolorize the dyes, thus indicating an obligate requirement for a supplementary carbon source for dye decolorization. When the medium was incubated under microaerophilic conditions, the reduction in TOC was low even after 7 days of incubation. Conversely, a significant increase in TOC reduction (>70%) was observed in the aerobic stage. The reduction of azo bonds is known to yield the production of high concentrations of amines in the microaerophilic or static stage therefore confirmed the azo bond was reduced. Therefore the oxidation of these aromatic amines was confirmed by the absence of amine in the aerobic stage indicating that an oxidative process was responsible by metabololite biodegradation. Tyrosinase activity was observed for Brevibacterium sp, suggesting the role of this enzyme in the decolorization process, but no-activity was observed for laccase and peroxydase. In the Fourier Transformed Infra Red (FTIR) analysis after microaerophilic or static decolorization, new bands were observed in region attributed to amine groups. These bands disappeared in the aerobic stage and a new broad region associated with carboxylic acid and NH3+ ions were observed. However, in the aerobic stage the partial mineralization of the dye degradation products and of the medium metabolites was confirmed. The decolorization products of the RR198 dye were analyzed by High Performence Liquid Chromatography (HPLC- MS) for tentative identification of the unknown metabolites tentating identifield compounds included, 4-chloro-N-o-tolyl-1,3,5-triazin-2-amine; sodium 4-aminonaphthalene-2-sulfonate and 3,6-dimethyl-7-(o-tolyldiazenyl) naphthalen-1-amine. After aerobic conditions the intensity of these metabolites was reduced. These results were also confirmed by FTIR and could be explained by degradation of these aromatics coumpounds previously generated in microaerophylic or static stage. After an extended period of time, laccase catalyzed polymerization of the aromatic amines in the destained solutions. The products generated precipitated spontaneously from the solution and acquired some color as confirmed by the UV-Vis analysis. The particle size was also significantly higher after laccase treatment as show by Photon Correlation Spectroscopy analysis (PCS). The bacterial strains used in this study were able to totally destain the azo dyes under microaerophilic or static condition. In the aerobic stage, partial mineralization of the dye decolorization products as well as of the medium metabolites was also confirmed by toxicity testing and TOC measurements. The strains were identified by 16S rDNA gene sequence analysis as Staphylococcus arlettae, Klebsiella sp, Microbacterium sp, Leucobacter albus e Brevibacterium sp. / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos