A semente de milho representa uma importante fonte de proteínas para alimentação humana e de animais monogástricos. Porém, como membros da família dos cereais não apresentam proteínas com um balanço nutricional adequado, devido principalmente ao baixo conteúdo de lisina. As proteínas de reserva da semente de milho são classificadas como fração não-zeína (albumina, globulina e glutelina) e zeína. Mutantes de endosperma de milho, como o2 apresentam quantidades maiores de lisina na semente. Porém, muitos mutantes considerados "alta lisina" não foram ainda caracterizados bioquimicamente. Uma série de mutantes, opaco (o1, o2, o5, o7, o10, o11 e o13) e floury (fl1 e fl2), foram estudadas para determinar as quantidades de proteínas de reserva, o perfil electroforético das proteínas e o conteúdo de LYS na semente, endosperma e embrião. Foi observado que os mutantes apresentaram redução no conteúdo de zeína e aumentos da fração não-zeína com variações dependendo do mutante, do background genético e do tecido analisado. A análise da semente determinou aumentos principalmente da fração albumina e globulina nos mutantes, exceto para o5 com aumentos apenas da fração glutelina. No endosperma foi observado aumento principalmente de albumina em o2, o7 e o5; e globulina em fl2, o10, o11 e o13. No embrião foram registrados os níveis maiores de albumina e globulina da semente, porém a quantidade de proteínas de reserva foi similar entre os genótipos. As quantidades de lisina presentes nas frações protéicas foram sempre maiores nos mutantes, porém para o10, o11 e o13 diferenças significativas, foram observadas principalmente para LYS na fração glutelina. O perfil SDS-PAGE revelou a presença de numerosas bandas protéicas variando entre 100kDa e 10kDa, sendo que a fração não-zeína revelou maior heterogeneidade no número de bandas. Bandas protéicas de maior intensidade foram observadas nos mutantes. Análise 2D-PAGE de proteínas de reserva do endosperma de mutantes o1, o2, fl1 e fl2, revelou padrões similares de distribuição de proteínas, aumentos de intensidade de spots protéicos e a presença de spots restrita ao perfil dos mutantes. Os resultados sugerem que os mutantes opacos e floury avaliados apresentam quantidades maiores de LYS na semente quando comparados aos genótipos selvagens que lhes deram origem. A futura análise dos spots que apresentaram alterações altamente significativas permitirá uma maior compreensão dos efeitos específicos dessas mutações sobre a regulação da biossíntese das proteínas de reserva e do acúmulo de lisina no grão. / The maize seed is an important source of proteins for humans and monogastric animals. However, such as all cereals, maize storage proteins is nutritionally poor mainly due to the low content of lysine. Maize seed storage proteins can be classified as non-zeins (albumins, globulins and glutelins) and zein. Some storage proteins mutants such as the o2 mutants exhibit higher contents of lysine. However, many of these high-lysine mutants have not yet been biochemically characterized. The opaque mutants o1, o2, o5, o7, o10, o11, o13 and floury mutants fl1 and fl2 were analyzed for storage proteins contents, eletrophoretic profile and lysine content in the seeds, endosperm, and embryo. It was observed that the mutants exhibited reduction in the zein fraction and increase in the non-zein fraction which varied according to the mutant, genetic background and tissue analyzed. The whole seed analysis revealed increases mainly in albumins and globulins, with the exception of the o5 mutants which exhibited a higher increase in the glutelin fraction. In the endosperm it was observed increase in the albumin fraction in o2, o7 and o5 and in the globulin fraction in fl2, o10 and o13. Higher concentrations of albumin and globulin were observed in the embryo, but with similar concentrations of total proteins among the mutants. The lysine content was higher always higher in the storage proteins of the mutants, however, in o10, o11 and o13 significant differences for lysine content were observed mainly in the glutelin fraction. SDSPAGE analysis revealed the presence of several band varying from 10kDa to 100kDa, with a higher heterogeneity among the non-zein fraction. Bands with higher intensity have been observed in the mutants. 2D-PAGE analysis revealed that the o1, o2, fl1 and fl2 mutants exhibited similar band patterns with increases in similar spots and mutant specific bands. The results suggest that the opaque and floury mutants exhibited higher lysine content when compared to their respective wild-type counterparts. Future analysis of the protein spots that exhibited significant variations will allow a better understanding of the specific effects of each mutation on the regulation of storage protein synthesis and lysine accumulation in the seeds.

O tratamento atual indicado para casos de envenenamentos por peçonhas é a administração intravenosa de antivenenos, produzidos através da hiperimunização de animais. Entretanto, os antivenenos disponíveis podem, algumas vezes, não proteger os pacientes e causar reações de hipersensibilidade. Fosfolipases A2 (PLA2), L-aminoácido oxidases (LAAO), metalo e serinoproteases são os principais componentes de peçonhas ofídicas e contribuem para a neurotoxicidade, hemorragia, hemólise, miotoxicidade, cardiotoxicidade e formação de edemas. Foram empregados ensaios para avaliar as atividades das enzimas presentes na peçonha de serpentes da espécie Lachesis muta rhombeata e aquele para atividade de protease foi otimizado. A tecnologia de Phage display foi empregada para a seleção de fagos-anticorpos capazes de reconhecer a peçonha bruta. Os fagos foram amplificados em Escherichia coli TG1 e usados para infectar E. coli HB2151, a qual produz fragmentos de anticorpos humanos solúveis. Estes foram purificados e utilizados em testes de inibição de alguns dos componentes tóxicos da peçonha. Os testes de atividade para PLA2, protease e Laminoácido oxidase foram padronizados com sucesso e as 3 proteínas mostraram elevada atividade enzimática. Após otimização, a quantidade de peçonha necessária para o ensaio de protease foi reduzida em 25 vezes. A massa molecular de PLA2 foi estimada em 17 kDa e as massas moleculares de proteases foram estimadas em 40, 35 e 24 kDa, através de zimogramas. O método de bio panning foi eficiente para a seleção de fagos-anticorpos contra a peçonha bruta. Diversos fragmentos de anticorpos foram purificados e incubados com a peçonha bruta para testar suas capacidades de neutralização sobre cada enzima. Cinco clones demonstraram-se hábeis em inibir a PLA2 através da inibição da hemólise. O clone 4E inibiu 100% da hemólise durante as duas horas de ensaio quando pré-incubado na proporção 2:1 (scFv:peçonha). Os clones 2C e 4E inibiram 100% durante uma hora quando pré-incubados na proporção 1:1 e os clones 2F e 9F inibiram a hemólise parcialmente. Outros testes serão conduzidos para a seleção de clones capazes de neutralizar as demais enzimas, os quais, juntamente com os clones já selecionados, serão analisados através de ensaios in vivo. Espera-se que eles possam contribuir para a construção de um novo antiveneno capaz de superar algumas das dificuldades associadas às técnicas de imunoterapia convencionais / The current treatment for animal envenoming is the intravenous administration of antivenoms, produced by animal hyperimmunization. Unfortunately, available antivenoms sometimes do not protect patients and may cause hypersensitivity reactions. Phospholipases A2 (PLA2), L-amino acid oxidases, metallo and serine proteases are considered the most important snake venom components and contribute to neurotoxicity, hemorrhage, hemolysis, myotoxicity, edematogeny and cardiotoxicity. Assays for evaluating the enzymes present in Lachesis muta rhombeata venom were developed and the protease one was optimized. Phage display technology was used to select phage antibodies able to recognize the crude venom. Phages were amplified in Escherichia coli TG1 and used to infect E. coli HB2151, which produces human antibody fragments. Inhibition tests aiming the neutralization of some toxic components of the venom were performed using purified antibody fragments. Activity assays for evaluating PLA2, protease and L-aminoacid oxidase were successfully performed and all enzymes showed high activity levels. The molecular mass of PLA2 was estimated in 17 kDa and the molecular mass of proteases were estimated in 40, 35 and 24 kDa, by zymography. After optimizing the conditions for proteolytic assay, it was possible to use 25 times less venom than it was necessary at first. The bio panning method was efficient for selecting specific phage antibodies against the crude venom. Several clones were selected to infect HB2151 and to produce soluble antibody fragments, which were purified and incubated with the venom to test their inhibition capacity over each enzyme. Five clones demonstrated ability to neutralize PLA2 by inhibiting hemolysis. The clone 4E could inhibit 100% of hemolysis for over 2 hours when preincubated at the ratio 2:1 (scFv:venom). Clones 2C and 4E could inhibit 100% for 1 hour when preincubated at the ratio 1:1 and clones 2F e 9F could inhibit partially. Other tests will be performed to select clones able to neutralize other enzymes and, together with the clones already selected, will be evaluated by in vivo experiments. It is expected that they may contribute to the construction of a potential new antivenom able to overcome some of the problems associated with conventional immunotherapy

A disponibilidade de nitrogênio no solo e o fornecimento de doses de potássio podem alterar a nutrição do capim-marandu, com reflexos diretos na morfologia, atividade de enzimas e acúmulo de poliaminas nas plantas. Objetivou-se: i) identificar a forma de nitrogênio e a dose de potássio que promovem a maximização dos atributos morfológicos da parte aérea e das raízes e, consequentemente, a produção de forragem do capim-marandu (Brachiaria brizantha cv. Marandu); ii) avaliar as concentrações de nitrogênio, nitrato, amônio, potássio, prolina, poliaminas e clorofila, além do valor SPAD e da redutase do nitrato nas folhas diagnósticas, em função da adubação de formas de nitrogênio com doses de potássio e iii) quantificar as transformações do nitrogênio do solo, em função da aplicação de formas de nitrogênio e adição de material vegetal de capim-marandu. Os experimentos foram realizados em duas etapas: a) em casa de vegetação onde as plantas de capim-marandu foram cultivadas em solo classificado como Neossolo Quartzarênico. Quatro formas de nitrogênio (nitrato, amônio, 70%nitrato+30%amônio e amídica) mais controle e quatro doses de potássio (0, 150; 300 e 450 mg dm-3) foram combinados em um fatorial completo 5x4. As unidades experimentais consistiram em 80 vasos e o delineamento experimental foi o de blocos inteiramente casualizados, com quatro repetições; b) em laboratório, seis combinações envolvendo formas de nitrogênio (nitrato e amônio enriquecidos com 15N e controle) e presença/ausência de material vegetal de capim-marandu foram avaliados em incubação aeróbica. Cada combinação foi repetida três vezes e todos foram incubados por oito períodos de avaliação (0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 e 20 semanas) com o Neossolo Quartzarênico, em delineamento completamente causalizado. Os resultados demonstraram que o fornecimento de nitrogênio associado ao de potássio foi fundamental para elevar a produção de forragem e das raízes e a concentração desses elementos nas folhas diagnósticas do capim-marandu. A forma nitrato+amônio, na dose de potássio de 450 mg dm-3, proporcionou mais elevada área foliar, a qual foi determinante no incremento da produção de forragem. O fornecimento das formas de nitrato, nitrato+amônio e amídica, associados à máxima dose de potássio proporcionaram incrementos nos números de perfilhos e folhas, área foliar, e consequentemente na produção de forragem. O não fornecimento de nitrogênio e a aplicação na forma de amônio proporcionaram as mais baixas produções de forragem. O incremento das doses de potássio reduziu os sintomas de toxicidade de amônio nas plantas de capim. Os atributos produtivos do sistema radicular foram alterados positivamente pelas formas nitrato, nitrato+amônio e amídica e pelas doses de potássio. O valor SPAD foi incrementado pelas formas nitrato, nitrato+amônio e amídica e a aplicação de potássio de 336 mg dm-3 que resultou em 38 unidades SPAD. A concentração de clorofila de 35 ?g g-1 correspondeu à de nitrogênio total de 22,5 g kg-1. A enzima redutase do nitrato teve sua atividade aumentada com o incremento das doses de potássio e o fornecimento de nitrato+amônio. As concentrações de putrescina, espermidina, espermina e prolina aumentaram mediante o fornecimento de amônio e diminuíram com incremento das doses de potássio. Os baixos teores de 15NH4 + no solo após a segunda semana permitiram verificar que todo amônio foi imobilizado pelos microrganismos do solo, em todas as combinações. A aplicação de amônio, com material vegetal de capimmarandu, resultou nos mais elevados teores de amônio, aminoácido, aminoaçúcar e nitrogênio total hidrolisados. / Soil nitrogen availability and potassium supply rates can influence Marandu palisadegrass nutrition, with direct effect on the morphology, enzyme activity and polyamines accumulation in plants. This study aimed to: i) identify the nitrogen form and the potassium rate that maximizes the morphological attributes of shoots and roots, and consequently, the forage production of Marandu palisadegrass (Brachiaria brizantha cv. Marandu), ii) evaluate the nitrogen, nitrate, ammonium, potassium, proline, polyamines and chlorophyll concentration, as well as the SPAD value and the nitrate reductase activity in diagnostic leaves, as a function of nitrogen forms and potassium rates, and iii) quantify the soil nitrogen changes according to different forms of nitrogen and addition of Marandu residue. The experiments were carried out in two stages: a) in a greenhouse, where Marandu plants were grown in an Entisol. Four nitrogen forms (nitrate, ammonium, 70% nitrate+30% ammonium, urea) plus the control (no nitrogen) and four potassium rates (0, 150, 300 and 450 mg dm-3) were arranged in a 5x4 complete factorial design. The experimental units consisted on 80 pots. The twenty combinations were evaluated in a completely randomized block design with four replications; b) in the laboratory experiment, six combinations involving three forms of N (nitrate and ammonium enriched with15N atoms 1% and no nitrogen) and Marandu residue (presence/absence) were evaluated using aerobic incubation. Each combination was replicated three times and incubated under eight incubation periods (0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 and 20 weeks) in an Entisol. In total, 144 experimental units were evaluated using a completely randomized design. The results from the first experiment showed that nitrogen supply associated with potassium rates were important for increasing the forage and roots biomass and the concentration of these elements in the diagnostic leaves. Nitrate+ammonium and potassium at 450 mg dm-3 provided with the largest leaf area, which was decisive for high forage production. The supply of nitrate, nitrate+ammonium and urea, associated with the maximum potassium rate resulted in increased number of tillers, leaves, leaf area, and consequently, increased forage production. Combinations involving ammonium and no nitrogen provided with the lowest forage production. High potassium rates were associated with less ammonium toxicity symptoms on the plants. The productive attributes of the root system were positively modified by nitrate, nitrate+ammonium and urea and by the high potassium rates. The SPAD value increased with nitrate, nitrate+ammonium and urea and potassium at 336 mg dm-3 resulted in 38 SPAD units. Chlorophyll concentration of 35 mg g-1 corresponded to a total nitrogen concentration of 22.5 g kg-1. Nitrate reductase activity increased with higher potassium rates and nitrate+ammonium supply. Higher concentrations of putrescine, spermidine, spermine and proline were observed with ammonium supply, but they decreased with higher potassium rates. The low concentration of 15NH4 + in the soil after the second week indicates that all ammonium was immobilized by soil microorganisms, for all combinations. The application of ammonium in combination with Marandu residue resulted in higher concentration of ammonium, amino acid, amino sugar and total nitrogen hydrolysates.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa clonal caracterizada pela presença do cromossomo Philadelphia e o oncogene BCR-ABL1. Este oncogene codifica a oncoproteína Bcr-Abl com atividade tirosina-quinase constitutiva. A proteína Bcr-Abl é responsável pela resistência das células leucêmicas a apoptose. Atualmente, os pacientes com LMC são tratados com os inibidores de tirosina-quinase - mesilato de imatinibe, dasatinibe e nilotinibe. Apesar de o tratamento ser eficiente, pacientes em fases avançadas e mesmo na fase crônica da doença, apresentam resistência à terapia. Desta forma, novos fármacos devem ser investigados para melhorar o tratamento da LMC. As L-aminoácido oxidases (LAAOs) têm sido descritas como substâncias citotóxicas e indutoras de apoptose. Assim, o principal objetivo do presente estudo foi investigar o potencial antitumoral da LAAO isolada da serpente Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) nas células Bcr-Abl positivas. Avaliou-se a citotoxicidade da CR-LAAO nas linhagens HL-60 (linhagem Bcr-Abl negativa), HL-60.Bcr-Abl, K562 e KCL22 (linhagens Bcr-Abl positivas) e nas células mononucleares (MNC) de sangue periférico de indivíduos saudáveis, na presença ou ausência da catalase. Para investigar os mecanismos da ação citotóxica da CR-LAAO, realizou-se os ensaios de indução de apoptose por meio da quantificação das percentagens de núcleos hipodiplóides e anexina V-FITC, nas linhagens celulares e nas células MNC de indivíduos saudáveis e pacientes com LMC. Avaliou-se também os níveis de expressão das caspases 3, 8 e 9, o potencial de membrana mitocondrial, danos no DNA e o efeito apoptótico da toxina combinada com os inibidores de tirosina-quinase nas linhagens Bcr-Abl positivas. Além disso, investigamos se a CR-LAAO foi capaz de modular a expressão dos apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-146a, miR-21, miR-130a e miR-130b, assim como das proteínas pro- e anti-apoptóticas Bak, Bax, Bid, Bim, A1, Bcl-2, c-Flip, Ciap-2 e Mcl-1 nas linhagens Bcr-Abl positivas. Nossos resultados mostraram que o efeito citotóxico da CR-LAAO foi mais potente nas linhagens Bcr-Abl positivas em relação às células MNC de indivíduos saudáveis, e está associado ao peróxido de hidrogênio produzido durante a reação enzimática da CR-LAAO. Demonstrou-se também que a CR-LAAO induziu apoptose nas linhagens Bcr-Abl postivas testadas e nas células MNC de pacientes com LMC na fase crônica da doença. Em todas as linhagens celulares detectou-se danos no DNA, perda do potencial de membrana e ativação das caspases 3, 8 e 9. A percentagem de apoptose aumentou quando as células HL-60.Bcr-Abl foram tratadas com a CR-LAAO combinada com os inibidores de tirosina-quinase. A CR-LAAO modulou a expressão dos apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-21, miR-130a e miR-130b e de possíveis proteínas alvos nas linhagens Bcr-Abl positivas. Sendo assim, os resultados obtidos sugerem que a CR-LAAO apresenta uma ação antitumoral capaz de destruir as células leucêmicas / Chronic myeloid leukemia (CML) is a clonal myeloproliferative disease characterized by the presence of Philadelphia chromosome and BCR-ABL1 oncogene. This oncogene encodes the Bcr-Abl tyrosine kinase (TK) which presents a constitutive activity. The Bcr-Abl is responsible for leukemic cells resistance to apoptosis. The CML patients are currently treated with tyrosine kinase inhibitors (TKI) - imatinib mesylate, dasatinib and nilotinib. Although TKI are efficient for CML treatment, patients in advanced phases and even in chronic phase of the disease present resistance to therapy. Thus, potential new drugs must be investigated to improve the CML treatment. The L-amino acid oxidases (LAAOs) have been described as cytotoxic and apoptosis-inducing substances. Here, we investigated the LAAO from Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) antitumoral potential against Bcr-Abl positive cells. We evaluated the CR-LAAO cytotoxic effect against HL-60 (Bcr-Abl negative cell line), HL-60.Bcr-Abl, K562, KCL22 (Bcr-Abl positive cell lines) and the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy subjects, in the presence or absence of catalase. To investigate the mechanisms underlying the CR-LAAO cytotoxic action, we performed the apoptosis induction assays through the hypodiploid nuclei and annexin-V quantification in the cell lines and PBMC from healthy subjects and CML patients. We also evaluated the levels of caspases 3, 8 and 9 expression, the mitochondrial membrane potential, DNA damage and the apoptotic effect of CR-LAAO combined with TKI on Bcr-Abl positive cells. In addition we investigated if CR-LAAO was capable of modulating the apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-29c, hsa-let-7d, miR-145, miR-146a, miR-21, miR-130a, miR-130b, miR-142-3p and miR-26a, the pro- and anti-apoptotic proteins (Bak, Bax, Bid, Bim, A1, Bcl-2, c-Flip, Ciap-2 and Mcl-1 expression in HL-60, HL-60.Bcr-Abl, K562 and KCL22 cells. Our results showed that the CR-LAAO cytotoxic effect was more potent in Bcr-Abl positive cell lines than in PBMC from healthy subjects and it is linked to hydrogen peroxide produced during the enzymatic action of CR-LAAO. It was also demonstrated that CR-LAAO was capable of inducing apoptosis in Bcr-Abl positive cell lines and CML patient\'s cells in chronic phase of the disease. In all tested cell lines, the loss of mitochondrial membrane potential, DNA damage and caspases 3, 8 and 9 activation were detected. The apoptosis percentage was improved when HL-60.Bcr-Abl cells were treated with CR-LAAO combined with TKI. The CR-LAAO modulated the apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-21, miR-130a and miR-130b expression as well the predict target proteins levels on Bcr-Abl positive cells. Thus, our results suggest that CR-LAAO presents an antitumoral action capable of destroying the CML cells.

As L-aminoácido oxidases (LAAOs) isoladas de peçonhas de serpentes são alvos de um grande número de pesquisas devido às suas inúmeras ações biológicas e farmacológicas. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar funcionalmente a Laminoácido oxidase da peçonha de Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) por meio das atividades: bactericida, fungicida, leishmanicida, tripanomicida, citotóxica, inflamatória e análise da expressão de genes e proteínas apoptóticas. A CR-LAAO mostrou-se altamente citotóxica sobre as células tumorais HepG2 e HL-60, promovendo cerca de 80% de morte celular na maior concentração testada (100 ?g/mL) e apresentou baixa toxicidade sobre células PBMC. Foi possível observar que a proteína induziu apoptose (AV+) em PBMC. Em HepG2, as menores concentrações (0,1-2,5 ?g/mL) causaram apoptose (AV+), e as maiores (5-100 ?g/mL) causaram apoptose/necrose (PI+/AV+). Em HL-60, as concentrações testadas (0,1-100 ?g/mL) induziram apoptose/necrose (PI+/AV+). A expressão do gene FAS e ativação das caspases 8 e 3 determinou a ativação da via extrínseca da apoptose na linhagem HL-60. A CR-LAAO promoveu algumas alterações na modulação do ciclo celular, sendo que nas linhagens tumorais os atrasos se concentraram nas fases G0/G1 e S do ciclo celular. Ademais, a CR-LAAO mostrouse bactericida contra as cepas S. aureus e E. coli, com maior especificidade para a cepa gram-positiva (S. aureus). Em análises de microscopia de transmissão, foi possível observar um desmantelamento da parede celular bacteriana. Após 6h de pré-incubação com C. albicans, a CR-LAAO foi capaz de inibir 80% do crescimento da levedura. A CR-LAAO mostrou-se também um bom agente leishmanicida contra as espécies L. infantum chagasi (IC50=16,66 ?g/mL) e L. braziliensis (IC50=24,47 ?g/mL) e inibiu o crescimento da forma promastigota do Trypanosoma cruzi (IC50=196,8 ?g/mL). Testes in vivo revelaram que a CR-LAAO promoveu inflamação local aguda, recrutando células inflamatórias como neutrófilos e induzindo a formação de citocinas (IL-6 e IL-1?) e mediadores lipídicos (LTB4 e PGE2). Os resultados obtidos sugerem que a CR-LAAO apresenta potencial biotecnológico evidente, com efeitos antiparasitários, fungicida, bactericida, bem como atividade antitumoral in vitro. Dessa forma, os resultados obtidos para a CR-LAAO fornecem subsídios importantes para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas de ação direcionada, como quimioterápicos e antimicrobianos mais eficazes. / L-amino acid oxidases (LAAOs) isolated from snake venoms are targets of a large number of researches due to their numerous biological and pharmacological actions. The objective of this study was to functionally characterize the L-amino acid oxidase from the venom of Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) through the activities: bactericidal, fungicidal, leishmanicidal, trypanocidal, cytotoxic, inflammatory and analysis of gene expression and apoptotic proteins. CR-LAAO showed high cytotoxicity in HepG2 and HL-60 tumor cells, inducing about 80% cell death at the highest concentration tested (100 ?g/mL) and showing low toxicity in PBMC cells. It was observed that the protein induced apoptosis (AV+) in PBMC. In HepG2, lower concentrations (0.1-2.5 ?g/mL) caused apoptosis (AV+), while major concentrations (5-100 ?g/mL) caused apoptosis/necrosis (PI+/AV+). In HL-60, the concentrations tested (0.1-100 ?g/mL) induced apoptosis/necrosis (PI+/AV+). The FAS gene expression and activation of caspases 8 and 3 determined the activation of the extrinsic pathway of apoptosis in HL-60 cells. CR- LAAO promoted some changes in the modulation of the cell cycle, and delays in tumor cell lines were concentrated in G0/G1 and S cell cycle phases. In addition, CR-LAAO proved to be bactericidal against S. aureus and E. coli strains, with higher specificity for Gram-positive strains (S. aureus). In analyses of transmission electron microscopy, it was possible to observe a dismantling of the bacterial cell wall. After 6 hours of preincubation with C. albicans, CR-LAAO was able to inhibit 80% of growth of yeast. CR-LAAO also showed antiparasite potential against species L. chagasi infantum (IC50 = 16.66 ?g/mL) and L. braziliensis (IC50 = 24.47 ?g/mL) and inhibited the growth of Trypanosoma cruzi promastigote form (IC50 = 196.8 ?g/mL). In vivo tests revealed that CR-LAAO promotes acute local inflammation by recruiting inflammatory cells as neutrophils and by inducing the production of cytokines (IL-6 and IL-1?) and lipid mediators (PGE2 and LTB4). The results suggest that CR-LAAO presents evident biotechnological potential, with antiparasite, fungicidal, bactericidal and antitumor effects in vitro. Thus, the results obtained for CR-LAAO provide important information for the development of therapeutic strategies with directed action, such as more effective chemotherapeutic and antimicrobial agents.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa caracterizada citogeneticamente pela presença do cromossomo Philadelfia (Ph) e molecularmente pelo neogene bcr-abl1 que codifica a oncoproteína BCR-ABL com alta atividade de tirosina-quinase. A célula leucêmica BCR-ABL+ apresenta baixa adesão ao estroma medular, resistência à apoptose e potencial mitogênico exacerbado. A LMC possui curso evolutivo trifásico (fase crônica, acelerada e blástica) e seu tratamento pode ser realizado por meio de diferentes modalidades terapêuticas, destacando-se o mesilato de imatinibe (MI) que inibe a TK BCR-ABL induzindo altas taxas de remissão citogenética dos pacientes na fase crônica da doença. Apesar do MI ser eficiente, os pacientes na fase acelerada e blástica da doença são comumente refratários a essa terapia e na fase crônica há casos de resistência ao MI descritos. Nesse contexto, potenciais novos fármacos são investigados para melhorar a eficiência da terapia da LMC. Nesse estudo, investigamos o efeito do veneno bruto (VB) e da enzima L-amino-ácido-oxidase (LAAO) da Bothrops pirajai em desencadear apoptose em células BCR-ABL+. A apoptose das células HL-60 e HL-60.BCR-ABL foi quantificada pela detecção da percentagem de células com núcleos hipodiplóides pela da citometria de fluxo e confirmada pela observação da ativação das caspases 3, 8 e 9 por western-blot. Os resultados obtidos indicam que a LAAO é capaz de induzir apoptose em células HL-60 e HL-60.BCR-ABL por ativação das vias extrínseca e intrínseca. Além disso, foi verificado que a LAAO diminui a fosforilação de BCR-ABL em células HL-60.BCR-ABL e quando associada ao MI potencializou a inibição da atividade quinase de BCR-ABL. Os dados da presente investigação indicaram ainda que a LAAO é capaz de modular a expressão de bad, bak, bax, bid, bimel, fas,fasl, a1, bcl-2, bcl-xl, bcl-w e c-flip, genes reguladores da apoptose celular. Apesar do pouco conhecimento acerca do mecanismo de ação dessa toxina, os dados obtidos sugerem que a LAAO possui o potencial de estimular a apoptose nas linhagens HL-60 e HL-60.BCR-ABL e aumentar o efeito do inibidor da atividade quinase, MI, dados relevantes para estudos futuros associados a descrição de novos fármacos contra leucemia mielóide crônica. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder cytogenetically characterized by the presence of Philadelphia chromosome (Ph) and molecularly by bcr-abl1 neogene that encodes the BCR-ABL oncoprotein with high tyrosine kinase (TK) activity. The leukemic cell BCR-ABL+ presents poor adhesion to bone marrow stroma, resistance to apoptosis and exacerbated mitogenic potential. The CML has a three-phase course (chronic, accelerated and blastic phase) and its treatment can be performed by different therapeutic modalities, especially the imatinib mesylate (IM) that inhibits the TK BCR-ABL inducing high rates of cytogenetic remission in chronic phase. Although MI is effective, patients in accelerated and blastic phases of the disease are often refractory to this therapy and there are also cases of resistance to MI described in chronic phase. In this context, potential new drugs are investigated to improve the efficiency of the therapy of CML. In this study, we investigated the effect of crude venom (CV) and of the enzyme L-amino acid oxidase (LAAO) from Bothrops pirajai in triggering apoptosis in BCR-ABL+. The apoptosis of HL-60 cells and HL-60. BCR-ABL was quantified by detecting the percentage of cells with hypodiploid nuclei by flow cytometry and confirmed by observation of the activation of caspases 3, 8 and 9 by Western blot. The results indicate that LAAO is able to induce apoptosis in HL-60 cells and HL-60. BCR-ABL by activation of the extrinsic and intrinsic pathways. Furthermore, it was found that LAAO decreases phosphorylation of BCR-ABL in HL-60 cells. BCR-ABL when associated with MI potencialized the inhibition of kinase activity of BCR-ABL. The data from this study also indicated that the LAAO is able to modulate the expression of bad, bak, bax, bid, bimel, fas, FasL, A1, bcl-2, bcl-xl, bcl-w and c-flip, regulatory genes of apoptosis. Even though there is little knowledge about the mechanism of action of this toxin, the data obtained suggests that LAAO has the potential to stimulate apoptosis in HL-60 lines and HL-60. BCR-ABL and increase the effect of the inhibitor of protein kinase activity, MI, relevant data for future studies associated with the description of new drugs against chronic myeloid leukemia.

Avaliaram-se diferentes níveis de lisina digestível para frangos de corte, machos, utilizando-se 1050 aves dos 12 aos 22 e 1015 aves dos 37 aos 49 dias de idade. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com cinco tratamentos, sete repetições e as unidades experimentais continham, respectivamente, trinta e vinte e nove, correspondentes às fases inicial e final. Nas duas fases, as dietas dos tratamentos eram isoenergéticas e isoprotéicas à base de milho e farelo de soja, suplementadas dos demais aminoácidos, quando necessário. Na fase inicial, os tratamentos corresponderam aos níveis 1,05; 1,10; 1,15; 1,20 e 1,25% de lisina digestível, em dietas com 3050 kcal de EM/kg e com 19% de PB. Na fase final, os tratamentos corresponderam aos níveis 0,90; 0,95; 1,00; 1,05; 1,10% de lisina digestível, em dietas com 3250 de EM/kg e 18% de PB. Avaliaram-se ganho de peso, consumo de ração, conversão alimentar, composição e deposição de nutrientes corporais, e na fase final as características e rendimento de cortes na carcaça. Na fase inicial, os níveis de lisina dietéticos influenciaram o consumo de ração, constatando-se resposta (P<0,01) quadrática. Observou-se efeito (P<0,01) linear ascendente no peso da carcaça. Dos componentes químicos, expressos em porcentagem na carcaça, houve resposta (P=0,02) quadrática do teor de lisina digestível na concentração de proteína bruta. Efeitos similares foram observados na deposição de proteína e água da carcaça e do corpo vazio, com aumento (P<0,01) linear, em resposta ao acréscimo de lisina na dieta. Da mesma forma, houve efeito (P<0,01) linear ascendente dos níveis de lisina digestível da ração sobre o peso vivo reconstituído. Na composição química das vísceras e sangue observou-se efeito (P<0,10) do nível de lisina apenas na concentração de matéria mineral do corpo vazio e a resposta foi decrescente com o aumento do aminoácido. O nível 1,10% de lisina digestível satisfaz as necessidades do desempenho de frangos de corte machos, dos 12 aos 22 dias de idade, mas ao considerar a composição química e deposição dos nutrientes corporais esta exigência torna-se igual ou maior a 1,25%. Na fase final, das variáveis do desempenho, apenas conversão alimentar foi influenciada pelos níveis de lisina digestível na ração, caracterizando-se efeito (P<0,01) linear descendente. Das características de carcaça e rendimento de cortes, apenas gordura abdominal teve efeito (P=0,02) quadrático em função dos níveis de lisina empregados nas rações. Nas variáveis de composição química da carcaça e do corpo vazio, observou-se efeito (P<0,01) quadrático dos níveis de lisina digestível apenas no teor da matéria mineral. Nas demais frações, vísceras e sangue, não houve efeito dos níveis de lisina digestível na composição química. Observou-se, contudo, indicação de aumento (P=0,09) linear na taxa de deposição de proteína da carcaça e do corpo vazio em resposta a elevação do nível de lisina digestível. Com base no desempenho o nível de lisina digestível deve ser igual ou maior a 1,10%, mas em relação à quantidade de gordura abdominal o indicado seria 1,00%. Essas informações das duas fases estudadas confirmam que a exigência de lisina digestível para desempenho in vivo é inferior às reais demandas para síntese protéica na deposição de massa muscular esquelética / A group of 1050 commercial male broilers, ranging from 12 to 22 days of age, and a group of 1015 commercial male broilers, ranging from 37 to 49 days of age were used to evaluate different digestible lysine levels. A completely randomized trial was used, with 5 treatments (1.05, 1.10, 1.15, 1.20 and 1.25% of digestible lysine, respectively) in Initial Phase and 5 treatments (0.90, 0.95, 1.00, 1.05 and 1.10% of digestible lysine, respectively) in Final Phase, applied in 7 replications and 35 experimental units. The experimental unit was 30 birds in first group and 29 birds in second group. Lysine levels were added in isoenergetic (3050 and 3250 kcal of ME/kg for groups, respectively) and isoproteic (19 and 18% of Crude Protein, for groups, respectively) corn and soy meal rations. The rations were balanced with several amino acids when needed. Weight gain, feed intake, feed: gain rate, body composition, nutrient deposition were measured and carcass characteristics and cut yield in Final Phase. In Initial Phase dietary lysine levels influenced ration consumption (P<0.01), with increasing linear effect on carcass weight (P<0.01). Quadratic effect was observed of the digestible lysine on crude protein concentration (P=0.02), when chemical compounds were analyzed. Protein and water deposition was observed (P<0.01), in carcass and empty body, with linear increase, due to the lysine addition in ration. Same effects were observed on reconstituted body weight. Chemical composition of blood and offal were statistically different (P<0.10) in empty body mineral matter concentrations with decreasing values when increasing lysine levels. Lysine levels of 1.10% was sufficient for 12 to 22 day old male broiler development requirements, however, considering body chemical composition, the level needed would not be down 1.25%. In Final Phase, dietary lysine levels influenced feed: gain rate (P<0.01), with decreasing linear effect. Quadratic effect was observed (P=0.02) due to lysine levels used when evaluating carcass characteristics and cuts, abdominal fat deposition. Chemical composition of carcass was statistically different (P<0.01) in empty body mineral matter, with squared effect due to the lysine level considered. Blood and offal chemical composition had no effects, however, linear increase (P=0.09) was shown in carcass protein deposition and empty body due to the increase of lysine levels. Considering the performance, digestible lysine level might be 1.10% or higher, however, for abdominal fat composition, suggested level is 1.00%. According to the given results, the needs for in vivo performance are lower than the real requirements for protein synthesis in skeletal muscle formation

Femtosecond laser inscribed waveguides inside the bulk of materials have shown great relevance for the development of photonic optical circuits. Due to high intensity, long interaction length and strong light confinement, nonlinear optical effects are significant to pulse propagation within the waveguide. Therefore, it is important to search for new and better platforms to host photonic devices, as well as, to analyze its linear and nonlinear optical properties. In this dissertation, we have studied the inscription of nonlinear waveguides in Gorilla Glass (strengthened alkali aluminosilicate glass) and in L-threonine organic crystals. Initially, we studied the nonlinear refractive index of Gorilla Glass, demonstrating that it presents an approximately constant value of n2 = (3.3 &plusmn; 0.6) &times; 10-20 m2/W over the spectral region from 490 nm up to 1.5 &micro;m. Single-mode waveguides written in Gorilla Glass presents propagation losses on the order of (0.35 &plusmn; 0.01) dB/mm, which is comparable to other waveguides inscribed in silicate glasses. In the nonlinear regime, the guided pulse presented spectral broadening, compatible with the measured n2 value, and white-light continuum generation. The generation of new frequencies is due to self-phase modulation and stimulated Raman scattering effects, both associated with third-order nonlinearities of Gorilla Glass. In a second part, we inscribed cladding waveguides in L-threonine organic crystal, in order to explore its second-order nonlinearities. After their linear characterization, that revealed propagation losses of (0.5 &plusmn; 0.1) dB/mm, we obtained guided second harmonic generation in the ultraviolet region. The written waveguide presented a normalized power conversion efficiency of (10.3 &plusmn; 0.4) % (MW cm2)-1 and approximately four times higher normalized intensity conversion efficiency than the crystal itself. Such enhancement effect was attributed to the influence of the waveguide dispersion in the phase-matching condition necessary for second harmonic generation. In general, the results presented here expand the knowledge on femtosecond laser writing of waveguide in organic and inorganic materials, and their nonlinear properties, which are relevant for developing photonic devices. / Guias de ondas fabricados com pulsos de femtossegundos no volume de materiais são de grande importância para o desenvolvimento de circuitos fotônicos. Devido as altas intensidades, longos comprimentos de interação e forte confinamento, efeitos ópticos não lineares são significativos durante a propagação de pulsos laser em guias de onda. Portanto, é importante buscar novas e melhores plataformas para construir os dispositivos fotônicos, bem como analisar suas propriedades ópticas lineares e não lineares de guiamento. Nesta tese, estudamos a fabricação de guias de onda não lineares em Gorilla Glass (vidro aluminossilicato alcalino) e no cristal orgânico de L-treonina. Inicialmente, estudamos o índice de refração não linear do Gorilla Glass, demonstrando que este apresenta um valor aproximadamente constante, n2 = (3.3 &plusmn; 0.6) &times; 10-20 m2/W, no intervalo espectral de 490 nm até 1,5 &micro;m. Os guias monomodo produzidos no Gorilla Glassapresentaram perdas de transmissão da ordem de (0,35 &plusmn; 0,01) dB/mm, as quais são comparáveis às de outros guias em vidros silicatos já reportados. No regime não linear, o pulso guiado apresentou alargamento espectral compatível com o valor determinado para n2, e geração de luz branca. A geração de novas frequências observada se deve aos fenômenos de auto modulação de fase e espalhamento Raman estimulado, ambos associados à não linearidade de terceira ordem do Gorilla Glass. Numa segunda etapa, fabricamos guias de onda do tipo casca em cristais orgânicos de L-treonina, afim de explorar sua não linearidade de segunda ordem. Após sua caracterização linear, onde medimos uma perda de guiamento de (0,5 &plusmn; 0,1) dB/mm, fomos capazes de obter geração de segundo harmônico guiada, na região do ultravioleta. O guia fabricado apresentou uma eficiência normalizada de conversão de potência de (10.3 &plusmn; 0,4) % (MW cm2)-1 e eficiência normalizada de conversão de intensidade aproximadamente quatro vezes maior do que a do cristal em si. Tal aumento foi atribuído à influência da dispersão do guia no casamento de fase, necessário para geração de segundo harmônico. De maneira geral, os resultados apresentados aqui expandem o conhecimento de fabricação de guias de onda com laser de femtossegundos em materiais inorgânicos e orgânicos, bem como de suas propriedades não lineares relevantes para produção de dispositivos.

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Samples of blood 1.0 ml were collected by cannulation of the left jugular vein with heparinized syringe, the intervals from 0 to 9 hr. After centrifugation the plasma was frozen at -20 until the time of analysis. The bioanalytical method to quantify rutrpII was developed and validated in UV-VIS at a wavelength of 417 nm. From the construction of the concentration versus time curve, the kinetic parameters were calculated (Software WinNonlin 5.0 (Pharsight ™) Results were: Tmax = 8 h, Cmax = 169.86 mg/mL, t1/2 = 1.04 ± 0.02 h, ClT/F = 1.32 ± 0.05 mL/min/kg, Vd/F = 1,98 ± 0,05 L/kg. The developed and validated bioanalytical method was suitable for the detection and quantification of RutrpII in rat plasma. The values of pharmacokinetic profiles found, and extrapolated on allometric scaling allow us to understand that the compound studied showed a slow tissue distribution profile and / or was eliminated slowly (Vd low and low value CLT), due to a possible affinity between RutrpII and plasma proteins. This affinity may be explained by the similarity of their chemical structure with iron, enabling it to be transported by biomolecules such as transferrin, albumin or any other, and having as a target the DNA of cancer cells. In general, the compounds of ruthenium (II) / amino acids may be promising drugs for the amino acids present in the complex, may facilitate the recognition of the complex as a whole by DNA, and thus less toxic. / O complexo de rutênio(II)/aminoácido (rutrpII) demonstrou alta atividade antineoplásica contra carcinoma de mama murino (tumor de Ehrlich) in vitro e in vivo, sendo que neste último, aumentou a média de sobrevida dos animais. Fez-se necessária então a investigação dos parâmetros farmacocinéticos deste protótipo de fármaco como requisito ao conhecimento pré-clínico do mesmo. O objetivo deste trabalho foi obter o perfil farmacocinético do rutênio(II)/triptofano administrado a ratos, via intraperitoneal, em dose única por meio da quantificação desta substância em plasma utilizando metodologia analítica validada em espectrofotômetro UV-VIS. A metodologia consistiu na administração do protótipo rutrpII a 3 ratos em dose de 6 mg/kg, por via intraperitonal. Foram coletadas amostras de 1,0 mL de sangue, por canulação da veia jugular esquerda, com seringa heparinizada, nos intervalos de tempo de 0 a 9 h. Após centrifugação, o plasma foi congelado a -20ºC até o momento da análise. O método bioanalítico de quantificação do rutrpII foi desenvolvido e validado em espectrofotômetro UV-VIS no comprimento de onda de 417 nm. A partir da construção da curva de concentração versus tempo, foram calculados os parâmetros cinéticos (Software Winnonlin 5.0 (Pharsight™)). Os resultados encontrados foram: Tmax= 8h, Cmax= 169,86 µg/mL, t(1/2) =1,04 ± 0,02 h,ClT/F = 1,32 ± 0,05 mL/min/kg, Vd/F = 1,98 ± 0,05 L/kg. O método bioanalítico desenvolvido e validado foi adequado para a detecção e quantificação do RutrpII em plasma de rato. Os valores dos perfis farmacocinéticos encontrados, e extrapolados em escala alométrica, permitem entender que o composto estudado apresentou um perfil lento de distribuição tecidual e/ou foi eliminado lentamente (baixo Vd e baixo valor de CLT), devido a uma possível afinidade entre o RutrpII e as proteínas plasmáticas. Esta afinidade pode ser explicada pela semelhança de sua estrutura química com o ferro, possibilitando que ele seja transportado por biomoléculas como a transferrina, albumina ou alguma outra, e tendo como alvo, o DNA da células cancerosas. De maneira geral os compostos de rutênio(II)/ aminoácidos podem ser fármacos promissores pois os aminoácidos presentes nos complexos, podem facilitar o reconhecimento do complexo como um todo pelo DNA, sendo assim menos tóxicos.

A disponibilidade de nitrogênio no solo e o fornecimento de doses de potássio podem alterar a nutrição do capim-marandu, com reflexos diretos na morfologia, atividade de enzimas e acúmulo de poliaminas nas plantas. Objetivou-se: i) identificar a forma de nitrogênio e a dose de potássio que promovem a maximização dos atributos morfológicos da parte aérea e das raízes e, consequentemente, a produção de forragem do capim-marandu (Brachiaria brizantha cv. Marandu); ii) avaliar as concentrações de nitrogênio, nitrato, amônio, potássio, prolina, poliaminas e clorofila, além do valor SPAD e da redutase do nitrato nas folhas diagnósticas, em função da adubação de formas de nitrogênio com doses de potássio e iii) quantificar as transformações do nitrogênio do solo, em função da aplicação de formas de nitrogênio e adição de material vegetal de capim-marandu. Os experimentos foram realizados em duas etapas: a) em casa de vegetação onde as plantas de capim-marandu foram cultivadas em solo classificado como Neossolo Quartzarênico. Quatro formas de nitrogênio (nitrato, amônio, 70%nitrato+30%amônio e amídica) mais controle e quatro doses de potássio (0, 150; 300 e 450 mg dm-3) foram combinados em um fatorial completo 5x4. As unidades experimentais consistiram em 80 vasos e o delineamento experimental foi o de blocos inteiramente casualizados, com quatro repetições; b) em laboratório, seis combinações envolvendo formas de nitrogênio (nitrato e amônio enriquecidos com 15N e controle) e presença/ausência de material vegetal de capim-marandu foram avaliados em incubação aeróbica. Cada combinação foi repetida três vezes e todos foram incubados por oito períodos de avaliação (0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 e 20 semanas) com o Neossolo Quartzarênico, em delineamento completamente causalizado. Os resultados demonstraram que o fornecimento de nitrogênio associado ao de potássio foi fundamental para elevar a produção de forragem e das raízes e a concentração desses elementos nas folhas diagnósticas do capim-marandu. A forma nitrato+amônio, na dose de potássio de 450 mg dm-3, proporcionou mais elevada área foliar, a qual foi determinante no incremento da produção de forragem. O fornecimento das formas de nitrato, nitrato+amônio e amídica, associados à máxima dose de potássio proporcionaram incrementos nos números de perfilhos e folhas, área foliar, e consequentemente na produção de forragem. O não fornecimento de nitrogênio e a aplicação na forma de amônio proporcionaram as mais baixas produções de forragem. O incremento das doses de potássio reduziu os sintomas de toxicidade de amônio nas plantas de capim. Os atributos produtivos do sistema radicular foram alterados positivamente pelas formas nitrato, nitrato+amônio e amídica e pelas doses de potássio. O valor SPAD foi incrementado pelas formas nitrato, nitrato+amônio e amídica e a aplicação de potássio de 336 mg dm-3 que resultou em 38 unidades SPAD. A concentração de clorofila de 35 ?g g-1 correspondeu à de nitrogênio total de 22,5 g kg-1. A enzima redutase do nitrato teve sua atividade aumentada com o incremento das doses de potássio e o fornecimento de nitrato+amônio. As concentrações de putrescina, espermidina, espermina e prolina aumentaram mediante o fornecimento de amônio e diminuíram com incremento das doses de potássio. Os baixos teores de 15NH4 + no solo após a segunda semana permitiram verificar que todo amônio foi imobilizado pelos microrganismos do solo, em todas as combinações. A aplicação de amônio, com material vegetal de capimmarandu, resultou nos mais elevados teores de amônio, aminoácido, aminoaçúcar e nitrogênio total hidrolisados. / Soil nitrogen availability and potassium supply rates can influence Marandu palisadegrass nutrition, with direct effect on the morphology, enzyme activity and polyamines accumulation in plants. This study aimed to: i) identify the nitrogen form and the potassium rate that maximizes the morphological attributes of shoots and roots, and consequently, the forage production of Marandu palisadegrass (Brachiaria brizantha cv. Marandu), ii) evaluate the nitrogen, nitrate, ammonium, potassium, proline, polyamines and chlorophyll concentration, as well as the SPAD value and the nitrate reductase activity in diagnostic leaves, as a function of nitrogen forms and potassium rates, and iii) quantify the soil nitrogen changes according to different forms of nitrogen and addition of Marandu residue. The experiments were carried out in two stages: a) in a greenhouse, where Marandu plants were grown in an Entisol. Four nitrogen forms (nitrate, ammonium, 70% nitrate+30% ammonium, urea) plus the control (no nitrogen) and four potassium rates (0, 150, 300 and 450 mg dm-3) were arranged in a 5x4 complete factorial design. The experimental units consisted on 80 pots. The twenty combinations were evaluated in a completely randomized block design with four replications; b) in the laboratory experiment, six combinations involving three forms of N (nitrate and ammonium enriched with15N atoms 1% and no nitrogen) and Marandu residue (presence/absence) were evaluated using aerobic incubation. Each combination was replicated three times and incubated under eight incubation periods (0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 and 20 weeks) in an Entisol. In total, 144 experimental units were evaluated using a completely randomized design. The results from the first experiment showed that nitrogen supply associated with potassium rates were important for increasing the forage and roots biomass and the concentration of these elements in the diagnostic leaves. Nitrate+ammonium and potassium at 450 mg dm-3 provided with the largest leaf area, which was decisive for high forage production. The supply of nitrate, nitrate+ammonium and urea, associated with the maximum potassium rate resulted in increased number of tillers, leaves, leaf area, and consequently, increased forage production. Combinations involving ammonium and no nitrogen provided with the lowest forage production. High potassium rates were associated with less ammonium toxicity symptoms on the plants. The productive attributes of the root system were positively modified by nitrate, nitrate+ammonium and urea and by the high potassium rates. The SPAD value increased with nitrate, nitrate+ammonium and urea and potassium at 336 mg dm-3 resulted in 38 SPAD units. Chlorophyll concentration of 35 mg g-1 corresponded to a total nitrogen concentration of 22.5 g kg-1. Nitrate reductase activity increased with higher potassium rates and nitrate+ammonium supply. Higher concentrations of putrescine, spermidine, spermine and proline were observed with ammonium supply, but they decreased with higher potassium rates. The low concentration of 15NH4 + in the soil after the second week indicates that all ammonium was immobilized by soil microorganisms, for all combinations. The application of ammonium in combination with Marandu residue resulted in higher concentration of ammonium, amino acid, amino sugar and total nitrogen hydrolysates.