Vários estudos clínicos demonstram que existem fatores adicionais ao efeito reforçador primário das drogas que determinam por que alguns indivíduos permanecem usuários ocasionais, enquanto outros progridem para a farmacodependência. Evidências clínicas apontam o estresse como uma variável importante na iniciação, manutenção e recaída ao uso da cocaína ou morfina. Em roedores, a cocaína induz a sensibilização comportamental que se caracteriza pelo aumento progressivo da atividade motora no decorrer do seu uso prolongado. Esse fenômeno é um dos eventos que emergem no decurso temporal das adaptações que levam à farmacodependência. Recentemente foi sugerido que a sensibilização é a gênese do uso compulsivo de drogas. Muitos estudos revelam que o estresse induz a sensibilização comportamental cruzada com os psicostimulantes. O objetivo desse trabalho foi avaliar a sensibilização cruzada entre o estresse e a cocaína, bem como os mecanismos neurais subjacentes. Para tanto foram avaliados as concentrações plasmáticas da corticosterona, a atividade locomotora basal e a induzida por cocaína, e a atividade da PKA nos animais expostos aos estresses agudo ou crônico, previsível ou imprevisível. A exposição ao estresse crônico previsível (EP) aumentou a atividade locomotora basal e a induzida por cocaína. A exposição ao EP aumentou as concentrações basais da corticosterona mas não alterou a atividade da PKA no núcleo acumbens e no corpo estriado. Assim, podemos concluir que a exposição a EP induziu sensibilização comportamental cruzada à cocaína, sendo que esse efeito não se correlacionou com as alterações na atividade da PKA. / A potential etiologic factor in substance abuse is stress, and it is possible that chronic exposure to stressful life’s events is related to the development of drug dependence and relapse. Behavioral sensitization is defined as an augmentation of a response to a drug during repeated drug exposure. Behavioral sensitization has been shown to occur to the locomotor and reinforcing effects of cocaine, amphetamine and other drugs of abuse. It has been suggested that sensitization is the genesis of compulsive drug use. Converging evidence suggests that exposure to stress induces behavioral sensitization to psychostimulant drugs. The present study investigates behavioral and molecular aspects of the cross-sensitization between stress and cocaine. We evaluated the basal and cocaine-induced locomotor activity, corticosterone plasma levels and protein kinase cAMP-dependent (PKA) activity in animals exposed to acute or chronic predictable and unpredictable stress. Increased basal and cocaine-induced locomotor activity was observed in animals exposed to chronic predictable stress. Chronic predictable stress increased basal corticosterone levels but did not change protein kinase A activity in both accumbens and striatum. In conclusion, predictable stress produced sensitization to locomotor effects of cocaine but this effect did not correlate with changes in PKA activity.

Au cours du développement, les axones des cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs) voyagent sur de longues distances pour établir des connexions avec leurs cellules cibles. La navigation des cônes de croissance est guidée par différentes molécules chimiotropiques présentes dans leur environnement. Les endocannabinoïdes (eCB) sont d’importants neuromodulateurs qui régulent de manière rétrograde la fonction de nombreuses synapses du cerveau. Ils agissent principalement par le biais de leurs récepteurs liés à une protéine Gi/o CB1 (CB1R) et CB2 (CB2R). La présence des eCBs durant le stade fœtal et la période postnatale suggère leur implication dans des événements régulant le développement du système nerveux. Cette thèse confirme l’expression des récepteurs aux cannabinoïdes CB1 et CB2 ainsi que l’enzyme dégradant les eCBs lors du développement embryonnaire et perinatal des CGRs et de la voie rétinothalamique in vivo. La manipulation pharmacologique de l’activité de CB1R et CB2R réorganise la morphologie du cône de croissance des CGRs et des neurones corticaux in vitro. De plus, la stimulation locale avec un agoniste de CB1R ou de CB2R modifie le comportement du cône de croissance entraînant sa répulsion. CB1R et CB2R modulent par le biais de la voie de signalisation AMPc/PKA, la mobilisation de DCC à la membrane plasmique. Par ailleurs, les résultats de cette recherche démontrent également l’implication de CB1R et CB2R dans la ségrégation des projections ipsi- et controlatérales et le développement de la voie rétinothalamique. / Following differentiation, retinal ganglion cell (RGC) axons, tipped at their distal end by the growth cone (GC), navigate through relatively long distances in a highly directed manner in order to establish functional synapses with thalamic and superior colliculus (SC) neurons. This is achieved with the help of extracellular guidance molecules which steer RGC axon growth by regulating GC morphology by means of attractive and/or repulsive mechanisms. In the adult brain, endocannabinoids (eCBs) exert an important neuromodulatory function by acting as retrograde messengers to regulate the function of many synapses. Endocannabinoids act mainly via their Gi/o protein coupled receptors CB1 (CB1R) and CB2 (CB2R). Due to their presence at the fetal and early postnatal periods, it has been proposed that eCBs and their receptors might be involved in several developmental events, such as cell proliferation and migration, axon guidance and synaptogenesis. We observed that during early postnatal development, components of the eCB system are expressed along the visual pathway (the optic chiasm, the lateral geniculate nucleus and the SC). To assess the implication of the eCB system, in vitro, embryonic retinal explant and primary neuron cultures were treated with pharmacological agonists and inverse agonists of CB1R and CB2R. These experiments demonstrated that these cannabinoid receptors modify the GC’s morphology. Most importantly, CB1R and CB2R act through the cAMP/PKA pathway to modulate the presence of DCC at the plasma membrane. In vivo, CB1R and CB2R play a major role and the absence of either one of them induces a decrease in eye-specific segregation of retinal projections. These results show an implication of CB1R and CB2R during RGC growth and retinothalamic development.

À partir des ovocytes de la palourde Spisula solidissima, un ADNc codant un récepteur nommé Spi-OAR a été cloné et séquencé. Une analyse de la séquence en acides aminés a indiqué que ce nouveau récepteur possède une forte similarité avec les récepteurs β-adrénergiques et les récepteurs à octopamine. En effet, il est étroitement lié à la classe des récepteurs à octopamine « β-adrénergique-like » couplés à une protéine Gs. L’ADNc de Spi-OAR a été introduit dans un vecteur d'expression (pCEP4) et un épitope reconnaissable par un anticorps commercial a été ajouté au segment N-terminal. Cette construction a été transfectée dans des cellules hôtes (HEK 293) et des études d’immunofluorescence ont montré une expression efficace du récepteur au niveau membranaire. Également, des mesures d'AMPc pour les cellules exprimant Spi-OAR ont révélé une augmentation de ce messager secondaire lors de l'ajout de l'octopamine, et dans une moindre mesure, la tyramine, tandis que la dopamine, la sérotonine et l'histamine n’ont engendré aucun effet. Une légère activité constitutive de ce récepteur dans les cellules hôtes a été observée. De plus, une analyse RT-PCR avec des oligonucléotides spécifiques a révélé l'ARNm de Spi-OAR non seulement dans les ovocytes, mais aussi dans les gonades, le cœur, les muscles adducteurs, les branchies et les ganglions suggérant que ce récepteur soit exprimé de façon ubiquitaire dans divers tissus et dans différents stades embryonnaires chez la palourde. En outre, des études avec des ovocytes isolés n'ont montré aucun effet de l’octopamine sur la réactivation méiotique. Des études éventuelles pourront finalement confirmer le rôle fonctionnel de Spi-OAR. / A cDNA encoding for an octopamine receptor named Spi-OAR was cloned and sequenced from the surf clam Spisula solidissima oocytes. An analysis of its predicted amino acid sequence showed a high degree of similarity with β-adrenergic and octopamine receptors. This receptor qualifies as a novel receptor closely related to the proposed class of insect octopamine « β-adrenergic–like » receptors coupled to Gs protein. This cDNA was introduced into an expression vector (pCEP4), with an added N-terminal FLAG tag sequence, and transfected in host cells (HEK 293). Immunofluorescence studies showed expression of the receptor with a proper localization to the plasma membrane. Measurements of cAMP in transfected cells revealed that addition of octopamine, and to a lower extent, tyramine induced a rise in cAMP while dopamine, serotonine and histamine had no effect. Overexpression of Spi-OAR in mammalian cells induced slight constitutive increase of cAMP. An RT-PCR analysis with specific oligonucleotides revealed the presence of the receptor mRNA not only in oocytes but also in whole gonads, heart, adductor muscle, gills and ganglia suggesting that this receptor is likely ubiquitously expressed. Expression of Spi-OAR was also detected at different embryonic stages. Despite the demonstrated expression of Spi-OAR in oocytes, octopamine had no effect on meiotic reinitiation. Further studies will examine the function of Spi-OAR.

As infecções associadas aos cuidados de saúde constituem um problema grave nas unidades hospitalares bem como nos serviços de atendimento extra-hospitalares. Diferentemente de outros países, no Brasil, existe uma incidência alta dessas infecções causadas por microorganismos Gram-negativos produtores de β-lactamase de espectroestendido (ESBL). Estas enzimas hidrolisam compostos β-lactâmicos e são consideradas mundialmente como de importância clínica, pois a localização de seus genes emelementos móveis facilitam a transmissão cruzada. Este estudo foi realizado com amostras bacterianas isoladas de material clínico e de fezes de pacientes internados em um hospital da rede pública no Rio de Janeiro, Brasil. Estes pacientes estavam internados em duas unidades de terapia intensiva cardiológica, no período de janeiro a dezembro de 2007. O estudo teve por objetivo realizar a caracterização fenotípica e genotípica desses isolados associados à colonização ou infecção dos pacientes. Os testes fenotípicos e genotípicos foram realizados na Universidade do Estado do Rio de Janeiro e incluíram provas bioquímicas, teste de susceptibilidade, teste confirmatório para a expressão da produção da enzima ESBL e Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) com iniciadores específicos para cinco genes: blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 e AmpC. As espécies bactérianas mais frequentemente isoladas foram Escherichia coli (25%) e Klebsiella pneumoniae (30,56%), e os genes mais prevalentes foram blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), e Toho1 (19,44%). Identificamos em 25% das amostras enterobactérias que não eram E. coli, K. pneumoniae ou Proteus sp, com fenótipo para ESBL e a expressão dos mesmos genes, confirmando a necessidade de investigação nestes grupos microbianos. O substrato mais sensível para a expressão da área de sinergismo no Teste de Aproximação foi o ceftriaxone (80%). Identificamos também que 17% das amostras positivas para ESBL apresentaram co-produção para AmpC e 50% apresentaram mais de um gene para os iniciadores testados. A presença da carbapenemase foi avaliada em amostras bacterianas com susceptibilidade intermediária para ertapenem, através do Teste de Hodge modificado. Os achados do presente estudo caracterizaram a co-produção de AmpC e ESBL, bem como sugerem a necessidade da revisão e a ampliação dos métodos para a detecção de outros padrões de resistência na nossa Instituição. / Healthcare-associated infections are a major problem in hospital units as well as in units outside hospital, where procedures are performed. In Brazil, differently from other countries, a large proportion of these infections are caused by extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing Gram-negative microorganisms. These enzymes, which hydrolyse β-lactams, are considered of clinical importance worldwide. Their localization in genes that are located in móbile structures facilitate cross infection. This study was performed with bacterial isolates found in clinical specimens and faeces of patients hospitalized in a public hospital in the city of Rio de Janeiro, Brazil. These patients were in two different cardiological intensive care units from January till December 2007. The goal of the study was the phenotypic and genotypic characterization of the bacterial isolates which were associated with colonization or infection. Phenotypic and genotypic tests were performed in Universidade do Estado do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro State University) and included biochemical tests, susceptibility tests, a comfirmatory test for the expression of ESBL, and polymerase chain reaction (PCR) with specific primers for five gentes : blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 and AmpC. The most frequently isolated bactéria were Escherichia coli (25%) and Klebsiella pneumoniae (30,56%), and the most prevalent genes were blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), and Toho1 (19,44%). In 25% of samples we identified enterobacteria that were not E. coli, K. pneumoniae oor Proteus spp, but with the ESBL phenotype and the expression of the same genes, suggesting these microbes needed investigating. The most sensitive substrate for expressing synergism in the double-disk diffusion test was ceftriaxone (80%). We also identified that 17% of ESBL positive isolates showed co-production of AmpC and 50% showed more than one gene tested by PCR. The presence of carbapenemase was studied in bacterial isolates with intermediate susceptibility to ertapenem, by a modified Hodge test. The findings in the present study characterize the co-production of AmpC and ESBL, and suggest the need for reviewing detection methods used and possibly using other methods for the detection of other resistance patterns in our Institution.

As infecções associadas aos cuidados de saúde constituem um problema grave nas unidades hospitalares bem como nos serviços de atendimento extra-hospitalares. Diferentemente de outros países, no Brasil, existe uma incidência alta dessas infecções causadas por microorganismos Gram-negativos produtores de β-lactamase de espectroestendido (ESBL). Estas enzimas hidrolisam compostos β-lactâmicos e são consideradas mundialmente como de importância clínica, pois a localização de seus genes emelementos móveis facilitam a transmissão cruzada. Este estudo foi realizado com amostras bacterianas isoladas de material clínico e de fezes de pacientes internados em um hospital da rede pública no Rio de Janeiro, Brasil. Estes pacientes estavam internados em duas unidades de terapia intensiva cardiológica, no período de janeiro a dezembro de 2007. O estudo teve por objetivo realizar a caracterização fenotípica e genotípica desses isolados associados à colonização ou infecção dos pacientes. Os testes fenotípicos e genotípicos foram realizados na Universidade do Estado do Rio de Janeiro e incluíram provas bioquímicas, teste de susceptibilidade, teste confirmatório para a expressão da produção da enzima ESBL e Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) com iniciadores específicos para cinco genes: blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 e AmpC. As espécies bactérianas mais frequentemente isoladas foram Escherichia coli (25%) e Klebsiella pneumoniae (30,56%), e os genes mais prevalentes foram blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), e Toho1 (19,44%). Identificamos em 25% das amostras enterobactérias que não eram E. coli, K. pneumoniae ou Proteus sp, com fenótipo para ESBL e a expressão dos mesmos genes, confirmando a necessidade de investigação nestes grupos microbianos. O substrato mais sensível para a expressão da área de sinergismo no Teste de Aproximação foi o ceftriaxone (80%). Identificamos também que 17% das amostras positivas para ESBL apresentaram co-produção para AmpC e 50% apresentaram mais de um gene para os iniciadores testados. A presença da carbapenemase foi avaliada em amostras bacterianas com susceptibilidade intermediária para ertapenem, através do Teste de Hodge modificado. Os achados do presente estudo caracterizaram a co-produção de AmpC e ESBL, bem como sugerem a necessidade da revisão e a ampliação dos métodos para a detecção de outros padrões de resistência na nossa Instituição. / Healthcare-associated infections are a major problem in hospital units as well as in units outside hospital, where procedures are performed. In Brazil, differently from other countries, a large proportion of these infections are caused by extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing Gram-negative microorganisms. These enzymes, which hydrolyse β-lactams, are considered of clinical importance worldwide. Their localization in genes that are located in móbile structures facilitate cross infection. This study was performed with bacterial isolates found in clinical specimens and faeces of patients hospitalized in a public hospital in the city of Rio de Janeiro, Brazil. These patients were in two different cardiological intensive care units from January till December 2007. The goal of the study was the phenotypic and genotypic characterization of the bacterial isolates which were associated with colonization or infection. Phenotypic and genotypic tests were performed in Universidade do Estado do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro State University) and included biochemical tests, susceptibility tests, a comfirmatory test for the expression of ESBL, and polymerase chain reaction (PCR) with specific primers for five gentes : blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 and AmpC. The most frequently isolated bactéria were Escherichia coli (25%) and Klebsiella pneumoniae (30,56%), and the most prevalent genes were blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), and Toho1 (19,44%). In 25% of samples we identified enterobacteria that were not E. coli, K. pneumoniae oor Proteus spp, but with the ESBL phenotype and the expression of the same genes, suggesting these microbes needed investigating. The most sensitive substrate for expressing synergism in the double-disk diffusion test was ceftriaxone (80%). We also identified that 17% of ESBL positive isolates showed co-production of AmpC and 50% showed more than one gene tested by PCR. The presence of carbapenemase was studied in bacterial isolates with intermediate susceptibility to ertapenem, by a modified Hodge test. The findings in the present study characterize the co-production of AmpC and ESBL, and suggest the need for reviewing detection methods used and possibly using other methods for the detection of other resistance patterns in our Institution.

Vários estudos clínicos demonstram que existem fatores adicionais ao efeito reforçador primário das drogas que determinam por que alguns indivíduos permanecem usuários ocasionais, enquanto outros progridem para a farmacodependência. Evidências clínicas apontam o estresse como uma variável importante na iniciação, manutenção e recaída ao uso da cocaína ou morfina. Em roedores, a cocaína induz a sensibilização comportamental que se caracteriza pelo aumento progressivo da atividade motora no decorrer do seu uso prolongado. Esse fenômeno é um dos eventos que emergem no decurso temporal das adaptações que levam à farmacodependência. Recentemente foi sugerido que a sensibilização é a gênese do uso compulsivo de drogas. Muitos estudos revelam que o estresse induz a sensibilização comportamental cruzada com os psicostimulantes. O objetivo desse trabalho foi avaliar a sensibilização cruzada entre o estresse e a cocaína, bem como os mecanismos neurais subjacentes. Para tanto foram avaliados as concentrações plasmáticas da corticosterona, a atividade locomotora basal e a induzida por cocaína, e a atividade da PKA nos animais expostos aos estresses agudo ou crônico, previsível ou imprevisível. A exposição ao estresse crônico previsível (EP) aumentou a atividade locomotora basal e a induzida por cocaína. A exposição ao EP aumentou as concentrações basais da corticosterona mas não alterou a atividade da PKA no núcleo acumbens e no corpo estriado. Assim, podemos concluir que a exposição a EP induziu sensibilização comportamental cruzada à cocaína, sendo que esse efeito não se correlacionou com as alterações na atividade da PKA. / A potential etiologic factor in substance abuse is stress, and it is possible that chronic exposure to stressful life’s events is related to the development of drug dependence and relapse. Behavioral sensitization is defined as an augmentation of a response to a drug during repeated drug exposure. Behavioral sensitization has been shown to occur to the locomotor and reinforcing effects of cocaine, amphetamine and other drugs of abuse. It has been suggested that sensitization is the genesis of compulsive drug use. Converging evidence suggests that exposure to stress induces behavioral sensitization to psychostimulant drugs. The present study investigates behavioral and molecular aspects of the cross-sensitization between stress and cocaine. We evaluated the basal and cocaine-induced locomotor activity, corticosterone plasma levels and protein kinase cAMP-dependent (PKA) activity in animals exposed to acute or chronic predictable and unpredictable stress. Increased basal and cocaine-induced locomotor activity was observed in animals exposed to chronic predictable stress. Chronic predictable stress increased basal corticosterone levels but did not change protein kinase A activity in both accumbens and striatum. In conclusion, predictable stress produced sensitization to locomotor effects of cocaine but this effect did not correlate with changes in PKA activity.

Les petites protéines G de la famille Rho sont des régulateurs importants de la fonction cellulaire. Elles lient les signaux extracellulaires à l'activation de diverses voies de signalisation telles que celles menant à la phagocytose, la mitogénèse, l'adhésion cellulaire, l'expression génique, Toutefois leur fonction principale est l'assemblage et l'organisation du cytosquelette d'actine. Ces GTPases fonctionnent comme des interrupteurs moléculaires, actifs lorsque liés au GTP et inactifs sous la forme liée au GDP. <p><p>Le but de notre thèse est d'investiguer, dans les cellules thyroïdiennes de chien en culture primaire, l'implication des protéines de la famille Rho et de l'organisation du cytosquelette d'actine dans les actions diverses que la TSH exerce, via l'AMPc, sur la morphologie, la prolifération, la différenciation et la fonction des thyrocytes de chien en culture primaire.<p><p>Trois cascades conduisant à la mitogénèse coexistent dans la cellule thyroïdienne de chien: la voie de l'AMPc stimulée par la TSH ou la forskoline (activateur direct de l'adénylate cyclase), la voie des facteurs de croissance (tels que l'EGF, l'HGF) activant leur récepteur à activité tyrosine kinase et la cascade dépendante de la protéine kinase C activée par les esters de phorbol (TPA). Contrairement aux voies indépendantes de l'AMPc qui répriment l'expression des caractéristiques de différenciation, la cascade de l'AMPc stimule à la fois la prolifération, l'expression des gènes de l'état différencié et la fonction (iodation, formation d'H2O2, sécrétion hormonale).<p><p>Dans la cellule thyroïdienne de chien, les agents activant les cascades dépendantes et indépendantes de l'AMPc ont des effets différents sur l'organisation du cytosquelette d'actine. La TSH/AMPc et le TPA induisent une destruction des microfilaments d'actine et un "ruffling" membranaire, tandis que les autres agents (insuline, EGF, HGF, sérum) ne modifient pas le réseau de fibres d'actine (fibres de stress) présent dans les cellules quiescentes.<p><p>Parmi les protéines de la famille Rho, RhoA, Rac1 et Cdc42 sont les premières à avoir été identifiées et sont actuellement les mieux caractérisées. Nous montrons que la TSH, via l'AMPc, induit une diminution de la concentration de la forme active des protéines Rac1, Cdc42 et RhoA. En revanche, les autres agents mitogènes, tels que l'EGF et le TPA, qui activent des voies indépendantes de l'AMPc, n'affectent pas les taux de Rac1 et Cdc42 activés, mais augmentent le taux de RhoA-GTP. L'activation ou l'inactivation des protéines RhoA, Rac1 et Cdc42 est donc un nouvel élément distinguant les voies dépendantes et indépendantes de l'AMPc.<p><p>Grâce à deux toxines bactériennes, la toxine B qui inactive les protéines Rho et la toxine CNF1 qui au contraire les active, nous montrons que, dans les thyrocytes, celles-ci jouent un rôle critique dans l'organisation du cytosquelette, dans la transition G1-S, dans l'expression des gènes de différenciation Tg, ThOXs, NIS et TPO, mais pas dans la génération d'H2O2. <p><p>En effet, l'activité d'un ou plusieurs membres de cette famille est nécessaire à l'entrée des thyrocytes en phase S et à la phosphorylation de la protéine pRb, étape pré-requise à la transition G1-S. L'activation de ces protéines n'induit cependant pas, à elle seule, la prolifération. Nous mettons également en évidence l'existence d'un nouveau mécanisme par lequel ces protéines contrôleraient l'activité des complexes cycline D3-CDK4 indépendamment de leur assemblage. Par l'utilisation de la dihydrocytochalasine B, qui comme la toxine B via l'inactivation des Rhos, désorganise le cytosquelette, nous démontrons que l'intégrité de celui-ci n'est pas requise pour la progression des thyrocytes en phases G1 et S. L'inactivation des protéines Rho est par contre nécessaire à l'induction, par l'AMPc, de l'expression des gènes de différenciation incluant Tg, ThOXs, NIS et TPO, puisque ce processus est inhibé par la toxine CNF1. De plus, l'inactivation des Rhos par la toxine B, ainsi que le désassemblage des fibres de stress et du cytosquelette induit par la dihydrocytochalasine B, suffisent à imiter l'induction dépendante de l'AMPc de Tg et ThOXs, mais pas de NIS et TPO. La toxine B et la dihydrocytochalasine B imitent aussi l’effet de la voie TSH/AMPc sur l’accumulation de p27kip1. Enfin, nous montrons que l'augmentation de la production d'H2O2, nécessaire à la synthèse des hormones thyroïdiennes, ne requiert pas l'activité de la protéine Rac (ni des autres protéines de la famille Rho) alors que celle-ci joue un rôle déterminant dans la génération d'H2O2 dans le leucocyte. <p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Une hyperactivation de la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) contribue à la pathogenèse des maladies des vaisseaux. Des travaux antérieurs suggèrent que l’augmentation de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) inhibe la prolifération des CMLV. Provoquer une augmentation d’AMPc préviendrait aussi certaines maladies vasculaires qui sont associées à des altérations dans sa signalisation impliquant l'activité de la protéine kinase A (PKA). Des études ont démontré la contribution du facteur de transcription « early growth response protein-1» (Egr-1) dans la pathogenèse des maladies vasculaires et une surexpression d’Egr-1 a été rapportée dans des modèles d'athérosclérose et d'hyperplasie intimale. Divers agents vasoactifs contrôlent l'expression d’Egr-1 suivant des mécanismes qui ont fait l’objet de plusieurs études mais demeurent incomplètement élucidés. L'angiotensine-II (Ang-II) est l'un des principaux peptides vasoactifs impliqués dans la pathogenèse des maladies vasculaires. Une des voies de signalisation induite par l’Ang-II implique l’augmentation du calcium (Ca2+) intracellulaire. Celle-ci se produit par l’activation de l'entrée de calcium opérée par la relâche des réserves (SOCE) de Ca2+ réticulaire suite à l’activation du récepteur à l’inositol-3-phosphate (IP3R) et le recrutement ultérieur du complexe conducteur formé par la molécule d'interaction stromale 1 (STIM-1) et le canal Orai-1. Bien qu’il ait déjà été démontré que l’expression de l'Egr-1 est régulée par la signalisation calcique en réponse à plusieurs stimuli, l'implication du complexe STIM-1/Orai-1 dans l'expression d'Egr-1 dans la CMLV n’a jamais été étudiée. De même, la question de savoir si la signalisation induite par l'Ang-II conduisant à l'expression d'Egr-1 est modulée par l'AMPc n’a jamais été explorée. Par conséquent, les travaux menés dans cette thèse ont consisté à examiner le rôle de la signalisation du Ca2+ dans l'expression d'Egr-1 induite par l’Ang-II dans la CMLV avec une attention particulière portée sur le rôle joué par STIM-1 et Orai-1. En outre, nous avons examiné l'effet de l’augmentation de l’AMPc sur l'expression d'Egr-1 induite par l’Ang-II et étudié les voies de signalisation associées. Nos données montrent que l’inhibition du récepteur IP3R et du SOCE par le 2-aminoéthoxydiphénylborate atténue la libération de Ca2+ induite par l’Ang-II et ceci s’accompagne d’une baisse des niveaux d’expression de protéine et d’ARN messager de l’Egr-1. La stimulation de l’expression de l'Egr-1 a également été supprimée à la suite du blocage de la calmoduline et de la protéine kinase CaMKII. De plus, le blocage par interférence d’ARN de l’expression de STIM-1 et Orai-1 a atténué l'expression d'Egr-1 induite par l’Ang-II ainsi que la phosphorylation des protéines ERK et CREB. Par ailleurs, l'isoproterenol (ISO) et la forskoline (FSK), deux activateurs de l'adénylate cyclase ont atténué de manière dose-dépendante l'expression d'Egr-1 induite par l’Ang-II. Des réponses similaires ont été observées en utilisant des analogues non spécifique (dibutyryl-cAMP) et PKA-spécifique (Benzoyl-cAMP) de l’AMPc, ainsi qu'un inhibiteur à large spectre de l'activité phosphodiesterase intracellualaire (isobutylméthylxanthine). L'inhibition de l'expression d'Egr-1 induite par l’Ang-II s’accompagne d'une augmentation de l’activité de la PKA mesurée par la phosphorylation de la « phosphoprotéine activée par les vasodilatateurs (VASP) », et d’une diminution concomitante de la phosphorylation de la protéine ERK. Le blocage pharmacologique de la PKA a réduit la phosphorylation de VASP et restauré la phosphorylation de la protéine ERK ainsi que l'expression d'Egr-1 en présence de l’Ang-II. En résumé, nos données démontrent que la voie STIM-1/Orai-1 /Ca2+ médie l'expression de l'Egr-1 induite par l'Ang-II dans la CMLV et suggèrent que la suppression de la réponse à l’Ang-II menant à l’expression de l'Egr-1 peut expliquer les effets vasoprotecteurs de l’AMPc. En outre, ces travaux montrent que les mécanismes moléculaires de régulation de l’expression d’Egr-1 en réponse aux signaux externes culminent vers la modulation des cascades de signalisation en aval de la protéine ERK dans les CMLV. / Aberrant vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferative responses contribute to the development of neointimal lesions. Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is believed to inhibit VSMC proliferation, and vascular diseases are associated with impairments in cAMP-induced signalling responses involving protein kinase A (PKA) signaling. An enhanced expression of the early growth response protein-1 (Egr-1), a zinc finger transcription factor, has been reported in models of vascular diseases and, a crucial role of Egr-1 in regulating the expression of genes implicated in neointimal formation leading to atherogenesis has been suggested. Various vasoactive factors have been shown to modulate Egr-1 expression in VSMC via mechanisms which remain to be completely understood. Angiotensin-II (Ang-II) is one of the key vasoactive peptides implicated in the pathogenesis of vascular diseases. Ang-II elevates intracellular calcium (Ca2+) through activation of voltage-gated calcium channels as well as store-operated calcium channels. The store-operated calcium entry (SOCE) involves an inositol-3-phosphate receptor (IP3R)-coupled depletion of endoplasmic reticular Ca2+ and a subsequent activation of the stromal interaction molecule 1 (STIM-1) /Orai-1 complex. Although Egr-1 has been demonstrated to be upregulated in a Ca2+-dependent fashion in response to several stimuli, the involvement of STIM-1/Orai-1-dependent signaling in Egr-1 expression in VSMC has never been addressed. Besides, whether Ang-II-induced signaling leading to Egr-1 expression is modulated by cAMP-dependent signaling pathway remains unexplored. Therefore, in the present studies, we have examined the role of Ca2+ signaling in Ang-II-induced Egr-1 expression in VSMC and investigated the contribution of STIM-1 or Orai-1. Additionnaly, we have examined the effect of cAMP on Ang-II-induced expression of Egr-1 and have investigated the associated signalling pathways. Pharmacological blockade of IP3R and SOCE by 2-aminoethoxydiphenylborate (2-APB) decreased Ang-II-induced Ca2+ release and attenuated Ang-II-induced enhanced expression of Egr-1 protein and mRNA levels. Egr-1 upregulation was also suppressed following blockade of calmodulin and CaMKII. Furthermore, RNA interference-mediated depletion of STIM-1 or Orai-1 attenuated Ang-II-induced Egr-1 expression, as well as Ang-II-induced phosphorylation of ERK1/2 and CREB. Moreover, isoproterenol (ISO) and forskolin (FSK), two respective receptor and non-receptor activators of adenylate cyclase, attenuated Ang-II-induced Egr-1 expression in a dose-dependent fashion. Similar responses were observed using non-specific (dibutyryl-cAMP) and PKA-specific (Benzoyl-cAMP) analogs of cAMP, as well as a broad spectrum inhibitor of intracellular phosphodiesterase activity (isobutylmethylxanthine). The inhibition of Ang-II-induced Egr-1 expression was accompanied by an increase in serine 157 phosphorylation of the vasodilator-activated phosphoprotein (VASP), a marker of PKA activity, and this was associated with a concomitant decrease in ERK phosphorylation. Pharmacological blockade of PKA using H89 decreased VASP phosphorylation, restored Ang-II-induced ERK phosphorylation and abolished ISO- and FSK-mediated inhibition of Ang-II-induced Egr-1 expression. In summary, our data demonstrate that STIM-1/Orai-1/Ca2+-dependent signaling pathways mediate Ang-II-induced Egr-1 expression in A-10 VSMC and suggest that PKA-mediated suppression of Ang-II-induced Egr-1 expression and phosphorylation of ERK may be among the mechanisms by which cAMP exerts its vasoprotective effects. In addition, our data supports the notion that stimuli-induced regulation of Egr-1 expression involves the participation of signaling cascades downstream of ERK in VSMC.

L'anorexie mentale est une maladie mortelle liée à une privation volontaire d'aliments en dépit d'un besoin énergétique. La compréhension des causes biologiques des anomalies alimentaires requiert un niveau d'analyse simplifié. Ainsi l'utilisation de modèles animaux a permis d'identifier l'une des premières cibles thérapeutiques potentielles de l'anorexie : le récepteur 5-HT4 de la sérotonine (R5-HT4). La stimulation des R5-HT4 dans le noyau accumbens (NAc) active la voie de signalisation AMPc/PKA/CART et inhibe la faim, alors que l'inhibition de son activité constitutive par un agoniste inverse spécifique inhibe cette voie et provoque une hyperphagie. La transfection d'un R5-HT4 muté (R5-HT4ASSL), insensible à la sérotonine et dont l'activité constitutive est plus forte que celle du récepteur natif, dans le NAc chez la souris sauvage ou privée des R5-HT4, réduit la motivation à consommer des aliments, en activant la voie AMPc/PKA/CART de façon indépendante de la sérotonine. Ces résultats constituent un des rares cas connus d'implication de l'activité constitutive d'un récepteur couplé à une protéine G dans une fonction physiologique, la prise alimentaire. Dans ce contexte, nous décrivons un nouveau facteur de régulation du taux d'AMPc sous le contrôle des R5-HT4 dans le NAc : le complexe « A-kinase anchoring protein/Protein kinase A » (AKAP/PKA). La liaison de la PKA à l'AKAP inhibe l'augmentation du taux d'AMPc et d'ARNm codant le peptide CART, induite par la stimulation pharmacologique des R5-HT4, dans le NAc. Cet effet s'accompagne d'une diminution de la prise alimentaire. Ce rétrocontrôle négatif du complexe AKAP/PKA sur l'activité des R5-HT4 permet de diminuer le taux d'AMPc dans le NAc et de réguler la prise alimentaire. Ces résultats suggèrent qu'une trop forte activité constitutive des R5-HT4 induit une augmentation anormale d'AMPc dans le NAc qui peut conduire à des anomalies alimentaires comme l'anorexie mentale. Nous avons ainsi identifié un mécanisme moléculaire capable de réguler l'activité des R5-HT4 et qui pourrait servir de cible pour le traitement de l'anorexie. / Anorexia nervosa is a deadly mental disease related to a voluntary deprivation of food despite an energy requirement. Understanding of the biological causes of food anomalies requires a level of simplified analysis. And the use of animal models has previously allowed us to identify one of the first potential therapeutic targets of anorexia : serotonin 4 receptors (5-HT4Rs). Stimulation of 5-HT4Rs in the nucleus accumbens (Nac) activates the cAMP/PKA/CART signaling pathway and inhibits hunger, while the inhibition of its constitutive activity by a specific inverse agonist inhibits this pathway and causes hyperphagia. Transfection of a mutated 5-HT4R (5-HT4RASSL) insensitive to serotonin and whose constitutive activity is stronger that the native receptor, in the NAc in mice, reduces motivation for consuming food while activating the cAMP/PKA/CART pathway independently of serotonin. These results are one of the few known cases of involvement of the constitutive activity of G protein coupled receptor to a physiological function, the intake of food.In this context, we describe a new factor regulating cAMP levels under the control of 5-HT4Rs in the NAc: the A-kinase anchoring protein/Protein kinase A (AKAP/PKA) complex. The binding of PKA to AKAPs inhibits the increase in cAMP levels and mRNA encoding the peptide CART induced by pharmacological stimulation of 5-HT4Rs, in Nac. This effect is accompanied by a decrease in food intake The negative feedback of AKAP/PKA complex on the activity of 5-HT4Rs reduces the cAMP levels in the NAc and controls food intake.These results suggest that a too strong constitutive activity of 5-HT4Rs induces cAMP abnormal increase in the Nac and leads to eating abnormalities such as anorexia nervosa. We identified a molecular mechanism that regulates the activity of 5-HT4Rs and could serve as a target for the treatment of anorexia.

L’AMPc est un second messager exerçant un rôle vasculoprotecteur majeur, par ses effets relaxants et inhibiteurs de la prolifération et de la migration cellulaires. Les concentrations intracellulaires d’AMPc sont finement régulées par leur synthèse via les adénylates cyclases et leur dégradation par les phosphodiestérases (PDEs). Nous avons évalué l’impact de l’environnement cellulaire sur la voie de signalisation couplée au récepteur β-adrénergique (β-AR/AMPc/PDE) dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs), ainsi que les altérations potentielles de celle-ci en situation pathologique d’insuffisance cardiaque (IC).Notre première étude montre que dans les CMLs d’aorte de rat en culture, adoptant un phénotype synthétique, la voie de signalisation β-AR/AMPc/PDE est hautement modulée par la densité cellulaire Ainsi, une faible densité cellulaire est associée à une régulation négative de l’expression fonctionnelle du récepteur β1-AR, à une activité hydrolytique des PDEs-AMPc plus faible et à des concentrations d’AMPc intracellulaire plus élevées que celles observées dans des cellules confluentes.Notre deuxième étude montre que dans l’aorte de rat, l’IC est associée à une dysfonction endothéliale (DE), une hyperréactivité aux agents contractants et une altération de la fonction et de l’expression des PDEs-AMPc. Nos résultats suggèrent que l’altération de la voie du NO/GMPc suite à la DE conduit à une hyper-activation de la PDE3, qui masque la fonction de la PDE4 et altère la relaxation β-AR.L’ensemble de ce travail met en évidence le rôle critique de l'environnement cellulaire dans le contrôle de la voie β-AR/AMPc/PDE des CMLVsMots clés : Muscle lisse vasculaire, récepteur β-adrénergique, AMPc, phosphodiestérases, densité cellulaire, insuffisance cardiaque / CAMP is second messenger which plays a prominent vasculoprotective role by its relaxing effects and inhibition of cell proliferation and migration. Intracellular cAMP level is regulated by its synthesis by adenylate cyclase and its degradation by phosphodiesterases (PDEs). We evaluated the influence of cellular environment on signaling pathway coupled to β-adrenoceptors (β-AR/cAMP/PDE) on vascular smooth muscle cells (VSMCs), as well as potential alterations in heart failure (HF).The first study showed that in cultured rat aortic SMCs exhibiting synthetic phenotype, the β-AR/cAMP/PDE signaling pathway is highly modulated by the cellular density.Thus, the low density state being associated to a downregulation of the β1-AR, a lower cAMP-PDE activity and a higher basal [cAMP]i compared to confluent cells.Our second study showed that in rat aorta, HF is associated with endothelial dysfunction, hyper-reactivity to contractile agents and an alteration of function and expression of cAMP-PDEs. Our results suggest that NO/cGMP pathway alteration following the ED in HF leads to hyper-activation of PDE3 which masks PDE4 function and alters β-adrenoceptor relaxationThus, our works highlights the critical role of the cellular environment in controlling the vascular β-AR signaling.Keywords: Vascular smooth muscle, β-adrenoceptor, cAMP, phosphodiesterases, cellular density, heart failure.