L’Osteoprotégérine est une cytokine soluble qui joue un rôle clé dans le métabolisme osseux et est impliquée dans la réponse immunitaire et l’hématopoïèse. Elle est associée à la dysfonction endothéliale et semble intervenir dans l’angiogenèse. Cette cytokine constituerait en fait, un trait d’union entre le tissu osseux et vasculaire. Son rôle dans la formation de la matrice osseuse est aujourd’hui bien élucidé mais son implication dans la vascularisation reste à établir. L’OPG est rapidement libérée par l’endothélium dans des conditions inflammatoires et est donc en mesure d’intervenir dans le processus de revascularisation initié par les cellules progénitrices endothéliales (PECs). Au cours de cette étude, nous avons tenté de comprendre le rôle joué par cette cytokines dans la néovascularisation induite in vitro, par une sous population de PECs appelées ECFCs (endothelial colony-forming cells), et sur la formation des néovaisseaux in vivo.Nous avons montré qu’elle agit sur la « souchitude » des cellules CD34+, potentialise les propriétés proangiogènes des ECFCs in vitro, et participe au processus angiogénique in vivo. L’OPG agit sur les ECFCs via le syndécanne-1, inhibe leur adhésion à la matrice extracellulaire, favorise leur migration et leur tubulogenèse via la voie SDF-1/CXCR4, et potentialise leur adhésion à l'endothélium activé. Les effets observés sont corrélés à la libération du SDF-1, une activation des voies de signalisation ERK1/2, Akt et mTOR et à une activation de l’intégrine αVβ3. Par ailleurs, nous avons montré que l'OPG potentialise l’effet proangiogène du FGF-2 in vivo. Elle participe également au développement tumoral et à la dissémination des métastases, probablement via l'inhibition de l'apoptose des cellules tumorales, mais aussi par la promotion de l'angiogenèse tumorale. / Osteoprotegerin is a key regulator of bone metabolism involved in the immune response, hematopoiesis, and endothelial dysfunction. It seems to be implicated in angiogenesis and may represent a link between bone and vascular system. Although its role in bone is well recognized, its involvement in vasculature remains to be established. In inflammatory conditions, OPG is constitutively released by endothelial cells and smooth muscle cells, and therefore is able to participate in blood vessels formation induced by endothelial progenitor cells (EPCs). In this study we attempted to determine, in vitro the precise role of OPG in angiogenesis process induced by a subpopulation of EPCs called “endothelial colony-forming cells” (ECFCs), and on neovessel formation in vivo.We found that OPG causes phenotype changes of ECFCs via the activation of different molecular pathways targeting cell clonogenicity, differentiation, proliferation, migration and adhesion. Our results suggest that OPG may interact with ECFCs through its binding to syndecan-1, to induce an anti-adhesive effect and thereby promoting ECFCs migration through a SDF-1/CXCR4 dependant pathway and the ERK1/2, Akt and the mTOR pathways activation. OPG can intervene on the autocrine effect of ECFCs by inducing their adhesion to activated endothelium and their tubulogenesis, and potentiate their paracrine effects by inducing SDF-1 release. Alternatively, it can promote ECFCs survival, probably, in a αVβ3 integrin-dependent manner. In vivo, OPG potentiates FGF-2 proangiogenic effects and may participate in tumour growth, invasion and metastasis, possibly through inhibition of tumour cell apoptosis but also by promoting tumour angiogenesis.

Les graines de pin (Pinus halepensis Mill., Pinus pinea L., Pinus pinaster et Pinus canariensis) sont les quatre espèces les plus disponibles dans le bassin méditerranéen. Elles sont très utilisées par les populations Nord-africaines en médecine traditionnelle et en gastronomie où elles agrémentent les plats traditionnels (salades, riz, poissons …etc), car elles sont bien connues pour leur excellent goût salé. Cependant, la composition biochimique, les valeurs nutritionnelles, et les mécanismes d'actions cellulaires et moléculaires via lesquels ces graines exercent leurs effets thérapeutiques restent mal élucidés. Le but de notre travail est d'étudier les propriétés physico-chimiques des graines de quatre espèces de pin et la valeur nutritionnelle et pharmaceutique des fractions lipidiques des graines de Pinus halepensis Mill., en utilisant différentes techniques de séparation et d'analyse telles que (DRX, IRTF, CC, LC/MS, GC, GC/MS et RMN) et en examinant la voie principale impliquée dans le développement du cancer qui est l'angiogenèse via des essais biologiques in vitro sur la prolifération et la migration des cellules endothéliales sur Matrigel et in vivo sur une membrane chorioallantoïdienne (CAM) des œufs de poulet ainsi que leurs toxicités sur des cultures cellulaires (Myélome humain HL60, Adénocarcinome du coulon, humain HCT15, Cellules épithéliales A549 et cellules de mélanomes B16F1). Les résultats de la caractérisation physico-chimiques montrent que les quatre graines sont très riches en métabolites primaires (sucres, protéines, protéines de réserve) et secondaires (Phénols totaux et flavonoïdes) comme elles présentent une importante concentration en oligo-éléments (phosphore, potassium, magnésium, Zinc, fer, cuivre et manganèse). Leurs huiles essentielles sont riches en limonène. Les principaux acides gras insaturés pour les quatre espèces sont l'acide linoléique et l'acide oléique. Les propriétés chimiques et physiques de leurs huiles fixes sont dans la norme de qualité agroalimentaire. Les graines de Pinus halepensis Mill. sont les plus riches en lipides totaux qui atteignent un taux de 36% diversifiés chimiquement avec des lipides apolaires (Lipides neutres) et polaires (Quatre classes de glycolipides et six classes de phospholipides). Ces résultats sont de bons indicateurs de la qualité nutritionnelle des graines de pins et impliquent que les lipides neutres, les glycolipides et les phospholipides des graines de Pinus halepensis Mill. dépourvus de toxicité aux concentrations de 1, 10, 25, 50, 100 et 200µg/ml et ayant une activité cytotoxique à 500 et 1000µg/ml et anti-angiogénique in vitro à des concentrations de 100 et 500µg/ml et in vivo à des concentrations de 1mg /ml et 10 mg/ml peuvent être utilisés dans la prévention des maladies liées à l'angiogenèse et à la lutte contre le cancer. / The pine (Pinus halepensis Mill., Pinus pinea L., Pinus pinaster and Pinus canariensis) seeds are the four most available species in the Mediterranean basin. They are widely used by North African populations in traditional medicine and gastronomy where they adorn the traditional dishes (salads, rice, fish ... etc) because they are well known for their excellent taste salty. However, the biochemical composition, nutritional value, and the cellular and molecular mechanisms of action through which these seeds exert their therapeutic effects remain poorly understood. The aim of our study was to investigate the physicochemical properties of pine seed species and nutritional and pharmaceutical value of lipid fractions of Pinus halepensis Mill. Seeds using different separation and analysis techniques such as (XRD, FTIR, CC, LC/MS, GC, GC/MS and NMR) and examining the main pathway involved in the development of cancer which is angiogenesis through biological tests in vitro on the proliferation and migration of endothelial cells on Matrigel and in vivo on a chorioallantoic membrane (CAM) of chicken eggs, thus that their toxicity on healthy cell cultures (human myeloma HL60, Adenocarcinoma of human coulon, HCT15, human epithelial cells, A549 and cells melanoma, B16F1). The results of the physico-chemical characterization showed that four seeds are rich in primary metabolites (sugars, proteins, protein reserves) and secondary (total phenolic and flavonoids) as they have a high concentration of trace elements (phosphorus, potassium, magnesium, zinc, iron, copper and manganese). Their essential oils are rich in limonene. The main unsaturated fatty acids of all species are linoleic acid and oleic acid. The chemical and physical properties of their fixed oils are the in standard food quality. Pinus halepensis Mill. seeds are the richest in total lipids which achieved a rate of 36% chemically diverse with non polar lipids (neutral lipids) and polar lipids (Four classes of glycolipids and six classes of phospholipids). These results are good indicators of the nutritional quality of pine seeds and imply that the neutral lipids, glycolipids and phospholipids of Pinus halepensis Mill. seeds devoid of toxicity at the concentrations of 1, 10, 25, 50, 100 and 200µg/ml and having cytotoxic activity at 500 and 1000µg/ml and anti-angiogenic effect in vitro at the concentrations of 100 and 500 µM and in vivo at the concentrations of 1 mg/ml and 10 mg/ml may be useful in prevention of angiogenesis-related and the fight against cancer diseases.

Les métastases sont à l'origine dans 90% des cas du décès des patients et sont donc un enjeu thérapeutique majeur. Les traitements anti-angiogéniques qui inhibent la vascularisation tumorale et augmentent l'hypoxie ont une efficacité limitée en clinique. Des liens ont été établis entre l'hypoxie et le changement métabolique des cellules tumorales, l'augmentation des cellules souches cancéreuses, la transition épithélio-mésenchymateuse et la résistance aux traitements mais également la dissémination métastatique. Ces observations nous ont poussés à réévaluer le rôle de l'hypoxie dans la dissémination métastatique du cancer du sein, en nous focalisant sur l'étude du premier inhibiteur endogène de l'angiogenèse identifié, la Thrombospondine 1 (TSP1). En clinique, nous avons observé que l'expression de la TSP1 est corrélée aux marqueurs d'agressivité et qu'elle augmente avec le grade tumoral. Dans un modèle orthotopique de tumeurs mammaires métastatiques, nous avons montré que l'inhibition de la TSP1 réduit fortement l'EMT, l'invasion et les métastases pulmonaires alors même que la vascularisation de la tumeur primaire est densifiée et plus fonctionnelle, réduisant l'hypoxie. Pour déterminer le rôle de la TSP1 dans la survenue des métastases, nous avons effectué des mutations ponctuelles de ce gène dans le domaine d'activation du TGFbéta ou dans celui de la liaison au CD36 qui médie majoritairement les propriétés anti-angiogéniques de la TSP1. La mutation de l'une ou l'autre de ces séquences entraîne une diminution drastique des métastases pulmonaires. Ce travail nous conduit à proposer un nouveau concept thérapeutique, visant à normaliser la vascularisation tumorale et à réduire l'hypoxie par une stratégie "anti-antiangiogénique" basée sur l'inhibition de la TSP1. Cette stratégie devrait inhiber la dissémination métastatique et favoriser la pénétration des traitements chimiothérapeutiques et augmenter l'efficacité de la radiothérapie, dépendante de la présence d'oxygène. / Metastasis are responsible for 90% of cases of patients death and so represent a major therapeutic challenge in oncology. Anti-angiogenic treatments, which inhibit tumor vascularization and increase hypoxia, have limited clinical efficiency. This inefficiency could be a consequence of hypoxia. Indeed, links have been established between hypoxia and: metabolic changes in tumor cells, increase in cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and resistance to treatment. Experimental and clinical evidence also suggest that hypoxia may directly induce metastatic dissemination. These observations led us to reassess the role of hypoxia in metastatic dissemination by focusing on the study of the first identified endogenous angiogenic inhibitor, the Thrombospondin 1 (TSP1). TSP1 is also an activator of latent TGFbéta. The aim of this work was to study the role of TSP1 in tumor progression and dissemination of metastatic breast cancer. In clinic, we observed that the expression of TSP1 is correlated with markers of aggressiveness and that it increases with tumor grade. In an orthotopic model of metastatic breast tumors, we have shown that inhibition of TSP1 strongly reduce EMT, invasion and lung metastasis meanwhile the vascularization of the primary tumor is densified and more functional, thus reducing hypoxia. To determine the role of TSP1 in the occurrence of metastasis, we generate point mutations of this gene in TGFbéta activation domain or in the binding domain to CD36 that predominantly mediates the anti-angiogenic properties of TSP1. Mutations of either of these sequences result in a drastic decrease in lung metastasis, which confirms the importance of TGFbéta in metastatic dissemination. Our results also demonstrate a direct link between hypoxia and metastasis: the inactivation of anti-angiogenic properties of TSP1, which increases tumor perfusion and decreases hypoxia without affecting primary tumor growth, blocks metastatic dissemination even though the cells have the ability to migrate. This work led us to propose a new therapeutic concept aiming to normalize tumor vascularization and reduce hypoxia by an "anti-antiangiogenic" strategy based on TSP1 inhibition. This strategy should inhibit metastatic spreading, promote the diffusion of chemotherapeutic treatments and increase the efficiency of radiotherapy, dependent on oxygen presence.

Chez les vertébrés, le système cardiovasculaire est composé d’un réseau hiérarchisé de vaisseaux sanguins couplés à la pompe cardiaque. Ce système tubulaire se ramifie dans chaque organe afin d’y acheminer l’oxygène et les nutriments et d’éliminer les sous-produits métaboliques. Au-delà de cette fonction ancestrale et malgré sa continuité anatomique, les segments constituant ce système sont fortement hétérogènes, s’adaptant localement à la fonction de chaque organe. Cette spécification organotypique se manifeste le plus distinctement par la barrière hémato-encéphalique (BHE), un ensemble de propriétés protectrices adoptées par l’endothélium cérébral. Il est établi que tant la formation du système vasculaire cérébral que sa maturation en BHE résultent d’une intense et complexe communication entre le système neural et vasculaire, et que cette communication reste active jusque chez l’adulte.Au cœur de cette thématique, le GPR124, un GPCR d’adhésion orphelin, fut caractérisé à l’entame de ce travail de thèse comme le premier facteur endothélial spécifiquement impliqué dans la vascularisation du système nerveux central chez les mammifères. Malgré cette découverte pionnière pour le domaine, la nature des signaux activant le Gpr124 ainsi que les mécanismes de signalisation de ce récepteur restaient totalement élusifs et ont été explorés au cours de ce travail de doctorat.Nous avons ainsi déterminé que le Gpr124 est requis pour l’activation de la voie Wnt/β-caténine dans l’endothélium cérébral et que cette voie est essentielle à l’angiogenèse cérébrale en contrôlant sélectivement les cellules de tête du bourgeon angiogénique. Nous avons également identifié Reck comme partenaire d’interaction essentiel du Gpr124. Le complexe Gpr124/Reck confère aux cellules la capacité unique de discriminer parmi les différents membres de la famille de ligands Wnt et ainsi de transduire spécifiquement les signaux Wnt7a/b angiogéniques dérivant du système neural.Notre étude a permis de développer un modèle moléculaire et cellulaire intégratif expliquant le contrôle neural de l’invasion vasculaire cérébrale chez les vertébrés. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les lymphomes sont constitués de sous-groupes tumoraux définis par différents critères cliniques, morphologiques, immunophénotypiques et moléculaires. Néanmoins, même au sein d’un sous-groupe, il existe une grande hétérogénéité dans l’évolution clinique des patients, ce qui rend leur prise en charge difficile. Ceci souligne l’importance de découvrir de nouveaux biomarqueurs pronostiques qui amélioreraient l’approche thérapeutique personnalisée. <p>La revue de la littérature fait apparaitre les galectines-1 et -3 comme des protéines impliquées dans le développement des cancers ainsi que dans la biologie des lymphocytes. Pourtant, au moment où nous avons débuté ce travail, peu de chercheurs s’étaient intéressés à l’implication de ces galectines dans les lymphomes.<p>Nous avons donc décidé d’évaluer le rôle diagnostique ou pronostique de la galectine-1 et de la galectine-3 dans les lymphomes.<p><p>La première étude a consisté en la caractérisation de l’expression immunohistochimique de ces deux galectines au sein d’une série clinique de lymphomes systémiques humains en comparaison au tissu lymphoïde normal. <p>En ce qui concerne la galectine-1, les cellules lymphomateuses l’expriment peu, de façon similaire à ce qui est observé pour les cellules lymphoïdes normales. Au contraire, les cellules endothéliales associées aux lymphomes sont caractérisées par une augmentation de l’expression de galectine-1 en comparaison aux cellules endothéliales normales. Cette expression endothéliale ne montre pas de relation avec les variables cliniques de notre étude mais est corrélée à la densité microvasculaire des lymphomes. <p>En ce qui concerne la galectine-3, les cellules lymphomateuses des lymphomes B diffus à grandes cellules se caractérisent par une expression plus élevée comparativement aux autres sous-groupes de lymphomes et aux cellules lymphoïdes normales. Cette expression de galectine-3 n’est pas associée aux variables cliniques dans notre étude. Contrairement à la galectine-1, la galectine-3 est exprimée de façon similaire par les cellules endothéliales des vaisseaux des tissus lymphoïdes normaux et des lymphomes.<p>Ces données suggèrent un rôle angiogénique de la galectine-1 dans les lymphomes systémiques.<p><p>Dans la deuxième étude, nous avons caractérisé l’expression des galectines-1 et -3 au sein d’une série clinique de lymphomes primitifs du système nerveux central (LPSNC). <p>Nous avons observé que les profils d’expression des cellules lymphomateuses sont similaires pour les lymphomes systémiques et les LPSNC, caractérisés par une absence d’expression de galectine-1 et une expression variable de galectine-3. <p>A l’opposé, nous avons observé une expression endothéliale de ces galectines différente entre les lymphomes systémiques et les LPSNC. La galectine-1 n’est pas exprimée par les cellules endothéliales des vaisseaux des LPSNC. Par contre, la galectine-3 est exprimée par les cellules endothéliales de certains LPSNC. Cette expression est associée à un mauvais pronostic. <p>Nous avons également démontré que l’hyperplasie endothéliocapillaire est associée à une survie diminuée. <p>Cette hyperplasie endothéliocapillaire et/ou l’expression endothéliale de galectine-3 sont des facteurs pronostiques indépendants au sein de notre série de patients immunocompétents atteints de LPSNC et traités par chimiothérapie.<p><p>Au vu des résultats des deux premières études, nous pensons que les galectines-1 et -3 jouent un rôle dans l’angiogenèse des lymphomes. Ce rôle est très certainement complexe comme l’illustre la différence d’expression endothéliale de ces galectines entre les lymphomes systémiques et les LPSNC. Ces variations d’expressions selon l’organe hôte sont à intégrer avec la notion générale d’hétérogénéité des cellules endothéliales. Cette hétérogénéité s’observe également entre les cellules endothéliales des vaisseaux normaux et les cellules endothéliales des vaisseaux dans un contexte tumoral (TAECs - tumor-associated endothelial cells). <p>Suite à ces observations, nous avons décidé d’étudier l’implication des galectines-1 et -3 extracellulaires sur deux modèles in vitro de cellules endothéliales (cellules HUVEC et EA.hy926). La revue de la littérature nous a permis de poser l’hypothèse que la lignée EA.hy926 pourrait s’apparenter aux TAECs. La première partie de cette troisième étude a pour but de valider cette hypothèse. La comparaison morphologique des lignées EA.hy926 et HUVEC cultivées sur un substrat de matrigel a permis de montrer que les tubes formés par les cellules EA.hy926 sont plus hétérogènes comme ce que l’on peut observer dans les vaisseaux tumoraux. La comparaison des profils d’expression des gènes de ces deux lignées a mis en évidence que différents gènes surexprimés dans les TAECs le sont également dans les cellules EA.hy926. Les cellules EA.hy926 présentent un profil d’expression des récepteurs au VEGF (VEGFR- vascular endothelial growth factor receptor) caractérisé par un taux élevé de VEGFR1 et un faible taux de VEGFR2 en comparaison aux cellules HUVEC. L’analyse in vivo des VEGFRs au sein des cellules endothéliales de tissus humains normaux et tumoraux nous a permis de confirmer la surexpression de VEGFR1 par les TAECs. L’ensemble de ces résultats supportent donc notre hypothèse que la lignée EA.hy926 présente des caractéristiques plus proches des TAECs en comparaison à la lignée HUVEC.<p>Nous avons ensuite, dans la deuxième partie de cette troisième étude, analysé les effets respectifs de la galectine-1, de la galectine-3 et de leur combinaison sur ces deux lignées. Nous avons observé que la galectine-1 extracellulaire dans notre modèle de cellules endothéliales normales (HUVEC) augmente la croissance cellulaire ainsi que la formation de tubes sans mise en évidence de phosphorylation significative de VEGFR1 ni de VEGFR2. Dans notre modèle de TAECs (EA.hy926), la galectine-1 extracellulaire ne favorise pas la croissance cellulaire et est faiblement angiogénique via la phosphorylation du VEGFR2, sans phosphorylation du VEGFR1. <p>En ce qui concerne la galectine-3, nous avons observé dans nos deux modèles des résultats similaires, à savoir une absence d’effet sur la croissance cellulaire et un effet positif sur la formation de tubes s’accompagnant d’une phosphorylation de VEGFR2 sans phosphorylation de VEGFR1. <p>Le résultat le plus original consiste en la mise en évidence d’un effet synergique des deux galectines sur la croissance et la formation de tubes des cellules EA.hy926. Cet effet synergique s’accompagne d’une phosphorylation de VEGFR1 et de VEGFR2. Il est important de noter que l’activation de VEGFR1 n’a été observée que pour la lignée EA.hy926 et uniquement en présence des deux galectines. <p>Dans ces conditions, nous avons démontré que les voies de signalisation activées suite à l’ajout de ces galectines impliquent la voie de l’extracellular signal regulated kinase1/2 et de l’heat shock protein 27. <p><p>En conclusion, ce travail nous a donc permis, à partir de la caractérisation de l’expression de galectine-1 et -3 dans une série de lymphomes systémiques et cérébraux, de proposer un rôle angiogénique pour ces galectines. Les études in vitro ont souligné les rôles différents que joueraient ces galectines extracellulaires dans l’angiogenèse non tumorale et tumorale et l’implication du VEGFR1 dans l’angiogenèse tumorale. <p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’angiogenèse étant un processus limité dans des conditions physiologiques et un processus clé dans la croissance tumorale, elle est devenue une cible thérapeutique prometteuse. La neuropiline-1 (Np1) est un corécepteur du VEGF, qui est le facteur pro-angiogénique le mieux décrit jusqu’à présent. Dans cette thèse, nous nous intéressons à la modélisation du ligand 47, une molécule active expérimentalement, en vue de l’amarrer dans la neuropiline-1. En raison de sa flexibilité conformationnelle, ce ligand pourrait en effet adopter une conformation étendue, comme la tuftsine, un ligand naturel de Np1, ou une conformation repliée. Une étape préliminaire essentielle, avant l'exploration de la complexation du lig-47 a Np1, est l'étude de sa flexibilité conformationnelle. Il est en effet impératif de s'assurer que les interactions intra-moleculaires (conformationnelles) dans le lig-47 sont calculées a une precision comparable a celles de ses interactions intermoléculaires avec Np1. Un écueil important tient au caractère conjugue du lig-47. Les quatre fragments constitutifs de cette molecule sont tous aromatiques ou conjugues, et sont tous connectes par des atomes insaturés. [...] Nous avons, dans une première étape, construit la molécule en quatre fragments : le benzimidazole, le méthylbenzène, le benzodioxane et le carboxythiourée (CTU). Nous avons approché ces quatre fragments par une molécule d’eau afin de calibrer les rayons de Van de Waals effectifs impliqués dans les contributions d’énergies électrostatique et de répulsion. L’anisotropie ayant été assurée, nous avons cherché à reproduire la conjugaison, par la calibration des barrières de torsion V0 primaires (n=1) et binaires (n=2). Nous obtenons des accords très satisfaisants entre les courbes conformationnelles obtenues avec SIBFA et celles obtenues par des calculs de chimie quantique (QC). Nous avons ensuite effectué des minimisations de l'énergie SIBFA en partant des minima des six courbes conformationnelles. Afin d'évaluer la transférabilité de la méthode, nous avons comparé les stabilités relatives de ces minima par des calculs QC ponctuels. Or les différences d'énergie séparant le minimum « global » des minima locaux se sont avérées sous-estimées par rapport aux calculs QC. Ces résultats nous ont amenés à envisager des façons différentes de représenter le fragment CTU. La possibilité la plus évidente consiste à le séparer en deux sous-fragments amide et thioamide. Les effets de la conjugaison et de la transférabilite des multipôles et polarisabilités sont ainsi perdus mais pourraient être compensés par la prise en compte explicite de l’énergie de polarisation des fragments amide et thioamide. Avec cette approche, la recalibration des rayons effectifs a permis de préserver des accords convenables avec les calculs quantiques pour l'approche des atomes du CTU par une molécule d'eau sonde. Les courbes conformationnelles reproduisent de près les courbes QC avec une recalibration minimale. Les minima de ces courbes ont été a nouveau minimisés en SIBFA, conduisant a des structures néanmoins très proches des minima correspondants de l'approche précédente avec un CTU construit d'un seul tenant. Mais à présent, les différences d'énergie séparant le minimum global des minima locaux sont très voisine de celles trouvées en QC. De plus, l'évolution des courbes conformationnelles en fonction de la structure considérée s'est avérée régie par l'énergie de polarisation. Par ailleurs, nous avons obtenu des résultats satisfaisants lors de l’amarrage de la tuftsine dans Np1. Ces résultats s'avèrent suffisamment probants pour permettre d'envisager à présent une étude détaillée des modes d'interaction du lig-47 avec Np-1. / Angiogenesis is a limited process in physiological conditions and a key process in tumor growth. Hence, it has become a promising therapeutic target. The neuropilin-1 (Np1) is a co-receptor for VEGF, which is today the best known pro-angiogenic factor. This manuscript deals with the molecular modelling of the ligand 47 (lig47), an experimentally active molecule, in order to dock it into Np1. Due to its conformational flexibility, this ligand could adopt and extended conformation such as tuftsin, a natural ligand, does in its complex with Np1, or a folded conformation. An essential preliminary step, before the exploration of the complexation of lig47 with Np1 is the study of its conformational flexibility. Indeed it must be ensured that the intramolecular (conformational) interactions are calculated with precision compared with the calculations of the interaction energies with Np1. An important issue comes from the polyconjugaison of the lig47. [...] We probed these four fragments with a water molecule in order to calibrate the effective Van der Waals radii implicated in electrostatic and repulsion contributions. Once the anisotropy was reproduced, we looked for reproducing the effect of the conjugaison on torsional barriers. We hence calibrated primary (n=1) and binary (n=2) barriers. We obtained very satisfactory agreements between the conformational curves obtained with SIBFA and those obtained with quantum chemistry (QC) calculations. Then we performed energy minimizations of SIBFA energy of the minima of the ix conformational curves. In order to evaluate the transferability of the method, we compared the relative stabilities of these minima with single-point QC calculations. But the differences of energy between the global minimum and local minima were underestimated in comparison with QC calculations. These results lead us to consider different ways of representing CTU. The more evident way consists in separating it in two fragments amide and thioamide. The effects of the conjugaison and the transferability of the multipoles and the polarisabilities are lost but could be compensated by the explicit consideration of the polarization energy between the amide and thioamide fragments. With this approach, the recalibration of the effective radii permitted to preserve good agreements with the QC calculations when probing the CTU by a water molecule. The conformational curves reproduce the QC curves after a minimal recalibration. The minima of these curves were then re-minimized with SIBFA, leading to structures close to those obtained with the first representation. But now, the differences of energy between the global minimum and the local minima are very close to those obtained in QC. Moreover, the evolution of the conformational curves as function of the number of the structure is ruled by the polarization energy. Otherwise, we obtained satisfactory results when we docked the tuftsin in Np1. These results will allow us to consider a detailed study of the interaction between lig47 et Np1.

Le but des travaux est de caractériser l’influence de la signalisation VEGF, en particulier la signalisation autocrine VEGF, sur la biologie et la sensibilité/résistance aux médicaments anticancéreux de cellules de cancer colorectal. Nous avons souhaité caractériser l’impact de la signalisation autocrine VEGF dans des modèles de CRC avec une résistance naturelle au bevacizumab, un anticorps anti-VEGF. Bien que ce composé soit actif dans le CRC, une sous population de patients ne répondent pas au traitement. Nos résultats montrent une sur régulation de la voie autocrine HIF-VEGF-VEGFR en réponse à une exposition prolongée au bevacizumab dans les cellules bevacizumab résistantes. Si la résistance à cet anticorps est bien établie, d’autres inhibiteur de la voie VEGF restent actifs (comme la petite molécule ciblée nintedanib) et peuvent inhiber la voie mTOR. La signalisation VEGF autocrine joue un rôle dans la survie de cellules de CRC. Chez les sujets résistants au bevacizumab, il serait intéressant d’introduire le nintedanib seul ou en combinaison pour accentuer l’inhibition angiogénique. Une autre combinaison d’agents (anti VEGF(R) et anti EGFR) a montré une efficacité dans des modèles de CRC en préclinique. La combinaison du bevacizumab et d’une petite molécule ciblant EGFR (erlotinib) a montré une plus grande efficacité que le bevacizumab seul dans des modèles de CRC indépendamment du statut KRAS. Le bevacizumab induit une activation de la voie de survie EGFR dans les cellules tumorales et dans les cellules endothéliales associées à la tumeur. Cette activation se trouve diminuée avec l’introduction de l’erlotinib. Les résultats indiquent que la combinaison du bevacizumab et de l’erlotinib sont plus actif en thérapie de maintenance que le bevacizumab seul, même pour les patients mutés KRAS. Ces résultats ont mené à l’étude clinique positive GERCOR phase III DREAM dans le cancer du côlon métastatique. / The aim of the work is to characterize the influence of VEGF signaling , especially autocrine VEGF signaling , the biology and susceptibility / resistance to anticancer drugs of colorectal cancer cells. We wished to characterize the impact of the autocrine VEGF signaling in CRC models with natural resistance to bevacizumab , an anti -VEGF antibody. Although this compound is active in the CRC, a subpopulation of patients do not respond to treatment. Our results show an autocrine regulatory pathway HIF- VEGF- VEGFR in response to prolonged exposure to bevacizumab in bevacizumab resistant cells. If the resistance to the antibody is established, other inhibitos of VEGF pathway remain active (such as small molecule nintedanib ) and can inhibit the mTOR pathway. Autocrine VEGF signaling plays a role in CRC cell survival. In subjects resistant to bevacizumab, it would be interesting to introduce the nintedanib alone or in combination to enhance the angiogenic inhibition. Another combination of targeted agents ( anti-VEGF (R) and anti EGFR) has shown efficacy in preclinical models of CRC. The combination of bevacizumab and a small molecule targeting EGFR (erlotinib) showed greater efficacy than bevacizumab alone in CRC models regardless of KRAS status. Bevacizumab induces activation of the EGFR survival pathway in tumor cells and in endothelial cells associated with the tumor. This activation is decreased with the introduction of erlotinib. The results indicate that the combination of bevacizumab and erlotinib are more active in maintenance therapy than bevacizumab alone, even for patients mutated KRAS . These findings led to the positive Phase III clinical study GERCOR DREAM in metastatic colon cancer.

Le cancer de la prostate est la principale cause de décès chez les hommes des pays occidentaux. Traitement du cancer de la prostate résistant à la castration (CRPC) métastatique est encore limité. RhoA/ROCK sont les régulateurs principaux du cytosquelette et sont impliqués dans l'angiogenèse et l'invasion tumorale. Dans la première étude (partie 1), nous avons étudié les effets anti-angiogéniques de fasudil ( inhibiteur de ROCK ) in vitro. Des cellules endothéliales de la veine ombilicale sont stimulé par les cellules du cancer de la prostate. La prolifération est détectée par la Bromodéoxyuridine (BrdU). La migration est détectée par la cicatrisation des plaies. Les conditions de l'angiogenèse in vitro sont évaluées par la formation des tubes et un ellipsoïde test de germination. Fasudil inhibe la prolifération et la migration des cellules endothéliales induite par le cancer de la prostate. Dans les tests in vitro de l'angiogenèse, les formations des tubes et des germes sphériques sont inhibées significativement par fasudil dans d'une manière dépendante de la dose. Selon les résultats de Western Blot, l'expression de MYPT-1 a été significativement réduite après le traitement de Fasudil, confirmé l'inhibition de l'activité de ROCK par fasudil. Dans la deuxière étude (partie 2 et 3), l'expression et l'activité de RhoA sont évaluées chez 34 tissues paraffinées et 20 échantillons congelés de la prostate, obteni de 45 malades du cancer de la prostate qui à été reçu une prostatectomie radicale. Les motifs de l'expression de RhoA sont detecté par la coloration immunomarquage et western blot. Les différence entre le centre, l'avant et plus loin autour de la tumeur sont évalué. L’activité de RhoA sont évalué par G-LISA. Le gradient d'augmentation de l'expression de RhoA a été trouvé du centre a la region autour de la tumeur. L'expression de RhoA est supérieure significativement dans les cellules de l’avant de la tumeur par rapport au centre de la tumeur par Immunohistochimie (p = 0001). Gleason score était significativement supérieur chez des patients avec l'expression de RhoA élevée dans l’avant et centre de la tumeur (p =0044 et 0039, respectivement). Après un suivi médian de 52 mois, le taux de récidive est plus élevé chez des patients avec l'expression de RhoA élevée dans l’avant de la tumeur (62,5% contre 35%), une tendance évidente a la différence significative (P = 0089). Il n'y a pas de corrélation entre l'expression de RhoA, PSA et la stadification pathologique. On a aussi découvert que l'expression de le ROCK2, mais pas l'expression de le ROCK1, est eleve significativement dans l’avant de la tumeur du cancer de la prostate. En conclusion, nous avons trouvé que fasudil inhiber la prolifération, la migration, la formation de capillaires et de la sphère de la germination des cellules endothéliales vasculaires d’'une manière dépendante de la dose. Ces effets peut-être grâce à l'inhibition de l'activité de la ROCK résultant de la sécrétion de cellules du cancer de la prostate. Nous avons aussi trouvé que l'expression de la RhoA et ROCK2 dans l’avant de la tumeur de la prostate sont plus élevés. La corrélation de l'expression de RhoA avec Gleason score et récidive est identifiée. Cela montre l’association entre la voie RhoA/ROCK et l’agressive du cancer de la prostate. L'étude décrite ici peut fournir de nouveaux traitements cible la voie RhoA/ROCK contre l’angiogenèse et agressive du cancer de la prostate. Fasudil peut être utile comme agent anti - angiogénique, doit être étudiée pour leur rôle potentiel dans le traitement du cancer de la prostate. / Prostate cancer remains a major cause of mortality among males in western countries. Treatment options for metastatic castration-resistant disease remain limited. There is a continuing unmet need for new systemic interventions in patients with progressive prostate cancer. RhoA/Rho-associated protein kinases (ROCK) are key regulators of the cytoskeleton and have been implicated in PCa angiogenesis and tumour invasion. In the first study (Part I), we investigated the anti-angiogenic effects of fasudil, a ROCK inhibitor, on PCa-induced angiogenesis in vitro. Proliferation of PCa-conditioned human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was assessed using a bromodeoxyuridine (BrdU) assay, and migration was assessed with a wound healing assay. In vitro angiogenesis of PCa-conditioned HUVECs was evaluated by tube formation and a spheroid sprouting assay. Fasudil inhibited PCa-induced endothelial cell proliferation, and also decreased PCa-induced endothelial cell migration. In the in vitro angiogenesis assay, tube formation and spheroid sprouts were significantly inhibited at fasudil in a dose dependent manner. Western blotting results showed that expression of phosphorylated myosin phosphatase target subunit 1 (MYPT-1) was significantly lower after fasudil treatment, confirming that fasudil inhibited ROCK activity in these model systems. In the second study (Part II & III), we evaluated RhoA expression and activity in a total of 34 paraffin embedded and 20 frozen prostate specimens, respectively, obtained from 45 patients treated with radical prostatectomy for clinically localized cancer. The expression patterns of RhoA were tested by immunohistochemical staining and Western blotting, and further compared between the tumour centre, tumour front and distant peritumoral tissue. RhoA activity was assessed by G-LISA. Our results showed an increasing gradient of expression from the centre to the periphery of index tumour foci. RhoA expression was indeed significantly higher at the tumour front as compared to tumour centre, using immunohistochemistry (p=0.001). Gleason score was significantly higher in the patients with higher RhoA expression in both the tumour front and tumour centre (p=0.044 and 0.039, respectively). After a median follow-up of 52 months, the rate of PSA relapse was higher in patients with a higher RhoA expression at the tumour front (62.5% vs 35%), although the difference was not significant (p=0.089). There was no association between RhoA expression and PSA, pathological stage. We also found ROCK2 expression, but not ROCK1 expression, was significantly higher in the prostate cancer tumor front. In conclusion, we found fasudil significantly inhibits the key steps of endothelial cell angiogenesis, including proliferation, migration, capillary tube formation and spheroid sprouting, in a dose-dependent manner. These effects may due to inhibition of ROCK activity induced by PCa cell secretions. We also identified higher RhoA and ROCK2 expression in human prostate tumour front. The correlation of higher RhoA expression with higher Gleason score and higher rate of cancer relapse. This indicated the association of RhoA/ROCK2 pathway with aggressiveness of prostate cancer. The insights described here may provide the foundation for novel therapeutic approaches targeting RhoA/ROCK pathway to inhibit angiogenesis and clinically aggressiveness of PCa. Fasudil may be a useful anti-angiogenic agent and should be investigated further for its potential role in PCa treatment.

L’angiogenèse est un processus majeur intervenant au cours du remodelage du microenvironnement tumoral, induit par l’hypoxie et le VEGF. La lysyl oxydase like-2 (LOXL2) appartient à la famille des lysyl oxydases, impliquée dans le pontage de constituants matriciels. Notre équipe a montré que l’induction de LOXL2 par l’hypoxie conduit à sa sécrétion par les cellules endothéliales et son accumulation dans la matrice extracellulaire endothéliale. Nous avons montré que LOXL2 joue un rôle dans l’angiogenèse au cours du développement. Des études ont montré que LOXL2 est surexprimée dans de nombreux cancers et que l’inhibition de LOXL2 extracellulaire empêche la formation d’un microenvironnement tumoral. Mon travail de thèse a porté sur l’étude du rôle de LOXL2, exprimée par les cellules endothéliales et tumorales, au cours de l’angiogenèse dans le carcinome du rein à cellules claires (ccRCC) humain. Nous avons montré que LOXL2 est exprimée à la fois par les cellules stromales et tumorales dans le ccRCC humain, mais aussi que LOXL2 pourrait jouer un rôle spécifique en fonction de son origine cellulaire dans ces tumeurs. L’étude de la contribution de LOXL2 endothéliale nous a permis de démontrer que LOXL2 promeut l’angiogenèse in vitro et in vivo dans le ccRCC, avec une implication partielle de son activité catalytique dans ce processus. Nous avons montré que LOXL2 sécrétée par les cellules tumorales stimule l’angiogenèse in vitro et in vivo, avec la participation de son activité catalytique, notamment en modulant la prolifération des cellules endothéliales. LOXL2 endothéliale et tumorale promeuvent l’angiogenèse dans le ccRCC, dépendamment ou non de son activité catalytique. / Angiogenesis is a major process in microenvironment remodeling which is mainly induced by hypoxia and VEGF. Lysyl oxidase like-2 (LOXL2) belongs to lysyl oxidase family involved in extracellular matrix crosslinking. Our team previously described that LOXL2 is a hypoxia-target, which is secreted by endothelial cells and accumulated into endothelial extracellular matrix. We also demonstrated that LOXL2 stimulates developmental angiogenesis. Moreover, several studies showed that LOXL2 is overexpressed in many cancers and inhibition of extracellular LOXL2 impedes the formation of a tumor microenvironment. My PhD work focused on the contribution of LOXL2 secreted by stromal cells (endothelial cells and cancer associated fibroblasts) and tumor cells in clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) angiogenesis. ccRCC is a highly vascularized and metastatic tumor. We showed that LOXL2 is expressed both by stromal and tumor cells in ccRCC and might play a specific role depending on its cellular origin in these tumors. Then we demonstrated that LOXL2 secreted by endothelial cells promotes angiogenesis in vitro and in vivo with a partial contribution of its catalytic activity. We also demonstrated that LOXL2 secreted by tumor cells stimulates angiogenesis in vitro and in vivo and that LOXL2 catalytic activity is involved in this process, notably modulating endothelial cells proliferation. Moreover, we showed that endothelial and tumor LOXL2 regulate several signaling pathways implicated in different steps of the angiogenic process.Both tumor and endothelial LOXL2 are involved in angiogenesis of ccRCC, in a dependent or independent catalytic activity manner.

L'endométriose est une maladie gynécologique fréquente et dont les principales manifestations sont la douleur et l'infertilité. Nous avons effectué un travail en deux étapes à partir d'un modèle d'endométriose chirurgicalement induite chez la souris. D'abord nous avons évalué l'impact de la grossesse sur la lésion d'endométriose puis nous avons évalué l'impact de l 'endométriose sur la qualité ovocytaire et embryonnaire. Nous avons mis en place un modèle d’endométriose chez la souris prélevant chez des souris donneuses des fragments utérins de 2 mm et en les fixant à la paroi péritonéale de souris receveuses. / Endometriosis is a frequent gynecological disease which main symptoms are pain and infertility. We performed a two-step study using a murine model of endometriosis. We built a model of surgically induced endometriosis in mouse. We harvested 2-mm uterine tissue samples from donor mice and transplanted them on the peritoneal wall of recipient mice. We first evaluated the impact of pregnancy on the endometriosis lesion and then assessed the effect of endometriosis on oocyte and embryo quality. Impact of pregnancy on endometriosis lesion : We compared endometriosis lesions of pregnant mice with those of non pregnant mice. Pregnancy was associated with important lesions’ modifications : reduction of the volume, dramatic reduction of the cystic part of the lesion, high cellular proliferation and high angiogenesis. Impact of endometriosis on fertility : We compared oocyte and embryo quality in two groups : endometriotic and control mice. Oocyte quality was decreased in endometriotic mice (meiotic spindle and first polar body abnormalities) and the number of embryos was reduced. This work provides new insights on pathophysiological mechanisms of lesion constitution and on endometriosis-associated infertility mechanisms. These experiments also validate the use of the surgically induced murine model of endometriosis in fertility parameters assessment.